一、兔血管内皮细胞与平滑肌细胞体外增殖的相互影响(英文)（论文文献综述）
帅芝琴,陈家蒙,刘滔滔,胡安玲,李利生,余丽梅,徐尚福[1]（2022）在《干细胞及其来源外泌体防治血管再狭窄的研究现状与问题》文中研究指明背景:血管再狭窄严重影响冠状动脉粥样硬化性心脏病介入治疗的远期疗效。干细胞的多向分化能力和分泌功能与再狭窄的发生发展和转归有密切关系,为血管再狭窄预防和治疗提供了新的思路,具有巨大的潜在优势。目的:对内皮祖细胞、间充质干细胞以及外泌体防治血管再狭窄的作用及机制作一综述。方法:检索CNKI和PubMed数据库,中文检索词为"干细胞""外泌体"和/或"再狭窄",英文检索词为"stem cell""exosomes"和/或"restenosis",筛选83篇文献进行分析总结。结果与结论:（1）再狭窄严重影响冠状动脉介入治疗的远期疗效,仍是临床上亟待解决的重要课题;（2）内皮祖细胞和间充质干细胞移植对血管再狭窄具有防治作用,其机制主要涉及直接分化修复血管内皮和旁分泌影响血管损伤微环境;（3）干细胞来源外泌体既可产生类似干细胞移植的作用,又可规避干细胞移植缺陷,在血管再狭窄防治中具有独特的潜在优势。
刘晓琳[2]（2021）在《DKK1介导生物力学对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用》文中认为研究背景心血管疾病是人类死亡的主要原因,各种危险因素导致的血管重构和动脉粥样硬化是常见的病理基础。临床和病理研究表明,动脉粥样硬化病变主要发生在血管分叉、弯曲以及狭窄区域,高血压可引起血管壁细胞增殖、血管壁增厚,介入治疗术后异常血流可引起血管增生和再狭窄。这些因素提示血管力学因素是血管重塑和动脉粥样硬化形成的重要诱因。血管重塑主要表现为血管平滑肌细胞（VSMCs）的异常增殖、凋亡和迁移。血管内皮细胞能够直接感受血流剪切力的刺激,通过细胞间的相互作用影响平滑肌细胞的功能。研究病理剪切力诱导血管重塑的分子机制以及内皮细胞和血管平滑肌细胞之间的相互作用有助于更好地理解心血管疾病的发病机制。近年来研究表明生物力学在新生内膜增生方面发挥了重要作用。DKK1蛋白,又称Dickkopf1,是一种分泌性糖蛋白,可通过旁分泌与自分泌发挥作用。一方面,DKK1通过与LRP6结合,从而拮抗下游Wnt通路发挥作用。另一方面,DKK1可以结合受体CKAP4,进而胞内段募集PI3K,激活Akt,促进增殖。既往研究中发现DKK1可通过调控CKAP4/PI3K/Akt、非经典Wnt/PCP/JNK以及β-catenin/MMP7通路促进肿瘤细胞增殖迁移及肿瘤存活。近年来,DKK1在心血管疾病中的作用受到关注,以DKK1为靶点的药物开发已进行到Ⅱ期临床试验。研究发现,DKK1与颈动脉内膜中层厚度呈正相关;接受双联抗血小板治疗的急性冠脉综合征患者中,DKK1水平与心血管事件和单独心血管死亡有独立相关性,内皮细胞与血小板来源的DKK1可通过抑制Wnt/β-catenin通路、活化NF-κB促进内皮细胞炎症反应,促进动脉粥样硬化。我们课题组前期研究发现,血清DKK1水平升高可作为急性冠脉综合征再发不良心血管事件的独立预测指标,联合危险因素显着提高预测价值。DKK1能够影响血管内皮细胞的功能。ox-LDL与病理剪切力均可上调血管内皮细胞DKK1表达,通过拮抗经典Wnt通路、激活JNK、促进脐静脉内皮细胞内质网应激,诱导凋亡,促进血流中单核细胞与内皮细胞黏附,并抑制内皮细胞间紧密连接分子的表达,从而促进动脉粥样硬化发生。在ApoE-/-小鼠中慢病毒过表达及沉默DKK1进一步证实,DKK1促进内皮细胞功能紊乱,促进斑块发生,增加斑块不稳定性。然而,DKK1对血管新生内膜形成的作用及机制尚未深入研究,DKK1受剪切力调节,剪切力干预下内皮细胞分泌的DKK1是否影响平滑肌细胞的功能,亦未见报道。本研究旨在研究剪切力-DKK1在内皮细胞-平滑肌细胞中对平滑肌增殖、迁移和新生内膜形成的影响及其潜在机制。研究目的1.探讨病理剪切力作用于内皮细胞分泌的DKK1是否影响平滑肌细胞的功能;2.检测内皮细胞DKK1蛋白缺失在低剪切力区域对血管新生内膜形成的影响;3.探索内皮细胞DKK1对血管新生内膜形成影响的潜在机制。研究方法1.采用CRISPR/Cas9法建立Tek-Cre-ERT/+/DKK1fl/fl条敲小鼠模型鉴于目前DKK1-/-小鼠胚胎致死,本课题采用CRISPR/Cas9法建立Tek-Cre-ERT/+/DKK1fl/fl（DKK1ECKO）条敲小鼠模型。2.小鼠颈动脉结扎模型的构建8-10周DKK1ECKO条敲小鼠及同窝对照DKK1fl/fl雄性小鼠行左侧颈动脉结扎制备血管低剪切力模型,21天后取材。3.动物取材小鼠麻醉,称量体重,固定。用1ml注射器于心尖取血,后续实验中检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）水平。使用提前预冷的生理盐水充分灌流,留取小鼠心肝脾肺肾,仔细剥离主动脉及两侧颈动脉,根据后续实验分别置于组织固定液或液氮中保存。固定24小时后置于流水下冲洗6-8小时,程序脱水后石蜡包埋,然后做连续切片。4.细胞及组织蛋白提取（全程冰上操作）根据细胞密度每孔加入80-120μl细胞及组织裂解液（RIPA）,每20mg组织加入200μl含PMSF的RIPA（1:100）,充分剪碎组织,冰上静置10min,14000rpm 4℃条件下离心5min,上清加入5×Loading Buffer,99℃10min煮蛋白使其变性,然后置于-20℃冰箱中保存。5.蛋白质印迹法（Western Blot,WB）细胞或组织蛋白上样每孔10-15ul,电泳,转膜,一抗目的分子4℃摇床上孵育过夜,洗膜,根据种属来源孵育相应二抗后ECL化学显影,然后分析条带灰度值。6.组织切片染色颈动脉石蜡切片分别进行H&E染色、免疫组织化学染色及免疫荧光染色。测量结扎处颈动脉新生内膜面积、检测DKK1表达水平、检测PCNA及Ki67等增殖指标的表达水平。7.小鼠原代内皮细胞提取与培养4-5周大小的DKK1ECKO基因敲除小鼠及同窝对照DKK1fl/fl雄鼠用于提取小鼠主动脉内皮细胞、肺动脉内皮细胞。8.人原代平滑肌细胞HASMC以及脐静脉内皮HUVECs的培养内皮细胞和平滑肌细胞均购买于美国ScienCell公司,培养传代。9.细胞共培养本实验中细胞共培养下的剪切力加载系统由3个部分组成:（1）用于内皮细胞-平滑肌细胞联合培养的平行平板流动腔;（2）培养基灌流循环系统;（3）细胞培养箱。给予内皮细胞加载生理剪切力（12dyne/cm2）和病理性低剪切力（4dyne/cm2）。静止状态下的共培养采用Transwell小室,上层接种转染Lenti-GFP-DKK1慢病毒过表达DKK1的内皮细胞,下室接种平滑肌细胞。10.VSMC细胞迁移的检测采用细胞划痕实验评价rDKK1对平滑肌细胞迁移的影响。11.VSMC细胞增殖的检测采用EdU试剂盒检测rDKK1对平滑肌细胞增殖的影响。12.统计分析实验数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 17.0软件分析数据。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较应用ANOVA单因素方差分析,P<0.05为具有显着统计学差异。研究结果1.病理性低剪切力上调小鼠血管壁细胞中DKK1的表达小鼠体内在血管的平直段,单向的生理性脉冲剪切力起到血管保护作用;主动脉弓小弯侧等处主要为病理性的低剪切力及震荡剪切力,容易导致炎症、氧化应激反应和血栓形成。Western Blot结果显示主动脉弓小弯侧血管组织中DKK1的表达含量较胸主动脉直段显着升高（P<0.05）。说明在体内,自然状态下病理性低剪切力能够促进血管壁细胞中DKK1的表达。为进一步观察病理剪切力对血管壁细胞DKK1表达的影响,对小鼠行左侧颈总动脉结扎建立病理性低剪切力模型。结扎后48小时,通过Western Blot以及免疫荧光双染检测DKK1在血管壁细胞中的表达情况,结果均显示结扎组颈总动脉血管壁细胞中DKK1表达高于假手术组。以上结果说明,在体内病理剪切力能够上调血管壁细胞中DKK1的表达。2.病理性低剪切力干预下内皮细胞DKK1具有旁分泌作用在时间效应实验中,给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力刺激0、1、3、6、12、24h。与对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,内皮细胞中DKK1的mRNA表达上调（p<0.05）,而平滑肌细胞中DKK1的mRNA水平下调（p<0.05）。内皮细胞以及PET膜对侧平滑肌细胞中DKK1蛋白表达均上调（p<0.05）。两种细胞的培养上清中DKK1分泌量增多（p<0.05）。在强度-效应实验中,给予内皮细胞大小为12dyne/cm2的生理剪切力（Normal shear stress,NSS）以及大小为 4dyne/cm2 的病理性低剪切力（Low shear stress,LSS）刺激12小时。结果显示,与对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,内皮细胞中DKK1的mRNA表达上调（p<0.05）,而平滑肌细胞中DKK1的mRNA水平下调（p<0.05）。内皮细胞以及PET膜对侧平滑肌细胞中DKK1蛋白表达均上调（p<0.05）。两种细胞的培养上清中DKK1分泌量增多（p<0.05）。构建带有GFP标签的DKK1过表达慢病毒,转染内皮细胞并构建稳转株。Lenti-DKK1病毒转染的内皮细胞（上室）与平滑肌细胞（下室）共培养,24h后观察下室细胞荧光表达;发现共培养的平滑肌细胞内出现GFP荧光,提示内皮细胞分泌的DKK1可被共培养的平滑肌细胞摄取。3.病理性低剪切力干预下内皮细胞DKK1通过旁分泌作用对平滑肌细胞功能的影响在时间效应实验中,给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力刺激0、1、3、6、12、24h。Western blot检测平滑肌细胞中PCNA的表达水平。结果显示,与0h相比,病理性低剪切力促进平滑肌细胞PCNA的表达,3h开始升高,12h达峰,并持续至24h（p<0.05）。在强度-效应实验中,给予联合培养的内皮细胞大小为12dyne/cm2的生理剪切力（Normal shear stress,NSS）以及大小为4dyne/cm2的病理性低剪切力（Low shear stress,LSS）刺激12小时。结果显示,生理对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,平滑肌细胞中PCNA表达上调（p<0.05）。将前期实验获得的DKK1干扰稳转株内皮细胞与平滑肌细胞联合培养,给予内皮细胞病理性低剪切力刺激12h。Western blot检测平滑肌细胞中PCNA的表达水平。结果提示:干扰内皮细胞的DKK1,病理性低剪切力对平滑肌细胞增殖的促进作用被抑制（p<0.05）。中和抗体封闭实验:在进行剪切力加载前3h,在平滑肌细胞的培养液中加入10μg/ml DKK1的中和抗体。然后给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力12h。结果显示:使用DKK1中和抗体,病理性低剪切力对平滑肌细胞增殖的促进作用被抑制（p<0.05）。重组蛋白刺激实验:用不同浓度的rDKK1（0,25,50,100,150,200ng/ml）对平滑肌细胞进行刺激不同时间（0,1,3,6,12,24h）,增殖的标志物PCNA表达上调（P<0.05）。免疫荧光显示,与Con组相比,rDKK1组Ki67以及PCNA阳性细胞的比率增加。EdU结果:与Con组相比,rDKK1组EdU阳性细胞量升高。结果提示外源性DKK1具有促进平滑肌细胞的增殖作用。4.DKK1内皮条件性敲基因小鼠一般情况检测DKK1ECKO基因敲除小鼠及DKK1fl/fl对照组小鼠的TC、TG、LDL-C及HDL-C的血清水平,均无统计学差异,说明DKK1不影响敲基因小鼠的血脂。5.内皮细胞DKK1蛋白不参与维持小鼠的血管形态DKK1不影响小鼠的血管形态。实验选取未造模的5、6、7周龄DKK1ECKO组及对照组小鼠,每周龄组各3只,行颈动脉H&E染色,结果显示2组小鼠血管形态均正常且无显着差异。6.内皮细胞DKK1蛋白缺失抑制小鼠结扎血管的内膜新生HE染色显示,与同窝对照的小鼠相比,内皮细胞条件性敲除DKK1明显抑制了小鼠颈动脉结扎导致的病理性低剪切力区域的新生内膜形成（P<0.05）。7.内皮细胞DKK1蛋白缺失抑制血管平滑肌细胞的增殖体内EdU以及组织免疫荧光染色显示,内皮细胞条件性敲除DKK1明显抑制血管新生内膜中平滑肌细胞的增殖（P<0.05）。8.血管组织全基因组测序分析（RNA-seq）为了确定DKK1影响血管功能所涉及的分子特征和生物学过程,选取同窝生DKK1ECKO雄性小鼠与DKK1fl/fl雄性小鼠各6只,于8周龄时取材主动脉及颈动脉全长,2只同种小鼠血管为1个样本,进行血管组织全基因组测序分析。测序结果显示基因COX2及转录因子MYB的表达水平有明显差异。9.DKK1通过COX2促进平滑肌细胞的增殖测序结果可知DKK1基因的缺失可以下调COX2的表达。利用Real-time RT-PCR、Western Blot验证,得到的结果与测序结果一致。体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激,COX2表达上调。siRNA转染干扰COX2,然后给与rDKK1刺激12h,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,rDKK1干预下HASMCs中PCNA的表达上调被抑制,说明COX2参与DKK1对平滑肌细胞增殖功能的调节。10.COX2是c-myb的靶基因,DKK1通过c-myb/COX2促进平滑肌细胞的增殖测序结果可知DKK1基因的缺失可以下调c-myb的表达。利用Real-time RT-PCR、Western Blot验证,得到的结果与测序结果一致。体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激c-myb表达水平升高。利用siRNA转染干扰c-myb,然后给与rDKK1刺激6h,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,rDKK1干预下HASMCs中COX2的表达上调被抑制,说明DKK1能够通过c-myb调控COX2的表达。11.DKK1主要通过与平滑肌细胞表面的CKAP4受体结合,通过PI3K/AKT通路促进平滑肌细胞的增殖利用siRNA转染干扰DKK1的常见受体LRP6以及CKAP4,然后给予人重组蛋白DKK1干预12h,敲除受体CKAP4可显着抑制DKK1对平滑肌细胞增殖的促进作用（P<0.05）。AKT是受体CKAP4的下游通路,使用AKT通路的抑制剂可阻断外源性DKK1对平滑肌细胞增殖的促进作用,也可阻断DKK1对c-myb的促表达作用（P<0.05）。结论1.病理性低剪切力可增加内皮细胞分泌DKK1并促进平滑肌细胞的增殖;2.内皮细胞DKK1促进小鼠血管结扎导致的低剪切力作用区域新生内膜的形成;3.DKK1可通过c-myb/COX2促进平滑肌细胞的增殖。研究背景心血管疾病是人类死亡的主要原因,高血压是心血管疾病的主要危险因素。高血压常常伴随血管壁的机械力异常,包括牵张力和剪切力,而牵张力增加是主要的力学改变。牵张力的异常可引起血管壁细胞的形态和功能改变,从而造成血管结构和功能异常,促进动脉粥样硬化斑块形成、血管增生、动脉瘤,并加重高血压靶器官损害。因此,进一步研究明确高血压的发生和致病机制,对于减少心血管病事件具有重要意义。肾素-血管紧张素（RAS）系统在心血管疾病的发生发展中发挥重要作用,血管紧张素转化酶2（ACE2）是其关键组分之一。近年来,大量研究研究表明ACE2对心血管具有广泛的保护作用。ACE2是ACE的同源物,但在底物特异性上与ACE不同,ACE2能够裂解AngⅡ并产生血管扩张肽Ang（1-7）。ACE2在多种心血管疾病如心力衰竭、腹主动脉瘤和糖尿病肾病以及心脏纤维化等中发挥重要保护作用。我们实验室前期研究表明在ApoE-/-小鼠中慢病毒过表达及沉默ACE2进一步证实,ACE2能够抑制斑块发生发展,增加斑块稳定性。Dickkopf-1（DKK1）是一种多功能的分泌蛋白,Wnt信号通路抑制剂,最初在肿瘤学研究中发现DKK1在肺癌、结肠癌等肿瘤的发生起重要作用,并作为药物开发靶点进行二期临床研究。近期临床研究表明,DKK1与心血管疾病关系密切。我们课题组前期研究发现,不良心血管事件发生率随DKK1水平升高增加,DKK1联合hs-CRP与GRACE危险评分可以提高对ACS患者再发心血管事件的预测价值;进一步研究证明DKK1能够促进斑块形成,增加斑块不稳定性。近期研究发现DKK1参与牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用,进而参与到牵张力对平滑肌细胞功能的影响和血管壁重构,但机制尚未见报道。关于机械刺激调节血管细胞中ACE2表达的机制尚需深入研究。牵张力是否通过调控平滑肌细胞DKK1从而影响ACE2的表达,进而影响平滑肌细胞的功能,亦未见报道。研究目的1.明确病理性牵张力对平滑肌细胞ACE2、DKK1表达的影响;2.探讨ACE2对病理牵张力诱导的的人主动脉平滑肌细胞功能影响;3.探讨DKK1在牵张力调控平滑肌细胞ACE2表达中的作用。研究方法1.人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）的培养与处理人主动脉平滑肌细胞均购买于美国ScienCell公司,培养传代。2.动物模型的建立与取材对大鼠行腹主动脉缩窄术建立病理牵张力模型,随机分为腹主动脉缩窄组和假手术对照组,造模后3、5及7天后取材。将大鼠麻醉,称量体重后将其固定于泡沫板上。使用提前预冷的生理盐水充分灌流,留取小鼠心肝脾肺肾,仔细剥离主动脉及两侧颈动脉,根据后续实验分别置于组织固定液或液氮中保存。固定24小时后置于流水下冲洗6-8小时,程序脱水后石蜡包埋,然后做连续切片。3.细胞及组织蛋白提取（全程冰上操作）根据细胞密度每孔加入80-120μ1细胞及组织裂解液（RIPA）,每20mg组织加入200μl含PMSF的RIPA（1:100）,充分剪碎组织,冰上静置10min,14000rpm 4℃条件下离心5min,上清加入5×Loading Buffer,99℃ 10min煮蛋白使其变性,然后置于-20℃冰箱中保存。4.蛋白质印迹法（Western Blot）细胞或组织蛋白上样每孔10-15ul,电泳,转膜,一抗目的分子4℃摇床上孵育过夜,洗膜,根据种属来源孵育相应二抗后ECL化学显影,然后分析条带灰度值。5.酶联免疫吸附测定（ELISA）牵张力加载结束后,收集不同组中平滑肌细胞的培养上清液,ELISA法检测上清中DKK1,Ang1-7及Ang Ⅱ的含量。6.EdU检测平滑肌细胞增殖采用EdU试剂盒检测ACE2在调节病理牵张力调节平滑肌细胞增殖中的作用。7.细胞划痕实验用细胞划痕实验检测ACE2在病理牵张力调节平滑肌迁移中的作用。8.流式细胞术检测细胞凋亡采用Annexin V/PI染色,通过流式细胞术检测ACE2在介导病理牵张力调节平滑肌细胞凋亡中的作用。9.细胞转染利用 Invitrogen 公司的 Lipo3000 分别转染DKK1 siRNA、ATF3 siRNA、Negtive control siRNA,检测ACE2的表达变化,验证DKK1及ATF3是否参与病理牵张力对ACE2的表达调节。10.