一、细胞衰老的研究进展(综述)（论文文献综述）
杨斓[1]（2021）在《基于生物信息学和网络药理学整合策略的人参平肺散干预特发性肺纤维化的机制研究》文中指出目的:特发性肺纤维化是一种慢性的致命性肺部疾病,主要影响老年群体,至今为止,其发病机制尚不完全明确,药物治疗手段有限。本研究应用生物信息学方法,通过特发性肺纤维化病人的转录组学数据探索疾病机制,比较与联系不同病人群体的疾病机制特征;从网络药理学的研究角度阐释古方人参平肺散对特发性肺纤维化的网络调控机制特点,比较与联系不同病人群体的作用机制;通过计算机模拟分子对接研究和体外实验研究,验证人参平肺散及其拆方干预特发肺纤维化的作用机制。方法:1.从美国国立生物技术信息中心GEO数据库下载GSE150910临床试验中肺移植手术病例的RNA测序原始数据,使用基因集富集分析（GSEA）挖掘特发性肺纤维化潜在的调控基因集,使用Reactome通路数据库富集分析关键通路与反应,使用R语言差异基因分析特发性肺纤维化与正常健康人的差异表达基因,分析关键基因的表达状态。2.使用加权基因共表达网络（WGCNA）分析挖掘特发性肺纤维化不同病人群体关联的基因模块,使用Reactome通路数据库富集分析不同病人群体的关键通路与反应,比较分析其共性与不同,使用文氏图分析分布在不同特征关联基因模块中的差异表达基因。3.基于网络药理学的研究策略,使用已发表研究、TCMSP、SwissTargetPrediction和Pharmapper等资源平台预测古方人参平肺散的潜在靶点,以GSEA分析得到的基因集作为疾病靶点,通过蛋白质相互作用网络和Reactome通路数据库预测人参平肺散干预特发性肺纤维化疾病的网络调控机制;以WGCNA分析得到的高、中年特征关联基因模块为疾病靶点,通过蛋白质相互作用网络和Reactome通路数据库分别预测人参平肺散对高、中年特征的网络调控机制。4.选择前述人参平肺散的网络调控机制中较为突出的TGF-β信号通路为研究对象。选择人参平肺散中的代表成分如 Ginsenoyne D、Ginsenoside 20-Glc-Rf、Notoginsenoside R1、Ginsenoside Rg1、6-Acetylacetonide、Caffeic acid、Timosaponin A1、Timosaponin B Ⅱ、Resveratrol、Rosmarinic acid、Xuelianlactone、Tectorigenin、sarsasapogenin、isomeranzin、glycyrol和Liquiritigenin作为配体,以TGF-β信号通路相关的靶点蛋白HDAC1、XPO1、HS90B、HS90A、A4、1433G、FYN、SRC、EGFR、LRRK2、ESR1、TGFB1、SMAD2、SMAD3和COL1A1为靶点,使用AutoDock进行拟分子虚对接,验证人参平肺散主要成分与靶点蛋白的结合能力。5.采用体外实验方法探讨人参平肺散全方及各拆方组（补益组、清肺组、化痰组）对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞MRC-5表型转化的影响。使用PCR和Western Blot方法检测TGF-β通路的成分Smad2/3、上皮间质转化标志α-SMA、细胞外基质1型胶原COL1A1和NADPH 4型氧化酶NOX4的基因、蛋白表达水平的变化。结果:1.GSEA分析得到9个基因集,分别为HALLMARK上皮间质转化、Kras下游信号、糖酵解、血管生成、G2/M检查点、凝血、Myc靶点V2版、E2F靶点和细胞连接基因集,以及对应的485个领先基因;疾病机制主要富集于细胞外基质、细胞衰老、细胞有丝分裂周期异常、凝血、DNA修复缺陷、细胞连接、糖类代谢和程序性死亡缺陷等;信号通路集中于Ras下游的PIK3/AKT、MAPK6/MAPK4通路,Ras家族通路Rho GTPase,酪氨酸激酶受体通路,TGF β家族和TP53转录调控通路等;衰老相关性分泌表型（SASP）因子主要为白介素4和白介素13家族。差异基因分析显示衰老表型相关基因CCND2、CDKN2A、TERT、GDF15、E2F8等均在疾病组显着上调。2.WGCNA分析富集得到疾病机制主要有细胞外基质、细胞应激、免疫、有丝分裂异常、凝血、细胞连接、肌肉收缩和糖脂蛋白代谢等机制,与GSEA分析的富集结果大部分吻合。WGCNA分析得到高龄特征（65岁以上）相关基因1076个,中年特征（55-65岁）相关基因422个,两组的机制都富集在细胞外基质、免疫系统、Ras下游信号系统、TP53细胞周期调控和TGF-β信号通路等。不同的是细胞周期异常、固有免疫和获得性免疫等反应在中年特征中更为显着;细胞衰老、未折叠蛋白质反应和内质网应激等在高龄特征中更显着富集。与高、中年特征关联的差异基因分别有203个和39个,其中有4组差异基因具有高度相关性,且与高龄特征相关,分别是（1）CDH2、SFRP1、SERPINE2、CXCL12、SFRP4和GEM,与上皮间质转化活动密切相关。（2）GREM1、VCAM1、PTHLH和RGS4,与上皮间质转化活动密切相关;（3）SLC7A5和HIF1A,与G2/M检查点活动有关;（4）UGT2B17和SLC12A3,与Kras下游信号密切相关。3.靶点整理共获取人参平肺散的药理靶点608个,与GSEA分析得到的基因集进行蛋白质相互作用网络分析得到核心靶点152个,机制主要涉及蛋白质翻译后修饰、细胞周期、DNA修复、TP53和FOXO为代表的转录调控活动、氧化应激和致癌基因诱导的衰老、SASP、固有凋亡途径、分子伴侣介导的自噬、细胞因子、固有免疫系统、雌激素受体介导的信号系统、Ras下游信号和TGF-β1信号通路等。人参平肺散成分与中、高年特征相关基因的核心干预靶点各有83个和90个,分别富集后,机制都主要涉及蛋白质翻译后修饰、细胞周期、TP53为主的转录调控活动、DNA修复、分子伴侣介导的自噬、氧化应激诱导的细胞衰老、SASP、免疫反应、Ras下游信号通路和TGF-β信号通路等。不同之处在于高龄组中金属蛋白酶的泛素化反应,SKP2介导的p27/p21的降解反应,获得性免疫反应尤为显着,此外致癌基因诱导的衰老、SASP和固有凋亡等也显着富集。中年组中FOXO、E2F6为主的转录调控活动和Toll样受体3层级反应为主的固有免疫反应尤为突出,此外囊泡运输、血小板聚集、焦亡和坏死也富集明显。4.经过计算机模拟对接验证,除了人参成分Ginsenoyne D的结合分数略低以外,其它成分与TGF-β通路成分HDAC1、XPO1、TGFB1、SMAD2和SMAD3蛋白的结合分数都达到了-5 kcal mol-1 以下。除知母成分Timosaponin AI、Timosaponin BⅡ对HS90A蛋白,人参成分Ginsenoyne D对HS90B和EGFR蛋白,桑白皮成分Xuelianlactone对LRRK2蛋白的结合分数较低,其它成分对TGF-β通路的间接作用靶点HS90B、HS90A、A4、1433G、FYN、SRC、EGFR、LRRK2和ESR1蛋白结合能力都达到了-5 kcal mol-1以下。所有成分与COL1A1蛋白结合能力都达到了-5 kcal mol-1以下。5.体外实验发现与模型组相比,全方组和各拆方组可明显降低α-SMA和COL1A1的mRNA和蛋白表达水平,提示全方组和各拆方组可以影响α-SMA和COL1A1基因的转录水平和转录后调控;全方组和清肺组可显着降低p-SMAD2的mRNA和蛋白表达水平,提示全方组和清肺组对该基因的转录水平和转录后调控都有明显疗效,补益组和化痰组对该基因的转录无明显调控作用;全方组和清肺组可显着降低p-SMAD3的mRNA和蛋白表达水平,补益组可显着降低mRNA水平,但蛋白表达无差异,说明全方组和清肺组对该基因的转录水平和转录后调控都有明显疗效,补益组对该基因的转录水平有明显调控作用,化痰组对该基因的转录无明显调控作用;全方组及各拆方组均可显着降低NOX4的mRNA和蛋白表达水平,说明全方组和各拆方组可以影响该基因的转录水平和转录后调控。结论:1.研究发现特发性肺纤维化病人的疾病机制与上皮间质转化、凝血、血管生成和糖酵解有关,并存在p16、TERT、CCND2和GDF15等细胞衰老表型,推测可能与Kras、Myc致癌基因诱导的衰老机制有关。研究既肯定了以往特发性肺纤维化异常基因与机制的研究,也发现了新的疾病机制特点和分子标志,如细胞周期异常、固有免疫和获得性免疫反应在55-65岁人群更为显着,细胞衰老、线粒体应激和未折叠蛋白质反应在65岁以上人群更为显着,得到了具有高度关联性,且与65岁以上特征相关的差异基因如GREM1、VCAM1、PTHLH和RGS4等。这些结果可能成为疾病的潜在靶点。2.人参平肺散可能通过蛋白质翻译后修饰、细胞周期、DNA修复、基因转录调控、氧化应激和致癌基因诱导的细胞衰老和免疫反应等机制干预特发性肺纤维化;可能通过金属蛋白酶降解,SKP2介导的p27/p21的降解反应和获得性免疫反应等机制干预65岁以上的病人;可能通过FOXO、E2F6的转录调控活动和固有免疫反应等机制干预55-65岁的病人。这些结果可能为进一步的实证研究提供理论依据。3.人参平肺散的代表成分与TGF-β信号通路中的成分蛋白和间接反应蛋白结合能力良好,为实证研究提供了理论基础。本章体外实验显示,人参平肺散全方和各拆方组可下调TGF-β1诱导的成纤维细胞间质标志α-SMA的升高,从而抑制成纤维细胞的表型转化。人参平肺散全方及拆方组均可减少TGF-β1诱导的成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白COL1A1的表达,从而抑制细胞外基质的沉积。人参平肺散全方和各拆方组均可下调TGF-β1诱导的成纤维细胞的促ROS生成酶NOX4的升高,从而抑制氧化应激压力。此外,人参平肺散全方和清肺组均可以抑制TGFβ的通路成分SMAD2/3的磷酸化。综上所述,人参平肺散可改善TGF-β1诱导后肺成纤维细胞的表型转化,可能是通过下调TGF-β通路中的SMAD2/3的磷酸化从而抑制了间质转化、细胞外基质沉积和氧化应激而作用。这些结果为进一步的实证研究提供了一定的依据。
郑文鸽[2]（2021）在《基于衰老相关分泌表型（SASP）研究黄芩素抑制H2O2诱导星形胶质细胞衰老的作用和机制》文中进行了进一步梳理黄芩素是从唇形科植物黄芩的干燥根中提取分离的黄酮类化合物,具有抗氧化、抗癌、神经保护等多种药理活性。已证明黄芩素可改善多种动物模型的记忆障碍,但其潜在作用机制仍然不明确。衰老是导致记忆障碍的主要危险因素,脑内衰老细胞的异常积累及其分泌的衰老相关分泌表型（SASP）与神经退变和认知障碍密切相关。因此,本研究采用H2O2诱导星形胶质细胞衰老模型,研究黄芩素的保护作用及延缓衰老的作用,并研究了其分子机制和代谢机制。研究结果表明,黄芩素可延缓H2O2诱导的星形胶质细胞衰老,表现为降低SA-β-gal活性,减少S期细胞数量,下调p16-INK4A和p21蛋白水平。黄芩素可保护H2O2诱导的星形胶质细胞损伤,表现为提高细胞活力,改善细胞形态,增加克隆和集落形成,减少氧化损伤（MDA和LDH水平）。黄芩素可抑制SASP（IL-6,IL-8,TNF-α,CXCL1和MMP-1）分泌及mRNA表达,并抑制SASP相关的NF-κB和JAK2/STAT1通路。1H-NMR代谢组学研究结果表明,黄芩素可调节亮氨酸、苏氨酸等10种差异代谢物,涉及精氨酸的生物合成等5条代谢通路。差异代谢物与SASP的相关性分析结果表明,亮氨酸与SASP因子显着相关。进一步的研究发现,外源补充亮氨酸可以抑制SASP的分泌,黄芩素可以通过下调支链氨基酸转移酶（branched-chain amino acid aminotransferase,BCAT1）和上调SLC7A5的表达来显着提高亮氨酸水平。总之,黄芩素可能通过抑制SASP,抑制JAK2/STAT1/NF-κB通路和调节亮氨酸代谢而在H2O2诱导的衰老星形胶质细胞中发挥保护作用和抗衰老作用,为阿尔兹海默症等神经退行性疾病的治疗提供新思路。目的:采用H2O2诱导星形胶质细胞衰老模型,研究黄芩素对H2O2诱导星形胶质细胞损伤的保护作用和抗衰老作用,以及对衰老相关分泌表型（SASP）的抑制作用;明确黄芩素延缓星形胶质细胞衰老的分子机制和代谢机制。方法:1.采用200μM H2O2诱导T98G星形胶质细胞衰老和损伤,通过检测衰老标志物SA-β-Gal、细胞周期、p16-INK4A和p21,评价黄芩素延缓H2O2致T98G细胞衰老的作用;通过细胞活力、细胞克隆形成、MDA和LDH检测,考察黄芩素对H2O2致T98G细胞损伤的保护作用。2.采用ELISA法考察黄芩素抑制H2O2诱导衰老星形胶质细胞SASP分泌的作用;采用q RT-PCR法考察黄芩素抑制H2O2诱导衰老星形胶质细胞SASP的mRNA水平的作用,采用Western Blot考察黄芩素对H2O2诱导衰老星形胶质细胞NF-κB、p-NF-κB、JAK2、p-JAK2、STAT1和p-STAT1蛋白的调节作用。3.采用1H-NMR代谢组学技术寻找黄芩素调节的差异代谢物和代谢通路,通过相关性分析寻找与SASP相关的代谢物,并采用ELISA法检测亮氨酸对H2O2诱导衰老星形胶质细胞SASP分泌的作用,考察黄芩素对细胞内亮氨酸含量及调节亮氨酸的关键酶（亮氨酸转氨酶、亮氨酸脱氢酶和支链氨基酸转移酶）的调节作用,采用Western Blot技术考察黄芩素对亮氨酸转运蛋白SLC7A5的调节作用,研究黄芩素调节亮氨酸代谢的作用机制。结果:1.200μM H2O2作用T98G细胞8 h能成功诱导衰老模型和损伤模型的建立。黄芩素预处理2 h可显着降低SA-β-gal酶活性,减少S期细胞数量、下调p16-INK4A和p21蛋白水平,表明黄芩素能延缓细胞衰老。此外,黄芩素能显着提高细胞活力,改善细胞形态,增加细胞克隆和集落形成,降低细胞外LDH水平和细胞内MDA水平,保护H2O2诱导的细胞损伤。2.黄芩素能抑制H2O2诱导的衰老星形胶质细胞SASP（IL-6、IL-8、TNF-α、CXCL1和MMP1）分泌及并下调其mRNA的表达水平,促进HGF的分泌并增加其mRNA表达水平,同时黄芩素能抑制NF-κB和JAK2/STAT1通路。表明黄芩素能调节SASP的分泌及其mRNA水平,并调节SASP相关通路NF-κB和JAK2/STAT1。3.1H-NMR代谢组学分析结果表明,黄芩素显着上调了10种差异代谢物,涉及5种代谢途径,包括精氨酸生物合成,精氨酸和脯氨酸代谢等。差异代谢物与SASP进行相关性分析,结果表明亮氨酸与6种SASP因子显着相关。进一步研究发现,外源补充亮氨酸（400-600μM）可以抑制SASP（IL-8、TNF-α和CXCL1）的分泌,且黄芩素可能通过下调BCAT1和上调SLC7A5促进亮氨酸在细胞内的积累。结论:黄芩素可能通过抑制SASP,抑制JAK2/STAT1/NF-κB通路和调节亮氨酸代谢,在H2O2诱导的衰老星形胶质细胞中发挥保护和抗衰老作用。
