一、联合运用基因芯片和反义寡核苷酸技术筛选骨肉瘤转移相关基因（论文文献综述）
王伟豪[1]（2021）在《TFF3在骨肉瘤中的作用及相关机制研究》文中研究指明背景与目的骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤,在世界范围内对人类健康造成巨大威胁,尤其是在儿童和年轻人中。当骨肉瘤被诊断出来时,大约15-20%的患者存在转移,以肺转移多见,导致患者预后不良。而且骨肉瘤以手术治疗加联合化疗为主,截肢手术对患者的生存质量影响较大。本研究旨在找出骨肉瘤发病机制中的关键基因,探索骨肉瘤发病机制的上下游途径,寻找骨肉瘤治疗的新靶点,以期改善病人预后。材料与方法在GEO数据库下载4个骨肉瘤研究实验的数据集,并从中筛选差异表达基因（DEGs）,同时将4个数据集中共同存在的差异表达基因作为关键基因。采用基因集的富集分析（GSEA）找出与该关键基因相关的下游信号通路,并用和皮尔逊相关性分析验证信号通路与关键基因表达的相关性。为寻找其上游调控机制,使用皮尔逊相关性分析研究了关键基因与DNA甲基化位点之间的表达相关性。实验结果TFF3是唯一在GEO数据库4个骨肉瘤数据集中同时存在的差异表达基因,并且在骨肉瘤中是低表达。TFF3低表达与骨肉瘤患者预后不良相关,差异具有统计学意义（P<0.05）。对TFF3潜在下游通路进行研究,基因集富集分析揭示了TFF3与细胞因子-细胞因子受体相互作用途径、移植物抗宿主病途径、原发免疫缺陷途径及I型糖尿病途径等通路密切相关,相关性分析表明TFF3在骨肉瘤中与细胞因子-细胞因子受体相互作用途径呈正相关,表明TFF3在骨肉瘤中通过该途径发挥调控作用。本研究还显示骨肉瘤组织和正常骨组织中TFF3基因甲基化状态无统计学差异,相关性分析表明,在骨肉瘤样本中TFF3与其DNA甲基化位点无相关性,提示TFF3在骨肉瘤中低表达不是DNA甲基化调控的结果。结论TFF3是骨肉瘤的关键基因并在骨肉瘤中低表达,TFF3低表达与骨肉瘤患者预后不良相关。TFF3在骨肉瘤中的低表达不受DNA甲基化沉默所调节。TFF3通过细胞因子-细胞因子受体相互作用途径促进骨肉瘤的发生发展,TFF3在骨肉瘤中的具体作用机制及对化疗敏感性的影响有待进一步研究。
汪文杰[2]（2020）在《长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究》文中研究说明背景和目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别位于全球癌症的第四位和第五位。中国的GC发病率和死亡率占到了全世界一半以上。总的来说,GC的发生是遗传因素和环境因素交互作用的结果。目前,手术切除仍然是GC治疗的主要方式。在中国,通常超过80%的患者在初诊时就被诊断为进展期GC,术后5年生存率不到30%。尽管近年来在GC的治疗方面取得了很大的进步,但GC患者的生存率仍然很低。因此,亟需寻找GC新的分子生物标记物和特异的治疗靶点。随着高通量测序技术的发展,以往被认为是转录“噪音”和“垃圾”的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）引起了许多科学家的关注。研究发现lncRNA具有高度的组织特异性,并且参与了肿瘤细胞的多种生物学过程。此外,lncRNA可以通过表观遗传修饰、转录调控、转录后调控等多种方式参与肿瘤的发生和发展。尽管lncRNA在GC的研究中仍然属于探索阶段,但还是发现了一些lncRNA可能在GC的病变过程中起关键作用,这也为GC的诊断和治疗提供了新思路。因此,lncRNA具有成为GC诊断生物标记物和治疗靶标的巨大潜力。本研究选择lncRNA癌症易感候选物19（Cancer susceptibility candidate 19,CASC19）作为研究对象,CASC19位于被称为基因沙漠的染色体8q24.21区域,目前在GC中的功能未见报道。我们前期对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库进行深入挖掘,发现CASC19在GC中上调,并且与GC的浸润深度、TNM分期、远处转移和总体生存期（Overall survival,OS）显着相关。然后,利用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）实验获得了CASC19在GC细胞中存在的717bp全长序列,并通过UCSC确认这是个新的转录本。我们在临床样本,细胞模型和动物模型中对CASC19在GC中作用和调控机制进行一系列实验验证,以期为GC的诊断和治疗提供参考。研究方法:1.通过TCGA数据库获取了375位GC患者的RNA测序和临床性状数据,利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）和差异基因表达分析相结合的方法,筛选与GC进展和预后相关的lncRNA。然后,分析目的lncRNA表达与临床病理参数和预后的关系。最后,进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）探索lncRNA相关的信号通路。2.收集了联勤保障部队第九四〇医院普通外科和兰州大学第一医院肿瘤外科从2019年9月1日至2020年1月30日手术切除的80对新鲜GC组织和癌旁对照组织。利用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测CASC19在GC组织和癌旁对照组织中的表达水平,并分析CASC19的表达与患者临床病理参数之间的关系以及与下游靶基因NPM1的相关性。采用受试者工作特征（Receiver operator characteristic,ROC）曲线评估CASC19在GC诊断中的意义。3.采用qRT-PCR检测CASC19在人GC细胞系（AGS,BGC-823,MGC-803,HGC-27和MKN-45）和正常胃粘膜上皮细胞系（GES-1）中的表达水平。采用RACE实验鉴定CASC19在GC细胞中的全长序列。制备CASC19 shRNA和过表达慢病毒,shRNA慢病毒感染MKN-45和BGC-823细胞,过表达慢病毒感染HGC-27和AGS细胞,用qRT-PCR检测敲减和过表达效率。采用CCK-8实验、细胞克隆形成实验和EdU细胞增殖实验检测CASC19对GC细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测CASC19对GC细胞迁移和侵袭能力的影响。采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响。采用WB实验检测CASC19对上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin,Vimentin和N-cadherin表达的影响。4.用带有Luciferase标签的CASC19 shRNA慢病毒和MKN-45细胞构建稳转细胞株。