一、人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养（论文文献综述）
熊丽玲[1]（2021）在《SIRT1降低通过上调波形蛋白乙酰化水平影响高龄妊娠滋养细胞EMT的机制研究》文中认为研究背景:高龄妊娠（AMA）是指分娩时年龄达到或超过35岁。我国高龄妊娠的数量及占比逐年攀升,由此带来的子痫前期（PE）、妊娠期糖尿病（GDM）、早产（PTB）以及死胎等相关并发症的风险也随之升高,伴随的母体远/近期健康及围产儿不良结局相关问题日益凸显。目前,诸多文献已证实母体高龄是导致不良妊娠结局的独立风险因素,但深入探讨其基础病因机制的研究却较为匮乏。AMA胎盘所呈现的血管灌注不良、绒毛成熟障碍以及广泛脉管病变等早衰的病理学特征,强烈提示胎盘早衰及滋养细胞功能障碍可能是AMA致不良妊娠结局发生率升高的重要原因。SIRT1是一种NAD+依赖的去乙酰化酶,是目前衰老相关研究的热点分子,但其与胎盘早衰的关系尚未见相关报道。本研究拟应用分子生物学、细胞生物学、药理学等方法,从组织、细胞、个体三个层面探索SIRT1影响胎盘早衰及EMT的分子机制,为降低AMA妊娠不良结局提供潜在靶点。方法:首先,收集高龄妊娠（≥40岁）及对照组（<30岁）妊娠足月胎盘及早孕绒毛组织,通过免疫印迹试验（Western blot）对Sirtuins家族蛋白表达量及衰老相关标志物进行检测。通过免疫组织化学（IHC）及免疫荧光（IF）对SIRT1在早孕绒毛及胎盘中的表达及定位进行明确。通过分别将年轻与高龄的雌雄C57小鼠进行交配建立小鼠AMA模型。其次,通过sh RNA慢病毒转染或使用SIRT1激活剂或抑制剂调控HTR8/SVneo细胞中SIRT1的表达及活性,WB检测衰老相关标志物的表达,并通过侵袭实验及划痕实验对细胞侵袭迁移能力进行评估。将Elf5-Cre和Sirt1fl/fl小鼠交配产生滋养细胞特异性Sirt1-KO小鼠胎盘。最后,使用免疫沉淀-质谱联用法（IP-MS）鉴定出HTR8细胞和人早孕绒毛中与SIRT1结合的蛋白。结果:SIRT1是在AMA和对照组早孕绒毛及足月胎盘中唯一差异表达的sirtuin。SIRT1主要定位于细胞滋养层细胞（CTBs）和绒毛外滋养细胞（EVTs）。SIRT1也在高龄孕鼠胎盘中降低,并且高龄孕鼠胎盘连接层（Jz）明显变窄。SIRT1降低上调P53乙酰化水平,并伴有P21表达水平升高。敲降SIRT1以及使用抑制剂可以减弱HTR8细胞的侵袭迁移能力,而使用SIRT1激动剂可以明显增强HTR8细胞的侵袭迁移能力。Sirt1-KO小鼠胎盘衰老相关标志物表达增多,并且Jz层明显变窄,胎盘重量及胎儿重量明显降低。在滋养细胞中,SIRT1可与波形蛋白相互作用,调节其乙酰化水平并影响滋养细胞上皮-间质转化（EMT）过程。结论:由于滋养细胞SIRT1缺失,高龄妊娠在早孕期就存在胎盘早衰,并且,SIRT1降低促进波形蛋白乙酰化水平升高并抑制滋养细胞EMT过程。因此,SIRT1可能是改善AMA妊娠胎盘发育和围产儿不良结局的潜在治疗靶点。
李聪[2]（2021）在《生理性低氧经HIF1α-PLOD2/WIPF1促进滋养细胞侵袭的分子机制》文中指出胎盘是连接母体和胎儿结构的嵌合器官,对于妊娠维持和建立至关重要。胎盘滋养细胞分化为锚定绒毛滋养细胞和绒毛外滋养细胞,延伸穿过合体滋养细胞层,并通过蜕膜间质和血管内途径侵入母体子宫组织、重塑螺旋动脉,建立子宫胎盘循环以及随后的氧气和营养物质运输过程[1]。然而,EVT侵入子宫蜕膜的不足以及随后螺旋动脉重塑异常会导致自然流产、先兆子痫等不良妊娠结局[2,3]。目前,滋养细胞分化调节的具体分子机制仍不清楚。本研究采用人早孕绒毛组织、小鼠胎盘组织和人滋养细胞系结合相关组织形态学分析技术、分子生物学和细胞生物学检测技术,探究滋养细胞分化过程和自然流产发病机制,研究结果如下:一、生理性低氧经HIF1α的下游靶基因参与EVT分化调控首先对转录因子HIF1α靶基因和EVT分化过程中的差异表达基因进行生物信息学分析,并筛选出二者交集基因,作为转录因子HIF1α调控EVT分化的潜在靶标基因。同时采用滋养细胞生理性低氧模型、RT-q PCR和Western blot等方法进行实验验证,发现生理性低氧（8%O2）处理后,转录因子HIF1α及其下游靶基因WIPF1、PLOD2、HPCAL1、SLC16A3、FAM174B和SYDE1均上调表达,而NREP和CD4下调表达。过表达HIF1α后,上述基因被调控并呈现与生理性低氧处理后相同的表达模式。利用滋养细胞诱导分化模型针对上述关键因子的表达进行实验验证,发现在滋养细胞侵袭表型分化过程中WIPF1、PLOD2上调表达。提示在生理性低氧通过HIF1α调控滋养细胞下游靶基因参与EVT侵袭分化过程。二、PLOD2和WIPF1促进滋养细胞的迁移和侵袭鉴于滋养细胞在成功侵袭过程需要形成肌动蛋白细胞骨架突出结构伪足小体,同时降解细胞外基质相辅相成[4]。我们进一步从细胞外基质重构相关基因PLOD2及肌动蛋白细胞骨架重塑相关基因WIPF1开展后续研究。第一,基于PLOD2基因,通过Transwell侵袭、细胞划痕和绒毛外植体实验,发现敲低靶基因PLOD2后可显着抑制滋养细胞的侵袭、迁移和外植体外延水平。为了探究PLOD2对滋养细胞EMT的影响,我们检测了滋养细胞EMT标志物表达水平,发现干扰PLOD2抑制了滋养细胞上皮–间质转换。第二,针对WIPF1基因,通过上述实验同样发现干扰WIPF1后可对滋养细胞侵袭、迁移和外植体外延能力产生抑制,然而,过表达WIPF1后产生相反效果。为了进一步探究WIPF1参与滋养细胞侵袭分化的分子机制,我们采用过表达WIPF1质粒转染HTR-8/SVneo细胞,通过IP-MS发现WIPF1互作蛋白。利用GO及KEGG分析,结果显示WIPF1互作蛋白主要与肌动蛋白细胞骨架关键基因ACTN4及EMT相关基因Vimentin有关。通过细胞骨架染色发现,敲低WIPF1干扰滋养细胞的细胞骨架重塑和非典型伪足小体的形成,而过表达WIPF1产生相反效果。提示在PLOD2和WIPF1参与EVT迁移、侵袭和EMT过程,是调控EVT功能的重要因子。三、WIPF1经YAP促进滋养细胞侵袭利用滋养细胞系HTR-8/SVneo和JEG-3的WIPF1干扰和过表达模型和Western blot方法检测了相关EMT蛋白表达,结果显示WIPF1过表达可促进滋养细胞上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）。进一步通过EMT激活剂TGFβ1对HTR-8/SVneo细胞进行诱导,Western blot检测蛋白水平发现WIPF1、N-Cadherin均可被TGFβ1诱导,并且挽救由于敲低WIPF1导致的WIPF1水平下调及其引起的N-Cadherin的下调,促进滋养细胞EMT。此外,通过免疫荧光法和Western blot法检测了YAP和β-catenin的滋养细胞定位和蛋白表达水平,结果显示过表达WIPF1较对照细胞YAP和β-catenin核表达和蛋白水平上调,反之,敲低WIPF1较对照细胞YAP核表达和蛋白水平下调。不仅如此,通过YAP抑制剂VP处理滋养细胞,结果发现YAP抑制剂下调对照组YAP、Vimentin,同时上调E-Cadherin,并且WIPF1过表达组可以上调YAP抑制剂组上皮标记蛋白E-Cadherin,促进滋养细胞EMT。有趣的是,HTR-8/SVneo细胞敲低和过表达WIPF1,并使用TGFβ1处理后,发现TGFβ1诱导的阴性对照质粒组细胞、敲低WIPF1组细胞的YAP核表达水平上调。不仅如此,在HTR-8/SVneo细胞经过VP处理后可显着降低转染阴性对照质粒NC-m Cherry组和过表达WIPF1组细胞的的肌动蛋白骨架重塑及非典型伪足小体荧光强度和数目。提示WIPF1作为上游因子介导YAP参与EVT肌动蛋白骨架重塑和EMT调控过程,促进滋养细胞侵袭。四、WIPF1异常表达参与自然流产发生采用免疫组化和免疫荧光法,发现WIPF1在早孕绒毛中高量表达,但在流产绒毛中低表达,同样在正常小鼠妊娠第八天母胎界面由PL1标记的滋养巨细胞（Trophoblast giant cell,TGC）位置高表达,但在流产小鼠TGC低表达。这暗示WIPF1的异常表达可能参与自然流产发生。本研究证实生理性低氧可以诱导HIF1α上调,并进一步介导其下游靶基因PLOD2、WIPF1的上调表达,促进EVT分化,其异常表达可能参与自然流产的发生,为揭示自然流产发病的潜在靶标因子及其分子机制提供了科学依据。
徐增伟[3]（2020）在《Notch3表达异常影响胎盘滋养细胞分化的检测分析与调控机制研究》文中进行了进一步梳理合体滋养细胞作为母胎屏障的重要组成部分,承担母胎间营养、气体交换和激素分泌等生物学功能,在维持正常妊娠的过程中扮演重要角色。Notch信号在人干细胞生态位的自我更新和分化,决定细胞命运发挥重要作用。Notch3作为Notch信号通路受体蛋白,亦可决定人胎盘滋养细胞命运,但其在人胎盘合体滋养细胞分化中的作用,以及此生物过程调控异常是否参与子痫前期的发生,目前均不明确。本研究利用人早孕绒毛、足月胎盘组织、原代滋养细胞（Primary Human Trophoblast,PHT）及BeWo细胞合体化模型,采用IFC、IHC、Western blot及qRT-PCR等检测技术,验证Notch3在人胎盘滋养细胞中的表达模式,明确Notch3在滋养细胞合体化过程中的作用;采用血清饥饿法阻滞BeWo细胞周期验证细胞周期阻滞对滋养细胞合体化过程的影响;利用缺氧培养BeWo细胞模型验证缺氧对滋养细胞合体化过程的影响;最后利用Ad-N3ICD腺病毒构建体内Notch3过表达孕鼠模型,明确Notch3对孕鼠的影响以及探究Notch3在子痫前期发病中的作用。现研究结果如下:一、Notch3在人胎盘滋养细胞中的表达模式利用人原代滋养细胞体外自发合体化模型、人足月胎盘组织、人早孕绒毛组织及绒毛合体滋养细胞重建组织,采用qRT-PCR、IHC及IFC等检测技术,检测Notch3在人滋养细胞中的表达模式。结果显示:在人原代滋养细胞体外自发合体化模型中,Notch3及其它Notch家族受体及配体mRNA水平均发生下调;Notch3在人早孕绒毛及足月胎盘组织中主要表达于单核的细胞滋养细胞中,在合体滋养细胞中呈低表达;在人早孕绒毛新生合体滋养细胞中,Notch3的表达亦较低。