李凯明[3]（2021）在《补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床研究及对人髓核细胞活性与功能的影响》文中研究表明椎间盘源性腰痛（Discogenic lowback pain,DLBP）作为一种临床常见的腰椎间盘退行性疾病,多由椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration,IDD）引起,以“腰痛”为主要临床症状,一般无神经组织受压表现。近年来,随着科学技术的进步,尤其是磁共振影像技术的广泛应用,人们对DLBP的诊断和治疗方面取得了巨大进展。目前临床治疗DLBP主要包括西药、手术等疗法。尽管具体治疗方式多种多样,短期内疗效显着,但缺乏显着特异性,且主要停留在对症治疗层面,未对产生症状的病变椎间盘本身进行干预,复发率较高。中医学认为DLBP属于“腰痛”的范畴,且在治疗此类慢性脊柱骨伤科疾病方面积累了丰富的临床经验。课题组前期通过小样本的临床观察发现,将古方青娥丸化裁而来的补肾活血方应用到DLBP的治疗,能够减轻患者的疼痛,改善腰椎活动功能,提高患者的生存质量。但是,目前我们仍缺乏高等级的循证学临床研究,且评价指标仅限于主观指标,也未进行药物安全性评定;同时该方治疗DLBP的具体调控机制仍缺乏基础研究进一步阐释。因此,本项目在课题组前期研究的基础上,首先应用平行、双盲、随机、安慰剂对照的试验设计,进一步采用公认主观评分结合客观评价的方法,以期更加全面的评定补肾活血方治疗DLBP的临床疗效及安全性。然后采用HE染色、Masson染色、免疫组织化学分析等以观察药物对兔退变椎间盘组织结构形态及MMP-3、VEGF等相关蛋白表达的影响。最后采用MTT、免疫荧光技术、蛋白质印迹法、β-半乳糖苷酶染色等技术观察药物对IL-1β或H2O2诱导的人髓核细胞外基质内相关蛋白表达水平的影响。旨在从分子细胞水平探究补肾活血方调控椎间盘髓核细胞活性与功能延缓或抑制IDD进程的作用机制,也为下一步补肾活血中药延缓IDD的机理研究提供新思路。研究一补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床疗效及安全性目的:评价补肾活血方治疗DLBP的临床疗效及安全性,为进一步临床应用推广提供高等级的循证医学依据。方法:本研究严格按照纳入、排除标准,共纳入来自于我院脊柱骨科、骨伤综合科门诊的DLBP患者70例。应用平行、双盲、随机、安慰剂对照的试验设计方法,其中治疗组35例,对照组35例,以腰椎牵引为基础疗法,治疗组服用补肾活血方颗粒剂,对照组服用补肾活血方安慰剂,总疗程为3周,随访期3个月。分别于入组时,治疗后7、14、21天,及疗程结束后1个月与3个月随访,共六个时间点对比观察两组患者的VAS评分、ODI评分,与肌肉软组织张力位移、腰部压痛阈值、腰椎活动度,以及实验室检查、不良反应等指标,并记录分析相关临床试验数据。结果:两组患者在性别（P=0.208）、年龄（P=0.363）、病变节段（P=0.771）、病程（P=0.781）等方面的差异无统计学意义（P>0.05）,一般资料具有可比性。相关结局评价指标比较结果如下:（1）VAS评分方面:①与治疗前比较,两组患者在治疗后至随访时均有统计学意义（P<0.05）;②与治疗前及治疗1周时比较,治疗组在治疗2周后及随访时差异均有统计学意义（P<0.05）;③两组间比较治疗2周后至随访时治疗组较对照组均有显着差异（P<0.05）。（2）ODI评分方面:①对照组患者治疗3周后至随访时较治疗前差异有统计学意义（P<0.05）,随访1月时较治疗1周后也有明显差异（P<0.05）,随访3月时较治疗1周后与2周后有显着差异（P<0.05）;②治疗组患者治疗1周后较治疗前就有差异（P<0.05）,治疗2周至随访时与治疗前及治疗1周时相比,时间效应均有统计学意义（P<0.05）;③两组间比较治疗2周后至随访1月时治疗组较对照组均有显着差异（P<0.05）。（3）软组织张力位移方面:①较治疗前相比,治疗3周后两组患者的张力位移均显着增加（P<0.05）;②两组间比较治疗组较对照组位移增加显着（P<0.05）。（4）腰部压痛阈值方面:①治疗3周后,两组患者的腰部压痛阈值较治疗前均显着增加（P<0.05）;②两组间比较治疗组较对照组阈值增加显着（P<0.05）。（5）腰椎活动度方面:①对照组患者治疗3周后与治疗前相比,腰椎左侧屈度数显着增加（P<0.05）;②治疗组患者治疗3周后前屈、后伸、左侧屈、右侧屈角度较治疗前均显着增加（P<0.05）。（6）临床治疗效果方面:经补肾活血方治疗1,2,3周后总有效率分别为47.06%,61.76%,70.59%,表现出优于对照组的趋势。（7）安全性评价方面:①两组患者在治疗期间一般生命体征均未出现异常;②均未发现与药物有关的不良反应;③实验室及心电图等检查未见异常。结论:补肾活血方对椎间盘源性腰痛患者具有较好的临床疗效,能够显着减轻疼痛程度、改善功能障碍,且安全性较高。研究二补肾活血方对兔退变椎间盘模型的影响目的:应用补肾活血方对实验兔椎间盘退变模型进行干预,观察补肾活血方对IDD进程的影响。方法:40只健康兔随机分为5组,每组8只,分别为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,连续给药8周。采用HE染色、Masson染色等以观察药物对椎间盘组织形态结构的影响;采用免疫组织化学分析药物对MMP-3、VEGF等蛋白表达水平的影响。并记录分析相关动物实验数据。结果:（1）HE染色:正常椎间盘组织可见大量NPCs,ECM的排列均匀。造模后纤维环疏松、紊乱,部分出现断裂,细胞数量减少,指纹样改变突出,裂隙增多。药物干预后,中、高剂量组NPCs数量较低剂量组增多,ECM排列较低剂量组及模型组也更加规则,纤维环断裂减少,其中中剂量组的髓核组织形态更接近对照组。（2）Masson染色:正常椎间盘纤维环结构完整,胶原排列有序,呈现蓝色,NPCs呈现深红色或褐色,细胞质呈现红色,髓核组织与纤维环分界清晰。造模后,纤维环内层出现裂隙,NPCs排列紊乱,细胞变性、凋亡,髓核与纤维环边界模糊,髓核组织逐渐纤维化。中药干预后,胶原纤维含量显着增多,髓核及纤维环之间裂隙减少,且中、高剂量组组织形态明显优于低剂量组。（3）免疫组织化学分析:模型组MMP-3、VEGF蛋白阳性染色率较对照组均明显增加（P<0.05）,而中、高剂量组MMP-3、VEGF的表达较模型组均显着下调（P<0.05）。结论:补肾活血方可下调兔退变椎间盘组织中的MMP-3、VEGF表达水平,其中中剂量组的效应最显着,提示可能在IDD的过程中发挥了作用。研究三补肾活血方对人髓核细胞活性和细胞外基质的影响目的:观察补肾活血方对IL-1β和H2O2诱导的人NPCs活性、功能和ECM分解、代谢的影响。方法:通过培养人原代髓核细胞系,取传代后NPCs备用;按一定比例制备补肾活血方（BSHXF）提取液,向NPCs中加入不同浓度的BSHXF,分别于干预后24 h、48 h对细胞活性进行MTT检测;将研究共分五组,组别及干预方案分别为:①Control 组;②IL-1β组;③H2O2组;④IL-1β+BSHXF 组;⑤H2O2+BSHXF组;分别采用MTT法检测NPCs增殖情况;细胞免疫荧光技术检测Ⅱ型胶原表达情况;WB法检测Collagen Ⅱ、Aggrecan、MMP-3及ADAMTS-5等蛋白表达水平;SA-β-gal染色检测NPCs衰老情况;并记录分析相关细胞实验数据。结果:（1）BSHXF适宜浓度检测:①所有浓度的BSHXF对NPCs均无毒副作用,且5、10、50、100或200μg/ml处理48h后可显着提高NPCs的增殖率（P<0.05）。其中100μg/ml处理48h后促细胞活性和增殖作用最显着（P<0.01）。（2）MTT法检测细胞增殖情况:①24h细胞增殖,与Contrl组相比,其余四组细胞的增殖能力明显下降（P<0.01）;②48h细胞增殖,与Contrl组相比,其余四组细胞的增殖能力明显下降（P<0.01）;与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高（P<0.05）;与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高（P<0.05）;③72h细胞增殖,与Contrl组相比,其余四组细胞的增殖能力明显下降（P<0.01）;与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高（P<0.01）;与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组细胞的增殖能力明显提高（P<0.01）。（3）Ⅱ型胶原免疫荧光检测:①与Contrl组相比,其余四组细胞中Ⅱ型胶原表达显着下调;②与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组Ⅱ型胶原表达明显上调;③与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组Ⅱ型胶原表达明显上调。（4）WB检测:CollagenⅡ、Aggrecan蛋白检测结果显示:①与Control组相比:其余四组蛋白表达量显着下调（P<0.01）;②与IL-1β组相比:IL-1β+BSHXF组细胞中蛋白表达明显上调（P<0.01）;③与H2O2组相比:H2O2+BSHXF组细胞中蛋白表达明显上调（P<0.01）。MMP-3蛋白检测结果显示:①与Control组相比:其余四组蛋白表达量显着上调（P<0.01）;②与IL-1β组相比:IL-1β+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调（P<0.01）;③与H2O2组相比:H2O2+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调（P<0.01）。ADAMTS-5蛋白检测结果显示:①与Control组相比:IL-1β组,H2O2组蛋白表达量显着上调（P<0.01）,而IL-1β+BSHXF组,H2O2+BSHXF组蛋白表达量明显下调（P<0.01）;②与IL-1β组相比:IL-1β+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调（P<0.01）;③与H2O2组相比:H2O2+BSHXF组细胞中蛋白表达明显下调（P<0.01）。（5）细胞衰老情况:①与Contrl组相比,其余四组细胞衰老数量明显增多（P<0.01）;②与IL-1β组相比,IL-1β+BSHXF组细胞衰老数量明显减少（P<0.05）;③与H2O2组相比,H2O2+BSHXF组细胞衰老数量明显减少（P<0.01）。结论:（1）不同浓度的补肾活血方均可提高人NPCs活性,促进细胞增殖,100μg/ml浓度是一个较为适宜的实验浓度,可为后续细胞实验提供参照;（2）补肾活血方可以改善人NPCs活性与功能,在一定程度上延缓IL-1β或H2O2刺激诱导的人NPCs衰老或凋亡,为中医药防治IDD提供一种新的思路。