双荧光素酶报告实验分别构建不同长度的ACE2启动子序列。将ATF3过表达质粒或ATF3 siRNA和ACE2启动子序列共转染HEK293工具细胞,双荧光素酶报告实验检测荧光表达强度。明确ATF3与ACE2基因的启动子结合。11.组织切片染色腹主动脉切片分别进行苏木素-伊红染色（H&E）、免疫组织化学染色。检测DKK1、ACE2表达水平。同时观察人体组织的血管,比较高血压与非高血压血管ACE2与DKK1的表达。12.人体血管组织的获取研究方案由山东大学齐鲁医院科研伦理委员会批准科研伦理号:KYLL-2021-121。13.统计分析实验数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 17.0软件分析数据。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较应用ANOVA单因素方差分析,P<0.05为具有显着统计学差异。结果1.在体大鼠腹主动脉缩窄影响ACE2和DKK1的表达免疫组化与Western Blot结果均显示:与假手术组相比,大鼠腹主动脉缩窄后,血管壁细胞中ACE2表达下降（P<0.01）,DKK1以及ACE表达升高（P<0.01）。2.在高血压患者观察血管壁ACE2、DKK1的表达情况人体血管免疫组化染色显示:高血压患者血管壁平滑肌细胞中的ACE2表达均显着降低,DKK1的表达明显升高。3.病理牵张力调节血管平滑肌细胞中DKK1,ACE2/Ang-（1-7）和ACE/AngⅡ的表达给予平滑肌细胞不同时间（0,3,6,12,24h）18%机械牵张力刺激,同0h相比,18%机械牵张力能够抑制ACE2的表达（p<0.05）;促进ACE以及DKK1的表达（p<0.05）。18%机械牵张力促进AngⅡ及DKK1分泌（P<0.01）,抑制Ang（1-7）分泌（P<0.01）。4.ACE2对病理牵张力诱导的的人主动脉平滑肌细胞功能影响通过EdU检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞增殖的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的增殖（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞增殖（P<0.05）;通过细胞划痕实验检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞迁移能力的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的迁移（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞迁移（P<0.05）;通过流式细胞术检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞凋亡的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的凋亡（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞凋亡（P<0.05）;通过Western Blot检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞胶原合成的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞胶原Ⅰ,胶原Ⅲ的表达（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞胶原Ⅰ,胶原Ⅲ的合成（P<0.05）:5.病理牵张力通过p38/DKK1调控ACE2的表达为了探讨DKK1是否参与病理牵张力对人主动脉平滑肌细胞中ACE2的调节作用,利用小干扰转染干扰DKK1表达,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,病理牵张力干预下HASMCs中ACE2的下调被抑制（p<0.05）。给予平滑肌细胞抗DKK1中和抗体处理,也可抑制病理性牵张力对平滑肌细胞中ACE2的下调。以上结果提示,DKK1参与介导病理牵张力对平滑肌细胞中ACE2的表达调节（p<0.05）。病理牵张力诱导p38 MAPK、JNK和ERK1/2磷酸化（P<0.05）。p38 MAPK抑制剂SB203580显着减弱了病理牵张力诱导的ACE2下调（P<0.05）。给予平滑肌细胞病理牵张力刺激时,DKK1表达增加,SB203580阻断了病理牵张力对DKK1的上调作用（P<0.05）。以上结果提示,病理牵张力通过p38 MAPK促进DKK1的表达与分泌,进而调控ACE2的表达。6.病理牵张力通过ATF3调控ACE2的表达给予平滑肌细胞病理牵张力刺激时,ATF3表达增加,免疫荧光染色显示18%病理牵张力促进ATF3的核转位。利用小干扰转染干扰ATF3的表达,发现ATF3的敲低逆转了病理牵张力下调的 ACE2 水平（P<0.05）。以上结果提示,病理牵张力促进ATF3的表达增高,并促进转位进入细胞核来调控ACE2的表达。7.外源性DKK1可通过ATF3调控ACE2的表达使用体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组 DKK1 蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激。与 0h 相比,rDKK1 刺激 6h 后 ACE2蛋白表达水平即明显下调,持续至24h（p<0.05）。使用体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、15、30、60、120、180min）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激。由于ATF3是一种快速反应蛋白,因此我们使用较短的时间梯度。与0h相比,rDKK1刺激15min即可明显促进ATF3的表达,30min达到高峰（p<0.05）。然后,利用小干扰转染干扰ATF3的表达,发现ATF3的敲低逆转了 DKK1下调的ACE2水平（P<0.05）。8.ACE2是ATF3的靶基因为了进一步确定ATF3是否直接能够调节ACE2的表达,我们利用JASPAR数据库（jaspar.genereg.net）分析了 ACE2启动子序列区域中ATF3潜在的结合位点。双荧光素酶基因报告实验证实,ATF3可调控ACE2的转录活性。ChIP实验结果进一步验证了 ATF3与ACE2基因的这个转录区域结合。结论1.病理性牵张力促进血管平滑肌细胞DKK1表达,抑制ACE2表达;2.ACE2参与病理性牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移等功能的作用;3.病理性牵张力可通过促进平滑肌细胞DKK1的分泌进而抑制ACE2的表达;4.病理牵张力通过p38/DKK1/ATF3调控ACE2的表达,ACE2是转录因子ATF3的靶基因。
郑腾飞[3]（2021）在《DKK1在机械牵张力调节血管平滑肌细胞功能和血管重构中的作用及机制研究》文中研究说明1 研究背景病理性的机械牵张力可导致心脏和血管重构,包括心肌肥大、心肌纤维化、心力衰竭、血管壁增厚和硬化以及动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）。血管中膜的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）在维持血管稳态中发挥重要作用,主要受到牵张力调控。病理性牵张力可以促使VSMCs从收缩表型向合成表型转换,表现为细胞增殖和迁移活性增强,收缩能力减弱以及细胞外基质分泌增加。然而,牵张力调节VSMCs功能的分子机制仍有待进一步阐明。机械牵张力调控平滑肌细胞基因表达及细胞功能需要将机械力转换为细胞内部信号,这个过程需要位于细胞膜表面及细胞内部的分子和细胞结构的介导。既往研究表明,初级纤毛、整合素、离子通道、钙黏蛋白以及近年报道的细胞核膜蛋白等参与了力学刺激向平滑肌细胞内部的信号转导。其中研究较为深入的是整合素家族,整合素β3亚基可介导病理性牵张力促平滑肌细胞增殖和表型转换的作用。Dickkopf-1（DKK1）是一种分泌型糖蛋白,是Dickkopf家族中最早被发现的成员。DKK1的经典作用是可阻断经典Wnt通路。除此之外,DKK1还可调控非β-连环蛋白（β-catenin）依赖的Wnt通路。另一方面,DKK1还可以结合细胞膜上的细胞骨架关联蛋白4（CKAP4）,激活PI3K/AKT通路发挥生物学作用。DKK1早期在肿瘤中研究得比较深入,目前已经有多项临床试验研究以DKK1作为肿瘤的治疗靶点。近年研究也证明DKK1在心血管疾病发生发展中发挥重要作用。DKK1参与动脉粥硬化发生发展的研究较为明确,本课题组既往研究发现DKK1介导病理性剪切力导致的AS。但其是否参与其他类型的血管重构及其可能机制研究相对较少,DKK1是否介导病理性牵张力导致的血管重构尚无报道。进一步揭示DKK1在心血管疾病发展中的作用及机制,对于研发和应用DKK1相关的抗肿瘤和心血管疾病的药物以及防治肿瘤治疗带来的心血管损害具有重要意义。2 研究目的（1）明确不同机械牵张力对血管平滑肌细胞DKK1表达的调控作用;（2）探讨DKK1在病理性牵张导致的血管重构中的作用。3 研究方法3.1 小鼠腹主动脉缩窄（AAC）模型的构建使用手术缝线在肾动脉以上水平部分结扎小鼠腹主动脉以构建病理性牵张力刺激的动物模型。3.2 构建平滑肌细胞特异性DKK1敲除小鼠将Dkk1flox/flox小鼠与SM22-Cre小鼠交配,F1代互相杂交得到Dkk1flox/floxSM22-Cre+小鼠,即为平滑肌细胞特异性DKK1敲除小鼠。该小鼠被命名为Dkk1SMKO小鼠。3.3 心率和血压测量小鼠的基线心率和血压使用自动血压分析系统通过鼠尾袖带法测量。AAC手术组和假手术组小鼠的血压用插入左颈动脉的Millar导管测量。3.4 超声心动图评价小鼠心功能使用Vevo 2100成像系统对小鼠进行超声心动图检查。异氟醚妥善麻醉后测量小鼠左心室分数缩短率（FS,%）和射血分数（EF,%）以评价收缩心脏功能,通过组织多普勒超声测量E/E’评价舒张功能。3.5 动物取材及病理组织学检测小鼠麻醉后心尖取血,分离血清,检测DKK1水平。取材小鼠心脏和主动脉全长。小鼠胸主动脉及心脏固定后石蜡包埋切片后行HE染色观察形态,免疫荧光染色检测小鼠胸主动脉及冠脉中DKK1、PCNA、α-SMA表达水平。3.6 蛋白质印迹法（Western Blot,WB）组织或HASMCs裂解后提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度后加入5×上样缓冲液,煮沸变性。按照蛋白总量10μg/孔上样,凝胶电泳后,应用电转法将蛋白转印到膜上。膜经过封闭后孵育一抗4℃过夜,次日充分洗膜3次,在室温下孵育二抗1小时。应用化学发光法检测蛋白信号,拍照,分析条带灰度值。3.7 平滑肌细胞培养原代人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）使用SMCM培养基培养,选取4-6代进行细胞实验。采用组织贴块法提取小鼠原代主动脉平滑肌细胞,使用含10%血清的DMEM培养基培养,选用4-6代细胞进行实验。3.8 体外牵张力刺激使细胞生长于包被有Ⅰ型鼠尾胶原的Bioflex板底部,加载于FX5000-Tension系统中对细胞施加周期性机械牵张力刺激。生理性牵张力刺激:5%延伸幅度,1Hz（60次/分钟）;病理性牵张力刺激:18%延伸幅度,1Hz（60次/分钟）。3.9 小干扰RNA与转染利用lipo2000转染目的基因的siRNA和对照siRNA,依照实验分组给予刺激,转染48h后进行下一步实验。3.10 EdU细胞增殖实验按照试剂盒说明书操作,细胞上清中加入10μM的EdU溶液,孵育6小时后固定细胞,经通透化处理后加入配好的Apollo染色液避光染色30分钟,充分洗涤后,复染细胞核。荧光显微镜下观察、拍照。3.11 CCK-8细胞增殖实验细胞上清中加入CCK-8溶液,细胞培养箱内孵育2-3小时,随时观察上清颜色变化,使用酶标仪在450nm波长测定吸光度。3.12细胞周期检测使用细胞周期检测试剂盒检测细胞周期。将HASMCs用胰酶消化,离心并用预冷PBS洗涤细胞1次,使用预冷的70%乙醇在4℃下固定过夜。然后用PBS洗涤细胞两次,加入碘化丙啶在37℃下避光染色30分钟。过滤细胞并在流式细胞仪的FL2通道中进行分析。3.13 Transwell细胞迁移实验使用具有8μm孔径的24孔插件进行Transwell实验。上室中加入200μl含有2×104个VSMCs的无血清SMCM,下室中加入600μl的含10%血清的SMCM。6小时后,将穿透至膜底的细胞固定,用结晶紫染色,并在显微镜下拍照。3.14 ELISA细胞上清和小鼠血清应用人和小鼠DKK1的ELISA试剂盒检测DKK1浓度。3.15 统计分析数据以均数±标准误表示,以Prism 6软件行数据统计分析。所有数据经过正态性检验,符合正态分布的使用非配对t检验分析两样本间差异,单因素方差分析和双因素方差分析检测多个样本间差异,然后进行Turkey事后检验。不符合正态分布的使用非参数检验。P<0.05为有显着统计学差异。4 研究结果4.1 AAC术后小鼠动脉平滑肌细胞中的DKK1表达增加AAC小鼠的收缩压（SBP）和舒张压（DBP）明显高于假手术对照组。免疫荧光实验结果显示,与假手术对照组相比,AAC小鼠术后1周胸主动脉和冠状动脉的中膜中检测到DKK1蛋白水平显着增加。胸主动脉组织蛋白行Western blot分析显示,AAC小鼠中DKK1的相对蛋白表达水平明显增加。4.2 平滑肌细胞特异性DKK1敲除小鼠构建及验证荧光双标检测到动脉中膜平滑肌DKK1敲除效率满意。分别提取对照和Dkk1SMKO主动脉组织蛋白和原代主动脉平滑肌细胞,经Western blot分析显示DKK1敲除效果良好。Dkk1SMKO与对照组小鼠在体重、血压、心率方面均无显着差异。4.3 平滑肌细胞特异性敲除DKK1改善AAC导致的血管重构将Dkk1SMKO小鼠与同窝生Dkk1flox/flox对照小鼠构建AAC模型,并设置假手术对照。术后3周取材,石蜡切片HE染色显示与Dkk1flox/flox对照小鼠相比Dkk1SMKO小鼠AAC术后3周胸主动脉和冠状动脉动脉中膜增厚明显减轻（P<0.05）。与Dkk1flox/flox对照小鼠相比,Dkk1SMKO小鼠AAC术后3周胸主动脉和冠脉中PCNA表达量明显减少,α-SMA表达量明显增高（P<0.05）。平滑肌细胞特异性敲除DKK1对AAC术导致的小鼠心脏增大和心功能改变没有明显影响。4.4病理性牵张力刺激促进平滑肌细胞中DKK1表达用病理性牵张力（18%）处理HASMCs不同持续时间（0、3、6、12或24小时）,HASMCs和细胞上清液都表现出DKK1蛋白水平的时间依赖性增加,并在6小时差异到达统计学意义,而在5%循环拉伸下HASMCs的DKK1蛋白水平无明显变化。静止、生理性（5%）或病理性牵张力（18%）处理HASMCs持续6小时,DKK1的蛋白水平在病理性牵张力处理的细胞中显着升高（P<0.05）。后续研究DKK1表达变化实验选择6小时作为机械牵张力刺激持续时间。4.5 整合素亚基β3介导机械拉伸对DKK1的调节Western blot、ELISA和RT-qPCR分析表明,在病理性牵张力刺激下,用siRNA干扰整合素亚基β3（ITGB3）表达。与对照组相比,干扰ITGB3表达组的DKK1蛋白水平、mRNA水平和分泌水平均明显下调（P<0.05）。4.6 DKK1介导病理性牵张力刺激调控平滑肌细胞功能在HASMCs转染DKK1 siRNA或对照siRNA后,用生理性或病理性牵张力刺激HASMCs 24hr。EdU和CCK-8实验表明,18%的牵张力刺激显着促进了HASMCs的增殖,而干扰DKK1表达可部分逆转这一作用（P<0.05）。细胞周期分析发现,干扰DKK1表达使G0-G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少（P<0.05）。同样,Transwell测定结果显示,DKK1 siRNA组迁移到下腔的细胞数量明显低于对照组（P<0.05）。提取细胞全蛋白行Western blot分析显示,与生理性牵张力处理相比,病理性牵张力上调了 PCNA的蛋白水平,下调了 α-SMA的蛋白水平（P<0.05）,干扰DKK1的表达可部分逆转这一作用。给予HASMCs外源性重组DKK1刺激促进了细胞的增殖和迁移,促进了 PCNA的表达,抑制了 α-SMA的表达（P<0.05）。5结论（1）人血管平滑肌细胞中DKK1表达受机械牵张力调控,病理性牵张力促进平滑肌细胞DKK1表达;（2）DKK1介导了机械牵张力调控血管平滑肌细胞的增殖和迁移功能;（3）平滑肌细胞敲除DKK1可减轻病理性牵张力导致的动脉中膜增厚,降低中膜平滑肌细胞增殖,改善中膜平滑肌细胞收缩表型的异常。1 研究背景Dickkopf-1（DKK1）蛋白,是一种分泌性糖蛋白。它最为人们熟知的作用是与Wnt分子竞争受体LRP5/6以及促进LRP5/6内吞降解进而拮抗经典Wnt/β-catenin通路。DKK1还能通过调控一些非β-catenin依赖的途径影影响细胞增殖、迁移、凋亡及炎症反应,如非经典Wnt通路等。DKK1还可与CKAP4结合,激活PI3K/AKT通路,促进肿瘤细胞增殖。因其在多种病理过程中的重要作用,DKK1成为一种有前景的药物开发靶点。在心血管疾病中,DKK1同样扮演重要角色,在内皮细胞功能失调以及动脉粥样硬化当中的作用已经得到证实。但是DKK1在平滑肌细胞功能失调和其他类型的血管重构中的作用仍有待研究。更加详细地阐明DKK1在心血管疾病中的作用及其机制对于指导靶向DKK1药物的开发和应用具有重要意义。在本研究第一部分,我们发现,敲除小鼠平滑肌中的DKK1可明显抑制病理牵张力所导致的血管重构。体外研究同样证实,干扰DKK1的表达可以显着抑制病理性牵张力导致的平滑肌细胞功能失调,包括增殖、迁移活性的增加以及收缩表型标记物的降低。然而,DKK1通过怎样的途径介导了机械牵张力调控平滑肌细胞的功能尚需进一步探讨。2研究目的（1）确定参与DKK1调控血管平滑肌功能的下游靶标;（2）揭示DKK1调控该靶标的信号通路和分子机制。3 研究方法3.1 细胞培养原代人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）使用SMCM培养基培养,选取4-6代进行细胞实验。293T细胞和原代小鼠主动脉平滑肌细胞在DMEM培养基中培养。3.2 质粒构建与转染分别构建含有野生型UHRF1启动子区、突变型UHRF1启动子区的萤光素酶报告基因质粒（pGL3）:UHRF1-WT和UHRF1-MUT。构建PCDNA3.1-YAP过表达质粒质粒,空白载体质粒PCDNA3.1。质粒使用Lipofectamine3000转染试剂进行瞬时转染。3.3 小干扰RNA与转染利用lipo2000转染目的siRNA和对照siRNA,依照实验分组给予刺激,转染48h后进行下一步实验。3.4 实时定量 PCR（RT-qPCR）用试剂盒提取细胞的总RNA,反转录为cDNA后,使用SYBR Green进行RT-qPCR。采用2-ΔΔCT方法测定相对基因表达。CT值以甘油醛酸-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为对照进行归一化。3.5 体外牵张刺激使细胞生长于包被有Ⅰ型鼠尾胶原的Bioflex板底部,于FX5000-Tension系统中对细胞施加牵张力刺激。