选用4-5周龄BALB/c-nu雄性裸鼠用于动物实验,将10只裸鼠随机分为sh-CASC19组和sh-NC组两个组,每组5只。将两组细胞注射于裸鼠肩胛下构建裸鼠皮下移植瘤模型,每天测量肿瘤体积,期间利用小动物活体成像仪监测肿瘤生长状态。饲养4周处死裸鼠,取下肿瘤后一半用10%中性福尔马林溶液固定,另一半放入液氮罐保存。采用qRT-PCR实验检测移植瘤中HDAC1和NPM1mRNA的表达。采用IHC实验和WB实验检测移植瘤中Ki-67,PCNA,HDAC1和NPM1蛋白的表达。5.通过基因芯片技术检测CASC19敲减后下游功能基因的表达,进而鉴定CASC19可能调控的下游靶基因,并结合创新途径分析（Ingenuity pathway analysis,IPA）软件进行经典通路分析,上游调控分析,疾病和功能分析,调控效应分析和相互作用网络分析。然后选择30个差异表达的基因（Differentially expressed gene,DEG）进行qRT-PCR验证。6.通过核质分离实验来确定CASC19在GC细胞中的亚细胞定位。采用RNA pull-down实验检测与CASC19相互作用的蛋白质。采用RNA纯化染色质分离（Chromatin Isolation by RNA Purification,ChIRP）实验检测与CASC19同时作用的蛋白质和基因,分别用质谱分析（Mass spectrometry,MS）和测序（Sequencing,Seq）鉴定下游蛋白质和基因。采用WB实验检测RNA pull-down洗脱产物中HDAC1蛋白的表达。采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）实验来反向验证HDAC1蛋白与CASC19的相互作用。采用HDAC1的染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测与HDAC1相互作用的基因。采用ChIP-qPCR实验验证HDAC1与NPM1启动子的结合。采用双荧光素酶报告基因实验验证CASC19和HDAC1同时与NPM1启动子的结合。采用ChIP-qPCR实验验证MYC与CASC19启动子的结合。研究结果:1.通过WGCNA方法确定CASC19作为核心lncRNA用于接下来的分析和验证。CASC19在TCGA数据库GC样本中上调,其过表达与T分期（P=0.034）,TNM分期（P=0.022）和淋巴结转移（P<0.001）显着相关。CASC19过表达GC患者的OS明显短于CASC19低表达的患者（P=0.015）。Cox分析显示CASC19过表达是影响GC患者OS的独立危险因素（HR=1.524,95%CI=1.003-2.316,P=0.049）。GSEA分析显示CASC19过表达引起变化的下游大多数基因富集在癌症相关信号通路和经典信号通路上。2.CASC19在GC组织中显着上调,其表达量是癌旁对照组织中的4.2倍。CASC19表达与GC肿瘤大小（P<0.001）,浸润程度（P=0.011）,TNM分期（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.003）呈正相关。CASC19的结合蛋白HDAC1在GC组织中上调,而CASC19的下游靶基因NPM1在GC组织中下调,并且NPM1的表达与CASC19负相关（R=-0.361,P=0.001）。相对于癌旁对照组织,HDAC1mRNA和蛋白在GC组织中过表达,而NPM1 mRNA和蛋白在GC组织中低表达。CASC19在ROC曲线下的面积（Area under the curve,AUC）为0.952（95%CI:0.920-0.984,P?<?0.0001）,提示CASC19对GC的诊断效果较好。3.CASC19在人GC细胞系中表达上调,其在GC细胞中的全长为717bp。UCSC网站、CPAT工具和ORFfinder网站均显示CASC19不具备蛋白质编码能力。shRNA慢病毒在MKN-45和BGC-823细胞中成功下调CASC19的表达,过表达慢病毒在AGS和HGC-27细胞中成功上调CASC19的表达。CASC19下调会抑制MKN-45和BGC-823细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而促进MKN-45和BGC-823细胞的凋亡。相反,CASC19上调会促进HGC-27和AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而抑制HGC-27和AGS细胞的凋亡。此外,CASC19下调后MKN-45和BGC-823细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和间质蛋白Vimentin和N-cadherin表达降低,而凋亡蛋白Casepase-3,Casepase-7和Casepase-9以及上皮蛋白E-cadherin表达升高。CASC19上调后HGC-27和AGS细胞中Bcl-2,Vimentin和N-cadherin蛋白表达升高,而Casepase-3,Casepase-7,Casepase-9和E-cadherin蛋白表达降低。4.sh-CASC19组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量明显小于sh-NC组,HE染色发现sh-NC组肿瘤细胞出现的核体积增大、核分裂像增多、瘤巨细胞等恶性增殖现象明显多于sh-CASC19组。Ki-67和PCNA蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显低于sh-NC组。HDAC1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平与sh-NC组无显着差异。NPM1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显高于sh-NC组。5.CASC19敲减引起1,433个DEG上调,369个DEG下调。IPA分析显示CASC19可能与THBS1和TGFBR2作用,进而影响GC细胞的增殖和凋亡。选择30个DEG进行qRT-PCR验证,与芯片实验结果一致。6.CASC19主要分布于GC细胞核内,提示CASC19可能通过表观遗传调控起作用。RNA pull-down和ChIRP-MS实验确定了96个与CASC19可能结合的蛋白,生物信息学预测到CASC19与组蛋白修饰蛋白HDAC1之间存在结合区域。WB和RIP实验证明HDAC1可直接与CASC19结合,上下调CASC19后HDAC1mRNA和蛋白的表达没有显着差异,证明HDAC1不受CASC19的调控。ChIRP-seq和HDAC1的ChIP-seq实验确定了281个HDAC1与CASC19在基因组上可能共同调控的基因。生物信息学分析表明NPM1基因启动子区域出现peak-calling峰,提示CASC19可能结合在NPM1启动子上。