王靖怡[4]（2021）在《血管抗衰方通过miR-146a/TRAF6/NF-κB改善血管衰老机制研究》文中认为血管衰老在机体衰老过程中发挥重要作用,现已成为心脑血管疾病的首要危险因素。目前,血管衰老相关研究多集中于机制层面,临床干预手段较为局限,多围绕防治危险因素或改善内皮功能等方面展开。中医对于衰老的认识历史久远,围绕“未老先养”理念构建了丰富的理论和诊疗体系。因此,深入挖掘中医衰老相关认知,结合现代研究方法,进一步探索延缓血管衰老的具体干预措施及其机制是有意义的。有鉴于此,在“七情”须使合和指导下,结合血管衰老病生理过程及中医对血脉理论相关认识,选用植物基源相近、成分相似、传统功效互有重叠和补充的人参和三七组成血管抗衰方,共同发挥益气活血,通补血脉之功。为明确该方能否针对血管衰老发挥效用,本研究利用生物信息学、网络药理学、临床研究及细胞实验多种方法,旨在探索血管抗衰方的临床有效性及其具体作用机制,以期为延缓血管衰老提供切实有效的干预手段。目的利用生物信息学对衰老内皮细胞差异表达miRNA分子进行筛选,并预测差异表达miRNA分子作用的靶基因及下游通路,初步构建调控关系,利用网络药理学预测血管抗衰方干预血管衰老可能的作用靶点及涉及的生物学功能,通过临床研究验证其有效性及安全性,并在细胞实验中探讨其发挥作用的分子机制,系统构建“中医理论-组方用药-生信预测-临床验证-机制研究”的研究模式,以揭示血管抗衰方可从miRNA水平改善血管衰老。方法第一部分利用生物信息学方法筛选衰老内皮细胞差异表达miRNA及血管抗衰方延缓血管衰老作用靶点预测研究首先,利用GEO数据库筛选衰老内皮细胞差异表达miRNA分子,对GSE92655和GSE37092两个数据集进行分析,利用R语言（3.6.3版本）处理数据矩阵,以|log2FC|≥ 1 且 adjusted P value<0.05 作为筛选 DEMs（Differentially Expressed miRNAs）的条件,对筛选出的DEMs进行VENN交集,寻找共同的DEMs信息,利用ggplot2包绘制火山图并对DEMs进行标注,利用GEO2R分析工具对表达矩阵进行归一化处理后绘制相关图形。其次,利用TargetScan、miRTarBase 8.0、miRDB三大数据库对DEMs下游靶基因进行预测,进行VENN交集以提高预测准确性,同时利用Metascape网站对差异表达miRNA下游靶基因进行富集分析,miRpathDB2.0数据库及KEGG筛选并明确后续研究的下游通路。最后,利用口服生物利用度（oral bioavailability,OB≥30%）和类药性（drug-likeness,DL≥0.18）作为筛选条件,在TCMSP平台筛选血管抗衰方组成药物人参、三七主要活性成分,并利用CNKI及PubMed对其结果进行补充,利用TCMSP、ETCM及PharmMapper（norm fit≥0.9）获取成分靶点信息,利用cytoHubba获取排名前十的活性成分;利用NCBI、GeneCards、HAGR、OMIM收集血管相关疾病与衰老相关基因,取交集获得血管衰老相关基因,构建疾病靶点数据集,通过对成分靶点与疾病靶点取交集筛选出血管抗衰方主要活性成分发挥延缓血管衰老功效的潜在靶点,进行蛋白-蛋白互作网络构建与富集分析,以明确血管抗衰方可能参与的生物学过程或所涉及的信号通路。第二部分血管抗衰方干预血管衰老临床试验及miR-146a/TRAF6/NF-KB调控关系初步探索采用自身前后配对设计,对血管抗衰方临床有效性及安全性进行探索性研究,纳入血管动脉硬化检测诊断为动脉硬化的受试者共40例,给予血管抗衰方进行为期4周的干预。临床研究分为3部分开展,分别为有效性、安全性及探索性指标。有效性研究中分为主要疗效指标和次要疗效指标,主要疗效指标包括受试者脉搏波传导速度数值变化,以及血管僵硬度评级变化;次要结局指标包括血压、踝臂指数、生化指标、细胞因子、血液流变学及颈动脉超声。安全性指标包括血尿常规、肝肾功能及凝血功能,用以评估该药物的临床安全性。探索性指标包括:受试者血浆样品NO及ET-1变化情况以反映内皮功能变化;利用实时荧光定量PCR技术检测血液样品中miR-146a、TRAF6、NF-κB及下游相关炎症因子表达水平变化,并采用2-△△Ct计算治疗前后差异表达倍数。第三部分血管抗衰方调控miR-146a/TRAF6/NF-KB干预衰老内皮细胞作用机制研究首先,筛选合适的药物诱导模型,分别采用不同浓度梯度Ang Ⅱ和TNF-α对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）诱导24h,光镜下观察细胞形态学变化,CCK8法检测细胞增殖情况,SA-β-gal染色检测细胞衰老情况,流式检测细胞周期,RT-qPCR检测不同模型诱导后对miR-146a表达影响情况,综合选取适宜的造模药物及浓度。其次,在药物诱导模型上,进行血管抗衰方、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和三七总皂苷PNS无毒浓度筛选,利用CCK8法检测上述药物对细胞增殖抑制率的影响,以确定适宜药物干预浓度。最后,进行药物干预衰老内皮细胞的机制研究,共分为:对照组、TNF-α模型组、TNF-α模型组+人参皂苷Rg1组、TNF-α模型组+三七皂苷R1组、TNF-α模型组+人参皂苷Rg1组+三七皂苷R1组、TNF-α模型组+血管抗衰方组、TNF-α模型组+三七总皂苷PNS组,对各组细胞分别进行CCK8检测、SA-β-gal染色、流式检测,从增殖、衰老、细胞周期等功能层面评估药物作用,利用RT-qPCR、Western Blot和ELISA检测,判断miR-146a/TRAF6/NF-κB及其下游炎症效应分子表达水平变化。结果第一部分1、GSE92655 和 GSE37092 中获得 3 个共同的 DEMs,分别为 hsa-miR-146a、hsa-miR-181a、hsa-miR-1275。共同上调 DEM 为 hsa-miR-181a,共同下调 DEM为hsa-miR-1275,has-miR-146a在两个数据集中呈现不同差异表达趋势,故选定为本研究主变量;2、miRTarBase 8.0、TargetScan、miRDB 中对 miR-146a 下游靶基因预测交集为14 个:ERBB4、IRAK1、TRAF6、CD80、CARD10、LRP2、RARB、NUMB、CCDC6、PPP1R11、ROBO1、KDM2B、LFNG、SLC10A3,涉及前额发育、激活NF-κB诱导的激酶活性、模式规范过程、前额神经元产生、细胞间受体信号通路等。miRpathDB2.0及KEGG筛选出miR-146a与NF-κB信号通路及炎症反应关系密切。构建miR-146a/TRAF6/NF-κB作为血管衰老的可能机制。3、筛选出人参活性成分27个,作用靶点201个,三七活性成分12个,作用靶点150个,二者共同作用靶点为139个,cytoHubba分析排名前10的活性成分包括:三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等;四个数据库共获得246个血管衰老相关靶点;将成分靶点与疾病靶点取交集后有22个共同靶点,PPI网络及MCODE聚类显示以炎症和凋亡为主,GO和KEGG分析显示涉及调控NF-κB信号通路。预测血管抗衰方可能通过调控NF-κB信号通路改善血管衰老。第二部分1、血管抗衰方能够降低患者脉搏波传导速度,改善血管僵硬度评级,改善受试者血压水平,降低总胆固醇水平,升高高密度脂蛋白胆固醇水平,改善血液流变学情况,降低血液粘稠度;2、血管抗衰方对受试者血常规、肝肾功能无明显影响,对患者凝血功能有一定的调节作用;3、血管抗衰方可以降低受试者血浆中ET-1水平;在miR-146a/TRAF6/NF-KB调控关系验证中发现,血管抗衰方能够下调受试者miR-146a和NF-κB以及NF-κB1的表达水平,上调TRAF6表达水平,对于NF-κB通路后续效应因子也具有下调作用,以VCAM下调最为明显。第三部分1、形态学方面,TNF-α与Ang Ⅱ诱导后,HUVEC细胞排列逐渐稀疏,体积增大,胞内逐渐浑浊,且与Ang Ⅱ相比,TNF-α诱导后的细胞排列更为稀疏松散;CCK8法检测结果显示,采用Ang Ⅱ诱导细胞与对照组相比无显着变化,200ng/ml、100ng/ml和50ng/ml TNF-α对细胞增殖存在抑制作用,且存在浓度依赖现象;SA-β-gal染色阳性率显示,与对照组相比,Ang Ⅱ在四个浓度下诱导HUVEC的染色阳性率无显着变化,而TNF-α四个浓度均可使HUVEC的SA-β-gal染色阳性率升高;流式检测发现两种药物均可使细胞在G0/G1期聚集,且随诱导浓度的增加,GO/G1期占比随之增加。综上,选择100ng/ml TNF-α为模型诱导药物;2、CCK8法筛选药物无毒浓度分别为:人参皂苷Rgl 50μg/ml;三七皂苷R112.5μg/ml;三七总皂苷50μg/ml;血管抗衰方200μg/ml;3、功能层面,五种干预方式均能显着降低细胞增殖抑制率,提高细胞增殖能力,其中,以三七总皂苷和血管抗衰方效果更为明显;五种干预方式均能显着减少衰老细胞的数量和程度,其中人参皂苷Rg1+三七皂苷R1、三七皂苷R1更为明显;五组干预方式均能显着降低细胞G0/G1期占比,改善细胞周期阻滞,其中三七总皂苷和人参皂苷Rg1效果更为明显;4、在miR-146a/TRAF6/NF-κB通路验证中,五组药物均能降低miR-146a、TRAF6表达水平,五组药物干预后与模型组相比能够降低磷酸化形式的IκBα和磷酸化的p65,对于NF-κB起到一定的抑制作用,对于NF-κB通路下游相关炎症效应分子表达水平的改变具体包括:人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg1+三七皂苷R1、三七总皂苷PNS可以降低TNF-α水平,人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、血管抗衰方可以降低IL-1β的表达水平,人参皂苷Rg1+三七皂苷R1、血管抗衰方、三七总皂苷PNS可以降低VCAM表达水平;5、对于衰老相关分子标志物p16和p21而言,五组药物均能有效降低p16的表达水平,但对于p21表达水平的降低,以三七皂苷R1、血管抗衰方、三七总皂苷PNS为主发挥效应。结论1、生物信息学方法筛选出衰老血管内皮细胞差异表达miRNA分子为miR-146a,预测并构建miR-146a/TRAF6/NF-κB作为血管衰老炎症相关调控环节;2、血管抗衰方改善血管衰老临床有效,能够改善血管壁僵硬程度、内皮舒缩功能及血液粘稠度,对miR-146a/TRAF6/NF-κB可发挥调控作用,其中以miR-146a和NF-κB改善更为明显;3、血管抗衰方及其重要单体成分或组合形式,可以改善TNF-α诱导的内皮细胞衰老模型,降低衰老相关标志物水平,同时通过改善细胞增殖能力、减少细胞周期阻滞发挥功效;能够显着降低miR-146a和TRAF6表达水平,抑制NF-κB通路激活,降低其下游炎症效应分子表达水平,抑制衰老相关炎症反应。
李祥来[5]（2021）在《HIF-1α在营养缺乏诱导髓核细胞衰老中的作用研究》文中研究说明研究目的:取退变髓核组织和非退变髓核组织进行SA-β-Gal染色,观察其染色情况。通过分离大鼠髓核细胞,体外进行原代髓核细胞的培养并利用不同浓度的胎牛血清诱导髓核细胞衰老,探讨营养缺乏与髓核细胞衰老之间的关系;并且通过检测HIF-1α的表达含量明确髓核细胞衰老和HIF-1α之间的关系。研究方法:取人体退变髓核组织和非退变髓核组织进行SA-β-Gal染色。取200-250g的雄性大鼠的髓核组织,分离髓核细胞,体外进行原代髓核细胞的培养,将髓核细胞随机进行实验分组,用不同浓度的胎牛血清培养72小时,其中对照组为10%浓度的胎牛血清,低浓度组为5%胎牛血清,无浓度组为1%胎牛血清。使用SA-β-Gal染色剂进行细胞染色,观察正常髓核细胞和衰老髓核细胞的细胞形态学变化,在光学显微镜下计数总细胞数及SA-β-Gal阳性细胞数。利用western blot检测三组间p53、p21、HIF-1α蛋白的表达含量,定性分析三组间蛋白表达不同。利用qPCR技术检测三组间p53、p21、HIF-1αmRNA的表达含量,定量分析三组间mRNA表达不同。结果:通过取人体非退变髓核组织和退变髓核组织进行SA-β-Gal染色情况发现虽然二者的髓核细胞都会被蓝染,但是他们之间有明显不同。非退变髓核组织内髓核细胞染色较浅,但是其细胞形态略微呈圆形,并不十分规整,轮廓较为清晰。而退变髓核组织内髓核细胞被明显蓝染,其细胞形态也发生了变化,细胞形态较为规整,呈圆形,轮廓清晰。对照组、低浓度组、无浓度组SA-β-Gal染色发现三组都有蓝染细胞,但三组蓝染细胞数有明显不同,并且具有明显统计学意义（F=30.023,P<0.01）。多重比较结果显示:对照组和低浓度组对比无统计学意义（P>0.05）,而低浓度组和无浓度组对比有明显统计学意义（P<0.01）,对照组和无浓度组对比有明显统计学意义（P<0.01）。Western blot技术定性分析显示:对照组、低浓度组、无浓度组髓核细胞都表达p21、p53、HIF-1α蛋白,但三组的表达含量有较为明显的差异。qPCR技术定量分析显示三组髓核细胞都表达p21、p53、HIF-1α,但三组间的表达含量有明显差异。多重比较结果显示:p21在对照组和低浓度组的表达有统计学意义（P<0.05）,p21在对照组和无浓度组对比有明显统计学意义（P<0.01）,p21在低浓度组和无浓度组对比有统计学意义（P<0.05）;p53在对照组和低浓度组的表达有明显统计学意义（P<0.01）,p53在对照组和无浓度组对比有明显统计学意义（P<0.01）,p53在低浓度组和无浓度组间对比无明显统计学意义（P>0.05）;HIF-1α在对照组和低浓度组有统计学意义（P<0.05）,HIF-1α在对照组和无浓度组有明显统计学意义（P<0.01）,HIF-1α在低浓度组和无浓度组无统计学意义（P>0.05）。结论:低营养能诱导髓核细胞衰老,营养缺乏是髓核细胞衰老的因素之一;正常髓核细胞和衰老髓核细胞都有衰老基因表达（p53、p21）,但衰老髓核细胞表达高于正常髓核细胞;HIF-1α在正常髓核细胞和衰老髓核细胞都有表达,但衰老髓核细胞表达明显低于正常髓核细胞;SA-β-Gal在非退变髓核组织和退变髓核组织内都会有表达,但退变组织内颜色更深。