二、Notch3在BeWo细胞合体化过程中的作用利用福斯克林（Forskolin,FSK）体外诱导BeWo细胞合体化,并使用Notch3信号通路抑制剂DAPT直接抑制Notch3胞内结构域（Notch3Intracellular Domain,N3ICD）入核,采用IFC、qRT-PCR及Western blot等检测技术,探究Notch3对BeWo细胞合体化的影响。结果显示:Notch3在BeWo细胞合体化过程中表达下调,并主要表达于单个核的BeWo细胞中,在合体BeWo细胞中表达较低;DAPT处理BeWo细胞后,细胞核内N3ICD水平降低,抑制Notch3信号激活,BeWo细胞合体化能力增强。三、细胞周期阻滞对BeWo细胞合体化过程的影响采用无血清饥饿法培养BeWo细胞诱导细胞周期同步化模型,以阻滞BeWo细胞周期于G1期。利用IFC、qRT-PCR、Western blot及流式细胞术等检测技术,明确BeWo细胞周期阻滞对其合体化过程的影响。结果显示:BeWo细胞经无血清饥饿法培养24 h后,G1期BeWo细胞数量增多,细胞周期成功阻滞于G1期;BeWo细胞周期阻滞后,促进了BeWo细胞合体化进程。四、缺氧对BeWo细胞合体化过程的影响采用缺氧培养BeWo细胞,利用qRT-PCR、Western blot、IFC及ELISA等检测技术探究缺氧经Notch3信号通路对BeWo细胞合体化过程的影响。结果显示:在缺氧条件下（2%O2）培养BeWo细胞并诱导合体化过程中,Notch3表达水平升高,BeWo细胞合体化能力受损;经Western blot检测BeWo细胞核蛋白组分,BeWo细胞核内N3ICD水平在缺氧条件下升高,缺氧增强了N3ICD转移入核的能力;通过ELISA检测BeWo细胞培养基中sFLT1,结果显示:缺氧增加了BeWo细胞合体化过程中sFLT1蛋白的分泌。五、N3ICD过表达小鼠模型呈现人子痫前期特征利用Ad-N3ICD腺病毒构建体内Notch3过表达孕鼠模型,在小鼠怀孕第6天（GD6）通过尾静脉注射腺病毒,通过检测孕鼠孕期血压、尿蛋白、血清中sFLT1水平变化及胎儿体重,明确Notch3对孕鼠妊娠结局的影响及验证Notch3对子痫前期发生的影响。结果显示:于GD6注射Ad-N3ICD后,孕鼠胎盘中N3ICD的mRNA水平升高,成功构建Notch3过表达孕鼠模型;Notch3过表达孕鼠的血压,尿蛋白及血清中sFLT1蛋白水平均于注射Ad-N3ICD后发生上调,GD18天的胎儿体重降低,成功模拟出人子痫前期特征。综合以上结果,本研究发现Notch3在滋养细胞合体化过程中发生表达下调,缺氧通过增加Notch3表达并促进N3ICD入核调控细胞周期,影响滋养细胞自我更新及分化平衡,从而抑制滋养细胞合体化并参与子痫前期发展。
文政芳[4]（2019）在《TNF-α通过miR-145-5p下调Cyr61表达抑制人绒毛膜滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞侵袭能力的研究》文中提出目的子痫前期（PE）是一种妊娠特有的临床疾病,其发病机制尚不清楚,临床治疗手段有限。因此深入研究PE的发病原因,为PE的早期诊断和有效地治疗提供依据就显得尤其重要。绒毛膜外滋养细胞浸润过浅是PE发病的主要原因,细胞迁移和侵袭能力受到多种分子和信号通路影响,筛选影响PE发生发展的分子将有助于深入理解PE的发病机制。人绒毛膜外滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞来源于早孕期滋养层细胞,具有绒毛膜外滋养细胞的特性,被大量的应用于滋养细胞的生物学活性的研究,国内外关于子痫前期的研究多数以HTR8/SVneo细胞作为细胞模型。本研究的目的是以HTR8/SVneo细胞为模型,研究TNF-α/miR-145-5p/Cyr61轴对HTR8/SVneo侵袭和迁移能力的影响,并着重探讨其中的分子机制,以期为子痫前期在临床上的抗TNF-α治疗提供依据,并试图为临床上子痫前期的早期诊断提供分子标志,为子痫前期的临床治疗提供靶标。方法（1）分别利用转化生长因子-β（TGF-β）、溶血磷脂酸（LPA）、白介素35（IL-35）和肿瘤坏死因子（TNF-α）处理HTR8/SVneo细胞,利用划痕实验检测上述因子对HTR8/SVneo细胞迁移能力的影响,根据实验结果选择对HTR8/SVneo细胞迁移能力影响较大的细胞因子进一步研究分子机制。（2）根据筛选结果,选择TNF-α做进一步研究,筛选TNF-α影响HTR8/SVneo细胞迁移能力的下游分子,使用不同浓度TNF-α处理HTR8/SVneo细胞,分别利用real time RT-PCR和Western blotting在mRNA和蛋白水平检测侵袭相关转录因子MSH同源盒蛋白2（MSX2）、叉头框蛋白M1（FOXM1）、转录因子插头框蛋白O1（FOXO1）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）和富含半胱氨酸蛋白61（Cyr61）等分子的表达情况。（3）依据筛选结果,确定Cyr61为TNF-α影响HTR8/SVneo细胞迁移能力的主要下游分子,利用基因克隆技术分别构建Cyr61慢病毒表达载体和Cyr61靶向shRNA表达载体,转染HEK293细胞包装成慢病毒颗粒,感染HTR8/SVneo细胞,利用划痕实验、Transwell等检测Cyr61对细胞迁移和侵袭能力的影响。（4）进一步证实探讨TNF-α影响Cyr61表达的分子机制,利用生物信息学和real time RT-PCR技术筛选TNF-α处理HTR8/SVneo细胞后,miRNAs的表达谱变化,筛选到miR-145-5p在TNF-α处理HTR8/SVneo细胞后升高;利用生物信息学和双荧光素报告系统验证miR-145-5p对Cyr61 mRNA沉默作用;利用合成miR-145-5p mimics、anti-miR-145-5p分别转染HTR8/SVneo细胞,Western blotting实验用来检测转染后HTR8-SVneo细胞中Cyr61的表达情况。利用划痕实验、Transwell等检测转染细胞迁移和侵袭能力变化。在HTR8/SVneo细胞中转染miR-145-5p inhibitor 48h后,用10 ng/mL TNF-α处理:划痕实验和Transwell实验用来检测TNF-α处理的HTR8/SVneo细胞中降低miR-145-5p表达对TNF-α介导的侵袭抑制的影响;结果（1）分别利用不同浓度TGF-β、LPA、IL-35和TNF-α处理HTR8/SVneo细胞24h后,划痕实验结果表明,TGF-β、LPA和IL-35对细胞的迁移能力没有明显影响,但是,终浓度为10 ng/ml和100 ng/ml的TNF-α可以显着抑制细胞的侵袭能力（P<0.05）。（2）real time RT-PCR结果表明,TNF-α处理的HTR8/SVneo细胞中侵袭相关转录因子Msx2、FOXO1、FOXM1、STAT3和Cyr61 mRNA表达均没有明显变化;Western blotting结果显示,TNF-α处理的HTR8/SVneo中侵袭相关转录因子Msx2、FOXO1、FOXM1和STAT3的表达没有显着变化,但是Cyr61蛋白表达水平显着降低（P<0.05）。（3）成功构建了Cyr61表达载体（pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro-Cyr61）和Cyr61靶向shRNA表达载体（pLKO.1-Cyr61-shRNA-1和pLKO.1-Cyr61-shRNA-2）,并包装成重组慢病毒颗粒,感染HTR8/Svneo细胞;real time RT-PCR和Western blotting的检测结果表明,在感染pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro-Cyr61重组慢病毒的HTR8/SVneo细胞中Cyr61在mRNA和蛋白水平表达均显着升高（P<0.05）。而在两株敲低细胞系中,Cyr61在mRNA和蛋白水平表达均显着降低（P<0.05）,而且pLKO.1-Cyr61-shRNA-1比pLKO.1-Cyr61-shRNA-2的效果要强。因此,我们用pLKO.1-Cyr61-shRNA-2稳转的细胞做后续实验。划痕实验结果显示,过表达Cyr61能够促进HTR8/SVneo细胞的迁移率（P<0.05）,而敲低Cyr61的表达则能够显着抑制HTR8/SVneo细胞的迁移率（P<0.05）。Transwell侵袭实验,我们得到了相似的结果。划痕实验和Transwell侵袭实验还显示,与转染载体的对照组细胞相比,过表达Cyr61的HTR8/SVneo细胞对TNF-α诱导的迁移和侵袭抑制具有明显的翻转效应。（4）real time RT-PCR结果显示,与对照组相比较,TNF-α处理的HTR8/SVneo细胞中miR-145-5p表达显着增加（P<0.05）;利用生物信息学方法分析结果显示,Cyr61-3′UTR与miR-145-5p有8nt碱基可以互补配对。双荧光素酶报告系统检测结果显示miR-145-5p mimics可以结合Cyr61-3′-UTR并抑制基因表达;转染miR-145-5p mimics后,real time RT-PCR结果显示,miR-145-5p的表达大约是原来的83倍;Western blotting结果表明,在转染miR-145-5p mimics的细胞中,Cyr61的表达显着下降,只有原来的26%左右;划痕实验和Transwell实验结果显示在HTR8/SVneo细胞中转染miR-145-5p mimics能够显着抑制HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭（P<0.05）,相反,转染miR-145-5p inhibitor则可以显着增强HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭（P<0.05）。而用miR-145-5p inhibitor转染HTR8/SVneo细胞48h后的划痕实验和Transwell实验结果表明,miR-145-5p inhibitor能够逆转10ng/ml TNF-α诱导的HTR8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的降低（P<0.05）。结论TNF-α能够上调miR-145-5p的表达,miR-145-5p过表达可以降低Cyr61蛋白的表达。miR-145-5p能够抑制HTR8/SVneo细胞的侵袭。Cyr61可以翻转TNF-α介导的对HTR8/SVneo细胞的侵袭的抑制作用。TNF-α通过上调miR-145-5p进而靶向调控Cyr61的表达从而发挥抑制HTR8/SVneo细胞的侵袭的作用。