ChIP-qPCR实验发现下调CASC19降低了HDAC1与NPM1启动子的结合。上下调CASC19和HDAC1,qRT-PCR和WB实验证明NPM1受CASC19和HDAC1的调控。双荧光素酶报告基因实验确认CASC19通过招募HDAC1共同结合到NPM1启动子上,从而抑制NPM1的表达。此外,ChIP-qPCR实验表明MYC可结合在CASC19启动子上,qRT-PCR实验证明MYC增加CASC19的表达。结论:本课题通过挖掘TCGA数据库,发现位于染色体8q24.21区域的lncRNA CASC19在GC中上调,并且与GC的进展和预后相关。通过RACE发现CASC19在GC细胞中存在717bp的长度。我们在GC细胞系,GC临床样本和动物模型中对CASC19进行了一系列体外体内验证,证明了CASC19在GC中是一个癌基因。CASC19主要分布于GC细胞核内。在机制上,CASC19通过募集HDAC1至NPM1的启动子区域,使NPM1的启动子区域组蛋白去乙酰化,抑制了NPM1的转录活性,从而降低进NPM1的表达。此外,我们还发现CASC19在上游受到转录因子MYC的调控。我们的研究发现了CASC19通过表观修饰抑制NPM1表达的一种新机制,为更好地理解lncRNA在GC中的作用和机制增加了新的证据。CASC19有望成为GC潜在的诊断标志物和治疗靶点。
孙朋[3]（2019）在《MicroRNA-1225-5p在喉癌中的功能及机制研究》文中指出目的:本研究旨在探讨microRNA-1225-5p（miR-1225-5p）在喉癌（LC）中的作用及机制。方法:通过qPCR分析收集的20例喉癌患者样本miR-1225-5p表达情况。使用miR-1225-mimic 和 miR-1225 inhibitor 对 Hep-2 细胞进行 miR-1225-5p 的过表达和干扰实验,并使用MTT法检测miR-1225-5p对于细胞增殖的影响,使用克隆增殖实验检测不同组克隆形成数,使用BrdU免疫荧光法检测细胞增殖活力,采用流式细胞仪（FC）检测miR-1225-5p在Hep-2细胞周期进展中的作用,Hoechst 33342染色实验和AnnexinV-FITC/PI FC 检测 miR-1225-5p 对于 Hep-2 细胞凋亡的影响,qPCR 及 western blot检测Bcl-2和Bax mRNA及蛋白表达水平变化,western blot检测Caspase-3蛋白变化;生物信息学方法寻找miR-1225-5p的靶标基因,并确定CDC14B为潜在靶标。荧光素酶报告基因检测miR-1225-5p与CDC14B 3’ UTR相互作用,qPCR及western blot检测CDC14B在Hep-2细胞及对照骨肉瘤U20S细胞中的表达水平;过表达及干扰miR-1225-5p情况下,qPCR及western blot检测CDC14B mRNA及蛋白表达变化,用于证明miR-1225-5p对CDC14B的调控作用;CDC14B干扰载体与miR-1225 inhibitor共转染、CDC14B过表达载体与miR-1225mimic在Hep-2细胞中共转染后,观察CDC14B表达水平逆转后,细胞水平恶性表型变化,westem blot检测CDC14B蛋白表达水平变化,MTT检测细胞增殖能力变化,采用流式细胞仪（FC）检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果:人喉癌样本中miR-1225-5p表达水平低于癌旁组织,喉癌细胞中miR-1225-5p表达水平显着低于U20S;miR-1225-5p过表达导致Hep-2细胞增殖能力下降,抑制miR-1225-5p促进Hep-2细胞增殖;miR-1225-5p过表达可提高Hep-2细胞在G0/G1期的比例,降低G2/M期细胞的百分率,反之亦然;Hoechst 33342染色和Annexin V-FITC/PI FC均显示,在过表达miR-1225-5p情况下,Hep-2凋亡细胞数量显着提高;提高miR-1225-5p情况下,Bcl-2表达降低,Bax表达升高,抑制miR-1225-5p,Bcl-2表达升高,Bax表达降低;提高miR-1225-5p情况下,活性caspase3表达升高,抑制miR-1225-5p,活性caspase3表达降低。生物信息学及荧光素酶报告基因分析提示,喉癌细胞Hep-2中,miR-1225-5p与CDC14B 3’UTR区能够结合并调控CDC14B的表达水平,CDC14B可能是喉癌中miR-1225-5p调控细胞恶性表型的潜在靶点;miR-1225-5p过表达及抑制后,Western blot及qPCR实验证实,miR-1225-5p过表达可抑制CDC14B表达水平,而miR-1225-5p干扰可上调CDC14B表达水平;CDC14B干扰载体与miR-1225 inhibitor共转染、CDC14B过表达载体与miR-1225mimic在Hep-2细胞中共转染实验证实,受miR-1225-5p调控的CDC14B表达的改变可以逆转喉癌细胞的增殖、细胞周期改变及细胞凋亡。结论:miR-1225-5p在喉癌标本中表达水平较低,提示miR-1225-5p可能在喉癌的恶性表型中发挥重要作用。增强miR-1225-5p的表达可以使喉癌细胞的增殖和生存受损,导致细胞分裂停滞在G1/S期;相反,抑制miR-1225-5p的表达促进了细胞的增殖及生存。因此miR-1225-5p导致喉癌细胞G1/S期周期阻滞,增加细胞凋亡率。miR-1225-5p可靶向作用于CDC14B 3’ UTR。抑制CDC14B的表达可逆转miR-1225-5p对喉癌细胞的抑制作用。本研究为miR-1225-5p在喉癌发展中的作用提供了直接证据,并初步探讨了 miR-1225-5p在喉癌发展中的机制。
赵雷[4]（2019）在《长链非编码RNA LINC00668在喉鳞状细胞癌中的表达、功能及机制研究》文中研究指明喉癌是一种侵袭性很强的头颈部肿瘤,其中96%98%为喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）,其次为腺癌、基底细胞癌、低分化癌及肉瘤等。2015年我国喉癌新发病例26400例,其中男性23700例;同期死亡病例14500例,其中男性12600例,发病和死亡均以男性为主。吸烟和饮酒目前被公认为是喉癌的两大危险因素,而随着吸烟人数的增加及年轻化,喉癌发病率有所上升。尽管在喉癌的治疗方面取得了一些进展,但其预后仍不容乐观,尤其是晚期喉癌（Ⅲ、Ⅳ期）5年存活率较低（术后44%、放化疗后39%）。喉癌的发生、发展是一个多因素参与的生物学过程,其中抑癌基因的失活与原癌基因的激活是促进喉癌发生、发展的主要因素。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸,不能编码蛋白质但具有丰富的生物学功能的转录本,而且有一小部分lncRNA可编码短的多肽,并经由这些多肽发挥作用。