奚婷[6]（2021）在《培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究》文中进行了进一步梳理目的1 探究培元补肾安胎方治疗黄体功能不足（LPD）型复发性流产（RSA）的临床疗效和安全性。2 通过网络药理学和分子对接学探讨培元补肾安胎方治疗RSA的作用机制。3 探究孕酮诱导“种植窗期”子宫内膜急性衰老对胚胎着床的影响。4 以“种植窗期”子宫内膜急性衰老为切入点,探究培元补肾安胎方治疗RSA的分子机制,并对上述网络药理学预测机制进行验证。方法1 采用临床随机对照研究方法,收集脾肾两虚型LPD型RSA患者60例,随机分为两组:治疗组30例和对照组30例。治疗组予培元补肾安胎方和西药地屈孕酮片治疗,对照组予西药地屈孕酮片治疗。观察对比两组患者的一般情况、孕12周妊娠结局、治疗前后中医证候积分、血清E2、P和β-HCG、盆腔B超,及治疗前后肝肾功、血常规等安全性指标。2 采用网络药理学方法对培元补肾安胎方治疗RSA的作用机制进行分析,并运用分子对接学对结果进行初步验证,具体方法如下:通过检索TCM、TCMSP数据库得到培元补肾安胎方的化合物;通过TCMSP、Pubchem、CHEMBL得到化合物对应的靶点;利用Genecards和OMIM数据库收集RSA相关基因;利用R语言得到培元补肾安胎方治疗RSA的潜在靶点;string数据库构建PPI网络图;应用clusterProfiler包对共同靶点完成GO和KEGG富集分析;最后采用MOE软件分子对接评估培元补肾安胎方重要活性成分与关键靶点的结合活性。3 采用体内和体外实验相结合方法,体内实验:将ICR雌鼠随机分为PD0-PD9组、除衰组、对照组①、米非司酮（RU486）组、对照组②。PD0-PD9组分别于PD0-9天下午取材,除衰组、对照组①、RU486组、对照组②分别于PD5和PD9下午取材,观察对比胚胎着床数目,应用SA-β-gal染色、IHC、WB检测子宫内膜组织衰老标志物（SA-β-gal活性、P16蛋白）的表达。体外实验:不同浓度、时间点的甲羟孕酮（MPA）对2BS细胞进行干预,应用WB检测各组2BS衰老标志蛋白P53、P21、P16表达量,SA-β-gal染色检测2BS SA-β-al活性,光学显微镜观察2BS形态的改变,EdU检测2BS增殖功能,RT-PCR检测2BS SASP、PRL mRNA表达量。收集MPA诱导2BS的衰老上清液与HTR-8/SVneo共培养,应用CCK8、EdU、划痕及Transwell实验分别检测HTR-8/SVneo的增殖、迁移和侵袭功能。4采用Clark经典复发性流产模型鼠造模方法造模,将CBA/J雌鼠随机分为12组。正常组B、模型组B、西药组B、中药低剂量组B、中药中剂量组B、中药高剂量组B在PD14取材计算胚胎丢失率;正常组A、模型组A、西药组A、中药低剂量组A、中药中剂量组A、中药高剂量组A在PD5下午取材,应用HE染色观察小鼠卵巢黄体面积,Elisa检测血清P水平,SA-β-gal染色检测内膜的SA-β-gal活性,WB和RT-PCR检测子宫内膜P16、P53、P21蛋白和mRNA表达,IHC检测子宫P16蛋白定位分布及表达。结果1培元补肾安胎方对LPD型RSA临床疗效1.1保胎结局:治疗组保胎成功率93.33%高于对照组70%（p<0.05）。1.2中医证候疗效:治疗组总有效率96.67%高于对照组60.00%（p<0.01）。1.3中医证候积分:治疗后两组患者脾肾两虚型中医证候总积分均明显低于治疗前（p<0.01）。治疗组改善LPD型RSA患者脾肾两虚型证候优于对照组（p<0.05）。1.4止血时间:治疗组平均止血时间4.29±0.46天短于对照组6.48±0.54天（p<0.05）。1.5腹痛消失时间:治疗组平均腹痛消失时间5.48±0.35天短于对照组8.63±0.84天（p<0.05）。1.6血清激素水平:治疗组在孕9、11、12周血清E2值高于对照组（p<0.05）;治疗组孕6、7、9、11、12周血清P值高于对照组（p<0.05）;治疗组孕8、9、10、11、12周血清β-HCG值高于对照组（p<0.01）。1.7 B超检查:治疗组胚胎发育与孕周相符22例,小于孕周6例,胎停育2例;对照组胚胎发育与孕周相符14例,小于孕周7例,停育9例。1.8不良反应:治疗组肝功异常1例,对照组肝功异常3例、皮疹1例,两组在安全性方面无差异（p>0.05）。2网络药理学和分子对接探讨培元补肾安胎方治疗复发性流产的作用机制2.1培元补肾安胎方潜在化合物及作用靶点:潜在化合物186个,作用靶点136个。2.2 RSA疾病靶点:经过筛选去重共得到RSA靶点1658个。2.3共同靶点筛选及互作网络构建:共同靶标65个,潜在靶点分别至少与两个化合物相连接。2.4 PPI网络的构建和关键靶点的提取:PPI网络中有65个节点,其中VEGFA、IL6、EGFR、MPAK8、ESR1等是关键靶点。2.5 GO和KEGG富集:GO主要涉及转录因子活性、单加氧酶活性等。KEGG主要涉及 PI3K-Akt、MPAK、P53 等。2.6分子对接:核心化合物和潜在靶点分子对接得分均≤-5.0 kcal/mol。3孕酮诱导“种植窗期”内膜细胞衰老在胚胎着床中的作用研究3.1“种植窗期”内膜存在急性衰老的生理表现:IHC结果显示,P16蛋白在子宫内膜间质成纤维细胞、上皮细胞胞核呈阳性表达,PD0-PD5组随着怀孕天数的增加P16蛋白表达量逐渐增多,于PD5达到最大值,PD6-PD9组P16表达量逐渐减少。WB和β-gal染色也得出相同结果。3.2“种植窗期”内膜衰老有利于胚胎着床:清除衰老细胞后胚胎着床数目、SA-β-gal活性、内膜P16蛋白表达量少于对照组（p<0.01）。3.3孕酮可诱导成纤维细胞衰老:与空白组相比,各组MPA干预后2BS细胞SA-β-gal活性和衰老标志蛋白P16、P21、P53表达量增多（p<0.01）,细胞形态不规则、细胞核增大,其中MPA（8μM）作用16天,各指标变化显着（p<0.01）。EDU结果显示MPA干预后2BS增殖减慢（;p<0.01）。RT-PCR实验结果显示,MPA组CXCL-2、CXCL-1 等 SASP、PRL mRNA 表达高于空白组（p<0.01）。3.4孕酮诱导细胞衰老是胚胎着床的重要条件:RU486阻断孕酮作用后胚胎着床数目、内膜P16蛋白表达量及SA-β-gal活性小于对照组（p<0.01）。3.5孕酮诱导形成的衰老微环境有利于滋养细胞功能:Senescent CM共培养的HTR-8/SVneo细胞水平和垂直迁移、侵袭功能强于Young CM组（p<0.01）。4基于“种植窗期”内膜衰老探讨培元补肾安胎方治疗RSA的作用研究4.1胚胎丢失率:模型组胚胎丢失率高于正常组（p<0.01）,提示造模成功。中药各剂量组和西药组均低于模型组（p<0.05）。4.2血清P水平:模型组血清P水平低于正常组（p<0.05）。中药中剂量组和西药组血清P水平高于模型组（p<0.05）。4.3卵巢黄体面积:模型组黄体面积少于正常组（p<0.05）。中药中剂量组和西药组卵巢黄体面积多于模型组（p<0.05）。4.4 SA-β-gal染色:模型组内膜SA-β-gal活性少于正常组（p<0.01）。中药中、高剂量组和西药组内膜组织SA-β-gal活性多于模型组（p<0.01）。4.5内膜组织P16、P53、P21蛋白和mRNA表达:模型组P16、P53、P21蛋白和mRNA表达低于正常组（p<0.05）。中药低、中剂量组、西药组P16、P53、P21蛋白和mRNA表达高于模型组（p<0.05）。4.6免疫组化:P16蛋白在内膜成纤维细胞、上皮细胞的胞核中呈阳性表达,模型组内膜P16蛋白表达量低于正常组（p<0.01）,中药低、中剂量组、西药组内膜P16蛋白表达量高于模型组（p<0.01）。结论1培元补肾安胎方能明显改善脾肾两虚证候,减轻阴道流血、腹痛症状,提高血清E2、P、β-HCG水平,促进胚胎发育,提高LPD型RSA的保胎成功率。2通过网络药理学初步明确培元补肾安胎方治疗RSA的分子机制可能是通过调控P53信号通路,调节细胞衰老,从而治疗RSA。3“种植窗期”内膜急性衰老是胚胎着床的必要条件之一,其中足量足时间的孕酮是诱导内膜衰老的重要因素。4 P不足、“种植窗期”内膜急性衰老不足可能是LPD型RSA发病机制。培元补肾安胎方可能通过提高血清P和卵巢黄体面积,增加“种植窗期”内膜P53、P21、P16表达,促进“种植窗期”内膜衰老从而发挥保胎作用。
周琦琦[7]（2021）在《NAMPT基因工程化外泌体制备及其抗衰老作用初探》文中指出外泌体是直径在30-150nm间的纳米级囊泡,包含蛋白质、DNA、miRNA、lncRNA等多种生物分子,通过质膜融合或与表面受体结合方式参与细胞间的物质交换和信息交流,在多种疾病的发生发展过程中发挥关键作用。研究表明,间充质干细胞外泌体作为新型的理想的无细胞治疗方法,通过基因修饰或化学方式包裹药物向特定部位运输,在人和动物相关疾病的诊断和治疗方面具有较高的应用价值。NAMPT是NAD+补救合成途径的限速酶,在细胞周期、细胞代谢、细胞衰老及DNA损伤修复等生理活动中发挥着重要作用。NAMPT在哺乳动物体内有两种存在形式:细胞内和细胞外NAMPT（iNAMPT和eNAMPT）。已有研究证实细胞外囊泡内eNAMPT具有延缓衰老和延长小鼠寿命的作用。为研究过表达NAMPT基因脐带间充质干细胞外泌体（hUCMSC-Exos）能否增强抗衰老作用,本研究采用转基因技术改造外泌体,得到过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos,随后与人皮肤成纤维细胞共培养和饲喂秀丽隐杆线虫,研究其抗衰老作用,为外泌体修饰及NAMPT基因抗衰老研究提供依据。主要研究方法和结果如下:1.过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos构建及鉴定本研究通过转基因技术构建过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos。首先,构建过表达NAMPT基因的重组载体。然后通过慢病毒包装、感染、药筛,得到过表达NAMPT基因脐带间充质干细胞（hUCMSC）细胞系,并通过RT-PCR和Western blot进行鉴定。最后,收集细胞上清,提取外泌体并检测NAMPT蛋白的表达量。结果表明,脐带间充质干细胞内NAMPT mRNA和蛋白均高表达,且外泌体内NAMPT蛋白也高表达,这提示过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos构建成功。2.过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos对人皮肤成纤维细胞的衰老影响本研究通过过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos与人皮肤成纤维细胞共培养,从细胞生长曲线、β-半乳糖苷酶染色、细胞划痕试验、丙二醛含量检测及衰老相关基因P16和P21 mRNA和蛋白的含量检测等实验验证过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos对人皮肤成纤维细胞的抗衰老作用。结果表明,过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos不仅促进人皮肤成纤维细胞的增殖和迁移,还增强了其抗氧化能力和降低了其衰老相关基因的表达量。3.过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos对秀丽隐杆线虫抗衰老的影响为进一步验证过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos的抗衰老作用,利用过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos饲喂秀丽隐杆线虫,从其寿命、身体摆动频率及其体内超氧化物歧化酶和活性氧自由基等试验进行验证。结果表明,过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos不仅延长秀丽隐杆线虫的寿命,还增强了其抗氧化能力和运动能力。综上,本研究构建了 NAMPT基因过表达的hUCMSC细胞系,获得过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos。通过与人皮肤共培养和饲喂秀丽隐杆线虫发现,过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos具有显着的抗衰老作用,有望成为一种新型的抗衰老制剂。