张琼芳[5]（2019）在《Elabela在子痫前期发病中的作用及其潜在血压调控机制》文中提出研究目的:子痫前期（Preeclampsia,PE）是最为重要的妊娠期心血管风险不良暴露,具有内皮功能异常、氧化应激、炎症等与心血管疾病共同的病生理机制,应进行一体化防控。子痫前期的早期筛查和干预应该作为心血管病早期预防的开端。Elabela作为APJ受体的一种新发现的内源性配体,对胚胎发育、胎盘发育、促进血管生成、抑制肾重塑、抑制纤维化和调节体液平衡等方面有着积极的作用,近年来越来越多的动物实验显示Elabela可以促进胎盘中滋养层细胞的迁移和侵袭能力,进而有利于螺旋动脉重塑,此外还可能起到舒张血管、调节血压的作用。目前针对Elabela作用于胎盘发育和PE发生的研究甚少,它在人类妊娠及PE发生发展中的作用有待进一步探讨。因此,本实验首先观察人类胎盘中Elabela的表达情况,然后用Elabela蛋白对人绒毛膜滋养层细胞进行干预,探讨其对人类胎盘滋养层细胞功能的影响及其潜在血压调控机制,探索Elabela在PE防治上的潜在应用价值。研究内容与方法:⑴收集2016年12月至2018年4月间在中国人民武装警察部队特色医学中心产科分娩的子痫前期孕妇34例作为观察组,同期收集正常孕妇40例作为对照组,运用RT-PCR技术检测胎盘中Elabela、APJ受体及ERK1/2的相对基因表达水平,应用免疫组化方法检测Elabela和APJ受体的蛋白水平及其在胎盘结构中的具体表达部位,通过Western blot技术检测胎盘中ERK1/2磷酸化活化水平,最后通过Pearson相关分析将Elabela表达水平、APJ受体表达水平及ERK1/2磷酸化活化水平同孕妇的血压水平进行相关分析。⑵用正常孕妇和PE孕妇的血清来培养人绒毛膜滋养层细胞,常规胎牛血清作为空白对照,再添加Elabela蛋白进行干预,梯度药物浓度干预实验找出Elabela蛋白对人绒毛膜滋养层细胞的最佳药物浓度,运用CCK-8技术检测各组细胞的增殖情况,通过Transwell技术检测各组细胞的侵袭能力变化情况,最后应用Western blot技术检测各组中ERK1/2活化水平的改变情况。研究结果:⑴基线资料上对照组与子痫前组在年龄和入院分孕龄上的差异没有统计学差异（P﹥0.05）;子痫前组的入院收缩压、舒张压、心率、BMI、孕期增加体重、S/D、PI、RI均高与对照组（P﹤0.05）。RT-PCR结果显示相比于对照组,Elabela和APJ受体基因的相对表达水平均降低,差异具有统计学意义（P﹤0.05）;ERK1/2的基因表达在对照组和子痫前期组之间没有明显的统计学意义（P﹥0.05）。免疫组化结果显示Elabela和APJ受体在胎盘中的表达部位基本一致,主要表达于绒毛滋养层细胞与蜕膜细胞中,散在表达于血管内皮细胞中,主要表达部位是细胞浆和细胞膜;此外在表达强度上,相比于对照组,Elabela和APJ受体在子痫前期组中表达均是降低的（分别为12.13±1.93比15.95±2.08,P=0.002;9.22±1.56比14.57±4.167,P=0.009）。Western blot结果显示ERK1/2总蛋白与PERK1/2的分子质量是42/44KD,β-actin的分子质量是42KD;对照组与子痫前期组在ERK1/2总蛋白的表达差异上无统计学意义（1.18±0.18比0.85±0.10,P=0.09）,而相比于比对照组,子痫前期组中ERK1/2活化水平升高（1.10±0.17比0.47±0.11,P=0.03）。Pearson相关分析结果显示,Elabela与收缩压存在负相关（r=﹣0.46,P=0.01）,与舒张压存在负相关（r=﹣0.44,P=0.01）;APJ受体与收缩压存在负相关（r=﹣0.47,P=0.006）,与舒张压存在负相关（r=﹣0.45,P=0.01）;ERK1/2活化水平与收缩压存在正相关（r=0.45,P=0.04）,与舒张压没有相关性（r=0.31,P=0.17）。⑵梯度药物浓度实验结果显示当Elabela药物浓度为1ug/ml时,CCK-8干预2小时和4小时后所检测到的OD值最大,所以1ug/ml是Elabela作用于HTR-8/SVneo细胞系的最佳浓度。CCK-8结果显示各加药组比非加药组的OD值均明显升高（FBS+Ela组vs FBS组、N+Ela组vs N组、PE+Ela组vsPE组,P<0.05）;在非加药组中,FBS组的OD值高于N组和PE（P<0.05）,其中N组的OD值高于PE组（P<0.05）;在各加药组中,FBS组的OD值也高于N组和PE（P<0.05）,其中N组的OD值也高于PE组（P<0.05）。Transwell结果显示FBS+Ela组比FBS组的细胞数明显增多（10.61±3.62比5.41±0.62,P<0.05）,N+Ela组比N组的细胞数明显增多（11.34±3.82比6.34±0.73,P<0.05）,PE+Ela组比PE组的细胞数也明显增多（11.93+3.09比5.77±0.47,P<0.05）。Western blot结果显示TERK1/2、P-ERK1/2、β-actin的分子质量分别是42/44KD、42/44KD、42KD;各加药组与对应的非加药组相比,ERK1/2总蛋白水平之间的差异没有统计学意义（P﹥0.05）,分别是FBS+Ela组（1.06±0.11）vs FBS组（0.92±0.15）、N+Ela组（0.97±0.63）vs N组（1.01±0.12）、PE+Ela组（0.55±0.22）vsPE组（0.78±0.16）;而相比于非加药组,各对应加药组的ERK1/2活化水平明显降低（P<0.05）,分别是FBS组（1.82±0.23）vs FBS+Ela组（1.19±0.15）、N组（0.91±0.11）vs N+Ela组（037±0.11）、PE组（1.76±0.47）vs PE+Ela组（0.97±0.13）。研究结论:Elabela/APJ途径在人类妊娠中可能发挥着重要的作用,不仅可以加强胎盘滋养层细胞的增殖、侵袭以及随后的子宫螺旋动脉重塑,还可能通过抑制ERK1/2的活化水平起到舒张血管、降低血压的作用,提示Elabela可能会为子痫前期的防治和心血管疾病初始预防提供一个新的思路。
董峰[6]（2014）在《苦马豆素诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的信号转导通路研究》文中研究表明疯草（locoweed）是豆科黄芪属（Astragalus）和棘豆属（Oxytropis）有毒植物的总称，在世界范围内广泛分布，动物采食后会导致严重的疯草病（locoism），极大地危害了草原畜牧业的发展。研究发现，疯草中的主要有毒成分是苦马豆素（1，2，8-trihyroxyindolizidine，swainsonine，SW）。妊娠山羊采食含有SW的植物后，引起胎盘发育迟缓、充血，胎盘滋养层细胞发生病变，并最终导致妊娠山羊流产。胎盘滋养层细胞在胚胎发育和胎盘形成过程中发挥着重要作用，一些病原和有毒物质引起的胎盘滋养层细胞凋亡是导致滋养层细胞病变和动物流产的主要原因。本研究以山羊胎盘滋养层细胞为研究模型，检测SW对山羊胎盘滋养层细胞的细胞周期和侵袭特性的影响，探索SW诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的信号转导通路，以期揭示SW损伤妊娠山羊胎盘并导致山羊流产的分子机制。研究取得以下结果。1.采集妊娠45～60d的萨能奶山羊胎盘组织，无菌条件下分离、纯化得到了原代山羊胎盘滋养层细胞。原代山羊胎盘滋养层细胞贴壁后呈不规则多边形，细胞长满单层后呈典型的铺路石状，具有接触抑制的生长特点。纯化得到的细胞大多为单核滋养层细胞，同时含有少量的双核滋养层细胞。将携带有人端粒酶逆转录酶（human telomerasereverse transcriptase，hTERT）基因的pCI-neo-hTERT质粒导入第3代原代山羊胎盘滋养层细胞，经G418筛选14d后，挑取阳性细胞扩大培养。转染后第50代山羊胎盘滋养层细胞呈不规则多边形和典型的铺路石状、具有接触抑制的生长特点。通过免疫荧光检测发现，原代山羊胎盘滋养层细胞和转染后第50代山羊胎盘滋养层细胞特异性表达滋养层细胞标志分子—细胞角蛋白7（cytokeratin7，CK-7）。RT-PCR、Westren blot和TRAP-ELISA检测结果显示，hTERT基因在转染后山羊胎盘滋养层细胞内能稳定表达，并且保持着相对较高的端粒酶活性；通过绘制细胞生长曲线发现，转染后第50代山羊胎盘滋养层细胞的群体倍增时间比第3代原代山羊胎盘滋养层细胞群体倍增时间缩短将近1h。结果表明，转染后，hTERT基因稳定整合于山羊胎盘滋养层细胞基因组，在细胞中稳定表达并保持着相对较高的端粒酶活性，从而使细胞永生化。2. RT-PCR检测结果表明，转染后第50代山羊胎盘滋养层细胞和原代山羊胎盘滋养层细胞均表达上皮细胞特异性黏附分子E-cadherin；免疫荧光和RT-PCR检测显示，转染后第50代和原代山羊胎盘滋养层细胞能够表达与滋养层细胞侵袭特性相关的波形蛋白（vimentin，Vim）分子和非经典MHC-ⅠmRNA，Transwell细胞侵袭试验进一步证实了转染后的山羊胎盘滋养层细胞保留了原代滋养层细胞的侵袭特性；放射免疫检测发现，转染后的山羊胎盘滋养层细胞具有原代细胞分泌绒毛膜促性腺激素β亚基（CG-β）和胎盘催乳素（PL）的功能，并且差异不显着。软琼脂克隆形成试验和裸鼠致瘤性试验结果表明，转染后的山羊胎盘滋养层细胞没有发生肿瘤转化。研究结果表明，永生化的山羊胎盘滋养细胞保留了原代滋养层细胞的关键生物学特性和功能，并且没有获得肿瘤转化特性，可以作为研究山羊胎盘滋养层细胞功能和病原、毒物与滋养层细胞相互作用的细胞模型。