与蛋白质编码基因相比,lncRNA表达丰度相对较低,且具有很高的组织和细胞特异性。虽然表达丰度较低,但lncRNA可作为信号、诱饵、向导或骨架,在转录、转录后及表观遗传学水平,对包括肿瘤在内的多种疾病发挥不同的调控作用。诸多研究证实,lncRNA在包括LSCC在内的头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）、食管癌、肝癌等肿瘤中异常表达,并发挥着抑癌或促癌作用。虽然lncRNA在肿瘤中的机制研究取得了一定进展,但其在LSCC中的相关研究,尤其是机制研究却相对较少。为初步探讨LSCC的发生发展机制,本课题通过转录组表达谱芯片筛选出LSCC中差异表达的lncRNA共3073个,结合公共数据库中LSCC相关lncRNA表达谱综合分析,筛选出LSCC中显着表达增高的长链非编码RNA LINC00668（long intergenic non-protein coding RNA 668,LINC00668）。而LINC00668在LSCC中的研究尚未见相关报道。本课题通过系列实验探讨LINC00668在LSCC中的功能及作用机制,可为LSCC候选分子标志物的筛选提供实验数据,对LSCC的分子诊断和靶向治疗具有重要意义。第一部分 喉鳞状细胞癌中长链非编码RNA表达谱筛选及表达验证目的:通过转录组表达谱芯片技术,对4对LSCC癌组织及配对癌旁正常组织中差异表达的lncRNA进行筛选,并利用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR）的方法对部分差异表达的lncRNA进行表达验证,以初步了解LSCC中差异lncRNA的表达情况。方法:1.收集2016年10月至2017年6月期间,被确诊并接受手术治疗的LSCC患者癌组织及配对癌旁正常组织样本29对,选取其中4对用于lncRNA和mRNA（messenger RNA）转录组表达谱芯片筛选。2.根据差异基因筛选原则（差异倍数（Fold change,FC）≥2或≤0.5,且P<0.05）,筛选出在LSCC癌组织及配对癌旁正常组织中差异表达的lncRNA和mRNA。3.在差异表达lncRNA中随机选取FC在2倍以上的10个lncRNA（H19、HOTAIR、TINCR、MIR155HG、LINC00511、LINC00520、HULC、MALAT1、MEG3、ZNF667-AS1）,通过qRT-PCR的方法在其余25对LSCC癌组织及配对癌旁正常组织中进行表达水平验证。结果:1.通过对4对LSCC组织样本进行转录组表达谱芯片筛选,根据差异基因筛选原则（FC≥2或≤0.5,且P<0.05）,筛选出差异表达的lncRNA3073个,其中1967个在癌组织中高表达,1106个低表达;差异表达的mRNA 2809个,其中1791个在癌组织中高表达,1018个低表达。2.通过对差异表达的mRNA进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）pathway分析,发现差异表达的mRNA主要富集于DNA解螺旋参与的DNA复制、着丝点外染色体凝集等功能模块以及细胞因子与细胞因子受体间相互作用、趋化因子信号通路等重要信号通路。3.进一步从差异表达的lncRNA中选取FC较大的10个lncRNA,通过qRT-PCR的方法在25对组织样本中进行表达验证,发现其表达趋势与芯片结果一致,从而肯定了表达谱芯片筛选结果的可靠性。小结:1.转录组表达谱芯片筛选出LSCC中差异表达的lncRNA 3073个,差异表达的mRNA 2809个（FC≥2或≤0.5且P<0.05）。2.通过qRT-PCR的方法证实转录组表达谱芯片筛选结果具有很高的可靠性,可用于后续研究分析。第二部分 长链非编码RNA LINC00668在喉鳞状细胞癌中的表达及临床相关性研究目的:在芯片筛选的基础上,选取LSCC中差异表达的lncRNA LINC00668,并分析其相对表达水平与LSCC患者临床病理特征的相关性,初步探究其临床意义。方法:1.通过NCBI/GEO（National Center for Biotechnology Information/Gene Expression Omnibus）公共芯片数据挖掘,获得LSCC相关lncRNA表达谱筛选结果,并与本课题组芯片筛选结果相比较,综合分析。2.通过qRT-PCR的方法验证LINC00668在42对LSCC癌组织及配对癌旁正常组织中的表达水平。3.通过独立样本t检验（数据正态分布）/Wilcoxon秩和检验（数据非正态分布）,对LINC00668表达水平与LSCC患者临床病理特征相关性进行分析。结果:1.通过公共数据挖掘,发现LSCC相关lncRNA表达谱数据集GSE84957,与本课题组芯片筛选结果共同分析,筛选出癌组织中高表达的lncRNA LINC00668。2.基于42对LSCC组织样本,通过qRT-PCR方法证实LINC00668在LSCC癌组织中呈高表达。3.通过临床相关性分析发现:LINC00668表达水平与肿瘤分期、病理分化程度、颈部淋巴结转移状态等临床特征具有明显相关性。小结:1.通过数据挖掘和生物信息学分析,结合第一部分实验lncRNA表达谱,筛选出LSCC癌组织中高表达的LINC00668。2.LINC00668在LSCC癌组织表达增高,其表达水平与LSCC患者临床分期、病理分化程度及颈部淋巴结转移状态相关。第三部分 长链非编码RNA LINC00668对喉鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响目的:通过细胞功能学实验,研究LINC00668对LSCC细胞生物学行为的影响。方法:1.通过qRT-PCR的方法检测LINC00668在LSCC不同细胞系（AMC-HN-8,TU212,TU177,TU686）中的表达情况,并通过核、浆RNA分离实验结合qRT-PCR的方法对LINC00668进行亚细胞定位。2.通过构建LINC00668反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides,ASO）和过表达载体（LINC00668-pcDNA3.1（-））,调控LINC00668在LSCC细胞系中的表达水平。3.通过MTS、Transwell迁移及侵袭实验,检测LINC00668对LSCC细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果:1.LINC00668在不同LSCC细胞系中表达水平存在差异,且细胞浆和细胞核中均有表达,但主要表达于细胞核。2.通过ASO-LINC00668可明显敲低LINC00668在LSCC细胞系TU177（4倍）和TU212（2倍）中的表达水平,而过表达载体LINC00668-pcDNA3.1（-）可明显上调LSCC细胞系AMC-HN-8（100倍）中LINC00668的表达水平。3.