生理性牵张刺激:1Hz（60个循环/分钟）,5%elongation;病理性牵张刺激:1Hz（60个循环/分钟）,18%elongation。3.6 EdU细胞增殖实验按照试剂盒说明书操作,细胞上清中加入10μM的EdU溶液,孵育6小时后固定细胞,经通透化处理后加入配好的Apollo染色液避光染色30分钟,充分洗涤后,使用Hoechst 33342染核,荧光显微镜下观察拍照。3.7 CCK-8细胞增殖实验细胞上清中加入CCK-8溶液,细胞培养箱内孵育2-3小时,待出现明显颜色变化后,在450nm波长处测定吸光度。3.8 Transwell 细胞迁移实验使用具有8μm孔径的24孔插件进行Transwell实验。将含有10%FBS的600μl SMCM培养基加入Transwell小室的下室,上室中加入200ul含有2×104个VSMCs无FBS的SMCM培养基加入上室。6小时后,将穿透至膜底的细胞固定,用结晶紫染色,并在显微镜下拍照。3.9 组织学检测新鲜组织在4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,切片。石蜡切片脱蜡至水。用免疫荧光染色法检测小鼠胸主动脉和冠状动脉中YAP的表达水平,用免疫组化染色法检测UHRF1的表达水平。3.10 蛋白质印迹法（Western Blot,WB）组织或HASMCs裂解后提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度后加入5×上样缓冲液,煮沸变性。按照蛋白总量10μg/孔上样,凝胶电泳后,应用电转法将蛋白转印到膜上。膜经过封闭后孵育一抗4℃过夜,次日充分洗膜3次,在室温下孵育二抗1小时。应用化学发光法检测蛋白信号,拍照,分析条带灰度值。3.11染色质免疫沉淀法用1%甲醛交联HASMCs,然后加入125mM甘氨酸。洗涤后,将细胞收集在离心管中,超声处理,用正常IgG、抗组蛋白H3、抗TEAD1和抗TEAD4抗体免疫沉淀,4℃过夜。洗脱和解交联后纯化DNA,并用覆盖UHRF1启动子特定区域的引物进行PCR分析。3.12萤光素酶报告基因检测将Renilla报告基因下游的野生型和突变型UHRF1-启动子克隆到PGL-3质粒中,并使用Lipofectamine 3000转染到YAP1过表达的293T细胞和对照293T细胞中。转染48小时后用双萤光素酶报告试剂盒分析荧光素酶活性。3.13统计分析数据以均数±标准误表示,以Prism 6软件行数据统计分析。所有数据经过正态性检验,符合正态分布的使用非配对t检验分析两样本间差异,单因素方差分析和双因素方差分析检测多个样本间差异,然后进行Turkey事后检验。不符合正态分布的使用非参数检验。P<0.05为有显着统计学差异。4研究结果4.1经典Wnt通路不参与DKK1在VSMCs中的作用用FH535对HASMCs进行预处理,不影响DKK1-siRNA转染导致的PCNA表达下调和α-SMA表达上调。EdU实验、CCK-8实验和Transwell实验也表明,用FH535预处理HASMCs不影响DKK1-siRNA转染导致的HASMCs细胞增殖和细胞迁移能力的下调。4.2 UHRF1的表达受DKK1调控UHRF1的蛋白水平在病理性牵张刺激下显着增加,而在生理性牵张刺激下无明显变化。在病理性牵张刺激下,通过转染siRNA干扰DKK1的表达后,UHRF1的mRNA和蛋白水平显着下调。此外,rhDKK1刺激显着增加HASMCs中UHRF1的表达。免疫组化和Western印迹分析显示,AAC增加了主动脉和冠状动脉中膜中UHRF1的表达,这种变化在Dkk1SMKO小鼠中明显减弱（P<0.05）。提取对照小鼠和Dkk1SMKO小鼠主动脉平滑肌细胞,体外培养后提取细胞全蛋白,发现敲除DKK1的小鼠主动脉平滑肌细胞中UHRF1蛋白水平显着降低。4.3 UHRF1介导了DKK1对HASMCs增殖和迁移功能的作用用siRNA干扰UHRF1 48小时后给予HASMCs以rhDKK1刺激的同时分别施加生理性牵张（5%）、病理性牵张（18%）刺激24小时。结果发现干扰UHRF1表达显着减弱了在rhDKK1刺激的HASMCs中观察到的细胞增殖和迁移的增加（P<0.05）。Western blot分析表明,干扰UHRF1表达后PCNA的蛋白水平明显下降,α-SMA的蛋白水平上升。4.4 DKK1 通过 YAP/TEAD 途径调控 UHRF1Western blot分析表明,病理性牵张减少了 YAP在Ser127处的磷酸化,干扰DKK1表达后,YAP的磷酸化增强（P<0.05）。用rhDKK1处理后,HASMCs中YAP在Ser127处的磷酸化也减少（P<0.05）。此外,免疫荧光结果证实DKK1敲除后明显降低了核YAP的定位。当用维替泊芬（VP）破坏YAP-TEAD的相互作用或用小干扰RNA干扰YAP在HASMCs中表达时,UHRF1的mRNA和蛋白水平明显下降（P<0.05）。Western blot分析显示,与假手术的小鼠主动脉相比,AAC小鼠主动脉表现出更高的YAP蛋白水平,敲除DKK1可以降低AAC诱导的YAP上调（P<0.05）。免疫荧光显示AAC增加了血管平滑肌细胞核中YAP阳性的比例。而在Dkk1SMKO小鼠中,这一比例显着降低。VP处理显着逆转了rhDKK1在HASMCs中的作用,导致HASMCs中UHRF1和PCNA表达减少,α-SMA表达增加。4.5 YAP/TEAD通路调控UHRF1表达的分子机制通过使用JASPAR数据库预测到TEAD蛋白家族成员可直接与UHRF1启动子区域结合。干扰TEAD1和TEAD4的表达,UHRF1 mRNA明显下调（P<0.05）。当同时敲除TEAD1和TEAD4时,UHRF1蛋白的减少比单独的siRNA处理更加明显（P<0.05）。此外,染色质免疫共沉淀（ChIP）实验表明,在UHRF1基因ATG上游275 bp和229 bp之间检测到TEAD1和TEAD4的富集。双萤光素酶实验数据证实,YAP过表达可显着激活野生型UHRF1启动子萤光素酶活性,而干扰TEAD1和TEAD4的表达可抑制这种激活（P<0.05）;YAP过表达可显着激活野生型UHRF1启动子萤光素酶活性,但不能激活结合位点突变的UHRF1启动子萤光素酶活性（P<0.05）。5结论（1）UHRF1参与DKK1对平滑肌细胞增殖和迁移功能的调控;（2）在机械牵张力刺激下,DKK1通过YAP/TEAD通路平滑肌细胞调控UHRF1的表达。
刘源[4]（2021）在《和厚朴酚抑制载脂蛋白E基因缺陷小鼠颈动脉动脉粥样硬化形成的作用机制研究》文中研究指明目的:动脉粥样硬化（AS）是一种慢性炎症性疾病,通常累及大、中动脉的血管壁。其病理特征包括脂质沉积、单核/巨噬细胞浸润、泡沫细胞形成、血管平滑肌细胞分化增生迁移和胶原纤维增生。几十年来,AS的形成机制一直存在争论,目前认为氧化应激、内皮功能障碍、炎症反应和免疫调控异常,均参与其形成。氧化应激反应被认为参与AS病理发展的全程。活性氧物质的过度生成,导致氧化和抗氧化作用的失衡,从而诱发内皮细胞损伤,并激活单核细胞成为巨噬细胞。同时,过量的活性氧物质,还能够诱导血管平滑肌细胞的增殖和迁移,并诱发内膜增生。活性氧的所有这些作用都促进了AS的进展。一氧化氮（NO）作为一种重要的生物活性分子,广泛存在于各种细胞和组织中,被认为是内皮功能障碍的标志。在生理条件下,NO发挥调节血管平滑肌松弛、抑制血小板聚集、降低肺循环阻力等各方面的作用;但在病理条件下,过量的NO可能引起组织器官损伤。在AS进展过程中,大量的NO由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）合成,两者在AS形成过程中发挥重要作用。在AS的形成和发展过程中,炎症反应也发挥着重要的作用,其作用通过多种细胞因子完成,如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和IL-1β。TNF-α是常见的一种炎性细胞因子,在AS病变中高度表达;IL-6也是一种经典的炎性细胞因子,在AS斑块局部显着上调;另外,IL-1β也被证明在AS中起着重要作用。Toll样受体（TLR）作为初始免疫反应的“感受器”,在炎症性疾病（包括AS过程）的发病机制中发挥关键作用。它们由多种免疫细胞表达,能够识别病原体相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP）。TLR4在富含脂质和AS斑块中均有表达。在TLR2-/-和TLR4-/-小鼠中,AS相关炎症反应减少。TLR与下游衔接分子结合,激活核因子-κB（NF-κB）通路,并通过各种机制与AS的发展相关。核因子NF-κB是一种能够调节各种炎症相关基因表达的转录因子。在正常情况下,NF-κB与其抑制蛋白IκBα结合,以无活性的状态存在于细胞质中。在受到各种刺激作用中,NF-κB易位进入细胞核,并与靶基因的启动子结合以促进其表达。既往研究表明,在AS发生发展过程中,NF-κB在炎症介质表达的调节中扮演重要角色。他汀类药物是羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-Co A）还原酶的选择竞争性抑制剂,其所具有的调控血脂及预防AS性心脑血管意外的作用,已被大量研究证实。然而,随着他汀类药物的广泛应用,临床上发现许多他汀相关副作用,如横纹肌溶解、新发糖尿病和出血性中风等。虽然,这并不影响其在预防心、脑源性卒中方面的价值,但进一步深入研究AS发生发展的相关机制,并据此开发新型药物补充现有控制AS的临床药物,仍具有现实意义。和厚朴酚（Honokiol,HNK）是从中草药厚朴中提取的天然活性化合物,具有抗炎、抗血栓、抗肿瘤等多种药理活性。最近的一系列研究也表明,HNK可能具有抗AS的潜力。因此,在本研究中,我们通过构建载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠颈动脉AS模型,首次在体内对比研究HNK与他汀类药物对AS形成发展相关机制的影响,并首次证实HNK具有抑制AS形成发展的作用。研究方法:30只6周龄的雄性ApoE-/-小鼠被分为5组。其中1组6只,喂以正常饮食（ND）;另外4组中的24只,喂以高脂饮食（WD）,共计10周。高脂饮食喂养两周后,通过手术在右颈总动脉周围置入套管,以加速AS病变的进展。随后,将高脂饮食小鼠随机分为4组,分别给予腹腔注射溶媒（200μl玉米油）、10 mg/kg HNK、20 mg/kg HNK和经口10 mg/kg阿托伐他汀（atorvastatin,ATV）灌胃8周。对正常饮食小鼠和经口10 mg/kg ATV组小鼠采用同样的方法,给与腹腔内注射载体（200μl玉米油）。手术8周后,切除右颈总动脉,部分组织固定在10%甲醛中,部分组织在液氮中快速冷冻进行下一步测试。为了确定和厚朴醇对AS斑块进展的影响,我们分别用HE染色、Masson三色染色和α-SMA免疫组化染色法,分别检查颈动脉AS形成程度、胶原纤维增生情况和血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖、迁移及功能状态。我们应用活性氧物质（ROS）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒和NO测定试剂盒,进一步研究了HNK对颈动脉组织中ROS生成、SOD活性和NO合成的影响。同时,我们采用实时聚合酶链反应（PCR）法,检测颈动脉组织中的m RNA表达,研究了HNK对TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS表达的影响。此外,还利用Western blot分析法,研究了iNOS、TLR2、TLR4,以及典型NF-κB信号通路的构成成分蛋白的表达。此外,应用EMSA试剂盒,对NF-κB的DNA结合活性进行了检测。所有统计分析均采用单因素方差分析（ANOVA）,然后采用Graph Pad Prism 5软件进行纽曼-凯尔斯多重比较试验。P值小于0.05时,有统计学意义的差异。结果:高脂饮食及颈动脉套管,能够显着增加ApoE-/-小鼠颈动脉动脉组织中,ROS的合成和SOD的消耗、iNOS基因的表达其合成NO的含量、炎性细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达、TLR2和TLR4的表达、胞浆内p-IκBα和胞核内NF-κB p65的蛋白表达水平、NF-κB的DNA结合活性以及降低胞浆内IκBα和NF-κB p65的蛋白表达水平,从而激发氧化应激、血管内皮功能障碍、炎症细胞因子表达、初始免疫应答和NF-κB信号通路系统,导致AS形成发展过程中的一系列病理改变,如脂质沉积、巨噬/泡沫细胞聚集、胶原纤维异常增生、血管平滑肌细胞分化增殖和迁移等。而HNK和ATV,可以在一定程度上,减缓上述变化的进展。1.HNK减轻ApoE-/-小鼠颈AS斑块的形成。（1）10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着减小斑块负荷（p值分别为:p<0.05、p<0.0001和p<0.0001）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p<0.0001）,而20mg/kg HNK与10mg/kg ATV作用相当（p>0.05）。（2）20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着抑制血管平滑肌细胞合成胶原纤维（p值分别为:p<0.001和p<0.0001）。其中,10mg/kg ATV与20mg/kg HNK作用相当（p>0.05）,但强于10mg/kg HNK（p<0.05）。（3）20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着抑制血管平滑肌细胞增殖分化和迁移（p值均<0.05）。其中,20mg/kg HNK与10mg/kg ATV作用相当（p>0.05）,且似乎均强于10mg/kg HNK,但各自间没有明显统计学差异。2.HNK抑制AS血管壁中的氧化应激反应。（1）20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着降低ROS的含量（p值均<0.05）,甚至达到正常饮食组水平（p值均>0.05）。其中,20mg/kg HNK与10mg/kg ATV作用相当（p>0.05）,且似乎均强于10mg/kg HNK,但各自间没有明显统计学差异。（2）20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着减少SOD的消耗（p值分别为:p<0.001和p<0.05）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p<0.05）,而10mg/kg ATV与10mg/kg或20mg/kg HNK的作用相当（p>0.05）。3.HNK能够通过抑制iNOS表达,并减少其合成的NO,缓解颈AS血管的内皮功能障碍。（1）20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着减少NO的合成（p值均<0.001）,甚至达到正常饮食组水平（p值均>0.05）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p<0.05）;而10mg/kg ATV与20mg/kg HNK的作用相当（p>0.05）,但强于10mg/kg HNK（p<0.001）。（2）10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着抑制iNOS基因转录（p值分别为:p<0.0001、p<0.0001和p<0.001）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p<0.05）,而10mg/kg ATV与10mg/kg或20mg/kg HNK的作用相当（p>0.05）。（3）10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着抑制iNOS蛋白合成（p值均<0.0001）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p<0.0001）,而10mg/kg ATV强于10mg/kg或20mg/kg HNK的作用（两者p值均<0.0001）。（4）10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着抑制iNOS蛋白在组织内表达及异常分布（p值分别为:p<0.05、p<0.001和p<0.001）;而后两组甚至接近正常饮食组水平（p值均>0.05）。其中,20mg/kg HNK与10mg/kg ATV作用相当（p>0.05）,且似乎均强于10mg/kg HNK,但各自间并没有明显统计学差异。4.HNK抑制AS血管壁中炎性细胞因子的表达,从而缓解血管炎症反应。（1）10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着抑制TNF-α的转录水平（p值分别为:p<0.05、p<0.0001和p<0.05）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p<0.001）;而10mg/kg ATV与10mg/kg HNK的作用相当（p>0.05）,但明显弱于20mg/kg HNK（p<0.001）。（2）20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着抑制IL-6的转录水平（p值分别为:p<0.0001和p<0.001）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p<0.001）,而10mg/kg ATV与10mg/kg HNK的作用相当（p>0.05）,但弱于20mg/kg HNK（p<0.05）。（3）10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着抑制IL-1β的转录水平（p值分别为:p<0.05、p<0.0001和p<0.001）。虽然,20mg/kg HNK的作用似乎强于10mg/kg ATV和10mg/kg HNK,但三组之间并没有明显统计学差异。5.HNK抑制AS血管壁中TLR2和TLR4的表达。（1）10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着抑制TLR2的蛋白表达水平（p值分别为:p<0.001、p<0.0001和p<0.0001）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p<0.001）;而10mg/kg ATV的作用,强于10mg/kg HNK（p<0.0001）和20mg/kg HNK（p<0.05）。（2）10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着抑制TLR4的蛋白表达水平（p值分别为:p<0.001、p<0.0001和p<0.0001）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p<0.001）;而10mg/kg ATV的作用,强于10mg/kg HNK（p<0.0001）和20mg/kg HNK（p<0.05）。6.HNK抑制AS血管壁中NF-κB信号通路的激活。（1）10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着降低p-IκBα蛋白水平（p值均<0.0001）,并增加IκBα蛋白水平（p值分别为:p<0.001、p<0.0001和p<0.0001）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p值均<0.001）;而10mg/kg ATV的作用,强于10mg/kg HNK（p值均<0.0001）和20mg/kg HNK（p-IκBα:p>0.05;IκBα:p<0.0001）。（2）10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV,均能够显着增加胞浆内NF-κB p65的蛋白水平（p值分别为:p<0.001、p<0.0001和p<0.0001）,而降低胞核内NF-κB p65的蛋白水平（p值均<0.0001）。其中,HNK的作用呈剂量依赖性（p<0.0001）;而10mg/kg ATV的作用,均强于10mg/kg HNK（p<0.0001）和20mg/kg HNK（p<0.0001）。（3）由于样本量的原因,仅完成一组NF-κB的DNA结合活性检测。结果显示,NF-κB的DNA结合活性强度,按10mg/kg、20mg/kg HNK和10mg/kg ATV的顺序,依次减低。结论:本研究结果再次证明,高脂饮食及颈动脉套管,能够诱发ApoE-/-小鼠颈动脉血管壁,发生氧化应激、内皮功能障碍、免疫炎症反应,激活NF-κB信号通路系统,从而促进AS病变的发生发展。本研究首次在体内验证,HNK和ATV能够通过消除氧化应激、改善血管内皮功能障碍、下调炎性细胞因子表达、限制初始免疫系统激活,从而抑制NF-κB信号通路系统,减缓AS发生发展。其中,首次探讨了HNK对TLR的影响,提示其在免疫调节方面具有药理活性。另外,本研究发现,HNK的上述药理作用,总体呈现剂量依赖性。同时,本研究首次发现,在抑制TLR和NF-κB信号通路系统激活作用方面,20mg/kg HNK弱于10mg/kg ATV;而在抑制炎性细胞因子表达方面,20mg/kg HNK的作用强于10mg/kg ATV。在抗氧化应激、改善内皮功能等药理作用方面,两者效果相当。以上结果表明,HNK具有多重抗动脉粥样硬化的作用。而作为一种能够阻止动脉粥样硬化性疾病进展的合理药物选择,未来有待于在人体内进一步研究。