3. MTT试验和台盼蓝排斥试验检测发现，山羊胎盘滋养层细胞分别经0、0.4、0.8、1.2μg/mL的SW处理24h后，细胞活性没有发生明显变化，1.6μg/mL的SW处理山羊胎盘滋养层细胞24h后，细胞活性显着降低。山羊胎盘滋养层细胞分别经0、0.4、0.8、1.2和1.6μg/mL的SW处理24h后，流式细胞术检测结果表明，浓度大于0.8μg/mL的SW显着地将细胞周期阻滞在G0/G1期，Western blot检测结果显示，细胞周期调控蛋白cyclin E，cyclin D1和CDK2的表达量随SW浓度升高而下降；细胞黏附试验发现，浓度大于0.8μg/mL的SW显着抑制了山羊胎盘滋养层细胞的黏附能力，并且呈一定的剂量依赖性，Western blot检测结果表明，滋养层细胞中与细胞黏附相关的整合素αvβ3分子表达量降低；Transwell试验结果表明，浓度大于0.8μg/mL的SW显着抑制了山羊胎盘滋养层细胞的迁移和侵袭能力，并且呈一定的剂量依赖性，Western blot检测发现，山羊胎盘滋养层细胞中MMP-2表达量随着SW剂量的升高而逐渐降低，MT1-MMP/TIMP-2的比值随着SW剂量的升高而逐渐降低。4. MTT试验结果表明，1.6μg/mL的SW处理山羊胎盘滋养层细胞24h或2.4μg/mL的SW处理山羊胎盘滋养层细胞12h后，细胞活性显着降低，并且呈一定的时间和剂量依赖性。AO/EB染色结果显示，SW能够引起山羊胎盘滋养层细胞染色质凝聚、细胞核固缩和裂解等典型的细胞凋亡表征；琼脂糖凝胶电泳结果显示，2.4μg/mL的SW处理山羊胎盘滋养层细胞24h后，细胞染色体DNA被切断成180～200bp整数倍大小的片段，呈典型的梯形条带；Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞术检测显示，SW诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡呈现出一定的时间和剂量依赖性关系。结果表明，SW是通过诱导细胞凋亡来抑制山羊胎盘滋养层细胞活性的。5. Caspase活性检测和Western blot检测发现，SW处理能够激活山羊胎盘滋养层细胞中的Caspase-9和Caspase-3，引起PARP降解，而Caspase-8的活性没有发生显着变化；Caspase-9和Caspase-3的特异性抑制剂均能够显着抑制SW引起的细胞凋亡，结果表明，SW诱导的细胞凋亡依赖于Caspase-9/-3的级联活化。Western blot检测显示，SW处理对山羊胎盘滋养层细胞中Fas，FasL的表达量没有明显影响，但SW能够上调山羊胎盘滋养层细胞中促凋亡蛋白Bax，下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，导致Bax/Bcl-2的比值升高，SW还能够促进Bax向线粒体转位，导致线粒体内Cytochrome c释放到细胞浆。此外，TUNEL染色结果显示，SW能够选择性的诱导山羊胎盘组织中滋养层细胞凋亡，而对胎盘组织中的其他细胞几乎没有影响。结果表明，SW是通过激活由线粒体介导的、依赖于Caspase-9/-3活化的凋亡途径来诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡。本研究建立了一株保持有原代山羊胎盘滋养层细胞关键生物学特性和功能的永生化细胞系，阐明了低浓度SW能够阻滞山羊胎盘滋养层细胞的细胞周期、抑制细胞的黏附、迁移和侵袭能力，而高浓度SW能够通过激活依赖于Caspase-9/-3活化的线粒体通路来诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡。研究结果揭示了SW引起妊娠山羊流产的分子机制，为解释疯草引起的母畜生殖障碍提供了新的理论基础。
左彦珍[7]（2013）在《人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良》文中认为目的：滋养细胞源于胚胎外滋养层，生长迅速。在胚囊表面形成许多毛状突起，称之“绒毛”（villi）。滋养层最早由一层扁平立方形细胞构成，到绒毛形成时逐渐分化为两层。内层与间质接触，称“细胞滋养层细胞（cytotrophoblast）”；外层与子宫蜕膜接触，称“合体滋养层细胞（syncytiotrophoblast）”。滋养细胞通过侵袭子宫内膜、肌层及螺旋动脉，而建立子宫胎盘循环。所以说人类胚胎的成功着床、胎盘的形成、胚胎的生长发育，与滋养细胞的增殖分化以及侵袭功能密切相关。胚胎的植入过程需要滋养层细胞对子宫基质的侵入，源自胚胎原始滋养细胞的绒毛外滋养层细胞发挥类似肿瘤细胞浸润的特性,通过其侵入子宫基质将胚胎粘附于子宫壁组织,并伴随胚胎逐渐发育完善。但是不同于恶性肿瘤，滋养层细胞的侵入过程中一系列复杂的彼此关联的事件受到严格的时空调控。若发生调节紊乱可导致一系列的妊娠相关疾病，如侵入不足会导致自然流产、宫内发育迟缓、先兆子痫、妊高征等，而过度的侵入会导致妊娠滋养细胞疾病（gestational trophoblastic disease,GTD），如葡萄胎、侵袭性葡萄胎、绒癌及罕见的胎盘部位滋养细胞肿瘤等。对这些与滋养细胞相关疾病的研究，需要滋养细胞体外培养模型的建立提供重要的实验基础。目前滋养细胞的体外模型主要有原代滋养细胞和滋养细胞系两大类。人滋养细胞系有：SGHPL、TCL-1、JAR、 JEG-3、HTR-8/SVneo、BeWo、SM10、TEV-1、Rcho-1、HPT-8等。滋养细胞系操作方便，但是任何一个滋养细胞系都无法完全替代原代滋养细胞。滋养细胞原代培养方法操作繁琐、产量低、纯度低、临床取材困难，限制了原代滋养细胞的实验研究。所以寻求简便高效的原代滋养细胞体外培养方法非常重要。人早孕绒毛中包括合体滋养层细胞、细胞滋养层细胞、红细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、子宫基质细胞和蜕膜细胞等。而细胞滋养细胞是各型滋养层细胞的备用库。国内外关于滋养细胞原代培养的方法有一些，但是由于细胞滋养细胞在胎盘中所处的位置，采用不同方法所得到的细胞数及纯度也各不相同。建立一种简便、稳定、高纯度和高数量的滋养细胞体外模型，可以为滋养细胞及相关疾病的研究提供重要的实验基础，促进滋养细胞及相关疾病的研究进展。方法：1取材无菌条件下获取新鲜的人工流产正常胎盘绒毛组织一至两例，孕龄5-8周。2分离用含青链霉素的冷PBS冰上冲洗三次，眼科镊去掉明显的血块。完整的组织直接放入无菌的小青瓶中，加入含EDTA的胰酶和胶原酶，置于37℃温箱中反复消化，终止，取上清。至镜下观察绒毛外的滋养层细胞已基本消化干净，肉眼也可看到残存组织绒毛部位多呈白色纤维状。收集3次消化的上清200目筛网过滤，离心，弃上清，重悬。3纯化将分离所得细胞悬液加入预先铺好的60%percoll、35%percoll液的15mL离心管中，离心。吸取60%percoll与35%percoll分离液之间的云雾层条带，离心洗涤两次。最后用含20%特级胎牛血清的DMEM/F12重悬，台盼蓝染色，调整细胞密度为1×105接种于培养皿和多聚赖氨酸铺板的无菌盖玻片上培养。4传代胰蛋白酶消化传代5细胞倒置显微镜下观察培养的细胞直接在倒置显微镜下观察并拍照6滋养细胞纯度的鉴定新鲜早孕胎盘绒毛组织经多聚甲醛固定，脱水，包埋，制片，分别做HE染色和免疫组化染色。细胞爬片用免疫细胞化学法观察细胞的细胞角蛋白（cytokeratin-7）和波形蛋白（vimentin）的表达。结果：1细胞的活性活细胞的百分比为95%以上。2细胞形态学观察和生长特性分离纯化后的细胞大而均一，1h后开始贴壁，个别细胞开始伸展，24h后80%以上细胞完全贴壁伸展，细胞呈胖三角型或不规则的多角形或圆形，胞核较大，胞浆丰富，高倍镜下见有丰富的胞浆突起，显示绒毛滋养层细胞特征。4-6天后细胞融合率达80%，传代后3-4天一代。3组织HE染色和免疫组化结果：组织HE染色，确定了绒毛位置和形态。免疫组化结果可见细胞滋养细胞CK-7（cytokeratin-7）染色表达呈强阳性，合体滋养细胞CK-7染色表达呈弱阳性，间质细胞表达阴性；Vimentin染色可见绒毛内部的纤维细胞表达强阳性，而外部的细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞均表达阴性；PBS做一抗的阴性对照组均呈阴性表达。4免疫细胞化学结果CK-7阳性表达的细胞大于90%；vimentin染色阴性，偶见亦呈弱阳性表达，表达部位主要在胞质；阴性对照组染色呈阴性结论：1本实验打破以往剪碎绒毛组织再消化的方法，根据滋养细胞在绒毛组织里的特殊位置采用了完整绒毛消化，能及时将已经消化下来的细胞取出终止消化，实现分步消化，更好的保存了细胞活力。2剪碎消化得到的细胞混杂，需结合经典Percoll分离法才能充分纯化；完整绒毛消化得到的滋养细胞纯度较高，结合简化的Percoll分离法纯化即可，操作更加简便。3完整绒毛消化下来的细胞悬液中主要为外层的滋养细胞，在通过简化的Percoll分离液纯化时，降低了间质细胞条带对滋养细胞的干扰，得到的滋养细胞产量高、纯度高。4本法通过一至两例早孕绒毛就能够在短时间内得到满足进一步实验的大量高纯度早孕滋养细胞，取材量小很大程度上降低了取材带来的个体差异，显着缩短了取材的时间，同时因为例数少也更容易一次性获得符合条件的绒毛组织，降低了临床取材限制，更利于进一步的实验研究。