体外实验证实在LSCC细胞系TU177、TU212中敲低LINC00668,可明显抑制TU177和TU212细胞的增殖、迁移及侵袭能力,相应地,在LSCC细胞系AMC-HN-8中过表达LINC00668,可明显促进AMC-HN-8细胞的增殖、迁移及侵袭能力。小结:1.LINC00668在LSCC细胞系（TU177、TU212、TU686、AMC-HN-8）中表达增高,且主要表达于细胞核。2.LINC00668可促进LSCC细胞系TU177、TU212、AMC-HN-8的增殖、迁移及侵袭能力,提示LINC00668可能作为促癌基因促进了LSCC的增殖、迁移和侵袭。第四部分 长链非编码RNA LINC00668在喉鳞状细胞癌中靶向调控的相关mRNA预测与筛选目的:对LINC00668靶向调控相关的mRNA进行预测和筛选,并通过qRT-PCR的方法对部分靶mRNA进行表达验证,初步探究LINC00668可能调控的靶mRNA或可能参与的生物学作用。方法:1.LSCC细胞系TU177转染ASO-LINC00668后,应用高通量测序技术筛选LINC00668敲低前后mRNA表达谱的变化。2.通过GO和KEGG pathway分析,对表达变化的mRNA进行功能富集分析。3.基于42对LSCC组织样本,通过qRT-PCR的方法对随机选取的部分靶mRNA（PDCD4、ARF1、PDGFRB、PTPRB、SP100、ITGA6、DUSP5、DUSP2）进行表达验证。结果:1.通过转录组高通量测序技术,筛选出可能与LINC00668调控相关的mRNA共670个,其中166个mRNA与LINC00668表达正相关,504个mRNA表达负相关。2.GO富集分析发现与LINC00668调控相关的mRNA主要富集在:生物学过程负调节、细胞过程负调节、膜结合细胞器、DNA结合和蛋白二聚化等功能模块。3.KEGG Pathway分析提示,LINC00668可能通过SP100、DUSP5、DUSP2、PDGFRB及ARF1等靶mRNA的介导,参与了LSCC中病毒致癌机理、MAPK信号通路、癌相关miRNAs和磷脂酶D信号通路等重要信号通路的调控。4.通过qRT-PCR的方法进行表达验证,随机选取的8个mRNA中5个（SP100、DUSP5、DUSP2、PDGFRB、ARF1）在LSCC癌组织中表达趋势与高通量测序结果一致,提示高通量测序结果具有很高的可靠性。小结:1.转录组高通量测序筛选出可能与LINC00668调控相关的mRNA共670个。2.GO和KEGG Pathway富集分析发现,与LINC00668调控相关的mRNA富集于多种功能模块及信号通路。3.高通量测序结果经qRT-PCR的方法验证具有较高的可靠性。结论:综合上述四部分内容,可得出以下结论:1.与癌旁正常组织相比,LSCC癌组织中lncRNA表达谱具有明显差异。2.LINC00668在LSCC癌组织中表达增高,且其相对表达水平与患者临床分期、病理分化程度及颈部淋巴结转移状态等临床特征相关,提示LINC00668可能参与了LSCC的进展。3.体外实验证实,LINC00668可一定程度上促进LSCC细胞的增殖、迁移及侵袭能力。4.LINC00668通过直接或间接与SP100、DUSP5、DUSP2、PDGFRB及ARF1等靶mRNA相互作用,参与了LSCC中病毒致癌机理、MAPK信号通路、癌相关miRNAs和磷脂酶D信号通路等重要信号通路的调控。
龙梅[5]（2015）在《新疆维吾尔族和哈萨克族2型糖尿病差异microRNAs表达谱的建立及其功能的研究》文中进行了进一步梳理目的:通过对新疆维吾尔族和哈萨克族2型糖尿病和正常糖耐量组microRNA微阵列芯片结果的分析,建立维、哈两民族2型糖尿病病人microRNAs表达谱;筛选从microRNA芯片结果中具有差异表达的microRNA10b、microRNA29a和microRNA143,验证后在3T3-L1前体脂肪细胞模型中,观察这三个microRNA对脂肪形成、葡萄糖摄取及脂联素、瘦素、IL-6和IL-10的影响,初步探讨这三个microRNA在2型糖尿病发生发展中的作用机制。方法:根据纳入和排除标准,采用microRNA基因芯片技术检测维、哈两民族2型糖尿病和正常糖耐量组中microRNA表达,分别对维、哈两民族microRNA芯片结果进行基因芯片显着性分析、表达谱分析、信号通路分析及其靶基因预测结果分析;扩大样本量后,采用实时荧光定量PCR验证从芯片结果中筛选维、哈两民族抗凝全血中microRNA10b、29a、143的表达,同时用实时荧光定量PCR检测维吾尔族2型糖尿病和正常糖耐量人脂肪组织中microRNA10b、29a、143的表达;采用两独立样本的t检验,用统计软件SPSS18.0进行数据的统计处理。比较维吾尔族、哈萨克族的血压、体重、IBM等体测指标和空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹胰岛素（Fasting insulin,FINS）、空腹C-肽（C-peptide,C-P）水平等生化指标水平,同时将这些指标与microRNA10b、29a、143表达量之间进行相关性分析。采用IBMX、地塞米松和胰岛素联合法诱导3T3-L1前体脂肪细胞为成熟的脂肪细胞,用实时荧光定量PCR检测3T3-L1前脂肪细胞诱导分化后及转染这三个microRNA的模拟物（mimics）和抑制物（inhibitor）后microRNA10b、29a、143的表达量;利用转染试剂将microRNA10b、29a、143的模拟物或抑制物转染至3T3-L1前脂肪细胞,同时设立阴性对照组和空白组,在不同的时间点收集细胞及上清液,用于后续油红O染色法检测脂肪细胞中甘油三酯的含量;Western-blot检测蛋白表达,葡萄糖氧化酶法检测细胞上清液中葡萄糖的含量,以及ELISA法检测细胞上清液中脂联素、瘦素、IL-6及IL-10的水平。结果:通过对microRNA基因芯片结果分析,建立了维吾尔族和哈萨克族2型糖尿病差异microRNA表达谱,采用实时荧光定量PCR验证了microRNA10b、29a、143的表达与芯片结果一致,在维族脂肪组织中这三个microRNA的表达无统计学差异。与维吾尔族正常糖耐量组相比,维吾尔族2型糖尿病组体重、BMI、FBG、TC、FINS水平以及HOMA-IR升高,而HDL-C水平降低;与哈萨克族NGT组比较,哈萨克族T2DM组FBG、LDL-C水平和HOMA-IR升高,而HOMA-IS和C-P水平降低;microRNA143的表达量与维吾尔族高密度脂蛋白和低密度脂蛋白呈正相关;microRNA10b与维吾尔族高密度脂蛋白呈正相关;microRNA29a与高密度脂蛋白胆固醇、舒张压和低密度脂蛋白胆固醇呈正相关;在哈萨克族中各体测指标及血脂指标与microRNA29a、10b和143之间的相关性不存在统计学差异。在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化后microRNA10b、29a、143的表达量逐渐增加,转染microRNA10b、29a、143的mimics后其表达量升高几十倍,但转染inhibitor后其表达量下降无统计学差异。