盘婕[8]（2021）在《萨能奶山羊耳缘成纤维细胞分离培养及抗衰老研究》文中认为我国拥有丰富的畜禽遗传资源,畜禽遗传资源的保护和利用是国家种业创新,保护生物多样性、农业安全和生态安全的重要保证。在动物体细胞克隆技术不断发展和成熟的情况下,体细胞遗传资源保护和利用受到越来越多的关注。体细胞遗传资源的保护和利用对于优良家畜的扩繁、育种以及濒危动物的挽救和种质资源的保护都具有重要意义。亚精胺（Spermidine）是一种广泛分布于生物体内的多胺化合物,参与调控细胞生长和增殖、组织再生、DNA和RNA稳定、酶促调节反应、翻译调节、抗氧化、抗炎和自噬等多种生物学过程,其可通过诱导自噬基因相关转录物的显着上调,从而增强细胞自噬作用,改善细胞老化状态,延长生物体的寿命。本研究对萨能奶山羊耳缘皮肤组织进行体细胞分离和培养,利用亚精胺处理分离培养的奶山羊成纤维细胞,进行体细胞抗衰老方面的研究,旨在为奶山羊遗传资源的保护和利用提供技术积累和支撑。研究结果如下:1.试验使用组织块贴壁法成功分离培养奶山羊成纤维细胞并根据细胞传代时不同细胞胰蛋白酶敏感性的不同进行了细胞纯化。使用免疫荧光染色对纯化后的细胞进行成纤维细胞特异性标记物Vimentin的检测,结果显示细胞Vimentin呈阳性且纯度达到98.3%。通过上述试验成功获得了高纯度的奶山羊成纤维细胞。随后对奶山羊成纤维细胞进行了生物学特性研究,包括细胞生长曲线绘制、核型分析、微生物污染检测。使用细胞计数法绘制的细胞生长曲线呈“S”型,最大细胞增殖数目为1.33×105,观察细胞生长状况良好;核型分析结果显示染色体数目为2n=60,包括29对常染色体和1对性染色体,性染色体为XY型;微生物污染检测结果表明细胞未受到细菌、真菌及支原体污染。不同代数的成纤维细胞形态观察结果发现,随着传代次数的增加,细胞生长状态变差,细胞形态变得扁平且体积增大,老化现象明显。上述试验结果表明分离培养的奶山羊成纤维细胞状态良好且稳定可用于后续的利用,但随着传代次数的增加出现了细胞老化现象。2.对分离培养获得的奶山羊成纤维细胞,进行传代培养和D-Gal诱导衰老,分别设置P5（传代5代）、P13（传代13代）自然衰老组和D-Gal诱导衰老组3个组,以亚精胺处理P5和P13组细胞,分别处理24h和48h,并对培养的各组细胞进行细胞老化水平的检测,包括细胞衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性染色率、端粒长度、衰老相关基因p21、p53 m RNA表达水平、活性氧水平、周期G0/G1期比例和衰老相关分泌表型（SASP）。结果显示亚精胺处理组细胞的SA-β-Gal阳性染色率、衰老相关基因p21、p53 m RNA表达水平、活性氧水平、周期G0/G1期比例、衰老相关分泌表型较对照组显着降低,端粒长度较对照组显着升高。表明亚精胺处理改善了奶山羊成纤维细胞的老化状态。本研究成功分离培养了萨能奶山羊耳缘成纤维细胞,并通过亚精胺处理延缓了细胞的衰老,有利于萨能奶山羊体细胞遗传资源的保护和利用。
张燕卓[9]（2021）在《PIN1在耳蜗毛细胞衰老中的保护作用及机制研究》文中研究表明老年性聋（Age-related hearing loss,ARHL）是指随着年龄的增长而逐渐发生的以高频听力下降为主的感音神经性听力损失,其患病率随着年龄的增长而增加,是当今世界上最常见的听力损失的原因,长期的听力损失不仅影响日常交流,还会导致老年人抑郁以及认知能力障碍等疾病。ARHL发病原因及机制复杂,目前缺乏有效的临床治疗手段。因此,明确老年性聋潜在的发病机制,探索新手段抑制其发展显的尤为重要。本研究拟以老年性聋（Age-related hearing loss,ARHL）患者血清、C57BL/6小鼠血清、C57BL/6小鼠耳蜗组织、耳蜗毛细胞系HEI-OC1细胞为研究对象,探讨PIN1（peptidyl-proplyl isomerase NIMA-interacting 1）及其相关信号通路在耳蜗毛细胞及HEI-OC1细胞衰老中的作用及其可能机制,为进一步揭示老年性聋的发病机制,探索靶向治疗的方法提供实验依据。具体实验分为一下三部分:第一部分PIN1在ARHL患者血清、衰老小鼠血清和耳蜗中表达下调目的:观察并分析PIN1在ARHL患者血清、衰老小鼠血清和耳蜗中的表达情况及其与听力障碍的关系,初步探讨PIN1在老年性聋发病中的作用及意义。方法:1.收集临床ARHL患者以及健康者对照组血清,采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测人血清中PIN1蛋白以及氧化应激指标ROS、抗衰老蛋白Klotho的表达水平并分析与听力的关系。2.2月龄和12月龄雄性C57BL/6小鼠,每组6只,行脑干诱发电位（Auditory brain response,ABR）检测后,留取血后处死小鼠,收集双侧耳蜗。采用ELISA方法检测小鼠血清中PIN1蛋白以及氧化应激指标ROS、抗衰老蛋白Klotho的表达水平。β-半乳糖苷酶染色法检测各组小鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞的衰老情况。免疫组织化学和免疫荧光方法检测各组小鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞中PIN1的表达情况。结果:1.ARHL患者及C57BL/6小鼠的听力检测ARHL患者的听力是明显下降的,高频为甚。与2月龄小鼠相比,12月龄小鼠不仅在高频率的ABR阈值显着高于2月龄的小鼠,而且中低频率的ABR阈值也显着高于2月龄小鼠,提示12月龄小鼠的听觉功能明显下降。2.ARHL患者及老年C57BL/6小鼠血清中均出现PIN1、Klotho水平下降,ROS水平升高1)ELISA结果显示,与对照组相比,ARHL组患者的血清中ROS的水平升高,而抗衰老蛋白Klotho和PIN1水平降低。年轻对照组与老年对照组血清中ROS、Klotho和PIN1水平之间相比均无统计学意义。ARHL患者血清中ROS的水平与听阈值呈正相关,Klotho、PIN1的水平与听阈值呈负相关。2)动物实验显示,与对照鼠相比,老年C57BL/6小鼠血清中ROS水平升高、Klotho和PIN1水平降低。老年鼠血清中ROS的水平与听阈值呈正相关,Klotho、PIN1的水平与听阈值呈负相关。3.老年C57BL/6小鼠耳蜗中衰老细胞数量增加β-半乳糖苷酶染色结果显示,老年小鼠的螺旋神经节细胞（SGCs）和毛细胞（HCs）中与衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）阳性细胞多于年轻小鼠。4.在老年C57BL/6小鼠耳蜗SGCs及HCs中PIN1蛋白的表达降低IF和IHC分析表明PIN1蛋白的阳性表达定位于HCs和SGCs的细胞质及细胞核中。与年轻小鼠相比,老年小鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节中的PIN1表达明显下降。线性分析表明,PIN1在耳蜗中的表达与听力阈值呈负相关。结论:PIN1和抗衰老蛋白Klotho在老年性聋患者血清、老年C57BL/6小鼠血清中及老年C57BL/6小鼠螺旋神经节和毛细胞中表达水平降低,ROS表达水平增高,提示PIN1表达下降可能参与了老年性聋的发生。第二部分PIN1表达降低介导耳蜗毛细胞及HEI-OC1细胞衰老目的:本部分以成年C57BL/6小鼠血清、耳蜗和HEI-OC1细胞为研究对象,通过上调或抑制PIN1表达,观察毛细胞衰老及听力改变,探讨PIN1在耳蜗毛细胞及HEI-OC1细胞衰老中的作用。方法:1.为了探讨H2O2是否通过氧化应激诱导HEI-OC1细胞衰老以及对PIN1蛋白的影响,首先将细胞分别用不同浓度（0 m M、1 m M、2 m M、3m M、4 m M、5 m M）H2O2处理2 h,MTS法检测细胞存活率,并计算IC50,确定H2O2诱导HEI-OC1衰老的条件。采用免疫荧光方法检测PIN1蛋白的表达,Western blot方法检测PIN1、p16、p21、p53、p-p53蛋白的表达,β-半乳糖苷酶染色方法观察细胞衰老情况。2.检测PIN1在H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老中的作用及可能机制。将常规培养的HEI-OC1细胞分为Control组、H2O2组、H2O2+OE-PIN1组和H2O2+NC组。Western blot方法检测PIN1、p16、p21、p53、p-p53蛋白的表达,同时收集细胞进行β-半乳糖苷酶染色。3.不同浓度的胡桃醌处理常规培养的HEI-OC1细胞（1、5、10μm,45 min）,Western blot方法检测PIN1蛋白及衰老相关蛋白的表达,SA-β-Gal染色法检测细胞衰老情况。4.18只2月龄C57BL/6雄性小鼠,随机分为3组:正常对照组（n=6）,胡桃醌组（n=6）,溶剂对照组（n+6）。正常对照组不做任何处理,胡桃醌组每2天给予腹腔注射胡桃醌（1 mg/kg体重）,溶剂对照组每两天给予腹腔注射等剂量的溶剂（DMSO）,连续给药4周,进行ABR听力检测、留取血标本和耳蜗标本。5.ELISA法检测各组小鼠血清中的PIN1的水平。6.各组小鼠耳蜗毛细胞铺片,采用β-半乳糖苷酶染色法检测各组小鼠毛细胞的衰老情况。结果:1.H2O2对HEI-OC1细胞存活率的影响与Control组相比,在1、2、3、4、5 m M H2O2刺激细胞2 h之后,随着浓度增加,细胞存活率下降。IC50=1.17 m M,故选用1 m M的浓度刺激2 h为诱导HEI-OC1衰老的条件。2.H2O2可诱导HEI-OC1细胞发生衰老和PIN1表达下调1 m M H2O2持续刺激HEI-OC1细胞2 h,采用SA-β-Gal染色法观察细胞衰老。与对照组相比,H2O2组细胞中SA-β-Gal阳性细胞的百分比显着增加。此外,与对照组相比,H2O2显着上调了衰老相关蛋白p-p53、p21和p16蛋白的表达,而PIN1蛋白表达明显降低。3.PIN1过表达可抑制H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老与H2O2组相比,上调PIN1表达可降低H2O2诱导的p-p53、p21和p16的表达升高,同时PIN1过表达组中SA-β-gal阳性细胞的百分比也显着降低。4.PIN1抑制剂胡桃醌对HEI-OC1细胞PIN1及衰老相关蛋白表达的影响使用PIN1抑制剂胡桃醌后,细胞内PIN1的表达明显下降,而衰老相关蛋白p-p53、p21和p16的表达显着增高,SA-β-gal阳性细胞的百分比也明显增加。5.胡桃醌对C57BL/6小鼠听力及对血清中PIN1水平的影响与对照组相比,胡桃醌组小鼠的全频听阈值均有所提高,但以高频为主。ELISA结果显示,与对照组相比,胡桃醌组小鼠血清中PIN1水平显着降低6.胡桃醌可引起C57BL/6小鼠耳蜗毛细胞衰老在各组小鼠耳蜗的底转毛细胞中,胡桃醌组β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性细胞多于溶剂对照组。结论:PIN1介导耳蜗毛细胞及HEI-OC1细胞衰老,过表达PIN1抑制HEI-OC1细胞衰老;抑制PIN1的表达导致听力下降和毛细胞及HEI-OC1细胞衰老的发生。第三部分PIN1下调通过PI3K/Akt/m TOR信号通路介导HEI-OC1细胞衰老目的:本部分以HEI-OC1细胞为研究对象,以H2O2诱导HEI-OC1细胞衰老,分别过表达或抑制PIN1、抑制或激活Akt信号通路,观察细胞衰老变化,明确PI3K/Akt/m TOR信号通路在HEI-OC1细胞衰老中作用,探讨PIN1下调是否通过调控PI3K/Akt/m TOR信号通路参与HEI-OC1细胞的衰老。方法:1.为了明确PI3K/Akt/m TOR信号通路在HEI-OC1细胞衰老中的可能作用,将细胞随机分为:Control组、H2O2组、LY294002+H2O2组、SC79+H2O2组和H2O2+DMSO组。