张玥[8]（2012）在《胎盘细胞凋亡在感染HBV的PBMC转运中作用的体外实验研究》文中进行了进一步梳理目的①在体外建立共培养模型模拟胎盘屏障的跨细胞转运。②胎盘细胞凋亡在感染HBV的PBMCs转运中作用。方法①本次实验采用100μl HBV DNA含量为5×106copies/ml的病人血清感染PBMC,用CCK-8试剂盒检测不同共培养时间点12h、24h、48h和72h细胞的生长状况。将共培养的细胞清洗4次，用FQ-PCR法检测PBMC和洗液中的HBV DNA的含量。②在1μm孔径Transwell小室共培养模型中，用流式细胞技术（FACS）检测Transwell小室上室感染HBV的PBMC与BeWo的融合现象。以8μm孔径Transwell小室共培养模型中，用流式细胞技术（FACS）检测下室中是否出现标有绿色荧光的PBMC。③本次实验将共培养模型设立三个组：正常对照组、HBV与BeWo共培养组、HBV+PBMC与BeWo共培养组，在共培养0h、12h、24h、48h后分别收集各组细胞通过FACS检测细胞的凋亡情况。④用RT-PCR法检测HBV+PBMC与BeWo共培养组不同时间点0h、12h、24h、48h，BeWo细胞的Caspase3 mRNA的表达情况。⑤用FQ-PCR法检测HBV+PBMC与BeWo共培养组下室中的PBMC的HBV DNA和HBVcccDNA含量。结果①5×106copies/ml的HBV阳性血清刺激PBMC，共培养12h、24h和48hPBMC的细胞数不断增加，共培养72h左右，细胞数会减少。与HBV血清共培养48h的PBMC检测出HBVDNA，提示发生感染，而清洗细胞的洗液中未检测出HBV DNA。②在1μm孔径的Transwell小室共培养模型中BeWo细胞被染上了绿色荧光提示HBV+PBMC与BeWo发生了融合。以8μm孔径的Transwell小室进行实验，下室中检测到标有绿色荧光的PBMC，证明在Transwell小室共培养感染HBV的PBMC与BeWo细胞模拟胎盘屏障的跨细胞转模型构建成功。③BeWo与HBV血清和HBV+PBMC共培养0h、12h、24h、48h，HBV感染组和HBV+PBMC共培养组的早期凋亡率与对照组比较差异无统计学意义（F值分别为0.027、1.824、7.186、7.749，P值均大于0.05）。在共培养0h、12h，HBV感染组和HBV+PBMC共培养组，BeWo总凋亡率与对照组比较差异无统计学意义（F值分别为2.922、1.356，P值均大于0.05）；但是共培养24h、48h，HBV感染组总凋亡率与同期的对照组和HBV+PBMC共培养组比较差异有统计学意义（F值分别为15.678、14.892，P值均小于0.05）。分别对同一组内不同时间点的早期凋亡率及总凋亡率进行比较，各组中不同时间点的凋亡率不同，随着共培养时间的延长，凋亡率呈现增加的趋势，到48h时HBV感染组总凋亡率为（68.90±0.33）%达到最高。不同时间点早期凋亡率的比较，除了对照组其它各组的差异均有统计学意义（F值分别为3.968、31.648、31.941，对照组P值大于0.05，其他各组P值均小于0.05），且不同时间点总凋亡率的差异有统计学意义（F值分别为82.827、29.292、63.951，P值均小于0.05）。④HBV+PBMC与BeWo共培养组不同的时间点BeWo细胞Caspase3 mRNA的表达量相比较差别有统计学意义（F=38.114,P=0.002），且各组间两两比较后，除12h与0h外，Caspase3mRNA的相对表达量相比无差异外，其他各组间差异均有统计学意义。在24h和48h组中，随着时间的延长Caspase3 mRNA的相对表达量有升高的趋势。⑤在BeWo细胞和HBV+PBMC共培养组中，BeWo细胞早期凋亡率与PBMC迁移率呈正相关关系（r=0.908，p=0.002），BeWo细胞总凋亡率与PBMC迁移率呈正相关关系（r=0.969，p=0.001）。BeWo细胞Caspase3 mRNA相对表达量和PBMC迁移率呈正相关关系（r=0.950，p=0.001）。⑥HBV+PBMC与BeWo细胞共培养24h和48h时，下室的PBMC HBV DNA拷贝数分别为（1.925±0.431）×103copies/ml、（2.565±0.361）×103copies/ml，同时，在此时间点HBV cccDNA的拷贝数分别为（7.560±1.513）×102copies/ml、（1.3550±2.473）×103copies/ml，按判断标准HBV DNA拷贝数≥103copies/ml为阳性，提示此时间点下室中的PBMC发生感染，且按判断标准HBV cccDNA拷贝数≥5×102copies/ml为阳性，提示HBV发生复制。结论①乙型肝炎病毒能够在PBMC中复制，并在体外成功构建BeWo细胞与感染HBV的PBMC共培养模型模拟胎盘屏障的跨细胞转运。②胎盘细胞凋亡率与PBMC的迁移率的正相关关系，提示凋亡可能与感染HBV的PBMC的转运有关。③上室中感染HBV的PBMC转运至下室后，可感染下室的PBMC。可推论若感染HBV的母亲PBMC转运至胎儿血循环会造成胎儿PBMC HBV感染。
董微[9]（2012）在《sEng、TGFβ1与妊娠期高血压疾病发生的相关性研究》文中提出妊娠期高血压疾病（Hypertensive disorder complicating pregnancy, HDCP）是妊娠期特有疾病,病因和发病机制尚未完全阐明,已有研究表明,转化生成因子TGFβ1及其受体与妊娠期高血压疾病发生的中心环节--血管内皮损伤及胎盘血管重铸过程密切相关,本研究将通过观察TGFβ1及其可溶性受体成份-sEng对体外培养的脐静脉内皮细胞及滋养细胞的影响,探讨其在妊娠期高血压疾病发生、发展中的作用。第一部分sEng及TGFβ1与内皮细胞损伤的相关性研究目的：观察可溶性Endoglin （soluble endoglin, sEng）及转化生长因子β1（TGFβ1）对体外培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）增殖、凋亡的影响,及其对HUVEC产生一氧化氮（nitric oxide, NO）量,内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）1177位点丝氨酸磷酸化程度的影响,探讨sEng及TGFβ1参与内皮细胞损伤的可能机制。方法：体外培养HUVEC,将3代以内的HUVEC接种于96孔培养板,分4组：对照组（单纯RPMI-1640完全培养液培养）、sEng组、TGFβ1及（sEng+TGFβ1）组：根据四甲基偶氮唑蓝（MTT）结果,将sEng组、TGFβ1及（sEng+TGFβ1）组按加药浓度分别分为110、100μg/L三个亚组,收集6h、12h,24h时间点的细胞及培养液。ELISA法测定细胞培养液中sEng及TGFβ1含量;MTT比色法检测对照组、不同浓度sEng、TGFβ1及（sEng+TGFβ1）培养6h、12h、24h后HUVEC的细胞的存活率,流式细胞技术观察各组凋亡率和细胞周期分布；硝酸酶还原法测定细胞培养液中NO含量,Western印迹法检测各组细胞eNOS蛋白相对表达量及其1177位点丝氨酸磷酸化情况,实时荧光PCR检测各组细胞eNOS mRNA的相对表达量。结果：（1）细胞培养液中sEng及TGFβ1的含量：24h、48h、72hHUVEC培养液中未测得sEng;24h、48h、72h细胞培养液中TGFβ1含量分别为（3.12±0.78）、（3.33±0.91）、（3.08±0.87）ng/L,三个时间段TGFβ1含量无明显变化（F=2.10,p>0.05）。（2）细胞存活率：sEng组HUVEC存活率在各个浓度点及时间点均低于对照组和其它各组,且与时间和加药浓度均呈负相关;TGFβ1组,加1μg/L时HUVEC表现为增殖,存活率高于对照组,加10、100μg/L时,HUVEC存活率与时间和加药浓度均呈负相关（sEng+TGFβ1）组HUVEC存活率与对照组比较无显着性差异,无时间及浓度依赖性。（3）细胞凋亡率和周期分布：sEng组,HUVEC凋亡率明显增加,与加药浓度及作用时间均呈正相关,sEng组G1期细胞比例显着高于对照组,亦与浓度及时间呈正相关；TGFβ1各组HUVEC凋亡率与对照组各点比较均无明显差异,1μg/L组G1期细胞比例显着低于对照组并与作用时间呈负相关,10、100μg/L组G1期细胞比例显着高于对照组且与作用浓度及时间呈正相关；（sEng+TGFβ1）组HUVEC凋亡率、G1期细胞比例、存活率与对照组比较无显着性差异,且无浓度及时间依赖性。（4）细胞培养液中NO含量变化：对照组培养液内NO含量24h内无明显变化（F=2.30,p>0.05）, sEng组细胞培养液中NO含量低于对照组和其它各组并与作用时间和加药浓度均呈负相关;TGFβ1组,加1gg/L时,细胞培养液中NO含量显着高于对照组及其它各组,与作用时间呈正相关,加10、100gg/L时,细胞培养液中NO含量与时间和加药浓度均呈负相关；（sEng-TGFβ1）组细胞培养液中NO含量与对照组比较无显着性差异,亦无时间及浓度依赖性。（5） eNOS蛋白及mRNA表达水平变化：sEng组,HUVEC eNOS蛋白及mRNA表达在各个时间点及浓度点均低于对照组及其它各组,且与作用时间及加药浓度呈明显的负相关;TGFβ1组,加1μg/L时eNOS蛋白及mRNA表达水平在各个时间点均高于对照组及其它各组,且与时间呈正相关,加10、100μg/L时,eNOS蛋白及mRNA表达水平在各个浓度点及时间点均低于对照组但高于sEng组,且与作用时间及浓度呈负相关（sEng+TGFβ1）组各个时间点及浓度点细胞eNOS蛋白及mRNA表达水平与对照组比较无显着性差异。（6） eNOS蛋白活化情况：sEng组,eNOS-Ser（p）1177/eNOS在各个时间点及浓度点均低于对照组及其它各组,并与作用时间及加药浓度呈负相关；TGFβ1组,加1μg/L时eNOS-Ser（p）1177/eNOS在各个时间点均高于对照组及其它各组并与时间呈正相关,加10、100μg/L时,eNOS-Ser（p）1177在各个浓度点及时间点均低于对照组但高于sEng组,且与时间及浓度呈负相关;（sEng+TGFβ1）组各个时间点及浓度点细胞eNOS-Ser（p）1177/eNOS与对照组比较无显着性差异。结论：1、加入外源性sEng可与内源性产生的TGFβ1结合阻断TGFβ1的信号传导,通过促进凋亡,并使细胞受阻于G1期,延缓其从Gl期向S期过渡的方式,抑制HUVEC的增殖.同时通过下调eNOS1177位点丝氨酸的磷酸化水平,抑制eNOS的活性,使HUVEC分泌NO功能下降,进而影响内皮细胞的舒缩功能。2、加入外源性的TGFβ1,对HUVEC的影响取决于作用浓度.高浓度TGFβ1主要通过使内皮细胞受阻于G1期.延缓其从G1期向S期过渡的方式,抑制HUVEC的增殖,同时通过下调eNOS1177位点丝氨酸的磷酸化水平,抑制eNOS的活性,使HUVEC分泌NO的能力下降,影响内皮细胞的舒缩功能,低浓度的TGFβ1对HUVEC的作用与之相反。