转染microRNA29a和microRNA143 mimics后细胞内甘油三酯含量均增加,而转染microRNA10b mimics组中细胞内甘油三酯含量降低;转染microRNA143mimics组和转染microRNA29a mimics组细胞上清液中的葡萄糖含量均降低;而转染microRNA10b mimics组细胞培养上清液中的葡萄糖含量升高;转染microRNA143inhibitor组细胞培养上清液中的IL-10和瘦素含量下降,而脂联素含量升高。转染microRNA29a inhibitor组细胞培养上清液中的IL-10和脂联素含量升高,而瘦素含量下降;转染microRNA10b mimics组细胞培养上清液中的IL-10和脂联素含量升高,而转染microRNA10b inhibitor组细胞上清液中的瘦素含量升高;转染microRNA10b mimics后3T3-L1脂肪细胞NCOR2的蛋白表达增加;而转染microRNA10b inhibitor后NCOR2的蛋白表达下降;转染microRNA10b mimics和inhibitor后PPARα的蛋白表达均增加;转染microRNA29a mimics和inhibitor后NCOR2的蛋白表达均增加;转染microRNA143 mimics和inhibitor后MAPK7的蛋白表达均下降。结论:通过对microRNA基因芯片分析,建立维吾尔族和哈萨克族差异microRNA表达谱;microRNA29a、10b和143与维族血脂指标存在一定的相关性;microRNA10b能抑制脂肪细胞成脂、改善胰岛素抵抗及具有一定的抑制炎症作用,而microRNA29a和microRNA143则促进脂肪细胞成脂,加重组织胰岛素抵抗;这三个microRNA可能通过上述作用参与2型糖尿病的发生发展。
闫康[6]（2013）在《NKD1参与介导miR-195对骨肉瘤转移的抑制作用》文中研究表明骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）好发于儿童和青少年，是临床上最常见的原发性恶性骨肿瘤之一。其恶性程度高、血行转移发生早、肺转移发生率高、患者病情发展快且死亡率十分高。准确地对骨肉瘤做出早期诊断和有效地抑制或阻断骨肉瘤转移，已经成为骨肉瘤治疗领域的研究重点。深入认识骨肉瘤转移的分子机制对其基因靶向治疗具有十分重要的指导作用。因此，科研工作者致力于寻找更为重要的骨肉瘤转移的相关分子并试图阐明其分子机制。miRNA （microRNA）是一类进化上高度保守的、非编码蛋白质的小分子RNA。它在多种生物体中广泛表达。通过对靶基因的转录后调控，miRNA参与多种肿瘤转移的调控。前期研究表明，miR-195能够显着抑制骨肉瘤细胞的转移能力，但是其具体的作用机制仍不十分清楚。Wnt信号通路是目前肿瘤研究领域的热点之一。Wnt信号通路参与调控包括骨肉瘤在内的多种肿瘤的发生、发展、转移等病理过程。课题组前期基因芯片检测结果显示，Wnt信号通路分子成员NKD1在高转移能力骨肉瘤细胞系F5M2中高表达，提示NKD1可能促进骨肉瘤的转移。同时，生物信息学分析结果显示NKD1是miR-195的潜在靶基因。这为进一步研究miR-195的作用机制奠定了良好的实验基础。结合上述―miR-195能够显着抑制骨肉瘤转移‖的研究基础，课题组提出了NKD1调控骨肉瘤转移机制的推论，即：NKD1参与介导miR-195对骨肉瘤转移的抑制作用。基于以上推论，研究NKD1在骨肉瘤转移中的作用和阐明其调控骨肉瘤转移的分子机制具有十分重要的临床指导意义。研究目的：本实验拟通过研究：阐明NKD1在骨肉瘤组织中的表达及其与骨肉瘤分级分期、病理类型、预后、患者生存率等临床表型之间的相关性；阐明NKD1在骨肉瘤转移中的调控作用及其分子机制；证明NKD1是miR-195的直接靶基因，并参与介导miR-195对骨肉瘤转移的调控。以期最终阐明NKD1在miR-195调控骨肉瘤转移中的作用及机制，为其在骨肉瘤转移的基因靶向治疗、早期诊断以及预后判断等方面的临床应用提供新的研究思路和切入点。研究方法：1.分别采用Realtime RT-PCR分析及Western Blot分析的方法，检测NKD1在不同转移能力骨肉瘤细胞系（F4和F5M2）中的表达情况，以验证NKD1在以上细胞中的差异表达。2.构建NKD1的干涉质粒pSil-NKD1-sh，将其转染入骨肉瘤细胞F5M2，并用G418筛选出稳定下调NKD1表达水平的骨肉瘤细胞系F5M2+NKD1-sh，为进一步研究NKD1在骨肉瘤转移中的作用及机制奠定实验基础。3.利用稳定下调NKD1表达水平的骨肉瘤细胞系F5M2+NKD1-sh，进行NKD1的功能缺失实验。在细胞水平，检测骨肉瘤细胞F5M2+NKD1-sh增殖、迁移及侵袭能力的变化情况；在裸鼠模型中，检测骨肉瘤细胞F5M2+NKD1-sh原位成瘤能力和肺转移能力的变化情况。4.首先，对NKD1和miR-195之间的调控关系进行生物信息学分析。然后，分别采用Realtime RT-PCR及Western Blot技术检测在骨肉瘤细胞中改变miR-195水平后NKD1的表达情况。最后，采用双荧光素酶报告基因系统证明NKD1mRNA3’UTR和miR-195之间直接结合，NKD1是miR-195的直接靶基因。5.收集福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE）的骨肉瘤组织标本，用免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）的方法检测NKD1蛋白的表达水平，并统计分析其与骨肉瘤转移、分级分期、病理类型、患者预后及生存率等临床表型之间的相关性。研究结果：1.分别采用Western Blot分析和Realtime RT-PCR分析的方法，检测骨肉瘤细胞系F4和F5M2中NKD1的表达情况，结果显示：NKD1在F5M2中的表达较F4中明显降低，与基因芯片检测结果一致。2.成功构建了NKD1的干涉质粒pSil-NKD1-sh，并筛选出稳定下调NKD1表达水平的骨肉瘤细胞系F5M2+NKD1-sh及其对照骨肉瘤细胞系F5M2+NC。Real-timeRT-PCR及Western Blot检测显示：NKD1在F5M2+NKD1-sh细胞中的表达较对照组明显降低。3.在体外细胞水平，质粒pSil-NKD1-sh对骨肉瘤细胞F5M2的侵袭和迁移能力有明显的抑制作用，而对增殖能力无显着影响。在裸鼠体内，质粒PSil-NKD1-sh对骨肉瘤细胞的肺转移能力和原位成瘤能力均有显着的抑制作用。4.生物信息学分析结果显示：NKD1是miR-195的潜在直接靶基因。在骨肉瘤细胞中，上调（下调）miR-195水平可以抑制（促进）NKD1的表达。双荧光素酶报告基因系统证明NKD1mRNA3’UTR和miR-195之间直接结合。5.骨肉瘤组织中NKD1蛋白表达阳性率明显高于骨样骨瘤组织和骨软骨瘤组织；而骨样骨瘤组织NKD1蛋白表达阳性率与骨软骨瘤NKD1蛋白表达阳性率相比无显着差异。