首先以LY294002 25μM、SC79 4μg/m L或DMSO预处理细胞1 h后给予1 m M H2O2刺激,2 h后收集细胞,Western blot方法检测PIN1、p16、p21、p53、p-p53、Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白的表达,同时收集细胞进行β-半乳糖苷酶染色。2.为了探讨PIN1是否通过调控PI3K/Akt/m TOR信号通路介导H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老,首先将HEI-OC1细胞分为Control组、H2O2组、H2O2+OE-PIN1组、H2O2+NC组和胡桃醌组,Western blot方法检测Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白及衰老相关蛋白的表达。结果:1.PI3K/Akt/m TOR信号通路活化参与H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老与对照组相比,H2O2组p-Akt、p-m TOR蛋白表达明显升高,而分别采用Akt信号通路的激活剂SC79或抑制剂LY294002预处理HEI-OC1细胞,再给予H2O2刺激,western blot结果显示,SC79能够显着上调p-Akt、p-m TOR蛋白表达,同时p-p53、p16、p21的表达和SA-β-gal阳性细胞的数量明显升高,而LY294002能够降低p-Akt、p-m TOR、p-p53、p16、p21的表达和SA-β-gal阳性细胞的数量。无论是Akt激活剂还是抑制剂均不影响细胞中PIN1蛋白表达。2.PIN1通过调控PI3K/Akt/m TOR信号通路介导H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老与H2O2组相比,上调PIN1蛋白表达能够逆转H2O2诱导的p-Akt和p-m TOR表达上调,同时衰老细胞和衰老相关蛋白表达下降。而胡桃醌能够降低HEI-OC1细胞中PIN1蛋白表达,上调p-Akt和p-m TOR的表达,HEI-OC1细胞的衰老和衰老相关蛋白表达升高。结论:过表达PIN1可以抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路的活化,从而减轻H2O2诱导的HEI-OC1细胞的衰老;抑制PIN1后激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,促进HEI-OC1细胞衰老;提示PIN1通过影响PI3K/Akt/m TOR信号通路来介导细胞衰老。第四部分ROS通过介导p53磷酸化下调PIN1的表达,进而影响毛细胞及HEI-OC1细胞衰老目的:本部分以成年C57BL/6小鼠血清、耳蜗和HEI-OC1细胞为研究对象,体外以H2O2诱导衰老,应用p53抑制剂Pifithrin-α（PFT-α）及自由基清除剂NAC处理细胞,观察PIN1表达及衰老、衰老相关蛋白表达,探讨ROS、p53与PIN1的关系,进一步探讨PIN1在毛细胞以及HEI-OC1细胞衰老中作用。方法:1.为了探讨p53活化是否影响H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老时PIN1蛋白表达,将常规培养的细胞随机分为:Control组、H2O2组、PFT-α（磷酸化p53的抑制剂）+H2O2组和H2O2+DMSO组。以PFT-α10μM或DMSO预处理24 h后以1 m M H2O2刺激细胞,2 h后收集细胞,Western blot方法检测PIN1、p16、p21、p53、p-p53蛋白的表达,同时收集细胞进行β-半乳糖苷酶染色。2.为进一步验证氧化应激在HEI-OC1衰老中的作用及PIN1蛋白表达的影响,使用ROS抑制剂N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）预处理细胞,再给予H2O2刺激,DCFH-DA探针法检测HEI-OC1细胞内ROS的含量,Western blotting方法检测检测PIN1蛋白及衰老相关蛋白的表达水平,SA-β-Gal染色检测细胞衰老情况。3.2个月C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、胡桃醌组、胡桃醌+NAC组（n=6）,给药方法:胡桃醌腹腔注射法给药,1mg/kg,每2天1次;NAC口服法给药,1.5g/kg/d;连续4周。分别进行ABR听力和相关指标的检测。结果:1.H2O2通过介导p53磷酸化下调PIN1的表达,进而影响衰老与H2O2组相比,H2O2与PFT-α共同孵育时,p-p53蛋白水平降低,但PIN1蛋白水平显着提高。此外,PFT-α预处理细胞能够降低H2O2引起的p21和p16表达上调,并且SA-β-gal阳性细胞的百分比也降低。2.H2O2通过ROS影响p53的表达和活性,进而影响衰老H2O2组细胞中ROS水平明显高于对照组,但当加入NAC后,ROS的水平几乎恢复到对照组水平,同时p-p53表达降低,PIN1的表达水平升高,而p21和p16的表达水平降低,SA-β-gal阳性细胞的百分比也降低。3.NAC处理能够改善胡桃醌引起的小鼠听力下降和耳蜗毛细胞的衰老与对照组相比,胡桃醌组在全频听阈均有所提高,但是以高频为主。但当同时给予自由基清除剂NAC治疗时,小鼠听力明显改善,听阈值下降,同时NAC治疗组小鼠的耳蜗毛细胞中β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性细胞减少。ELISA结果显示,胡桃醌组小鼠血清中ROS升高、PIN1降低,而NAC治疗组小鼠血清ROS水平下降,PIN1的水平上调。结论:在毛细胞衰老的过程中产生了大量的ROS,过量的ROS通过促进p53磷酸化,降低PIN1的表达,从而激活衰老相关蛋白表达,促进毛细胞衰老。
向前[10]（2021）在《NETO2在前列腺癌发生发展中的作用及机制研究》文中指出目的前列腺癌（prostate cancer,PCa）,是常见的老年男性泌尿系统恶性肿瘤,具有高发病率、高死亡率的特点。其发病机制多种多样,但其发生发展过程常伴有前列腺癌细胞内基因的异常表达,基因组不规律改变与前列腺癌的产生发展已成为研究前列腺癌致病机制的一大重点。神经纤毛以及类似透拉蛋白2（neuropilin and tolloid-like 2,NETO2）基因位于人类16号染色体,编码单次跨膜糖蛋白,最初研究认为主要表达于脑组织,参与脊椎动物脑部兴奋突触传导。最近的研究认为NETO2可作为促癌基因促进胃癌、胰腺癌、鼻咽癌等癌症的发生发展,但其在前列腺癌中的作用及机制尚不清楚。因此本课题旨在研究NETO2在前列腺癌中的表达水平及临床意义,探索其在前列腺癌中的功能及作用机制。方法利用Sanger Box软件和UALCAN等网站进行生物信息学分析,初步发掘NETO2在前列腺癌中的具体表达情况、与临床因素的关系及预后相关性。采用q RT-PCR和Western blot方法测定NETO2在前列腺癌细胞株中的表达情况;利用si RNA和慢病毒等载体构建下调或过表达NTO2的前列腺癌细胞株,通过MTS实验、单克隆实验、划痕实验、Ed U增殖实验、Transwell侵袭实验、裸鼠皮下成瘤实验等从体内、体外两方面探索NETO2对前列腺癌发生发展中的生物学行为影响;通过转录组测序分析及肿瘤相关分子信号通路节点蛋白的检测,探究NETO2影响前列腺癌生物学功能的可能的分子机制。结果利用生物信息学工具,可以看到在Taylor数据库中NETO2的表达量在癌旁组织、局限前列腺癌、转移性前列腺癌中逐渐增高;格里森评分、临床分期、病理分期、有无淋巴结转移、有无生化复发等临床因素也与NETO2表达水平密切相关;而且,NETO2低表达组预后优于高表达组（P=0.049）。与Taylor数据库的结果一致,TCGA数据库中的前列腺癌癌组织也比癌旁组织拥有更高的NETO2表达水平;高格里森评分组的患者癌组织NETO2表达量也更高;发生淋巴结转移的病患癌组织也较未转移者表达更高NETO2。在m RNA和蛋白水平,PC-3、DU145、C4-2、22-RV1、LN-Cap等实验室常用的前列腺癌细胞株均比前列腺上皮细胞RWPE1表达了更多的NETO2。利用si RNA敲低NETO2表达水平,MTS实验、单克隆集落形成实验、Ed U实验、Transwell侵袭实验及划痕实验等均显示了降低NETO2的表达后前列腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭等生物学特性均受到了抑制。而在构建稳定表达NETO2细胞株进行皮下成瘤实验后也可以得到相似的结果,过表达或沉默可以对应的增强或减弱前列腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力。稳转株转录组测序结合生物信息学分析,从富集程度评分、显着程度及差异基因的数目等方面评价,细胞衰老（cellular senescence）通路相关基因的变化程度最为显,提示NETO2可能通过调控与细胞衰老有关的通路发挥其功能。WB显示NETO2只调控p53-p21介导的细胞衰老来影响前列腺癌的发生发展,而对另一典型细胞衰老相关通路p16-p RB则无影响。同时,利用β-半乳糖苷酶染色也得到了相同的结果,相较于对照组,沉默NETO2表达后,有更多的肿瘤细胞进入了细胞衰老程序,更多肿瘤细胞呈现蓝色;然而过表达NETO2组进入衰老程序的细胞显着减少。86例临床病例资料对NETO2的临床具体情况进行验证,结果显示NETO2的表达不受患者年龄和术前PSA水平影响,但与格里森评分有关。病理分期≥T2期的患者肿瘤切片NETO2表达也较病理分期<T2的患者高（P=0.006）;有远处转移的患者肿瘤切片中也表达更多的NETO2（P=0.021）。通过Kaplan-Meier方法进行单因素生存分析,NETO2表达水平与PCa病人总体生存率相关（P=0.018）,低表达NETO2的患者拥有更长生存时间,预后更好。结论1、NETO2的表达与前列腺癌病人多种临床特征密切相关,表达升高可提示不良预后。2、下调NETO2可在体外抑制前列腺癌细胞PC-3、C4-2的增殖能力、侵袭能力和迁移能力。3、过表达或沉默NETO2的表达,可相应改变前列腺癌细胞PC-3、C4-2的体内成瘤能力。4、过表达或沉默NETO2,可相应影响前列腺癌细胞PC-3、C4-2的p53-p21蛋白表达水平,NETO2可能抑制p53-p21通路诱导的细胞衰老进而促进前列腺癌发生发展。5、NETO2表达水平与患者预后相关,表达量低者预后比表达量高者好。
二、细胞衰老的研究进展(综述)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞衰老的研究进展(综述)（论文提纲范文）
（1）基于生物信息学和网络药理学整合策略的人参平肺散干预特发性肺纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述 |
| 综述一 特发性肺纤维化发病机制的研究进展 |
| 综述二 生物信息学和网络药理学的主要研究方法及原理 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 基于特发性肺纤维化转录组数据的生物信息学研究 |
| 第一节 特发性肺纤维化的基因集富集研究 |
| 1 特发性肺纤维化的GSEA基因集富集分析 |
| 2 特发性肺纤维化关键基因的差异表达基因分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 特发性肺纤维化不同临床特征的加权基因共表达网络研究 |
| 1 特发性肺纤维化的基因共表达特征 |
| 2 特发性肺纤维化不同临床特征的基因共表达特征 |
| 3 特发性肺纤维化的分子特征 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 人参平肺散干预特发性肺纤维化的网络药理学研究 |
| 第一节 人参平肺散干预特发性肺纤维化的网络调控机制研究 |
| 第二节 人参平肺散干预中、高年龄特发性肺纤维化的网络调控机制比较研究 |
| 1 人参平肺散成分干预特发性肺纤维化高龄特征的网络机制 |
| 2 人参平肺散成分干预特发性肺纤维化中年特征的网络机制 |
| 3 讨论 |
| 第三节 人参平肺散对特发性肺纤维化调控机制的虚拟对接研究 |
| 1 以TGF β信号通路为例的通路靶点选择 |
| 2 人参平肺散靶点的计算机模拟对接研究 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 人参平肺散干预TGF-β_1诱导肺成纤维细胞MRC-5细胞表型转化的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 主要内容和结果 |