3、（sEng+TGFβ1）组HUVEC的增殖、eNOS活性、NO的产生与对照组比较无显着差异,说明两因子等量加入细胞培养液,sEng作为TGFβ1的受体,二者几乎达到1：1结合,结合后二者均不能发挥前述作用,推断受体与配体成比例结合有助于内皮细胞发挥正常的作用,任一因子过量使比例失调,则对HUVEC产生不同程度的影响,进而参与内皮细胞功能的紊乱。第二部分sEng与TGFβ1对人早孕绒毛膜滋养细胞增殖及浸润的影响目的：探讨可溶性Endoglin与TGFβ1对人早孕绒毛膜滋养细胞增殖能力和浸润功能的影响。方法：采用胰蛋白酶-DNase消化法培养人早孕期（孕6-8周）绒毛膜滋养层细胞,将3代以内的滋养细胞接种于96孔培养板,分4组：对照组（单纯DMEM完全培养液培养）、sEng组、TGFβ1及（sEng+TGFβ1）组ELISA法测定细胞培养液中sEng及TGFβ1含量；MTT法观察滋养细胞的增殖情况并确定后续试验中sEng、TGFβ1及（sEng-TGFβ1）（?）的加药浓度及作用时间：MTT法观察各组细胞存活率,流式细胞技术观察各组细胞的细胞周期变化,Transwell技术检测各组滋养细胞的浸润功能；Western印迹法检测各组滋养细胞MMP-2、MMP-9蛋白的表达；RT-PCR法检测各组滋养细胞MMP-2、MMP-9mRNA的表达。结果：24h、48h、72h滋养细胞培养液中未测得sEng:24h、48h、72h细胞培养液中TGFβ1含量分别为（5.03±0.54）、（4.09+0.27）、（5.91+0.68）ng/L,三个时间段TGFβ1含量无明显变化（F=3.09,p>0.05）;10μg/LsEng、TGFβ1分别作用6h、12h、24h,各组细胞存活率与对照组比较均无明显差异：作用36h、48h,存活率明显降低,分别为（71.44±6.07）%、（51.44±6.34）%（36h）,（62.37±8.12）%、（23.48±4.36）%（48h）,无明显的时间及浓度依赖性;（sEng+TGFβ1）组滋养细胞存活率在各个时间点及浓度点与对照组比较无明显差异.确定各组加药浓度为10μg/L;作用48h,各组均未见明显凋亡;sEng组G1期细胞比例（88.24±2.11）%显着高于对照组（55.23±1.22）%%但低于TGFβ1组（95.63±2.98）%,（均p<0.05）;TGFβ1组G1期细胞比例显着高于其它各组（均p<0.05）;（sEng+TGFβ1）组G1期细胞比例（58.11±1.25）%与对照组比较无明显差异；各组加药10μg/L、作用24h, sEng组滋养细胞穿透Transwell基底膜的细胞数为（87+6.3）个/5HP显着低于对照组（143±41.3）个/5HP, TGFβ1组滋养细胞穿透Transwell基底膜的细胞数为（157-±-55.9）个/5HP显着高于对照组,而（sEng+TGFβ1）组细胞穿透数与对照组比较无显着性差异（p>0.05）。sEng组滋养细胞MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA的表达明显低于对照组,TGFβ1组滋养细胞MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA的表达明显高于对照组,差异均有统计学意义（均p<0.05）,而（sEng+TGFβ1）组MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA的表达与对照组无显着差异（p>0.05）。结论：sEng和TGFβ1可能通过调节滋养细胞的G、期细胞比例,影响其增殖能力,但并不导致细胞的死亡;通过调节滋养细胞MMP-2和MMP-9的表达影响其浸润能力；在体外细胞培养环境下,sEng和TGFβ1可达到1:1的结合,并失云各自对滋养细胞的影响,据此推测,早孕期绒毛局部两种因子比例失调,可能不同程度的影响滋养细胞向子宫肌层的正常浸润,造成“胎盘浅着床”引起妊娠期高血压等相关疾病。
刘慧[10]（2012）在《蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养与鉴定》文中研究表明滋养层细胞是胎盘屏障的重要组成成分,对胚胎的植入过程起重要的调节作用。本研究旨在进行体外培养、鉴定蒙古绵羊滋养层细胞（trophoblastic cells）,并对其生物学特征进行探究,来建立一种能稳定、方便地获得较高纯度的绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法,为后续的细胞转染和RNA干扰试验提供细胞学基础。经过培养不同孕期（早、中、晚）的蒙古绵羊滋养层细胞,发现胎盘的采集时间对细胞的贴壁率及细胞活性影响较大,确定采集胎盘的最佳时期为孕中期。通过添加不同浓度的血清,筛选出含15%胎牛血清（Fetal Bovine Serum FBS）的高糖DMEM培养体系较适合细胞生长。细胞培养初期,通过胰酶消化差速法,去除上皮样细胞中混杂的成纤维状细胞,并在5代之内得到纯化的细胞。应用伊红-苏木素染色法（HE）,可观察到纯化的细胞形态多样,呈多角形或卵圆形,细胞界限清楚,胞浆透明,核圆或呈小泡状。使用免疫组织化学方法,分别检测不同孕期的正常绵羊胎盘绒毛组织,以及体外培养的滋养层细胞,结果显示,培养的滋养层细胞中细胞角蛋白呈阳性表达,波形蛋白呈阴性表达,证明细胞的纯度在90%以上,符合后续实验的要求纯度。应用透射电子显微镜观察绵羊绒毛膜滋养层细胞,观察结果显示,所培养的细胞具有滋养层细胞的典型结构,细胞表面有丰富的微绒毛,细胞质内线粒体较多,并可见电子密度较高的脂滴,细胞核较大,细胞间可见缝隙连接结构,提示所培养细胞为绵羊绒毛膜滋养层细胞。利用RT-PCR技术检测滋养层蛋白-1,结果显示,纯化的细胞能够表达滋养层蛋白-1。研究结果表明,本试验应用组织块培养法制备原代滋养层细胞,该方法简便易行,可以有效获得较高纯度的,且具有生物学活性的绵羊绒毛膜滋养层细胞,为本实验室后续的体外研究提供细胞学基础。
二、人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养（论文提纲范文）
（1）SIRT1降低通过上调波形蛋白乙酰化水平影响高龄妊娠滋养细胞EMT的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 高龄孕妇及孕鼠胎盘SIRT1 表达下降,并伴有衰老相关标志物表达上升 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SIRT1 调节滋养细胞衰老及功能 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SIRT1 通过去乙酰化波形蛋白调节滋养细胞EMT过程 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述:细胞衰老与妊娠相关疾病发生的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（2）生理性低氧经HIF1α-PLOD2/WIPF1促进滋养细胞侵袭的分子机制（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 生理性低氧通过HIF1α上调PLOD2 参与绒毛外滋养细胞侵袭 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 生理性低氧介导WIPF1 促进绒毛外滋养细胞侵袭 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 PLOD2和WIPF1调控滋养细胞侵袭分化机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
（3）Notch3表达异常影响胎盘滋养细胞分化的检测分析与调控机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
（4）TNF-α通过miR-145-5p下调Cyr61表达抑制人绒毛膜滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞侵袭能力的研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 TNF-α抑制HTR8/SVneo细胞迁移 |
| 1.实验材料 |
| 2.方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TNF-α通过下调Cyr61表达抑制HTR8/SVneo细胞侵袭和迁移 |
| 1.实验材料 |
| 2.方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-145-5p通过靶向抑制Cry61表达参与TNF-α诱导的细胞转移 |
| 1.实验材料 |
| 2.方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 胎盘miRNAs与妊娠疾病 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
（5）Elabela在子痫前期发病中的作用及其潜在血压调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、Elabela在子痫前期胎盘中的表达及其意义 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象和样本采集存储 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要实验试剂与耗材 |
| 1.1.4 主要溶液配制 |
| 1.1.5 荧光定量聚合酶连式反应（RT-PCR）检测相关因子基因相对表达水平 |
| 1.1.6.免疫组化（Immunohistochemistry）检测相关因子的蛋白表达情况 |
| 1.1.7.蛋白印迹（Western blot）检测 ERK1/2 的磷酸化活化水平 |
| 1.1.8.相关分析 |