同时，NKD1的表达与骨肉瘤是否转移及患者3年生存率显着相关，而与性别、年龄、肿瘤大小、组织学分级、组织学分型及肿瘤发生部位等临床表型无明确相关性。研究结论：1. NKD1的表达水平与骨肉瘤细胞的转移能力呈正相关性，这提示NKD1可能促进骨肉瘤的转移。因此，有必要进一步深入研究NKD1在骨肉瘤细胞转移中的功能及其分子机制。2.稳定下调NKD1表达水平的骨肉瘤细胞系F5M2+NKD1-sh及其对照骨肉瘤细胞系F5M2+NC构建成功。这为进一步研究NKD1在骨肉瘤细胞中的功能及其分子机制奠定了实验基础。3.在体外细胞水平及裸鼠体内，pSil-NKD1-sh均可以显着抑制骨肉瘤细胞的转移能力。提示，NKD1有可能成为骨肉瘤转移基因靶向治疗的新靶点。4.证明了NKD1是miR-195的直接靶基因。结合NKD1促进骨肉瘤转移以及miR-195抑制骨肉瘤转移的前期研究结果，NKD1可能介导miR-195对骨肉瘤转移的抑制。这为NKD1在骨肉瘤基因靶向治疗中的临床应用提供了一定的理论依据和实验基础。5. NKD1在骨肉瘤组织中的表达与是否转移及患者3年生存率显着相关。这提示，NKD1在骨肉瘤的转移过程中发挥着重要作用，有可能作为新的反映骨肉瘤转移及预后的重要分子标志物。
张朝贵[7]（2011）在《核仁素的表达在骨肉瘤细胞凋亡中的作用》文中研究指明第一部分核仁素和bcl-2在骨肉瘤细胞株中的表达目的1.选择p53野生型人骨肉瘤细胞株U-2OS、p53变异型人骨肉瘤细胞株MG-63和p53缺失型人骨肉瘤细胞株Saos-2,并选择永生化人成骨细胞hFOB1.19（人SV40转染成骨细胞）作为正常对照,定性了解上述细胞正常情况下核仁素和bcl-2的表达情况,并利用MTT实验研究顺铂对上述骨肉瘤细胞株的增值抑制作用。方法取指数生长期的U-2OS、MG-63、Saos-2和hFOB1.19,提取总RNA,逆转录得到cDNA,分别设计针对核仁素、bcl-2和内参GAPDH的PCR引物,进行PCR检测核仁素和bcl-2在人成骨肉瘤中的基因表达；分别提取细胞总蛋白,胞蛋白,利用免疫印迹法（Western blotting）检测细胞中核仁素和bcl-2蛋白表达水平；利用MTT,检测顺铂对不同P53功能状态的骨肉瘤细胞凋亡抑制作用。结果免疫印迹法（Western blotting）和RT-PCR结果显示,在骨肉瘤细胞株U-2OS、MG-63、Saos-2和正常人成骨细胞hFOB1.19中,均检测到了核仁素和bcl-2基因和蛋白的表达。与正常人成骨细胞hFOB1.19相比较,U-2OS、MG-63和Saos-2的核仁素和bcl-2基因和蛋白表达水平均显着增高。顺铂对不同骨肉瘤细胞株均有明显的抑制作用,并且可能和核仁素的表达水平相关。结论不同P53突变状态的骨肉瘤细胞系与成骨细胞比较,核仁素过表达的同时伴随bcl-2过表达。顺铂对不同骨肉瘤细胞株增值抑制作用可能与核仁素的表达水平相关。既初步验证了我们试验条件的可行性,又为进一步的研究打下了基础：我们可以进一步研究P53不同功能状态下,使用反义核仁素寡核苷酸对顺铂诱导的化疗敏感性的影响及进一步用RNA-CHIP等实验研究核仁素和bcl-2之间的相互作用,为进一步研究核仁素在骨肉瘤凋亡中的作用打下基础。第二部分反义核仁素寡核苷酸以P53非依赖机制增强人骨肉瘤细胞顺铂化疗敏感性目的观察核仁素反义寡核苷酸转染对顺铂诱导人骨肉瘤细胞株化疗敏感性影响方法设计合成核仁素反义与随机寡核苷酸并转染骨肉瘤细胞株Saos-2、U2-OS和MG63,利用细胞免疫组化和’Western Blot检测核仁素反义寡核苷酸转染有效性；将每种骨肉瘤细胞分别随机分为六组：空白对照组、单纯用顺铂组、转染随机核仁素寡核苷酸组、转染随机核仁素寡核苷酸后再用顺铂组、转染反义核仁素寡核苷酸组和转染反义寡核苷酸后再用顺铂组；用MTT法分别检测各组骨肉瘤细胞的增殖抑制率,并用Western Blot和RT-PCR检测各组核仁素和Bcl-2蛋白及其mRNA表达的表达情况；用Hoechst33258染色方法检测各组骨肉瘤细胞凋亡形态学改变及凋亡率；用流式细胞术检测各组骨肉瘤细胞凋亡率；通过检测各组骨肉瘤细胞caspase-3活性进一步反映骨肉瘤细胞凋亡情况。结果细胞免疫组化和Western Blot检测显示核仁素反义寡核苷酸有效地下调核仁素、bcl-2基因和蛋白表达；MTT、Western Blot、RT-PCR、Hoechst33258染色、流式细胞术和caspase-3活性检测显示反义核仁素寡核苷酸有效地促进了顺铂诱导的各种P53功能状态骨肉瘤细胞的凋亡；结论反义核仁素寡核苷酸以P53非依赖机制增强人骨肉瘤细胞顺铂化疗敏感性。第三部分骨肉瘤细胞核仁素过表达增加bcl-2mRNA稳定性目的了解骨肉瘤细胞株中核仁素过表达与bcl-2mRNA稳定性之间的关系；方法结合放线菌素d研究不同骨肉瘤细胞株中bcl-2mRNA稳定性差别；利用RNA-CHIP技术研究不同骨肉瘤细胞株中核仁素与bcl-2mRNA的结合作用；利用脂质体转染技术,研究反义下调核仁素对骨肉瘤细胞bcl-2mRNA稳定性及核仁素与bcl-2mRNA的结合作用的影响；结果核仁素的表达水平影响骨肉瘤细胞bcl-2mRNA稳定性相关,核仁素表达越高,bcl-2mRNA稳定性越强；骨肉瘤细胞中核仁素和bcl-2mRNA相结合,结合作用与核仁素的表达相关；反义下调核仁素的表达,可以降低bcl-2mRNA稳定性和降低核仁素和bcl-2mRNA的结合作用。结论骨肉瘤细胞核仁素过表达增加bcl-2mRNA稳定性
汤国庆,燕太强,郭卫,杨荣利,彭长亮,赵会[8]（2010）在《骨肉瘤肺转移相关基因的最新研究进展》文中研究表明 骨肉瘤是源于间叶组织以能产生骨样组织的梭形基质细胞为特征的恶性肿瘤,占原发性骨的恶性肿瘤的首位。随着手术、放疗以及化疗水平的提高,骨肉瘤患者的5年生存率已明显提高,但仍有大部分患者死于肺转移。骨肉瘤的肺转移
唐兆前[9]（2010）在《卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究》文中提出卵巢上皮癌在妇科恶性肿瘤中致死率最高。手术后,以铂类为基础的联合化疗是其主要的治疗方法。但随着化疗的进行,患者最终获得难以治愈的多药耐药,因而其五年生存率一直徘徊在30-50%。为了更好地认识肿瘤抑制基因在卵巢癌多药耐药中的机制,我们对卵巢癌卡铂耐药基因差异表达谱芯片进行了肿瘤抑制基因的筛选及验证,对相关的肿瘤抑制基因启动子区进行了甲基化检测以及突变基因筛选研究。并在组织标本中进行了临床意义的探讨。第二章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证目的:筛选卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）较其亲本（SKOV3）细胞系差异表达下调的肿瘤抑制基因,并验证其差异表达。