徐香山[5]（2021）在《低剪切力通过内皮细胞来源的外泌体miR-181b调控平滑肌细胞焦亡的实验研究》文中指出背景:冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病,简称为“冠心病”。近年来,药物治疗、介入治疗和外科手术极大的改善了冠心病病人的预后,但是仍有许多冠心病病人的预后不佳。此外,心血管疾病的患者对治疗的反应差异比较大,存在较大的个体差异性。因此深入了解这种疾病的分子机制,对于更加精准的诊断和治疗冠心病是非常重要的。冠状动脉血管管壁是由多种细胞组成的,其中内皮细胞和平滑肌细胞是动脉血管管壁中最重要的细胞成分,这些细胞的自身状态以及相互之间的作用对于维持血管壁的正常生理功能是非常重要的。研究显示,内皮细胞、平滑肌细胞之间存在着复杂的信号传递过程,它们之间的信号传递过程对于保持内皮细胞和平滑肌细胞的生理功能有着重要的作用。血管壁的各种细胞之间如何进行细胞间的信号通讯以及这种相互关系是如何被周围环境所影响的需要进一步的研究来证实。通过对体内及体外培养的多种细胞进行研究表明,细胞间的通讯与外泌体（exosomes）之间存在着重要的联系。外泌体可以将其携带的核酸、蛋白质、细胞因子等内容物转运到靶细胞内,进而参与调控受体细胞的各种生理行为（包括细胞增殖、死亡、迁移及表型转化等）。通过本课题组的前期研究表明,包含内皮细胞与平滑肌细胞的共培养系统能够明显抑制平滑肌细胞炎症因子IL-1β和IL-18的表达,所以我们想要进一步研究并证实外泌体在内皮细胞与平滑肌细胞共培养中的可能作用及隐藏在这个作用后面的相关机制。microRNA（miRNA）已经被证明具有非常广泛多样的生物学功能。大量基础研究表明,miR-181b可通过下调多种靶基因的方式参与到心血管系统的调控工作中。在冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜疾病、心力衰竭、心肌病等各种心血管疾病的调控中发挥重要作用。大量研究表明miRNA可在不同细胞中通过调控不同的靶点影响细胞焦亡。miR-181b是一种机械敏感性miRNA,它的表达水平在主动脉瓣膜内皮细胞中受到血管剪切力的影响。但是其在内皮细胞源性外泌体中的表达水平以及与平滑肌细胞焦亡的关系尚不明确。方法:1.分别建立平滑肌细胞单独培养和内皮细胞、平滑肌细胞共培养系统,在低剪切力条件下观察单独培养和共培养对平滑肌细胞细胞焦亡的影响。Western blot方法检测Caspase-1、GSDMD-N、NLRP3的蛋白表达水平,qRT-PCR方法检测miR-181b、Caspase-1、GSDMD-N、NLRP3、IL-1β和IL-18的表达水平,ELISA方法检测IL-1β和IL-18的表达情况。2.用无外泌体的血清培养内皮细胞,分别收集低剪切力和静息状态处理的细胞上清液。采用超速差异离心方法收集外泌体。外泌体的表征采用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪技术（NTA）以及蛋白电泳技术。采用microarray技术检测不同处理条件下外泌体中miRNA的表达情况。选取目标miRNA进行qRT-PCR方法验证。3.观察低剪切力处理下,内皮细胞源性外泌体对平滑肌细胞细胞焦亡的影响。Western blot检测Caspase-1、NLRP3的蛋白表达水平,qRT-PCR方法检测miR-181b、Caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18的表达水平,ELISA方法检测IL-1β和IL-18的表达情况。4.以miR-181b为检索关键词,通过常用miRNA靶基因预测网站Target Scan、Pic Tar和miRanda预测miR-181b的靶基因,根据各个网站的预测评分并参考既往文献得到预测的靶基因STAT3,靶基因验证采用双荧光素酶实验。5.使用miR-181b mimics上调平滑肌细胞中miR-181b的表达水平,观察miR-181b对STAT3的影响。同时检测Caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18等焦亡指标的水平。通过共转染miR-181b inhibitor和siSTAT3来同时改变miR-181b和STAT3的表达,以便进一步确定miR-181b通过STAT3信号通路调控平滑肌细胞细胞焦亡的水平。6.数据分析:所有数据的表达形式采用均数±标准差形式,所有实验数据至少重复3次。两组间的比较用t检验,多个组间的比较采用ANOVA分析。数据录入和图形绘制使用Graph Pad Prism 7.0软件,p值小于0.05说明差异存在统计学显着性。芯片数据及生物信息学分析采用R 3.4软件。结果:1.利用Western blot方法检测平滑肌细胞中细胞焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD-N的表达。结果显示:低剪切力可以显着促进血管平滑肌细胞中Caspase-1、GSDMD-N的表达（p<0.01）,RT-PCR也提示细胞焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的mRNA表达情况明显高于对照组。ELISA检测提示炎症因子IL-1β和IL-18的表达同样高于对照组,差异具有统计学意义。进一步分析表明共培养系统中内皮细胞可以抑制平滑肌细胞的细胞焦亡水平。在细胞共培养系统中,平滑肌细胞的细胞焦亡相关蛋白GSDMD-N、NLRP3的表达水平显着低于平滑肌细胞单独培养系统。同时RT-PCR检测也提示GSDMD-N、NLRP3、IL-1β和IL-18在mRNA水平也是显着低于平滑肌细胞单独培养系统的。ELISA检测提示IL-1β和IL-18的表达具有同样的趋势,差异具有统计学意义。2.对于内皮细胞单独培养系统收集上清液后采用超速差异离心方法分离外泌体并进行外泌体的表征研究。通过TEM结果提示提取的外泌体形状为茶杯状结构,符合外泌体的特征。NTA检测结果提示外泌体的直径范围在60-130nm之间,平均值为110nm,符合外泌体的特征。蛋白电泳结果表明外泌体表面蛋白CD63、CD9阳性表达,同时Calnexin表达阴性。根据以上结果提示成功提取出了外泌体。3.外泌体芯片数据结果提示共有16种miRNA差异表达（Fold change大于2同时p<0.05）,其中12种miRNA上调,4种miRNA下调。GO分析提示差异表达的miRNA的生理功能主要包括细胞间通讯、调控核酸代谢、信号转导等。根据表达量分析和前期文献检索的结果选择表达差异最大的miR-181b进行后续分析。RT-PCR结果分析提示低剪切力明显降低内皮细胞源性外泌体中miR-181b的表达。4.通过将外泌体作用于体外低剪切力单独处理的血管平滑肌细胞,RT-PCR方法检测miR-181b的表达,并将实验组和对照组结果进行比较,结果提示miR-181b在低剪切力作用下显着下调,给与内皮细胞源性外泌体处理后平滑肌细胞中的miR-181b的表达高于阴性对照组。通过共培养系统中施加外泌体抑制剂干预处理,研究发现,外泌体可抑制平滑肌细胞中GSDMD-N、NLRP3的表达。在共培养组中加入GW4869后,共培养系统对平滑肌细胞细胞焦亡的保护作用显着被抑制,表明内皮细胞源性外泌体参与了低剪切力条件下对平滑肌细胞焦亡的抑制作用。进一步研究证实转染miR-181b inhibitors可以抑制外泌体对平滑肌细胞的抗细胞焦亡作用,提示外泌体中的miR-181b参与了内皮细胞对平滑肌细胞焦亡抑制的过程。5.根据相关预测网站的结果推测STAT3为miR-181b的靶基因。首先构建含有STAT3mRNA 3’UTR中与miR-181b 5’端种子区域相结合的野生型与突变型的质粒并转染至平滑肌细胞,然后用双荧光素酶实验证实miR-181b与STAT3的靶向关系。结果显示miR-181b可显着抑制野生型STAT3质粒的荧光强度,但是对突变型的质粒荧光强度无影响。然后又检测了STAT3的mRNA表达情况,我们发现过表达miR-181b能够抑制STAT3的mRNA表达水平,这种效应在静息状态和低剪切力处理下都存在。这些结果提示STAT3是miR-181b的靶基因。6.STAT3可促进血管平滑肌细胞细胞焦亡的发生。首先通过转染siSTAT3到平滑肌细胞观察STAT3对平滑肌细胞细胞焦亡的影响。结果表明转染siSTAT3可以降低平滑肌细胞细胞焦亡的发生。Western Blot检测转染后平滑肌细胞中细胞焦亡相关蛋白Caspase-1和NLRP3的表达,结果表明通过转染siSTAT3可使平滑肌细胞中的Caspase-1和NLRP3的表达水平明显下调。同时RT-PCR检测也提示Caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18在mRNA水平也是显着低于对照组。ELISA检测提示IL-1β和IL-18的表达具有同样的趋势,差异具有统计学意义。继续通过共转染miR-181b抑制物和siSTAT3确定miR-181b通过STAT3信号通路调控平滑肌细胞的细胞焦亡。结果提示下调STAT3的表达可以逆转miR-181b inhibitor对平滑肌细胞的细胞焦亡的促进作用。以上结果说明miR-181b通过STAT3信号通路调控平滑肌细胞的细胞焦亡。结论低血管剪切力能够促进血管平滑肌细胞焦亡的发生,共培养系统提示内皮细胞能够抑制平滑肌细胞焦亡的发生。内皮细胞可分泌外泌体,这些外泌体的直径在110nm左右,根据芯片数据分析结果提示低血管剪切力可以抑制内皮细胞来源外泌体中miR-181b的表达水平。生信分析提示外泌体中差异miRNA的生理功能集中在细胞间通讯、调控核酸代谢、信号转导等方面。内皮细胞来源的外泌体可通过增加平滑肌细胞中的miR-181b来抑制血管平滑肌细胞细胞焦亡的发生。进一步的分析表明STAT3是miR-181b的候选靶基因并经过双荧光素酶实验得到验证。通过改变miR-181b和STAT3的表达水平,进一步证实了低血管剪切力通过外泌体miR-181b/STAT3轴来调控平滑肌细胞焦亡的发生。
王渊[6]（2020）在《基于PI3K/AKT/mTOR自噬信号通路探讨络风宁0号对HCASMC增殖的影响》文中进行了进一步梳理背景支架内再狭窄（ISR）是冠心病介入领域的一个难题,药物涂层球囊（DCB）和新一代的药物洗脱支架（DES）仍然存在一定的局限和不足,生物可降解支架（BRS）作为经皮冠状动脉介入治疗（PCI）领域的第四次革命,为患者带来了福音。导师王显教授早期基于心脉病证络风内动病机理论,结合中药配伍减毒原理及现代药理研究进展,选择红豆杉的单体成分紫杉醇和水蛭的单体成分水蛭素组成络风宁0号方用于支架涂层的探索。并陆续成功研发了络风宁0号复方中药单体涂层支架和涂层球囊。现在我们将进一步优化后的络风宁0号支架涂层复合物（紫杉醇和比伐卢定）用于生物可降解支架的研发。目的建立人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）增殖模型,从自噬角度切入,锁定PI3K/AKT/mTOR信号通路,探究络风宁0号支架涂层复合物抗支架内再狭窄的可能机制,为复方中药单体生物可降解支架的研发提供新思路。方法1.HCASMC的体外培养将购买的HCASMC用其配套培养基经规范复苏和传代,建立第4-6代稳定的HCASMC作为后续细胞研究的载体。2.络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖的影响（1）建立凝血酶诱导HCASMC增殖模型选用第4-6代的HCASMC作为研究载体。用不同浓度的凝血酶（0.01 NIH units/mL、0.05 NIH units/mL、0.1 NIH units/mL、0.5 NIH units/mL、1 NIH units/mL、5 NIH units/mL、10NIH units/mL、20NIH units/mL）干预 HCASMC 不同时间（24h、48 h、72 h）,采用CCK-8法对干预后的细胞活力进行检测,摸索出最大程度促进HCASMC增殖的凝血酶浓度和干预时间。（2）摸索络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围选用第4-6代的HCASMC作为研究载体。用不同浓度配比的络风宁0号支架涂层复合物,即1μmol/L 的紫杉醇配比不同浓度的比伐卢定（1/256 mg/mL、1/128 mg/mL、1/64 mg/mL、1/32 mg/ml、1/16 mg/mL、1/8 mg/mL、1/4 mg/mL、1/2 mg/mL、1 mg/mL）干预HCASMC4h,采用CCK-8法对干预后的细胞活力进行检测,摸索出使细胞活力保持90%以上,且对细胞无明显抑制作用的络风宁0号的浓度配比。（3）筛选络风宁0号支架涂层复合物抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖的最有效浓度选用第4-6代的HCASMC作为研究载体。先按照前面实验摸索的造模条件建立凝血酶诱导HCASMC增殖模型,再用前面实验摸索出的无毒性浓度范围的络风宁0号对模型进行干预,采用CCK-8法对干预后的细胞活力进行检测,筛选出能够最大程度抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖的络风宁0号浓度配比。3.探究络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖过程中自噬及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响用前面实验得到的络风宁0号支架涂层复合物的最有效浓度对凝血酶诱导的HCASMC 进行干预,采用 Western blot 法检测 LC3、Beclin1、p62、PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达变化,RT-qPCR法检测PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达变化。结果1.经传代培养至4-6代的HCASMC生长状态良好,可用于后续实验。2.络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖的影响（1）建立凝血酶诱导HCASMC增殖模型不同浓度的凝血酶干预HCASMC24 h后的CCK-8结果显示,随着凝血酶浓度的增加,细胞活力逐渐增强,两者成正相关,当凝血酶浓度达到0.05 NIH units/mL时,其对细胞开始显现出明显的促增殖作用,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;不同浓度的凝血酶干预HCASMC48 h后的CCK-8结果显示,与对照组相比,细胞活力均增强。随着凝血酶浓度的增加,从浓度为0.01 NIH units/mL开始,其对细胞显现出明显的促增殖作用,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。当凝血酶浓度达到1 NIH units/mL时,细胞活力达到最强,随后细胞活力随着凝血酶浓度的增加而减弱;不同浓度的凝血酶干预HCASMC72 h后的CCK-8结果显示,不同浓度的凝血酶作用细胞72 h后,均对细胞显现出明显的促增殖作用,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。细胞活力随着凝血酶浓度的增加,先增强后减弱,在凝血酶浓度为1 NIH units/mL时,细胞活力达到最强。考虑到后续实验需在模型的基础上进一步实施,故1 NIH units/mL的凝血酶作用HCASMC48 h可作为凝血酶最大程度促进HCASMC增殖的建模条件。（2）络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围不同浓度配比的络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC4 h后对细胞活力产生不同程度的抑制作用,细胞活力随着比伐卢定浓度的增加而减弱,两者成负相关。当1μmol/L的紫杉醇配比1/64 mg/mL的比伐卢定时,络风宁0号支架涂层复合物对HCASMC的生长开始显现出明显的抑制作用,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。当络风宁0号中比伐卢定的浓度不大于1/128 mg/mL时,其对HCASMC的生长无明显抑制作用,并且可使细胞活力保持90%以上,此时紫杉醇（1μmol/L）和比伐卢定（0 mg/mL-1/128 mg/mL）的浓度配比可作为络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围。（3）络风宁0号支架涂层复合物抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖的最有效浓度不同浓度配比的络风宁0号支架涂层复合物不同程度抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖,与模型组相比,细胞活力随着比伐卢定浓度的增加而减弱,两者成负相关。当1μmol/L的紫杉醇配比1/256 mg/mL的比伐卢定时,络风宁0号支架涂层复合物开始明显抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖,与模型组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。与比伐卢定浓度为1/256 mg/mL的络风宁0号相比,比伐卢定浓度为1/128mg/mL的络风宁0号对凝血酶诱导的HCASMC增殖的抑制作用更显着,差异有统计学意义（P<0.05）,可作为络风宁0号支架涂层复合物抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖的最有效浓度,即1 μmol/L的紫杉醇配比1/128 mg/mL的比伐卢定。3.络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖过程中自噬及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响Western blot结果显示,与对照组相比,凝血酶造模组中LC3Ⅱ/Ⅰ的比值和Beclin1的蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,p62、PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比络风宁0号组中LC3Ⅱ/Ⅰ的比值和Beclin1的蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,p62、PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,凝血酶造模组中PI3K、AKT及mTOR的mRNA表达显着增高,差异具有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比,络风宁0号组中PI3K、AKT及mTOR的mRNA表达显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论1.凝血酶可能通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制自噬,进而促进HCASMC的增殖。2.络风宁0号支架涂层复合物可能通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路促进自噬,进而抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖,发挥抗支架内再狭窄的作用。