| 1.1.9.统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 对照组与子痫前期组的临床基线资料比较 |
| 1.2.2 对照组与子痫前期组胎盘中相关因子的基因相对表达水平 |
| 1.2.3 对照组与子痫前期组胎盘中 Elabela 与 APJ 受体的蛋白表达情况 |
| 1.2.4 对照组和子痫前期组胎盘中 ERK1/2 的活化水平 |
| 1.2.5 相关分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、Elabela对人绒毛膜滋养层细胞功能的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验分组与技术路线 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂与耗材 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.1.6 HTR-8/SVneo细胞培养方法 |
| 2.1.7 细胞计数 |
| 2.1.8 确定 Elabela 最佳药物浓度 |
| 2.1.9 CCK-8 法检测细胞增殖情况 |
| 2.1.10 Transwell 法检测各组细胞的侵袭能力 |
| 2.1.11 Western blot 检测各组的 erk1/2 的磷酸化活化水平 |
| 2.1.12 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HTR-8/SVneo 细胞系最佳给药浓度 |
| 2.2.2 各组 HTR-8/SVneo 细胞的增殖情况 |
| 2.2.3 各组 HTR-8/SVneo 细胞的侵袭能力 |
| 2.2.4 各组中 ERK1/2 的磷酸化活化水平 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 Elabela的生物学功能 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）苦马豆素诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的信号转导通路研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一章 胎盘滋养层细胞的研究进展 |
| 1.1 滋养层细胞的功能 |
| 1.1.1 滋养层细胞与妊娠识别 |
| 1.1.2 滋养层细胞与胚胎附植 |
| 1.1.3 滋养层细胞与胎盘形成 |
| 1.2 胎盘滋养层细胞的体外培养 |
| 1.2.1 胎盘滋养层细胞的分离 |
| 1.2.2 胎盘滋养层细胞的纯化 |
| 1.3 胎盘滋养层细胞的鉴定 |
| 1.4 胎盘滋养层细胞的永生化 |
| 1.4.1 端粒（Telomere）和端粒酶（Telomerase）的发现 |
| 1.4.2 端粒和端粒酶的结构与功能 |
| 1.4.3 端粒酶与细胞衰老、永生化 |
| 第二章 胎盘滋养层细胞与细胞凋亡研究进展 |
| 2.1 细胞凋亡的生物学特征 |
| 2.2 细胞凋亡调控的分子基础 |
| 2.2.1 Caspase 家族 |
| 2.2.2 Bax/Bcl-2 蛋白家族 |
| 2.3 细胞凋亡信号转导通路 |
| 2.3.1 死亡受体通路 |
| 2.3.2 线粒体通路 |
| 2.4 胎盘滋养层细胞与细胞凋亡 |
| 2.4.1 内源性调控因素 |
| 2.4.2 外源性调控因素 |
| 2.4.3 单核细胞/巨噬细胞 |
| 2.5 苦马豆素与细胞凋亡 |
| 2.5.1 苦马豆素和家畜中毒 |
| 2.5.2 苦马豆素的诱导细胞凋亡作用 |
| 2.6 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第三章 永生化山羊胎盘滋养层细胞系的建立及生物学特性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种和细胞 |
| 3.1.2 组织和试验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 试验所用溶液及其配制 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 山羊胎盘滋养层细胞的分离培养 |
| 3.2.2 山羊胎盘滋养层细胞的鉴定 |
| 3.2.3 hTERT 基因转染原代山羊胎盘滋养层细胞 |
| 3.2.4 转染后山羊胎盘滋养层细胞的鉴定 |
| 3.2.5 外源性 hTERT 基因在转染后山羊胎盘滋养层细胞中的表达 |
| 3.2.6 山羊胎盘滋养层细胞生物学特性的分析 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 原代山羊胎盘滋养层细胞的分离 |
| 3.3.2 pCI-neo-hTERT 质粒的鉴定 |
| 3.3.3 G418 对山羊胎盘滋养层细胞最佳筛选浓度的确定 |
| 3.3.4 转染后阳性细胞的扩大培养 |
| 3.3.5 山羊胎盘滋养层细胞的形态特征 |
| 3.3.6 山羊胎盘滋养层细胞的鉴定 |
| 3.3.7 hTERT 基因在山羊胎盘滋养层细胞中的表达 |
| 3.3.8 山羊胎盘滋养层细胞的生长特性 |
| 3.3.9 山羊胎盘滋养层细胞激素分泌功能的检测 |
| 3.3.10 体外培养的山羊胎盘滋养层细胞具有侵袭性 |
| 3.3.11 软琼脂克隆形成试验 |
| 3.3.12 裸鼠致瘤性试验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 苦马豆素对山羊胎盘滋养层细胞迁移和侵袭功能的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 SW 与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 试验所用溶液及其配制 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 SW 对山羊胎盘滋养层细胞活性的影响 |
| 4.2.2 SW 对山羊胎盘滋养层细胞细胞周期的影响 |
| 4.2.3 SW 对山羊胎盘滋养层细胞黏附能力的影响 |
| 4.2.4 细胞迁移试验 |
| 4.2.5 细胞侵袭试验 |
| 4.2.6 Western blot 检测 |
| 4.2.7 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 SW 对山羊胎盘滋养层细胞活性的影响 |
| 4.3.2 SW 对山羊胎盘滋养层细胞细胞周期的影响 |
| 4.3.3 SW 对山羊胎盘滋养层细胞周期蛋白的影响 |
| 4.3.4 SW 对山羊胎盘滋养层细胞黏附能力的影响 |
| 4.3.5 SW 对山羊胎盘滋养层细胞迁移能力的影响 |
| 4.3.6 SW 对山羊胎盘滋养层细胞侵袭能力的影响 |
| 4.3.7 SW 对山羊胎盘滋养层细胞 MT1-MMP、MMP-2 和 TIMP-2 的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 苦马豆素诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的信号转导通路 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 SW 与细胞 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 试验所用溶液及其配制 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 SW 对山羊胎盘滋养层细胞活性的影响 |
| 5.2.2 SW 对山羊胎盘滋养层细胞形态的影响 |
| 5.2.3 DNA 片段化分析 |
| 5.2.4 流式细胞术检测 SW 对山羊胎盘滋养层细胞凋亡率的影响 |
| 5.2.5 蛋白浓度检测 |
| 5.2.6 Caspase 活性检测 |
| 5.2.7 Western blot 检测 |
| 5.2.8 TUNEL 试验 |
| 5.2.9 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SW 对山羊胎盘滋养层细胞活性的影响 |
| 5.3.2 SW 诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的形态学观察 |
| 5.3.3 DNA 片段化分析 |
| 5.3.4 SW 对山羊胎盘滋养层细胞凋亡率的影响 |
| 5.3.5 Caspase 级联反应在 SW 诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡中的作用 |
| 5.3.6 Caspase 抑制剂对 SW 诱导的山羊胎盘滋养层细胞凋亡的影响 |
| 5.3.7 SW 对山羊胎盘滋养层细胞 Fas 和 FasL 表达的影响 |
| 5.3.8 SW 促进山羊胎盘滋养层细胞中 Bax/Bcl-2 比值升高 |
| 5.3.9 SW 促进山羊胎盘滋养层细胞线粒体中 Cytochrome c 的释放 |
| 5.3.10 SW 选择性诱导妊娠山羊胎盘组织中滋养层细胞凋亡 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略词和中英文对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）胎盘细胞凋亡在感染HBV的PBMC转运中作用的体外实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一章 BeWo 细胞株与 PBMC 共培养模型的建立 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验用细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 BeWo 细胞的培养 |