| 2 创新点 |
| 3 问题与展望 |
| 附录 中英文缩略词对照表 |
| 攻读博士期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）基于衰老相关分泌表型（SASP）研究黄芩素抑制H2O2诱导星形胶质细胞衰老的作用和机制（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 立题背景和意义 |
| 1.2 本课题的研究内容、技术流程图及创新点 |
| 1.2.1 研究内容 |
| 1.2.2 技术流程图 |
| 1.2.3 创新点 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 细胞衰老 |
| 2.1.1 细胞衰老 |
| 2.1.2 星形胶质细胞衰老在神经退行性疾病中的作用 |
| 2.2 SASP |
| 2.2.1 SASP简介 |
| 2.2.2 调节SASP相关通路 |
| 2.2.3 调节SASP的抗衰老药物 |
| 2.3 氨基酸代谢与阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD) |
| 2.3.1 支链氨基酸和m TOR信号通路 |
| 2.3.2 谷氨酸和谷氨酰胺 |
| 2.3.3 其他氨基酸 |
| 第三章 黄芩素抑制H_2O_2诱导T98G细胞衰老和损伤的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 试剂的配置 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 H_2O_2诱导T98G细胞衰老模型的建立 |
| 3.3.3 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞活力的影响 |
| 3.3.4 SA-β-gal染色 |
| 3.3.5 Western Blot |
| 3.3.6 细胞形态 |
| 3.3.7 细胞克隆形成 |
| 3.3.8 MDA检测 |
| 3.3.9 LDH检测 |
| 3.3.10 统计学方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 H_2O_2诱导T98G细胞衰老模型的建立 |
| 3.4.2 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞活力的影响 |
| 3.4.3 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞SA-β-Gal酶性的影响 |
| 3.4.4 黄芩素对H_2O_2诱导星形胶质细胞T98G细胞周期的影响 |
| 3.4.5 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞p16和p21 的影响 |
| 3.4.6 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞形态的影响 |
| 3.4.7 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞克隆形成的影响 |
| 3.4.8 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞抗氧化能力的影响 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第四章 黄芩素抑制H_2O_2诱导T98G细胞SASP因子分泌及SASP相关通路的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 SASP因子检测 |
| 4.3.2 qRT-PCR检测 |
| 4.3.3 Western Blot实验 |
| 4.3.4 统计学方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞SASP因子分泌的作用 |
| 4.4.2 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞SASP因子mRNA水平的作用 |
| 4.4.3 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞NF-κB和 JAK2/ STAT1 通路的作用 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 第五章 基于~1H-NMR代谢组学黄芩素改善T98G细胞衰老的机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 样本收集与处理 |
| 5.3.2 ~1H-NMR代谢图谱采集 |
| 5.3.3 ~1H-NMR数据的多元统计分析 |
| 5.3.4 相关性分析 |
| 5.3.5 亮氨酸相关酶和亮氨酸含量的ELISA检测 |
| 5.3.6 统计学方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 代谢物图谱指认 |
| 5.4.2 多元统计分析 |
| 5.4.3 代谢通路分析 |
| 5.4.4 差异代谢物与SASP的相关性分析 |
| 5.4.5 亮氨酸对H_2O_2诱导T98G细胞SASP分泌的作用 |
| 5.4.6 黄芩素调节亮氨酸及相关酶和蛋白的作用 |
| 5.5 讨论与小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 研究工作总结 |
| 6.1.1 黄芩素对H_2O_2诱导T98G细胞衰老的抑制作用和诱导细胞损伤的保护作用 |
| 6.1.2 黄芩素抑制H_2O_2诱导T98G细胞SASP因子分泌及SASP相关通路的作用 |
| 6.1.3 基于~1H-NMR代谢组学黄芩素改善T98G细胞衰老的机制研究 |
| 6.2 不足和展望 |
| 6.3 学习心得 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（3）补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床研究及对人髓核细胞活性与功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 文献研究 |
| 综述一 椎间盘退变的分子病理学研究 |
| 1 正常椎间盘的解剖学结构和生物学特性 |
| 2 椎间盘退变的病理表现 |
| 3 椎间盘退变的分子病理机制 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 椎间盘源性腰痛的现代诊疗学研究 |
| 1 定义及分型 |
| 2 现代医学发病机制 |
| 3 诊断 |
| 4 治疗 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述三 补肾活血中药防治椎间盘退变的作用机理研究 |
| 1 中医学对椎间盘退变的认识与治则 |
| 2 补肾活血中药防治椎间盘退变的作用机理 |
| 3 补肾活血中药对相关信号通路的影响 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床疗效及安全性 |
| 前言 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 补肾活血方对兔退变椎间盘模型的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 补肾活血方对人髓核细胞活性和细胞外基质的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 中医药科技查新报告书 |
（4）血管抗衰方通过miR-146a/TRAF6/NF-κB改善血管衰老机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 文献综述 |
| 综述一 血管衰老研究进展 |
| 综述二 人参三七应用沿革及血管抗衰方配伍理论基础 |
| 前言 |
| 第一部分 利用生物信息学方法筛选衰老内皮细胞差异表达miRNA及血管抗衰方延缓血管衰老作用靶点预测研究 |
| 第一章 基于GEO数据库筛选衰老内皮细胞差异表达miRNA |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 第二章 差异表达miRNA下游靶基因及作用通路预测和筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 第三章 基于网络药理学预测血管抗衰方改善血管衰老作用靶点 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 第二部分 血管抗衰方干预血管衰老临床试验及miR-146a/TRAF6/NF-κB调控关系初步验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 第三部分 血管抗衰方调控miR-146a/TRAF6/NF-κB干预衰老内皮细胞作用机制研究 |
| 第一章 药物诱导衰老细胞模型构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 第二章 药物干预内皮细胞衰老机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 中医药科技查新报告书 |
（5）HIF-1α在营养缺乏诱导髓核细胞衰老中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 主要试剂及仪器 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 髓核细胞的分离及原代髓核细胞的培养 |
| 3.2 低营养诱导髓核细胞衰老 |
| 3.3 SA-β-Gal染色观察髓核细胞染色 |
| 3.4 Western blot检测各蛋白表达水平 |
| 3.5 实时荧光定量PCR(qPCR)检测mRNA表达水平 |
| 4 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1 人体髓核组织SA-β-Gal染色结果 |
| 2 三组髓核细胞SA-β-Gal染色结果 |
| 3 Western blot技术检测三组髓核细胞p53、p21、HIF-1α蛋白的表达结果 |
| 4 qPCR技术检测三组髓核细胞p53、p21、HIF-1αmRNA的表达结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞衰老对椎间盘退变的影响研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 综述一 复发性流产的西医研究进展 |
| 1 复发性流产的病因研究 |
| 2 复发性流产的治疗现状 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药治疗复发性流产的研究进展 |
| 1 中医病因病机 |
| 2 复发性流产的中医证型分布状况 |
| 3 复发性流产的中医治疗现状 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 子宫细胞衰老与女性生殖功能 |
| 1 衰老细胞 |
| 2 子宫的生理解剖及功能 |
| 3 子宫衰老细胞对女性生殖功能的影响 |
| 4 子宫衰老细胞的治疗现状 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 培元补肾安胎方治疗黄体功能不足型复发性流产临床疗效观察 |
| 前言 |
| 1 研究材料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于网络药理学和分子对接探讨培元补肾安胎方治疗复发性流产的作用机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第四章 孕酮诱导“种植窗期”子宫内膜细胞衰老在胚胎着床中的作用研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于“种植窗期”内膜衰老探讨培元补肾安胎方对复发性流产作用机制的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 研究总结 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）NAMPT基因工程化外泌体制备及其抗衰老作用初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 抗衰老 |