王凯[7]（2020）在《从NLRP3炎性小体探讨络风宁0号对HCAEC的保护作用及机制》文中研究说明背景支架内再狭窄（ISR）和支架内血栓形成（ST）是经皮冠脉介入领域的两大难题,二者发生的机制复杂,目前认为二者的发生均与支架对血管的机械性损伤、血管内皮损伤、血管舒缩功能障碍、金属异物和表面涂层聚合物导致的局部炎症等有关,各种因素共同导致的以人冠脉平滑肌细胞（HCASMC）病理性增生为核心的新生内膜形成是ISR的关键机制,而抗增殖药物导致的再内皮化延迟则是ST发生的重要原因。因此,为减少金属支架植入对血管的影响,“介入无植入”理念的产物——药物涂层球囊（DCB）逐渐受到介入医师青睐;另一方面,目前临床应用的药物洗脱支架（DES）和DCB表面所载药物皆为单一的抗细胞增殖药物,对细胞增殖活性的抑制无特异选择性,为减少药物对人冠脉内皮细胞（HCAEC）的损伤,制备出“内皮友好型”支架和球囊,新型涂层药物的研发也成为热点。但目前由于缺乏大规模的随机对照试验,除ISR病变外,其他类型冠脉病变应用DCB治疗仍需要更多循证医学证据支持;同时单一组分药物的研发目前处于一个瓶颈期,中医方剂中多药物合理配伍具有“增效减毒”的优点,或可为新型涂药物的研发提供思路。导师王显教授基于心脉病症络风内动理论将红豆杉和水蛭的单体有效成分——紫杉醇、比伐卢定（重组水蛭素）组成络风宁0号方,用于支架和球囊所载药物的研发。前期研究中已经证实络风宁0号中药单体复合物可通过抑制炎症反应降低HCASMC的炎性增殖水平,但其对HCAEC的保护作用的机制尚未进一步研究,而HCAEC的损伤和死亡是局部炎症反应和血管再内皮化延迟的重要因素,因此我们以HCAEC为研究载体,探索络风宁0号对HCAEC的保护作用及对损伤过程中NLRP3炎性小体的影响,为进一步研究络风宁0号涂层球囊的研发提供细胞层面的理论依据。目的本课题一方面通过对现有文献进行荟萃分析,探讨DCB在小冠状动脉（SCV）原发病变中的有效性和安全性;另一方面筛选络风宁0号中两种单体成分——紫杉醇和比伐卢定的最佳浓度配比,并对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的HCAEC损伤模型进行干预,观察络风宁0号对HCAEC的保护作用及对损伤过程中NLRP3炎性小体的影响,从炎症和细胞焦亡的角度探讨络风宁0号对HCAEC的保护作用,为研发新一代内皮友好型球囊提供理论依据。方法第一部分DCB和DES治疗SCV原发病变的疗效和安全性比较通过对9个医学数据库进行检索,筛选出符合标准的随机对照试验进行meta分析。第二部分络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用及机制实验一筛选络风宁0号中紫杉醇和比伐卢定最佳浓度配比选用第4～6代HCASMC和HCAEC作为研究载体。通过设立一系列不同的紫杉醇和比伐卢定的浓度配比,对两种细胞进行干预,采用MTT法对干预后的细胞增殖活性进行检测,筛选出可明显抑制HCASMC活性但对HCAEC无影响（以细胞相对活性90%作为判断阈值）的配比浓度。实验二络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用及机制选用第4～6代HCAEC作为研究载体。通过设立一系列不同的AngⅡ浓度,对HCAEC进行干预,采用MTT法对干预后的细胞增殖活性进行检测,筛选出可明显抑制HCAEC活性（以细胞相对活性70%作为判断阈值）的AngⅡ浓度。实验三络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用采用确定的络风宁0号最佳药物配比浓度对AngⅡ诱导的HCAEC损伤模型进行干预,LDH释放法检测各组细胞活性,并采用HO-PI免疫荧光染色对细胞死亡情况进行检测。实验四基于NLRP3炎性小体探讨络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用的机制采用确定的络风宁0号最佳药物配比浓度对AngⅡ诱导的HCAEC损伤模型进行干预,LDH释放法检测各组细胞活性,ELISA、RT-qPCR、Western Blot检测NLRP3炎性小体通路中主要信息传递位点、下游炎症产物的基因和蛋白表达水平的影响,并采用HO-PI免疫荧光染色对细胞死亡情况进行检测。结果第一部分DCB和DES治疗小冠状动脉原发病变的疗效和安全性比较通过对所检索的文献进行meta分析,结果提示在治疗SCV原发病变方面,单独应用DCB和DES具有类似的疗效和安全性,二者之间心血管事件（MACEs、TLR、MI和死亡）发生率相当。此外,单独应用DCB,在随访中血管造影结果如晚期血管丢失（LLL）和最小血管直径（MLD）方面表现较好。因此,单独应用DCB可能是治疗SCV原发病变的新选择。第二部分络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用及机制实验一筛选络风宁0号中紫杉醇和比伐卢定最佳浓度配比络风宁0号中紫杉醇的浓度为固定的1μmol/L,随着比伐卢定浓度的增高,对HCASMC和HCAEC活性的抑制程度加重与对照组相比差异明显（p<0.05）,抑制呈浓度依赖性,但对HCAEC的抑制程度明显低于HCASMC,当两种药物以紫杉醇1μmol/L+比伐卢定0.625mg/ml进行配比时,HCAEC的相对活性约为92%,HCASMC相对活性约为63%。实验二络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用及机制随着AngⅡ浓度的增高,对HCAEC活性的抑制程度加重,与对照组相比差异明显（p<0.05）,抑制呈浓度依赖关系,当AngⅡ浓度为10-5mol/L时,HCAEC的相对活性约为71.9%。实验三络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用1)LDH释放试验结果显示与对照组相比,模型组中LDH释放水平明显升高（p<0.05）,紫杉醇组和络风宁0号组LDH释放水平较模型组明显降低,且络风宁0号组降低更为明显（p<0.05）。2)HO-PI免疫荧光染色结果提示与对照组相比,模型组呈现强红色荧光,紫杉醇组和络风宁0号组中红色荧光较模型组明显减弱,络风宁0号组细胞存活数量优于紫杉醇组。实验四基于NLRP3炎性小体探讨络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用的机制1)ELISA结果显示与对照组相比,模型组中IL-1β和IL-18水平明显升高（p<0.05）,紫杉醇组和络风宁0号组IL-1β和IL-18释放水平较模型组明显降低,且络风宁0号组降低更为明显（p<0.05）。2)RT-qPCR结果显示与对照组相比,模型组中NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18基因表达水平明显升高（p<0.05）,紫杉醇组和络风宁0号组基因表达的水平较模型组明显降低,且络风宁0号组降低更为明显（p<0.05）。3)Western Blot结果显示与对照组相比,模型组中NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平明显升高（p<0.05）,紫杉醇组和络风宁0号组蛋白水平较模型组明显降低,且络风宁0号组降低更为明显（p<0.05）。结论1.在治疗冠脉小血管原发病变方面,单独应用DCB和DES具有相似的疗效性和安全性,而且DCB血管造影随访结果表现较好。因此,单独应用DCB可能是治疗SCV原发病变的较好选择。2.当紫杉醇1μmol/L配伍比伐卢定0.0625mg/ml做为络风宁0号最终药物浓度配比时,可达到不影响HCAEC活性的同时又能明显抑制HCASMC增殖的目的。3.络风宁0号通过对NLRP3炎性小体途径的抑制作用,减轻Ang Ⅱ诱导HCAEC产生的炎症损伤和细胞焦亡,对HCAEC产生保护作用,并且结果优于单独应用紫杉醇,可为新型DCB所载药物的研发提供了理论依据。
章萌[8]（2020）在《促红细胞生成素导致腹主动脉瘤形成的作用及分子机制研究》文中指出研究背景腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）是一种潜在的致命性血管疾病,其定义为腹主动脉局部扩张,直径大于3cm或超过正常主动脉直径50%。AAA主要累及肾动脉分支以下的腹主动脉,患者通常没有症状,即使医生查体也难以触及扩张的腹主动脉,患者常由于其他临床指征行腹部超声或CT检查时偶然发现AAA,因此早期发现极为困难。一旦发生AAA破裂,死亡率高达85%-90%,几乎是不治之症。如何发现AAA的发病原因和快速膨胀因素并进行有效的抑制,是临床医学界面临的重大难题。尽管在AAA发病机制的研究领域已取得了巨大进展,但目前尚无有效的临床预测因子或药物治疗来降低AAA的发病风险或限制其进展。当男性和女性患者的AAA内径分别大于55mm和50mm时,可实施外科矫正术或血管内介入手术,术后存活率超过95%。因此,对于预防AAA破裂,手术矫正和支架介入是唯一有效的方法,但这些操作均有创伤性和并发症。大力研发可抑制AAA发生和发展的新药,已成为AAA研究领域中的当务之急。促红细胞生成素（EPO）由165个氨基酸和4条分子量为34kd的紧密球状结构的碳水化合物侧链组成。EPO对正常红细胞的产生至关重要,主要由胎儿肝脏及成年人肾脏合成。EPO主要通过刺激造血系统中的促红细胞生成素受体（EPOR）起到促进红细胞生成的作用。EPO可在缺氧时由肾小管间质细胞产生,通过促进红细胞生成和抑制红细胞祖细胞的凋亡而增加红细胞数量。此外,EPO潜在的造血外功能也备受关注。研究表明,EPO可由肾脏以外组织产生,且EPORs在红系祖细胞以外的其他组织中亦有广泛分布。肾脏以外产生的EPO是通过旁分泌/自分泌的途径而发挥作用,而非造血功能中的激素样作用。在创伤和炎症反应中,EPO及其受体表达明显增加,从而触发创伤组织和器官中的关键保护反应。EPO的组织保护作用已在多个动物的疾病模型中得到证实,包括局灶性脑缺血、栓塞性卒中、创伤性脑损伤、心肌缺血、急性肾损伤、肢体缺血、组织创伤等。临床研究表明,在严重创伤患者中给予EPO治疗可降低患者的死亡率。最近的研究发现,EPO可通过促进内皮细胞增殖迁移和基质金属蛋白酶2（MMP2）表达促进血管新生。接受腹主动脉腔内修复的AAA患者有三分之一患有贫血,其血红蛋白水平与AAA的大小呈独立负相关,但其机制并不明确。最近一项高脂血症小鼠中输注血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）的实验研究发现,抑制缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）减弱了 AAA的进展。众所周知,慢性贫血和HIF可增加EPO的生成,而最近的证据表明,Ang Ⅱ可直接刺激造血祖细胞的受体或间接调节EPO的基因表达来影响造血功能。有罕见病例报道,一位长期进行血液透析并应用重组人EPO治疗的患者,无明显原因地对重组人EPO产生了耐药性,并CT检测发现了 AAA。这些临床和实验研究强烈提示EPO和AAA之间可能存在着某种联系,主动脉壁新生血管的形成,也被称为血管新生,是实验和临床AAAs的病理标志。有证据表明,主动脉瘤管壁内的血管新生可能在动脉瘤的进展和破裂中起关键作用。在人动脉瘤组织中,尤其是在邻近破裂区域和被白细胞浸润的区域,血管新生更为普遍。抑制实验性AAA进展的药物,也会减少动脉壁血管新生。基质金属蛋白酶（MMPs）家族密切参与新血管形成的过程,并发挥关键的促血管生成作用,而MMPs与动脉管壁的降解和破裂有关。缺氧和炎症是刺激血管新生的两个关键因素。HIF-1α及其靶基因在人类和实验性AAAs中表达增加。抑制HIF-1a治疗可以阻止实验性AAA进展,并减轻管壁白细胞浸润、血管新生和MMPs的过度表达。炎症和免疫相关疾病与血管新生相关,因为大多数白细胞能够产生一系列促血管生成因子,如血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（b-FGF）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）以及蛋白酶,如糜蛋白酶、胰蛋白酶、MMPs。有报道称肥大细胞特异性的糜蛋白酶和胰蛋白酶诱导内皮细胞（ECs）表达粘附分子和趋化因子,其利用趋化因子受体2（CCR2）作为募集趋化因子的受体,降解基质蛋白,促进血管新生,诱导平滑肌细胞凋亡。AAA发生和发展过程涉及了多种病理过程,比如血管新生、炎症浸润、氧化应激和平滑肌细胞凋亡等,在本研究中,我们提出如下科学假说,在ApoE-/-小鼠或野生型小鼠中,EPO可以剂量依赖性地导致AAA的发生,并且EPO通过促进血管新生,增加炎症浸润,诱导平滑肌凋亡,导致AAA的发生,为了验证这一假说,我们精心设计并进行了一系列的体内外实验。研究目的1.探讨EPO是否可在ApoE-/-小鼠和野生型小鼠中导致AAA的产生及其剂量效应;2.探讨EPO对小鼠AAA的影响是否受高脂喂养和高脂血症的影响;3.探讨EPO通过何种类型受体发挥作用对AAA产生影响;4.探讨EPO引起小鼠AAA的病理生理机制;5.探讨EPO对血管壁三种细胞（内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞）的作用及其机制。6.探讨在AAA临床患者中,血清EPO与AAA的发生有无关联。研究方法1.动物模型的建立和分组（1）雄性ApoE-/-小鼠60只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO 2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（2）雄性ApoE-/-小鼠60只,全程给予普通饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO 2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（3）雄性野生型小鼠60只,全程给予普通饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（4）雌性APoE-/-小鼠30只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为2组,每组15只;雌性野生型小鼠30只,全程给予普通饲料喂养,随机分为2组,每组15只;分别给予生理盐水和EPO5,000IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（5）雄性ApoE-/-小鼠45只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为3组,每组15只;雄性野生型小鼠45只,全程给予普通饲料喂养,随机分为3组,每组15只;分别给予生理盐水、焦谷氨酸螺旋B表面肽（pHBSP）30 mg/kg/day和pHBSP 300mg/kg/day持续泵入,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（6）雄性ApoE-/-小鼠或野生型小鼠各30只,随机分为两组,每组15只;对照组给予生理盐水持续泵入,实验组给予Ang Ⅱ（1.44mg/kg/day）持续泵入,全程给予高脂高胆固醇喂养或普通饲料喂养,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。2.鼠尾血压测量应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压,测量部位为小鼠尾动脉,每只小鼠检测3次,取其平均值作为最终数值。3.组织取材小鼠取材前饥饿6-8小时,麻醉小鼠后取材,留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻,-80℃冰箱保存,一部分置于4%多聚甲醛中固定,以备后续实验。4.血脂血常规、肝肾功检测检测各组小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮的水平;检测各组小鼠全血红细胞计数、血红蛋白含量和红细胞压积。5.血管组织全基因组测序分析接受EPO中剂量注射的ApoE-/-小鼠3只,正常对照组3只,取出其主动脉组织,加入RNAlater液氮速冻,送至北京诺禾致源生物科技有限公司进行RNA测序。6.病理学检测腹主动脉组织或肝肾组织制备石蜡切片,主要进行H&E染色、Verhoff弹力纤维染色和 Masson 染色。对 Endomucin、MMP2、MMP9、MT1-MMP、CD68、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α等指标进行免疫组织化学染色,对 CD68、IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α、CD144 和 Ki67 等指标进行组织免疫双荧光染色。