| 2.2 外周血单个核细胞的分离与培养 |
| 2.3 体外Transwell小室BeWo细胞株与PBMC共培养模型的建立 |
| 2.4 统计分析方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 细胞生长曲线的确定 |
| 3.2 检测 PBMC 感染 HBV 的情况 |
| 3.3 Transwell 小室观察细胞的融合 |
| 3.4 Transwell 小室观察细胞的迁移 |
| 4.讨论 |
| 第二章 胎盘细胞凋亡在感染 HBV 的 PBMC 转运中作用的体外实验研究 |
| 1.对象及方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 材料与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 Annexin V-FITC/PI 双染检测 BeWo 细胞的凋亡 |
| 2.2 BeWo 细胞的凋亡率和下方小室中标有绿色荧光的 PBMC 的迁移率的相关性 |
| 2.3 HBV~+PBMC与 BeWo细胞共培养模型中BeWo细胞Caspase3 mRNA的表达 |
| 2.4 HBV~+PBMC与BeWo细胞共培养模型中下室的PBMC HBV DNA和HBV cccDNA 定量检测 |
| 3.讨论 |
| 本文小结 |
| 研究特色 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（9）sEng、TGFβ1与妊娠期高血压疾病发生的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、sEng及TGFβ1与内皮细胞损伤的相关性研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 标本来源 |
| 1.1.2 主要试剂及设备 |
| 1.1.3 细胞的培养、传代、冻存及复苏 |
| 1.1.4 HUVEC的形态学观察及鉴定 |
| 1.1.5 MTT法测定吸光度 |
| 1.1.6 ELISA分析HUVEC培养液中sEng、TGFβ1含量 |
| 1.1.7 MTT法确定sEng、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)的加药浓度 |
| 1.1.8 流式细胞术 |
| 1.1.9 硝酸酶还原法测NO |
| 1.1.10 WesternBlot法测蛋白 |
| 1.1.11 实时荧光PCR测eNOSmRNA |
| 1.1.12 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 HUVEC的观察及鉴定 |
| 1.2.2 细胞培养液ELISA结果 |
| 1.2.3 MTT结果 |
| 1.2.4 各组HUVEC凋亡率和细胞周期分布比较 |
| 1.2.5 各组细胞培养液中NO含量比较 |
| 1.2.6 各组细胞eNOS蛋白表达比较 |
| 1.2.7 各组细胞eNOS蛋白活化比较 |
| 1.2.8 各组细胞eNOSmRNA表达比较 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 sEng与TGFβ1的生物学特征 |
| 1.3.2 sEng、TGFβ1与内皮细胞损伤的关系 |
| 1.4 小结 |
| 二、sEng与TGFβ1对人早孕绒毛膜滋养细胞增殖及浸润的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 标本来源 |
| 2.1.2 主要试剂及设备 |
| 2.1.3 细胞的培养、传代 |
| 2.1.4 滋养细胞形态学观察及鉴定 |
| 2.1.5 ELISA分析细胞培养液中sEng、TGFβ1含量 |
| 2.1.6 MTT法确定sEng、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)的加药浓度 |
| 2.1.7 流式细胞术 |
| 2.1.8 Transwell小室侵袭实验 |
| 2.1.9 WesternBlot法测蛋白 |
| 2.1.10 RT-PCR测MMP-2、MMP-9mRNA |
| 2.1.11 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 滋养细胞的观察及鉴定 |
| 2.2.2 细胞培养液ELISA结果 |
| 2.2.3 MTT法确定sEng、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)的加药浓度 |
| 2.2.4 各组滋养细胞周期分布比较 |
| 2.2.5 各组滋养细胞Transwell结果比较 |
| 2.2.6 各组滋养细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达比较 |
| 2.2.7 各组滋养细胞MMP-2、MMP-9mRNA表达比较 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 sEng、TGFβ1对滋养细胞增殖能力的影响 |
| 2.3.2 sEng、TGFβ1对滋养细胞浸润功能的影响 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 绵羊滋养层细胞概述 |
| 1.1.1 合体滋养细胞 |
| 1.1.2 单核立方上皮细胞 |
| 1.1.3 双核上皮细胞 |
| 1.2 胎盘的形成及妊娠期的变化 |
| 1.3 胎盘的功能 |
| 1.4 胎盘的种类 |
| 1.5 蒙古绵羊胚胎发育特征 |
| 1.6 滋养层细胞的建系 |
| 1.6.1 细胞系的建立方法 |
| 1.6.2 BEWO细胞 |
| 1.7 滋养层细胞的应用 |
| 1.8 滋养层细胞的体外分离 |
| 1.8.1 细胞分离方法 |
| 1.8.2 滋养层细胞原代培养方法的缺陷 |
| 1.9 原代培养滋养层细胞的质量鉴定 |
| 1.9.1 细胞角蛋白 |
| 1.9.2 波形纤维蛋白 |
| 1.9.3 人绒毛膜促性腺激素 |
| 1.9.4 绵羊滋养层蛋白-1 |
| 1.10 研究意义 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验药品及试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试剂配置 |
| 2.2.2 细胞的原代培养方法筛选 |
| 2.2.2.1 组织块培养法 |
| 2.2.2.2 消化法 |
| 2.2.3 绵羊滋养层细胞纯化及活力检测 |
| 2.2.4 不同的孕期对滋养层细胞的影响 |
| 2.2.5 蒙古绵羊滋养层细胞培养体系的筛选 |
| 2.2.6 细胞冻存试验 |
| 2.2.7 滋养层细胞的复苏试验 |
| 2.2.8 透射电镜观察 |
| 2.2.9 细胞免疫组化染色 |
| 2.2.10 HE染色 |
| 2.2.11 PCR检测滋养蛋白-1 |
| 2.2.11.1 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.11.2 cDNA合成 |
| 2.2.11.3 PCR反应 |
| 2.2.12 不同孕期的绵羊胎盘绒毛膜的免疫组化检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 培养方法筛选结果 |
| 3.2 原代培养细胞的生长及形态观察 |
| 3.3 胎龄对细胞活性的影响 |
| 3.4 滋养层细胞培养体系的筛选 |
| 3.5 滋养层细胞的冷冻及复苏对细胞的形态、活性的影响 |
| 3.6 透射电镜观察滋养层细胞超微结构结构 |
| 3.7 RNA分析与定量 |
| 3.8 RT-PCR检测的结果 |
| 3.9 绵羊胎盘绒毛膜免疫组化结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养（论文参考文献）
- [1]SIRT1降低通过上调波形蛋白乙酰化水平影响高龄妊娠滋养细胞EMT的机制研究[D]. 熊丽玲. 重庆医科大学, 2021
- [2]生理性低氧经HIF1α-PLOD2/WIPF1促进滋养细胞侵袭的分子机制[D]. 李聪. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]Notch3表达异常影响胎盘滋养细胞分化的检测分析与调控机制研究[D]. 徐增伟. 重庆医科大学, 2020(12)
- [4]TNF-α通过miR-145-5p下调Cyr61表达抑制人绒毛膜滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞侵袭能力的研究[D]. 文政芳. 广西医科大学, 2019(07)
- [5]Elabela在子痫前期发病中的作用及其潜在血压调控机制[D]. 张琼芳. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]苦马豆素诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡的信号转导通路研究[D]. 董峰. 西北农林科技大学, 2014(02)
- [7]人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良[D]. 左彦珍. 承德医学院, 2013(03)
- [8]胎盘细胞凋亡在感染HBV的PBMC转运中作用的体外实验研究[D]. 张玥. 山西医科大学, 2012(09)
- [9]sEng、TGFβ1与妊娠期高血压疾病发生的相关性研究[D]. 董微. 天津医科大学, 2012(01)
- [10]蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养与鉴定[D]. 刘慧. 内蒙古农业大学, 2012(07)