| 1.1.1 抗衰老概述 |
| 1.1.2 抗衰老研究进展 |
| 1.2 NAMPT基因 |
| 1.2.1 NAMPT基因 |
| 1.2.2 NAMPT基因与抗衰老研究进展 |
| 1.3 脐带间充质干细胞外泌体 |
| 1.3.1 外泌体 |
| 1.3.2 脐带间充质干细胞来源外泌体 |
| 1.3.3 脐带间充质干细胞外泌体抗衰老的研究进展 |
| 1.4 人皮肤成纤维细胞与抗衰老研究 |
| 1.5 秀丽隐杆线虫与抗衰老研究 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第2章 过表达NAMPT基因的脐带间充质干细胞及其外泌体的构建和鉴定 |
| 前言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.1.5 相关的引物合成 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建NAMPT过表达载体 |
| 2.2.2 慢病毒包装及感染hUCMSC |
| 2.2.3 过表达NAMPT基因的hUCMSC细胞系的鉴定 |
| 2.2.4 外泌体提取与鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 NAMPT转基因hUCMSC细胞系的鉴定 |
| 2.3.2 NAMPT转基因的外泌体鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 过表达NAMPT基因脐带间充质干细胞外泌体对人皮肤成纤维细胞的影响 |
| 前言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 引物合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验分组 |
| 3.2.2 细胞计数 |
| 3.2.3 外泌体浓度测定 |
| 3.2.4 细胞生长曲线观察 |
| 3.2.5 细胞划痕观察 |
| 3.2.6 β-半乳糖苷酶染色观察 |
| 3.2.7 MDA含量检测 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测HSF细胞内p16和p21 mRNA表达量 |
| 3.2.9 Western blot检测HSF细胞内p16和p21蛋白表达量 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos促进HSF细胞增殖 |
| 3.3.2 过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos促进HSF细胞迁移 |
| 3.3.3 过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos减少β-半乳糖苷酶染色阳性率 |
| 3.3.4 过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos减少HSF细胞内MDA含量 |
| 3.3.5 过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos降低HSF细胞内p16和p21 mRNA的表达量 |
| 3.3.6 过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos降低HSF细胞内p16和p21蛋白表达量 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 过表达NAMPT基因的脐带间充质干细胞外泌体对秀丽隐杆线虫抗衰老的影响 |
| 前言 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 E.coliOP50培养 |
| 4.2.2 秀丽隐杆线虫冻存与复苏 |
| 4.2.3 秀丽隐杆线虫同期化处理 |
| 4.2.4 实验分组 |
| 4.2.5 ROS含量检测选择外泌体最佳处理浓度 |
| 4.2.6 寿命实验 |
| 4.2.7 身体摆动频率测定 |
| 4.2.8 活性氧自由基ROS测定 |
| 4.2.9 超氧化物歧化酶SOD含量检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 选取外泌体最佳处理量 |
| 4.3.2 过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos延长秀丽隐杆线虫寿命 |
| 4.3.3 过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos加快秀丽隐杆线虫身体摆动频率 |
| 4.3.4 过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos减少秀丽隐杆线虫体内ROS含量 |
| 4.3.5 过表达NAMPT基因的hUCMSC-Exos增加秀丽隐杆线虫内SOD含量 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文总结 |
| 结语 |
| 创新性 |
| 研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）萨能奶山羊耳缘成纤维细胞分离培养及抗衰老研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 体细胞的分离培养及遗传资源保护的研究进展 |
| 1.1 畜禽遗传资源保护的研究进展 |
| 1.1.1 畜禽遗传资源保护的发展状况 |
| 1.1.2 畜禽遗传资源保护的技术方法 |
| 1.2 细胞培养及生物学特性的研究进展 |
| 1.2.1 细胞培养技术的发展概况 |
| 1.2.2 细胞培养的方法及特点 |
| 1.2.3 细胞的生物学特性检测 |
| 第二章 细胞衰老与亚精胺抗衰老的研究进展 |
| 2.1 细胞衰老的研究概况 |
| 2.1.1 细胞衰老的特征 |
| 2.1.2 细胞衰老诱因的相关研究 |
| 2.1.3 细胞抗衰老的相关研究 |
| 2.2 亚精胺的研究概况 |
| 2.2.1 亚精胺的简介 |
| 2.2.2 亚精胺的合成与代谢 |
| 2.2.3 亚精胺的功能研究 |
| 2.3 亚精胺抗衰老的研究概况 |
| 2.4 研究目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第三章 奶山羊成纤维细胞的分离培养及鉴定 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂与耗材 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 原代奶山羊成纤维细胞分离培养 |
| 3.2.2 奶山羊成纤维细胞的纯化和鉴定 |
| 3.2.3 奶山羊成纤维细胞生长曲线的绘制 |
| 3.2.4 奶山羊成纤维细胞核型分析 |
| 3.2.5 微生物污染检测 |
| 3.2.6 奶山羊成纤维细胞形态观察 |
| 3.2.7 数据分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 原代奶山羊成纤维细胞的分离培养 |
| 3.3.2 奶山羊成纤维细胞的纯化与鉴定 |
| 3.3.3 奶山羊成纤维细胞生长曲线 |
| 3.3.4 奶山羊成纤维细胞核型分析 |
| 3.3.5 微生物污染检测 |
| 3.3.6 不同代数奶山羊成纤维细胞的形态观察 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 亚精胺提高奶山羊成纤维细胞抗衰老的研究 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 主要试剂与耗材 |
| 4.1.4 主要溶液的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 奶山羊成纤维细胞细胞活力检测 |
| 4.2.2 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal) |
| 4.2.3 细胞DNA的提取 |
| 4.2.4 细胞RNA的提取及反转录 |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR |
| 4.2.6 奶山羊成纤维细胞活性氧水平 |
| 4.2.7 奶山羊成纤维细胞细胞周期 |
| 4.2.8 奶山羊成纤维细胞衰老相关分泌表型 |
| 4.2.9 数据分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 亚精胺对奶山羊成纤维细胞细胞活力的影响 |
| 4.3.2 亚精胺对奶山羊成纤维细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色率的影响 |
| 4.3.3 亚精胺对奶山羊成纤维细胞端粒长度的影响 |
| 4.3.4 亚精胺对奶山羊成纤维细胞衰老相关基因 p21、p53 mRNA 表达水平的影响 |
| 4.3.5 亚精胺对奶山羊成纤维细胞活性氧水平的影响 |
| 4.3.6 亚精胺对奶山羊成纤维细胞细胞周期的影响 |
| 4.3.7 亚精胺对奶山羊成纤维细胞衰老相关分泌表型的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）PIN1在耳蜗毛细胞衰老中的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 PIN1在老年性聋患者血清、衰老小鼠血清和耳蜗中表达下调 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PIN1表达降低介导耳蜗毛细胞及HEI-OC1细胞衰老 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 PIN1下调通过PI3K/Akt/mTOR信号通路介导HEI-OC1细胞衰老 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 ROS通过介导p53磷酸化下调PIN1的表达,进而影响毛细胞及HEI-OC1细胞衰老 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 PIN1在衰老中的作用机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）NETO2在前列腺癌发生发展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞衰老机制与其肿瘤抑制作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间参加课题及发表论文情况 |
| 致谢 |
四、细胞衰老的研究进展(综述)（论文参考文献）
- [1]基于生物信息学和网络药理学整合策略的人参平肺散干预特发性肺纤维化的机制研究[D]. 杨斓. 南京中医药大学, 2021
- [2]基于衰老相关分泌表型（SASP）研究黄芩素抑制H2O2诱导星形胶质细胞衰老的作用和机制[D]. 郑文鸽. 山西大学, 2021(12)
- [3]补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床研究及对人髓核细胞活性与功能的影响[D]. 李凯明. 中国中医科学院, 2021(02)
- [4]血管抗衰方通过miR-146a/TRAF6/NF-κB改善血管衰老机制研究[D]. 王靖怡. 中国中医科学院, 2021(02)
- [5]HIF-1α在营养缺乏诱导髓核细胞衰老中的作用研究[D]. 李祥来. 青岛大学, 2021(02)
- [6]培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究[D]. 奚婷. 北京中医药大学, 2021(01)
- [7]NAMPT基因工程化外泌体制备及其抗衰老作用初探[D]. 周琦琦. 扬州大学, 2021(09)
- [8]萨能奶山羊耳缘成纤维细胞分离培养及抗衰老研究[D]. 盘婕. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [9]PIN1在耳蜗毛细胞衰老中的保护作用及机制研究[D]. 张燕卓. 河北医科大学, 2021(02)
- [10]NETO2在前列腺癌发生发展中的作用及机制研究[D]. 向前. 广州医科大学, 2021(02)