7.蛋白免疫印迹实验提取腹主动脉段血管组织蛋白和各种细胞总蛋白,进行BCA蛋白浓度测定。配制SDS-PAGE凝胶,通过蛋白免疫印迹检测胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、MMP2、MMP9、MT1-MMP、VEGF、TGF-β1、KDR、Tie2、CD68、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α的蛋白含量。8.明胶酶谱实验配制含1%明胶的SDS-PAGE凝胶,提取腹主动脉段血管组织蛋白和各种细胞总蛋白,并进行BCA蛋白浓度测定。使用明胶酶谱试剂盒检测MMP2和MMP9的蛋白酶活性。9.RNA 提取、mRNA 逆转录、RT-PCR提取腹主动脉段血管组织RNA和各种细胞总RNA,应用TaKaRa#RR047A逆转录试剂盒进行mRNA逆转录。通过实时荧光定量PCR,得出循环阈值Ct值,通过公式2-ΔΔCT计算出cDNA的相对表达水平。10.细胞培养和信号通路（1）根据EPO浓度梯度预实验,5 IU/mL EPO刺激HUVEC 24小时,所表达的MMP2和MMP9酶活性最高,因此接下来的细胞实验选用EPO 5 IU/mL刺激24小时,作为实验组条件;（2）HUVEC、HAEC、HASMC和巨噬细胞:实验组加入5IU/mLEPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集细胞和上清;（3）HUVEC实验组加入5 IU/mL EPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集上清;加入预先种好板的HASMC中,刺激24小时,收集细胞和上清;（4）HUVEC实验组加入5 IU/mL EPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集上清;加入预先种好板的巨噬细胞中,分别刺激0、2、4、6、8和10小时,收集细胞和上清;（5）HUVEC实验组加入10mg/L pHBSP,对照组加入等体积1xPBS,刺激24小时,收集细胞和上清;（6）实验分为4组:对照组加入DMSO（作为溶剂对照）,EPO组加入EPO（5 IU/mL）+DMSO,JAK2 抑制剂组加入 EPO（5 IU/mL）+TG101348（1 μM）[49,50],STAT5 抑制剂组加入 EPO（5IU/mL）+CAS285986-31-4（50μg/mL）,刺激24小时,收集细胞或者观察拍照。11.EDU细胞增殖实验使用EDU试剂盒检测HUVEC或HASMC的增殖能力。12.内皮细胞迁移实验通过划痕实验和Transwell小室细胞迁移实验,检测HUVEC和HAEC在EPO作用下的迁移能力。13.体外小管生成实验利用低生长因子Matrigel基质胶观察HUVEC和HAEC在EPO作用下体外小管生成能力。14.主动脉环出芽实验取野生型小鼠胸主动脉段,将血管剪成长约1mm的小段,置于Matrigel基质胶中,加入相应的药物刺激,每天观察拍照,软件分析计算主动脉出芽数量和长度。15.单核-内皮细胞粘附实验将HUVEC给予EPO刺激24小时;用BCECF-AM（pH荧光探针）标记THP-1细胞悬液;取1x105/mL THP-1混悬液加入到上述HUVEC细胞培养板中,孵育至少1小时;4%多聚甲醛固定细胞。16.TUNEL细胞凋亡检测给予HASMC EPO或者EPO处理过的HUVEC上清干预,使用TUNEL试剂盒检测HASMC的凋亡情况。17.腹腔巨噬细胞的提取选取8-12周雄性野生型小鼠,提前3天给予腹腔注射6%淀粉溶液1mL;小鼠脱颈处死,撕开皮肤,充分暴露腹膜;用无菌注射器注入DMEM于腹腔中,回抽液体至新的50mL离心管中;冲洗腹腔3次,直至DMEM变澄清,得到腹腔巨噬细胞混悬液。18.体内基质胶塞血管新生实验使用高浓度Matrigel基质胶,配制基质胶与药物混合液,取0.7mL基质胶混合液,注入小鼠皮下。14天后,切除基质胶塞;4%多聚甲醛固定过夜,观察基质胶塞大体形态颜色;石蜡包埋,切片,进行常规染色和免疫组化。19.酶联免疫吸附实验使用ELISA方法检测血清中EPO的水平。20.腹主动脉瘤病人血清收集我们纳入40例AAA患者,在患者住院24小时内采集血样。患有贫血、心衰、慢性呼吸系统疾病和肾功能衰竭的病人排除入组。纳入45例健康志愿者的血清作为正常对照组。21.数据统计分析所有数据均以均数±标准误来表示,两组计量资料采用独立样本t检验,多组计量资料采用单因素方差分析LSD事后检验;计数资料采用卡方检验;生存分析采用Log-Rank检验;P<0.05认为有统计学差异。研究结果1.EPO剂量依赖性地诱导ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生腹腔注射高中低剂量EPO4周后,发现EPO剂量依赖的增加了小鼠AAA的发生率,腹主动脉直径明显增加;同时,小鼠死亡率也呈剂量依赖性增加。EPO高剂量组诱导ApoE-/-小鼠AAA发生率与Ang Ⅱ相当,而EPO高剂量组诱导野生型小鼠AAA发生率明显高于Ang Ⅱ。2.EPO导致ApoE-/-小鼠和野生型小鼠腹主动脉管壁增厚弹力板断裂结果显示注射低中高剂量EPO后,动脉管壁明显增厚,弹力纤维断裂,管腔内可伴有血栓形成。3.EPO不影响ApoE-/-、鼠和野生型小鼠血压和血脂的变化EPO注射4周后,与对照组相比,EPO低中高剂量组血压并无显着差异;同样,EPO注射后没有影响小鼠血脂水平变化。由此推断,EPO注射4周,对小鼠的血压和血脂无显着影响。4.EPO不影响ApoE-/-小鼠和野生型小鼠肝功和肾功的变化EPO注射四周后,与对照组相比,EPO低中高剂量组的指标没有明显变化;取对照组和EPO高剂量组小鼠的肝脏和肾脏进行H&E染色,组织形态亦没有明显差别。由此,从药物毒理学角度推测,EPO注射4周,并没有引起肝脏和肾脏的功能障碍。5.高脂饮食不影响EPO对ApoE-/-小鼠AAA形成的剂量效应在全程普通饲料喂养过程中,发现EPO剂量依赖的增加了 ApoE/-小鼠AAA的发生率,且与高脂喂养模型的发生率无显着差异;同时,高脂喂养与否,EPO高剂量组小鼠的死亡率无明显统计学意义。由此得出,高脂饮食不影响EPO对ApoE-/-小鼠AAA形成的剂量效应。6.EPO可诱导雌性ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生结果显示,在中剂量EPO刺激下雌性ApoE-/-小鼠和雌性野生型小鼠均有AAA发生,但都略低于雄性小鼠发生率,这符合人类AAA发病率中,男性高于女性的特征。7.pHBSP不能剂量依赖性的诱导小鼠AAA的发生结果显示pHBSP不能诱导两种基因型的小鼠发生AAA,因此推断EPO可能通过同源二聚体受体发挥作用,导致AAA。8.AAA患者血清EPO水平明显增高两组之间在年龄、性别、肾功能和药物治疗方面没有显着差异,但吸烟者在AAA组比正常对照组更常见。通过分析显示,年龄在>65岁和≤65岁之间、男性和女性之间、吸烟者和非吸烟者之间的腹主动脉直径没有显着差异,这表明在这组患者中,AAA直径不受传统动脉粥样硬化危险因素的影响。与健康对照组相比,AAA患者的血清EPO水平显着升高,这表明该组患者分泌了更多的EPO于循环血液中。9.基因测序分析EPO对ApoE-/-小鼠主动脉组织mRNA表达谱的影响基因本体论分析发现,两组间差异基因主要富集在血管形态发生、血管新生、细胞周期和迁移、炎症反应、白细胞浸润、和细胞外基质重塑中。10.血管新生和胶原代谢参与EPO诱导AAA的过程结果显示,与对照组相比,EPO组腹主动脉管壁胶原显着减少,尤其是胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达。MMPs蛋白表达和活性明显高于对照组。EPO组腹主动脉管壁微血管密度明显增加,VEGF、TGF-β1、KDR和Tie2蛋白表达明显增高。11.炎症反应参与EPO诱导AAA的过程结果显示,EPO组腹主动脉CD68阳性细胞浸润动脉壁的程度明显高于对照组。同时 ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1 和 TNF-α 等炎症因子 mRNA水平和蛋白水平表达明显多于对照组。CD68阳性细胞来源的炎症因子明显增高。MSD检测发现,血清炎症因子水平也明显高于对照组小鼠。12.EPO对小鼠红细胞、白细胞和血小板数量的影响给予小鼠EPO注射4周后,结果显示与对照组相比,EPO组红细胞计数、血红蛋白和红细胞压积明显增高。而白细胞计数、单核细胞计数、淋巴细胞计数、粒细胞计数和血小板计数在两组之间无显着性差别。13.三种细胞中内皮细胞EPOR mRNA表达水平最高与平滑肌细胞和巨噬细胞相比,内皮细胞的EPOR表达最高,提示EPO可能主要以内皮细胞为靶点发挥作用。14.EPO促进内皮细胞的增殖和迁移通过EDU实验可以观察到EPO促进HUVEC增殖。通过划痕实验和Transwell小室细胞迁移实验观察到EPO促进HUVEC和HAEC迁移。15.EPO促进内皮细胞体外小管形成和小鼠主动脉环出芽结果显示EPO组内皮细胞更容易形成闭合的管状结构。小鼠胸主动脉环种植于Matrigel基质胶中,在EPO刺激下,主动脉环比对照组更容易出芽,出芽的数量和出芽长度明显增加。16.EPO促进内皮细胞血管新生相关蛋白的表达结果显示,给予EPO刺激后HUVEC或HAEC的MMPs蛋白表达水平和活性明显高于对照组。EPO组细胞的KDR和Tie2表达明显增高。17.pHBSP不能促进HUVEC迁移、体外小管形成和MMPs的表达结果显示,对照组和pHBSP组细胞迁移数量无明显差别,形成小管数量和小管总长度无显着差异。给予pHBSP刺激后HUVEC的MMPs蛋白表达水平和酶活性与对照组无明显差别。18.EPO促进内皮-单核细胞间的粘附作用结果显示,与对照组相比,EPO组粘附的单核细胞数明显增多,由此得出,EPO能够促进内皮-单核细胞间的粘附作用。19.EPO对巨噬细胞炎症因子表达的影响直接给予EPO刺激,巨噬细胞炎症因子的表达无意义;溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激巨噬细胞,结果显示,IL-6、IL-1β和TNF-α在6小时明显增高,MCP-1在8小时明显增高,由此得出,内皮细胞参与是EPO诱导巨噬细胞炎症因子上调的关键环节。20.EPO对巨噬细胞MMPs表达的影响溶剂对照或EPO刺激巨噬细胞24小时后,两组MMP2和MMP9的蛋白表达和酶活性无明显差别。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激巨噬细胞,结果发现,两组MMP2和MMP9的蛋白表达和酶活性依然没有明显差别。由此推断,EPO并不能影响巨噬细胞MMPs的表达。21.EPO对平滑肌细胞胶原蛋白、MMPs和凋亡相关蛋白表达的影响给予浓度梯度的EPO刺激HASMC后,其胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、MMP2和MMP9表达没有明显变化。EPO组HASMC表达BCL2和BAX与对照组也没有明显差异。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激平滑肌细胞,结果显示,EPO组HASMC表达胶原Ⅰ和胶原Ⅲ明显减少,而MMP2和MMP9蛋白表达和酶活性明显增加。EPO组表达抗凋亡蛋白BCL2明显少于对照组,而表达促凋亡蛋白BAX明显多于对照组。22.EPO对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响结果显示直接给予EPO刺激,诱导的HASMC增殖和凋亡的数量与对照组无明显差别。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激HASMC,结果显示EPO组TUNEL 阳性细胞比例明显高于对照组,而EDU 阳性细胞比例明显低于对照组。23.EPO在体内水平促进血管新生和炎症浸润14天后从小鼠体内取出基质胶塞显示:混有溶剂对照的基质胶塞呈清晰的黄色,而含有EPO的基质胶塞呈红色,说明基质胶塞内形成了血管。EPO组侵袭的细胞和血管数量明显增多。EPO组CD144和Ki67阳性细胞数量明显高于对照组,说明EPO促进内皮细胞的增殖和迁移。并且EPO组切片CD68阳性细胞浸润程度和炎症因子表达明显高于对照组,这表明EPO促进炎症细胞入侵和炎症因子的表达。24.EPO通过JAK2/STAT5通路诱导血管新生结果显示,EPO明显增强了 JAK2和STAT5的磷酸化水平,而JAK2抑制剂明显抑制了 JAK2和STAT5的磷酸化水平,STAT5抑制剂只抑制了 STAT5的磷酸化水平,并没有影响JAK2的磷酸化水平。加入JAK2抑制剂和STAT5抑制剂后明显抑制了内皮细胞闭合管状结构的形成。通过以上结果可知,EPO通过JAK2/STAT5通路促进内皮细胞形成新生血管。25.EPO诱导AAA形成和发展的机制通过以上体内体外实验,我们基本得出EPO诱导AAA形成和发展的机制为:EPO刺激血管内皮细胞,激活JAK2/STAT5通路,促进血管新生、基质金属蛋白分泌、平滑肌细胞凋亡,抑制平滑肌细胞合成胶原蛋白,增强炎性细胞聚集和炎症因子释放,导致AAA的形成和发展。实验结论1.EPO剂量依赖性地促进了 ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的形成,EPO导致ApoE-/-小鼠AAA发生率与Ang Ⅱ相当,EPO导致野生型小鼠AAA发生率明显高于Ang Ⅱ;2.EPO是通过（EPOR）2同型二聚体发挥作用促进AAA的形成;3.EPO通过引起血管新生、炎症反应和胶原降解而导致AAA的形成;4.EPO通过内皮细胞的介导诱导巨噬细胞表达炎症因子,抑制HASMC胶原分泌,促进HASMC凋亡。研究背景在腹主动脉瘤（AAA）发生发展过程中,由于AAA常与主动脉壁严重动脉粥样硬化损伤相关,因此传统认为AAA是动脉粥样硬化的结果。但这一传统观点近年来受到越来越多的挑战。与不合并动脉粥样硬化性心血管疾病的人群相比,合并冠心病、周围血管疾病、颈动脉疾病、脑血管疾病的患者发生AAA的OR值分别为1.72、1.59、1.51和1.18。在6446例接受颈动脉、股动脉和腹主动脉超声检查的Troms0研究中,斑块负荷与AAA发生率之间无量效关系,提示动脉粥样硬化与AAA可能是伴随关系而非因果关系。糖尿病是动脉粥样硬化的重要危险因素,但却是AAA的保护性因素,在美国310万人AAA流行病学调查中,与非糖尿病患者相比,糖尿病患者发生AAA的OR值为0.75,提示糖尿病可使AAA风险减少25%。这一反常现象提示,动脉粥样硬化与AAA可能是两个互相独立的疾病。吸烟与AAA的发生有很强的临床联系。吸烟人群中AAA的患病率是终身不吸烟人群的四倍以上。一份比较慢性吸烟者罹患不同疾病的相对风险的报告显示,罹患AAA的风险比罹患冠状动脉疾病的风险高出三倍,比罹患脑血管疾病的风险高出近五倍。2011年在瑞典进行的26256例65岁以上老年男性超声检查结果表明,AAA的发病率已下降至2.2%,其主要原因可能是吸烟人群的减少,提示控制吸烟可能是一个预防AAA的有效策略。基于这些临床观察,慢性吸烟可能是AAA发生发展的最重要的环境危险因素。除了吸烟外,其他危险因素还包括男性、年龄、高血压、慢性阻塞性肺疾病、高脂血症和家族病史。动物模型是一种强有力的工具,可以提供AAA发生和发展机制的理解。目前,AngⅡ注射模型是最常用的AAA动物模型。在高脂喂养的ApoE-/-或LDLR-/-小鼠皮下埋置微量渗透泵,持续注射大剂量Ang Ⅱ,可导致AAA,因此目前有关AAA发生和发展的细胞和分子机制主要来自于这类模型的研究。已提出的AAA发病机制包括:氧化应激机制:AAA患者或小鼠模型中促氧化剂增多,而抗氧化剂减少,从而导致ROS水平的上升,氧化应激增加,刺激血管紧张素转换酶（ACE）表达,内源性Ang Ⅱ增多,炎症反应增强。肾素-血管紧张素激活机制:持续滴注AngⅡ首先导致腹主动脉的炎症反应,继之出现弹性蛋白降解、血管中层断裂和管腔扩张,这些作用通过AT1R所介导,使用ACEI、ARB和ACE2过表达等方法以减少Ang Ⅱ的产生和作用,均可减轻小鼠AAA病变。AMPKa2激活机制:尼古丁和Ang Ⅱ可通过激活细胞膜表面的G蛋白偶联受体增加胞内的活性氧水平,活性氧可激活AMPK,形成AMPKa2/AP-2o/MMP2级联反应,从而活化MMP2的基因转录,最终导致血管壁细胞外基质的降解加速,引发AAA。胶原代谢机制:炎性因子不仅通过刺激MMPs表达而增加细胞外间质的降解,而且使得胶原合成障碍,加速AAA的形成。由于AAA是一个病因不明、病程迁延、病变发展、治疗有限、预后险恶的多因素疾病,且所得出的干预靶点在临床试验中尚无成功的先例,因此,对于AAA发生和发展机制的研究,我们仍处于早期阶段。Ang Ⅱ可以促进特定造血细胞系的増殖,而且Ang Ⅱ也参与了EPO在体内的调控。对健康志愿者的临床研究表明,Ang Ⅱ通过激活AT1R使血清EPO浓度升高约35%或更高。此外,在另一项对健康志愿者的研究中,ACEI类药物卡托普利和依那普利显着降低了血浆EPO水平,降幅高达20-30%。这些发现表明Ang Ⅱ在体内通过受体依赖信号调节EPO的产生,但EPO是否介导了Ang Ⅱ在体内的生物学作用,且引起AAA产生尚无报道。结合本研究论文I和论文Ⅱ的结论,EPO能够导致AAA的产生,因此我们假设在ApoE-/-小鼠中,EPO介导了Ang Ⅱ诱导的AAA的发生和发展,因此我们设计了一系列体内体外实验以验证此假说。研究目的1.探讨EPO/EPOR信号通路在Ang Ⅱ诱导AAA过程中起到的作用;2.探讨Ang Ⅱ诱导野生型小鼠AAA发生率较低的原因;3.探讨Ang Ⅱ作用于EPO的分子机制。研究方法1.动物模型的建立和分组（1）雄性ApoE-/-小鼠60只,随机分为4组:其中对照组给予生理盐水持续泵入+生理盐水尾静脉注射,Ang Ⅱ组给予Ang Ⅱ持续泵入+生理盐水尾静脉注射,Ang Ⅱ+IgG2a组给予Ang Ⅱ持续泵入+EPO尾静脉注射,Ang Ⅱ+EPO中和抗体组给予Ang Ⅱ持续泵入+EPO中和抗体尾静脉注射,4周后小鼠给予安乐死。（2）实验组为EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠,对照组为同窝ApoE-/-小鼠,同时给予Ang Ⅱ持续栗入,4周后小鼠给予安乐死。（3）雄性野生型小鼠30只,随机分为两组,每组15只;对照组给予生理盐水持续栗入,实验组给予Ang Ⅱ持续泵入,全程给予普通饲料喂养,4周后小鼠给予安乐死。2.细胞培养和分组（1）实验分为四组:对照组（溶剂对照）,Ang Ⅱ（50μM）组,Ang Ⅱ+替米沙坦（lμM）组,AngII+PD123319（50μM）组,刺激12小时,收集细胞;（2）实验分为四组:对照组（溶剂对照）,Ang Ⅱ（50μM）组,Ang 11+替米沙坦（lμM）组,AngII+U0126（50μM）组,刺激12小时,收集细胞。3.鼠尾血压测量在给予药物干预4周末,应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压,测量部位为小鼠尾动脉,每只小鼠检测3次,取其平均值作为最终数值。4.组织取材步骤小鼠取材前饥饿6-8小时,麻醉小鼠后取材,留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻,-80℃冰箱保存,一部分置于4%多聚甲醛中固定,以备后续实验。5.血常规检测使用兽用全自动血液细胞分析仪检测各组小鼠全血红细胞计数,血红蛋白含量和红细胞压积。6.免疫组织化学染色腹主动脉组织制备石蜡切片,对IL-6、IL-lβ、MCP-1和TNF-α进行免疫组织化学染色。7.蛋白免疫印迹实验提取腹主动脉段血管姐织蛋白和各种细胞总蛋白,进行BCA蛋白浓度测定。配制SDS-PAGE凝胶,通过蛋白免疫印迹检测EPO、EPOR、ERK1/2的蛋白含量。8.RNA提取、mRNA逆转录、RT-PCR提取腹主动脉段血管组织RNA和各种细胞总RNA,应用TaKaRa#RR047A逆转录试剂盒进行mRNA逆转录。通过实时荧光定量PCR,得出循环阈值Ct值,通过公式2-△△CT计算出cDNA的相对表达水平。9.酶联免疫吸附实验使用ELISA方法检测血清中EPO的水平。10.数据统计分析所有数据均以均数±标准误来表示,两组计量资料采用独立样本t检验,多组计量资料采用单因素方差分析LSD事后检验;不符合正态分布的数据采用秩和检验;计数资料采用卡方检验;生存分析采用Log-Rank检验;户<0.05认为有统计学差异。研究结果1.EPO在Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠发生AAA的过程中起到重要作用结果显示,Ang Ⅱ组和Ang Ⅱ+IgG2a组AAA发生率明显增高;Ang Ⅱ组和Ang Ⅱ+IgG2a组之间无显着性差异,而Ang Ⅱ+EP0中和抗体组AAA发生率降为20%。Ang Ⅱ+EP0中和抗体组腹主动脉直径明显降低,死亡率明显下降。2.EPOR在Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠发生AAA的过程中起到重要作用由于EPOR-/-纯合小鼠致死,故我们只能获得EPOR+/-杂合小鼠。给予Ang Ⅱ埋泵4周后,结果显示与ApoE+小鼠组相比,EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠组AAA发生率明显降低,且腹主动脉直径明显降低,死亡率降低至0。3.EPOR敲除抑制Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠AAA中炎症因子的表达EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠组腹主动脉管壁IL-6、IL-lp、MCP-1、TNF-a的表达明显少于ApoE-/-小鼠组。4.各组小鼠血清EPO水平比较ApoE-/-小鼠和野生型小鼠给予Ang Ⅱ千预后,Ang Ⅱ组的血清EPO水平比对照组高出2倍以上。同样给予Ang Ⅱ干预的ApoE-/-小鼠的血清EPO水平显着高于野生型小鼠的血清EPO水平。在野生型小鼠中,EPO注射组导致的血清EPO水平远高于Ang Ⅱ干预组。在Ang Ⅱ和EPO诱导的ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA发病机制中EPO起了至关重要的作用。5.EPO介导了Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠的脾肿大和造血增加解剖小鼠后发现,与对照组相比,Angll组小鼠有明显的脾肿大现象,且脾脏重量明显高于对照组。EPO中和抗体治疗后,脾脏的大小和重量明显减少,且可显着抑制Ang Ⅱ诱导的RBC、HGB和HCT的增加。而EPOR+/-ApoE-/-小鼠与ApoE-/-小鼠相比,经Ang Ⅱ干预后造血表型无明显改变。6.Ang Ⅱ上调EPO表达的机制与对照组相比,Ang Ⅱ组表达EPO水平明显增高,Ang 11+替米沙坦组表达EPO水平显着低于Ang Ⅱ组,Ang Ⅱ+PD123319组表达EPO水平与Ang Ⅱ组无明显差异。Ang Ⅱ+U0126组表达EPO含量明显低于Ang Ⅱ组。Ang Ⅱ对786-0和HASMC有同样的作用。实验结论1.EPO/EPOR信号通路在Ang Ⅱ诱导AAA过程中起到关键性作用;2.血清EPO水平在Ang Ⅱ和EPO诱导的ApoE-/-和野生型小鼠AAA发病机制中起到关键作用;3.Ang Ⅱ通过AT1R/ERK1/2通路上调肾脏细胞和平滑肌细胞EPO表达,分别增加循环EPO水平和局部组织EPO水平。
张紫森[9]（2019）在《周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制》文中研究表明脓毒症是ICU中常见的危重病症,其发生率和死亡率均很高。据统计,我国每年有300万脓毒症患者,约100万人死于脓毒症。脓毒症和脓毒性休克的后期会出现血管功能障碍,即血管低反应性和血管渗漏,最终导致多器官功能衰竭,ICU中30%-40%的病人死亡与血管低反应性和血管渗漏有关。针对脓毒症血管低反应性和血管渗漏的发生机制,提出了一系列的治疗措施,但这些措施在纠正血管低反应性和血管渗漏过程中存在矛盾现象,如用缩血管药物增加血管反应性的同时,会导致血管内皮细胞骨架蛋白收缩,加重血管渗漏。目前临床上缺乏协同治疗血管低反应性和血管渗漏的措施。周细胞（Pericyte,PC）是位于小血管、微血管和毛细血管内皮细胞周围、基底膜内的一群具有收缩、分泌和多项分化潜能的细胞。近年来研究发现,周细胞参与炎症、免疫紊乱、血管异常增生等病理生理过程,在多种疾病如癫痫、阿尔兹海默症、糖尿病、心肌缺血、肺纤维化的发生发展过程中发挥重要作用。而周细胞能否协同调控和保护脓毒症后血管舒缩和屏障功能,及其主要作用机制是什么,目前尚不清楚。据此,本研究利用盲肠结扎穿孔（Cecal Ligation and Puncture,CLP）及静脉注射LPS复制SD大鼠和转基因小鼠脓毒症模型,以及LPS刺激血管平滑肌细胞（VSMC）和血管内皮细胞（VEC）,分别从整体及离体水平研究了周细胞对脓毒症血管反应性和血管通透性的协同保护作用及机制。研究内容:第一部分脓毒症周细胞结构和功能的变化及与血管反应性和血管通透性的关系利用CLP及静脉注射LPS复制脓毒症大鼠及小鼠（周细胞荧光标记）模型,观察脓毒症后不同时相点（6h、12h、24h）肠系膜血管周细胞数量和结构的变化;观察肠系膜血管舒缩反应性和血管通透性的变化,及其相关调节蛋白表达的变化,分析脓毒症后周细胞结构和功能的变化与血管反应性和血管通透性间的关系。第二部分输注外源性周细胞对脓毒症大鼠血管低反应性和血管渗漏的协同保护作用利用脓毒症大鼠模型,输注外源性周细胞和功能增强的周细胞（poly（i:C）预刺激）,观察周细胞在肠系膜微静脉上的定植情况,以及输注周细胞后对脓毒症大鼠肠系膜血管舒缩反应性、血管通透性及存活率的影响,以明确周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩功能和屏障功能的协同保护作用。第三部分周细胞敲减大鼠血管反应性和血管通透性的变化及输注外源性周细胞对血管舒缩功能和屏障功能的回复作用用CP-673451（PDGFR-β抑制剂）建立周细胞敲减大鼠模型（药物敲减模型）,观察周细胞敲减大鼠在脓毒症后血管反应性和血管通透性的变化情况,以及输注外源性周细胞对血管反应性和血管通透性的回复作用,以进一步明确周细胞对脓毒症大鼠血管反应性和血管通透性的协同保护作用。第四部分周细胞协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制1.周细胞调节血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能的直接作用利用培养的VSMC和VEC,观察正常和LPS刺激下周细胞与VSMC和VEC间直接接触的情况,以及对VSMC舒缩功能和VEC屏障功能的直接调节作用。2.周细胞微囊泡（PCMV）协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制利用培养的周细胞:（1）观察周细胞和功能增强周细胞分泌微囊泡数量的变化;（2）观察PCMV在VSMC和VEC中的吸收情况;（3）观察PCMV对整体动物和离体细胞血管反应性和血管通透性的影响;（4）观察PCMV及Poly（i:C）PCMV所含生长因子、microRNA的数量、种类的变化,观察这些活性物质对VSMC收缩功能和VEC屏障功能的影响。主要研究结果:第一部分脓毒症周细胞结构和功能的变化及与血管反应性和血管通透性的关系1.大鼠CLP和LPS致脓毒症后,肠系膜微血管周细胞数量明显减少、脱落;肠系膜微动脉舒缩反应性降低、血流速度逐渐减慢、肠系膜上动脉p-MLC20表达降低,肠系膜微静脉血管通透性增加、血管内皮细胞明显肿胀、内皮连续性结构破坏、紧密连接明显开放同时伴有红细胞渗出、肠系膜上静脉ZO-1和VE-cadherin表达降低。结果提示脓毒症后周细胞的脱落与血管低反应性和血管渗漏密切相关。2.周细胞荧光标记的小鼠脓毒症后,肠系膜微静脉及毛细血管PDGFR-β荧光表达降低,微血管周细胞脱落;肠系膜微动脉舒缩反应性降低,血管渗漏增加、血管内皮细胞明显肿胀、血管内皮结构破坏。上述结果进一步证实脓毒症后周细胞的脱落与血管低反应性和血管渗漏密切相关。第二部分输注外源性周细胞对脓毒症大鼠血管低反应性和血管渗漏的协同保护作用输注周细胞可定植于肠系膜微静脉上,在输注后24h定植最多。周细胞输注后可明显提升脓毒症大鼠72h的存活率和存活时间,明显改善脓毒症大鼠血管反应性、血管流速及肠系膜上动脉p-MLC20的表达;改善肠系膜血管屏障功能、改善血管内皮细胞结构和增加连接蛋白表达,功能增强（Poly（i:c）预处理）的周细胞效果更好。提示外源性周细胞对脓毒症血管反应性和血管通透性具有协同保护作用。第三部分周细胞敲减大鼠血管反应性和血管通透性的变化及输注外源性周细胞对血管舒缩功能和屏障功能的回复作用周细胞敲减大鼠肠系膜微血管周细胞数量减少、覆盖率明显降低,血管舒缩反应性明显降低,血管通透性明显增加、血管内皮紧密连接明显开放、血管内皮连接蛋白表达明显降低,周细胞输注后可恢复周细胞减少导致的血管舒缩功能和屏障功能的破坏。脓毒症会加重周细胞敲减大鼠的血管低反应性和血管渗漏,输注外源性周细胞可明显改善周细胞敲减大鼠脓毒症后血管反应性、血流速度和肠系膜上动脉p-MLC20表达,改善血管通透性,增加连接蛋白的表达;功能增强（Poly（i:c）预处理）的周细胞效果更好。提示输注外源性周细胞对周细胞敲减大鼠的血管反应性和血管通透性具有回复作用。第四部分周细胞协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制1.周细胞调节血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能的直接作用周细胞与VSMC和VEC可直接接触形成连接,直接调节VSMC的收缩功能和VEC的屏障功能。2.周细胞微囊泡协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制周细胞可通过产生微囊泡（PCMV）协同改善VSMC舒缩功能和VEC屏障功能。机制研究发现,PCMV可通过携带Ang-1、miR-145和miR-132来发挥对VSMC收缩功能和VEC屏障功能的协同保护作用。miR-145主要作用于VSMC,抑制Sphk2和S1PR1表达,增加S1PR2和p-MLC20的表达,改善血管平滑肌细胞舒缩功能;miR-132主要作用于VEC,抑制Sphk2和S1PR2的表达,增加S1PR1、ZO-1和VE-cadherin的表达,改善血管内皮细胞屏障功能。提示周细胞主要通过分泌微囊泡携带Ang-1、miR-145和miR-132作用于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实现对脓毒症血管反应性和血管通透性的协同调控和保护作用。结论:1.脓毒症后肠系膜微血管周细胞结构破坏、数量减少、覆盖率降低,在血管低反应性和血管渗漏中发挥重要作用。2.输注外源性周细胞可协同改善脓毒症血管低反应性和血管渗漏。3.周细胞敲减大鼠肠系膜微动脉收缩和舒张反应性明显下降,血管通透性明显增加,输注周细胞后可明显恢复周细胞减少导致的血管舒缩功能和内皮屏障功能损伤。4.周细胞可通过直接接触和分泌微囊泡协同保护脓毒症血管反应性和血管通透性。直接作用主要是周细胞与VSMC和VEC直接接触形成紧密和缝隙连接,产生物理覆盖和调节作用。旁分泌作用主要是周细胞分泌内含多种活性物质的微囊泡来发挥作用,如Ang-1、miR-145和miR-132。一方面周细胞分泌携带Ang-1的微囊泡,传递至VSMC和VEC,增加血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能。另一方面,周细胞通过分泌携带miR-145和miR-132的微囊泡来发挥协同保护作用,其中miR-145主要在血管平滑肌细胞中起作用,它主要是通过降低Sphk2和S1PR1的表达,增加S1PR2和p-MLC20的表达来发挥作用;miR-132主要在血管内皮细胞中起作用,它主要是通过降低Sphk2和S1PR2的表达,增加S1PR1、ZO-1和VE-cadherin的表达来发挥作用。
丘志良[10]（2019）在《冠通方及拆方对大鼠颈总动脉球囊损伤后ERK信号通路的影响》文中认为目的:为阐明冠通方防治PTCA（Percutaneous transluminal coronary ang ioplasty,经皮冠状动脉腔内血管成形术）术后再狭窄（RS,restenosis）的机理,本实验采用国际通用球囊内膜剥脱法建立大鼠颈总动脉球囊损伤后再狭窄模型。使用HE染色法以观察大鼠血管在冠通方干预前后形态学的改变。本研究选取ERK（Extracellular regulated protein kinases,细胞外调节蛋白激酶）信号通路作为切入点。进而测定大鼠血清中TNF-α（Tum or necrosis factor,肿瘤坏死因子）含量,及大鼠血管中ERK1/2（ERK1/ER K2 Extracellularsignal-regulated pathway,ERK1/ERK2细胞信号转导途径）的表达。以探究冠通方配伍机理及为冠通方防治PTCA术后再狭窄提供新靶点依据。方法:将64只SD大鼠随机分为8组（正常组,模型组,假手术组,冠通方组,化瘀拆方组,祛痰拆方组,冠通方大剂量组,冠通方小剂量组。）其中假手术组只从颈外动脉向颈总动脉插入球囊导管,但不进行球囊拉伤,正常组则不手术给予灌水,拆方及大、小剂量组按相应剂量进行干预。造模前大鼠禁食12h,用10%水合氯醛（0.35ml/100g体重）腹腔注射麻醉,肝素腹腔注射100U/kg,仰位固定于手术台上。在无菌条件下沿颈中线剪开皮肤,游离右侧颈总动脉、颈内、外动脉,结扎颈外动脉远心端和甲状腺上动脉,用微型血管夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉。在右侧颈外动脉上剪一切口,从切口逆心方向插入2F球囊导管至颈总动脉,松开颈总动脉上的血管夹,将导管送入至主动脉弓处,然后回拉导管至切口部位,如此拖动球囊导管3次以损伤血管内膜。退出导管后,结扎颈外动脉,松开颈总动脉及颈内动脉的微型血管夹,恢复血流。缝合伤口,术后大鼠肌注青霉素（4万单位/只）三天。并与28天后取大鼠右侧颈总动脉血管段用HE染色法观察大鼠血管情况及使用WB,PCR法检测血管中ERK1/2含量,后在腹主动脉取血、分离血清,用于ELISA法测TNF-α含量。后对以上检测项进行综合分析。结果:HE染色结果显示在与各组比较中发现冠通方组及拆方组的血管较之其他组形态最为完好,外膜及内膜相关细胞排列整齐组织间连续完整,内膜平滑管壁均匀管道通畅;ELISA检测结果:检测大鼠血清中TNF-α的含量,结果显示冠通方组及拆方组可抑制大鼠血清中肿瘤坏死因子的产生;WB法检测p-ERK1/2蛋白表达,结果显示冠通方组及拆方组可以下调p-ERK1/2蛋白表达;灰度值分析:正常组与假手术组、冠通方组及拆方组三者灰度值显示较浅,表示在以上各组间p-ERK1/2蛋白表达较少;模型组与冠通方大小剂量灰度值显示较深,表示p-ERK1/2蛋白在模型组与冠通方大小剂量间表达较多;PCR法检测ERK1/2m RNA的表达情况,结果显示冠通方组及拆方组可以下调ERK1/2m RNA表达;最后通过HE染色结果,及ELISA法、WB法、PCR法检测TNF-α、ERK1/2蛋白、ERK1/2m RNA等指标结果综合分析可得冠通方组的效果优于其他组,对比他组P<0.05,差异具有统计学意义。拆方组研究中冠通方组与化瘀祛痰组有统计学意义P<0.05,表明祛痰拆方组及化淤拆方组在冠通方对RS的防治中起协同作用。结论:1、冠通方防治RS的机制可能与抑制血清肿瘤坏死因子-α因子表达及下调ERK通路中ERK1/2因子含量进而抑制血管炎症及内膜增生最终达到防治PTCA术后再狭窄的作用。2、拆方研究结果:以全方组效果最好,并揭示化瘀药与祛痰药配伍对RS的防治有协同作用并提示再狭窄主要病机以痰淤互结为主。
二、兔血管内皮细胞与平滑肌细胞体外增殖的相互影响(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、兔血管内皮细胞与平滑肌细胞体外增殖的相互影响(英文)（论文提纲范文）
（1）干细胞及其来源外泌体防治血管再狭窄的研究现状与问题（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 资料筛选 |
| 1.3 资料提取与文献质量评价 |
| 2 结果Results |
| 2.1 血管再狭窄形成 |
| 2.2 干细胞移植防治血管再狭窄 |
| 2.2.1内皮祖细胞防治血管再狭窄的研究 |
| 2.2.2 间充质干细胞防治血管再狭窄的研究 |
| 2.3 干细胞来源外泌体防治血管再狭窄的研究 |
| 2.3.1 内皮祖细胞来源外泌体及其对血管再狭窄的作用 |
| 2.3.2 间充质干细胞来源外泌体及其对血管再狭窄的作用 |
| 3 展望Prospects |
（2）DKK1介导生物力学对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 病理性低剪切力介导的内皮细胞Dickkopf1的调控在内皮-平滑肌细胞中的作用及对血管新生内膜形成的影响 |
| 中文摘要Ⅰ |
| 英文摘要Ⅰ |
| 符号说明Ⅰ |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 病理牵张力通过DKK1-ACE2对平滑肌细胞增殖、迁移的作用 |
| 中文摘要Ⅱ |
| 英文摘要Ⅱ |
| 符号说明Ⅱ |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（3）DKK1在机械牵张力调节血管平滑肌细胞功能和血管重构中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 平滑肌细胞DKK1基因敲除对病理性牵张力所致小鼠血管重构的影响 |
| 中文摘要Ⅰ |
| 英文摘要Ⅰ |
| 符号说明Ⅰ |
| 前言 |
| 0. 研究目的 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ DKK1介导的机械牵张力调控平滑肌细胞增殖和迁移功能的机制研究 |
| 中文摘要Ⅱ |
| 英文摘要Ⅱ |
| 符号说明Ⅱ |
| 前言 |
| 0. 研究目的 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（4）和厚朴酚抑制载脂蛋白E基因缺陷小鼠颈动脉动脉粥样硬化形成的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 和厚朴酚抑制ApoE-/-小鼠颈动脉动脉粥样硬化斑块的病理形成 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 高脂饮食和颈总动脉套管法建立ApoE-/-小鼠颈动脉AS模型 |
| 2.3.2 HE染色检测颈动脉血管形态及AS斑块的形成 |
| 2.3.3 Masson染色检测颈动脉血管中胶原纤维的增生 |
| 2.3.4 免疫组化染色检测颈动脉血管中α-SMA的表达及分布 |
| 2.4 统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 高脂饮食结合颈动脉套管能够有效构建ApoE-/-小鼠颈动脉AS模型 |
| 3.2 HNK减少AS斑块负荷 |
| 3.2.1 高脂饮食结合颈动脉套管增加ApoE-/-小鼠颈动脉AS斑块负荷 |
| 3.2.2 HNK剂量依赖性降低AS斑块负荷,作用与阿托伐他汀相当 |
| 3.3 HNK抑制VSMC合成胶原纤维 |
| 3.3.1 高脂饮食和颈动脉套管增加ApoE-/-小鼠颈动脉胶原纤维增生 |
| 3.3.2 HNK抑制VSMC合成胶原纤维,作用与阿托伐他汀相当 |
| 3.4 HNK抑制VSMC分化、增殖和迁移 |
| 3.4.1 高脂饮食和颈动脉套管增加VSMC的分化、增殖和迁移 |
| 3.4.2 HNK增加α-SMA表达,改善VSMC收缩功能 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 和厚朴酚减轻ApoE-/-小鼠颈动脉血管中的氧化应激、内皮细胞功能障碍和血管炎症反应 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 试剂盒检测ROS的含量、SOD的活性和NO的含量 |
| 2.3.2 PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS的mRNA表达水平 |
| 2.3.3 Western blot检测iNOS的蛋白表达水平 |
| 2.3.4 免疫组化染色检测iNOS的表达部位及含量 |
| 2.4 统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HNK减少ApoE-/-小鼠颈动脉AS血管中的氧化应激反应 |
| 3.1.1 HNK抑制ROS的生成 |
| 3.1.2 HNK减少SOD的消耗 |
| 3.2 HNK减轻ApoE-/-小鼠颈动脉AS血管内皮功能障碍 |
| 3.2.1 HNK降低NO的含量 |
| 3.2.2 HNK下调iNOS的mRNA表达水平 |
| 3.2.3 HNK抑制iNOS的蛋白表达 |
| 3.2.4 HNK改善iNOS在血管壁内的过度表达及异常分布 |
| 3.3 HNK降低ApoE-/-小鼠颈动脉AS血管中炎性细胞因子的表达 |
| 3.3.1 HNK降低TNF-α的mRNA表达水平 |
| 3.3.2 HNK降低IL-6的mRNA表达水平 |
| 3.3.3 HNK降低IL-1β的mRNA表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 和厚朴酚抑制ApoE-/-小鼠颈动脉血管中TLR表达及NF-κB信号通路激活 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Western blot检测TLR2、TLR4的蛋白表达水平 |
| 2.3.2 Western blot检测IκBα、p-IκBα及胞浆和胞核内NF-κB p65的蛋白表达水平 |
| 2.3.3 EMSA法检测NF-κB的DNA结合活性 |
| 2.4 统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HNK降低ApoE-/-小鼠颈动脉AS血管中TLR2、TLR4的表达水平 |
| 3.1.1 HNK降低TLR2的表达水平 |
| 3.1.2 HNK降低TLR4的表达水平 |
| 3.2 HNK抑制ApoE-/-小鼠颈动脉AS血管中NF-κB信号通路的激活 |
| 3.2.1 HNK降低胞浆中p-IκBα和胞核内NF-κB p65的蛋白表达水平,增加胞浆中IκBα和NF-κB p65的蛋白表达水平 |
| 3.2.2 HNK降低NF-κB的DNA结合活性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 Toll样受体在脑血管疾病发生发展中作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）低剪切力通过内皮细胞来源的外泌体miR-181b调控平滑肌细胞焦亡的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:低血管剪切力促进血管平滑肌细胞焦亡 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 低血管剪切力促进平滑肌细胞焦亡 |
| 3.2 低剪切力下内皮细胞及平滑肌细胞共培养抑制平滑肌细胞焦亡 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:内皮细胞来源的外泌体miR-181b抑制平滑肌细胞焦亡 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 数据统计 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 内皮细胞源性外泌体研究 |
| 3.2 内皮细胞源性外泌体调控平滑肌细胞焦亡 |
| 3.3 外泌体miR-181b调控平滑肌细胞焦亡 |
| 4 讨论 |
| 第三部分:外泌体miR-181b通过STAT3 信号通路抑制平滑肌细胞焦亡 |
| 1 前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 miR-181b靶基因预测及验证 |
| 2.4 数据统计 |
| 3 结果部分 |
| 3.1 miR-181b靶向STAT3 信号通路 |
| 3.2 miR-181b通过STAT3 调节平滑肌细胞焦亡 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 血管剪切力与动脉粥样硬化的相互关系 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于PI3K/AKT/mTOR自噬信号通路探讨络风宁0号对HCASMC增殖的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 络风内动理论指导下的心血管疾病研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 自噬及天然产物在心血管疾病中的研究现状及进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 人冠状动脉平滑肌细胞的体外培养 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 试剂耗材 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 试剂配制与分装 |
| 2.2 细胞培养 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞培养 |
| 4.2 无菌操作 |
| 5 结论 |
| 第二部分 络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 试剂耗材 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 药物及试剂配制 |
| 2.2 建立凝血酶诱导HCASMC增殖模型 |
| 2.3 摸索络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围 |
| 2.4 筛选络风宁0号支架涂层复合物抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖的最有效浓度 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 建立凝血酶诱导HCASMC增殖模型 |
| 3.2 络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围 |
| 3.3 络风宁0号支架涂层复合物抑制凝血酶诱导的HCASMC增殖的最有效浓度 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖过程中自噬及PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 试剂耗材 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 药物及试剂配制 |
| 2.2 Western blot法检测络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖过程中PI3K、AKT、mTOR及自噬相关因子蛋白表达的影响 |
| 2.3 RT-qPCR法检测络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导HCASMC增殖过程中PI3K、AKT及mTOR的mRNA表达的影响 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导HCASMC的增殖过程中PI3K、AKT、mTOR及自噬相关因子蛋白表达的影响 |
| 3.2 络风宁0号支架涂层复合物对凝血酶诱导的HCASMC增殖过程中PI3K、AKT及mTOR的mRNA表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）从NLRP3炎性小体探讨络风宁0号对HCAEC的保护作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 从“络风内动”学说到中药复合单体涂层支架/球囊研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 药物涂层球囊在经皮冠状动脉介入治疗中的应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三 NLRP3炎性小体在冠心病发生发展中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 DCB治疗小冠状动脉原发病变疗效性研究: 一项随机对照试验的meta分析 |
| 第一节 资料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 局限性 |
| 第五节 结论 |
| 第六节 参考文献 |
| 第二部分 络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用及机制 |
| 实验一 络风宁0号对体外培养HCASMC和HCAEC增殖的影响 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方案 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第六节 参考文献 |
| 实验二 建立血管紧张素Ⅱ诱导的人冠状动脉内皮细胞损伤模型 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方案 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第六节 参考文献 |
| 实验三 络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方案 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第六节 参考文献 |
| 实验四 基于NLRP3炎性小体探讨络风宁0号对AngⅡ诱导的HCAEC损伤的保护作用的机制 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方案 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第六节 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）促红细胞生成素导致腹主动脉瘤形成的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 促红细胞生成素诱导小鼠发生腹主动脉瘤的作用及分子机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 促红细胞生成素在血管紧张素II诱导腹主动脉瘤小鼠模型中的作用和机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
| 外文论文3 |
（9）周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制 |
| 2.1 材料和实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 白藜芦醇对脓毒症大鼠血管舒张功能的保护作用及机制 |
| 3.1 材料和实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 周细胞在血管相关疾病中的作用及调控研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）冠通方及拆方对大鼠颈总动脉球囊损伤后ERK信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 冠通方及拆方对大鼠颈总动脉球囊损伤后ERK信号通路的影响 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验原理 |
| 2.1 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2 聚合酶链反应(PCR) |
| 2.3 苏木精—伊红染色法(HE染色) |
| 2.4 免疫印迹试验(Western Blot) |
| 3 实验材料与方法 |
| 3.1 实验动物选取 |
| 3.2 实验药物 |
| 3.3 实验主要仪器及试剂 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.5 标本制备 |
| 3.6 HE染色法检测血管形态 |
| 3.7 ELISA检测TNF-α |
| 3.8 PCR检测ERK1/2 因子 |
| 3.9 Western Blot检测ERK1/2 |
| 4 统计学方法 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 一般情况 |
| 5.2 HE染色结果(选取20X物镜) |
| 5.3 ELISA法检测TNF-α结果 |
| 5.4 WB法检测ERK1/2 蛋白表达结果 |
| 5.5 PCR法检测ERK1/2 m RNA结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 相关讨论 |
| 1 中医对PTCA术后再狭窄的认识及病因 |
| 1.1 中医认为PTCA术后再狭窄(RS)的病机 |
| 1.2 PTCA术后再狭窄的中医证型 |
| 1.3 “正虚为本,痰淤为标。”为诊治要点 |
| 1.4 中医对于PTCA术后再狭窄(RS)的主要治法 |
| 1.5 中医治疗冠心病PTCA术后再狭窄的优势 |
| 2 PTCA术后再狭窄(RS)的认识 |
| 2.1 PTCA术简介 |
| 2.2 PTCA术的局限性 |
| 2.3 现代医学认为PTCA术后再狭窄的机理 |
| 3 冠通方配伍分析 |
| 4 关于冠通方的现代药理研究 |
| 5 方剂学研究中量效关系及拆方研究的意义 |
| 6 ERK通路及EKR1\2 因子与RS的关系 |
| 7 TNF-α与RS关系 |
| 8 TNF-α与ERK的关系 |
| 9 结果分析 |
| 9.1 、冠通方及大小剂量、拆方组对血管形态的影响 |
| 9.2 冠通方、拆方及大小剂量组对ERK1/2 的影响 |
| 9.3 冠通方、拆方及大小剂量组对TNF-α的影响 |
| 10 存在的问题和展望 |
| 10.1 存在问题 |
| 10.2 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述一 基于ERK信号通路探讨中医药防治PTCA术后再狭窄的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 基于“胸痹”论述中医防治冠心病PTCA术后再狭窄中药方剂运用规律探讨 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
四、兔血管内皮细胞与平滑肌细胞体外增殖的相互影响(英文)（论文参考文献）
- [1]干细胞及其来源外泌体防治血管再狭窄的研究现状与问题[J]. 帅芝琴,陈家蒙,刘滔滔,胡安玲,李利生,余丽梅,徐尚福. 中国组织工程研究, 2022(01)
- [2]DKK1介导生物力学对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用[D]. 刘晓琳. 山东大学, 2021(10)
- [3]DKK1在机械牵张力调节血管平滑肌细胞功能和血管重构中的作用及机制研究[D]. 郑腾飞. 山东大学, 2021(11)
- [4]和厚朴酚抑制载脂蛋白E基因缺陷小鼠颈动脉动脉粥样硬化形成的作用机制研究[D]. 刘源. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]低剪切力通过内皮细胞来源的外泌体miR-181b调控平滑肌细胞焦亡的实验研究[D]. 徐香山. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]基于PI3K/AKT/mTOR自噬信号通路探讨络风宁0号对HCASMC增殖的影响[D]. 王渊. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]从NLRP3炎性小体探讨络风宁0号对HCAEC的保护作用及机制[D]. 王凯. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]促红细胞生成素导致腹主动脉瘤形成的作用及分子机制研究[D]. 章萌. 山东大学, 2020(12)
- [9]周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制[D]. 张紫森. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [10]冠通方及拆方对大鼠颈总动脉球囊损伤后ERK信号通路的影响[D]. 丘志良. 广西中医药大学, 2019(02)