方法:应用分子生物信息学方法,分析卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卵巢癌SKOV3-CB细胞系较SKOV3细胞系差异表达下调两倍以上的基因1554条,筛选肿瘤抑制基因。应用real-time PCR技术对基因芯片中差异表达基因检测验证。结果:从卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中筛选出RNASET2,VHL,DLG1,COPS2,NOL7,GGNBP2, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3,PCGF2,ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等17个肿瘤抑制基因,荧光定量PCR技术差异表达验证结果示:RNASET2,VHL, COPS2,NOL7, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3, ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等基因差异表达下调,下调倍数分别为24.47、65.24、10.81、21.30、72.94、5.95、27.13、1.57、1.32、12.93、46.8、7.57、14.9、14. 00、23.98。GGNBP2,PCGF2,DLG1等基因差异表达上调,上调倍数分别为5.76,2.19,17.1,基因芯片差异表达结果与real-time PCR所验证表达下降趋势的结果一致率为82.35%,下调两倍以上的基因一致率为64.70%。结论:利用基因芯片技术分析基因差异表达结合real-time PCR对其检测结果验证是一种有效的方法,多肿瘤抑制基因参与卵巢癌卡铂耐药的机制。第三章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态与卵巢癌卡铂耐药表达下调的关系。方法:应用分子生物信息学方法,分析肿瘤抑制基因启动子区CPG岛并设计出引物,采用甲基化特异性PCR（MS-PCR）法或亚硫酸盐测序法（bisulphite sequencing）检测SKOV3-CB、SKOV3中的耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态。结果:表达下调的14个基因（VHL, COPS2, NOL7,RANSET2, RBL1, S100A2, PARG1, PERP, TCF3, DNAJA3, ING1, RARRES3, RBBP8,CYLD）中,有10个基因（VHL, COPS2, NOL7, RBL1, PARG1, PERP, DNAJA3, ING1, RNASET2,CYLD）启动子区能够设计出引物,其中CYLD未检出结果,后改用亚硫酸盐测序法检测。MS-PCR检测结果显示,SKOV3-CB、SKOV3的ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物;COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物;RNASET2,PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物,CYLD重亚硫酸盐测序提示在SKOV3-CB及SKOV3细胞系均为未甲基化状态。结论:卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区无超甲基化,甲基化机制不是引起卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因差异表达下调的原因。第四章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因突变检测目的:筛查可能的基因突变,探讨其与卵巢卡铂耐药以及相关肿瘤抑制基因表达下调的关系。方法:以亲本细胞系（SKOV3）为对照,在卵巢癌卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）,应用单链构象多态性分析（SSCP）检测RNASET2,VHL, COPS2, NOL7, PARG1, RBL1, PERP, DNAJA3, ING1, CYLD等10个基因RT-PCR扩增片段的突变。结果:以SKOV3细胞系为对照,在SKOV3-CB细胞系中,SSCP检测发现DNAJA3,PERP基因聚丙烯酰胺电泳带型存在差异;RNASET2,VHL,COPS2, NOL7, PARG1, RBL1,ING1, CYLD等基因未检测到差异带型。经测序发现PERP第三外显子1093,1160,1222位点上分别存在A→G突变;1083位点及1085,1086位点,分别存在T,C,C,碱基缺失。DNAJA3第八个外显子87位点处存在A→T突变。结论:DNAJA3,PERP的基因突变以及PERP基因的碱基缺失与卵巢癌卡铂耐药相关,可能是导致其表达下调的原因,宜进一步深入研究。第五章卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系的研究目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达的临床意义方法:Trizol一步法提取卵巢肿瘤患者卵巢组织总RNA,应用RT-PCR检测85例卵巢组织的RNASET2、VHL、PARG1、CYLD、COPS2、PERP、DNAJA3、ING1、NOL7、RBL1基因mRNA表达,其中卵巢癌49例,卵巢良性组织21例,卵巢正常组织15例。结果: RT-PCR结果显示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7基因在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织、卵巢癌组织中均有一定程度表达;VHL、PERP、COPS2、CYLD基因在正常卵巢组织、良性肿瘤中、卵巢癌组织中均有一定程度表达,但在部分卵巢癌组织中表达沉默,分别为4（4/49）、3（3/49）、2（2/49）、32（32/49）例;采用Fisher确切概率法统计分析,提示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7、VHL、PERP、COPS2基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢正常组织及卵巢良性肿瘤中的表达沉默阳性率比较差异无意义。CYLD、DNAJA3基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢组织中的表达沉默阳性率比较差异有显着意义（P分别为0.00、0.00;0.00,0.00）。VHL等10个基因表达与卵巢癌临床病理的关系Fisher确切概率法统计分析,提示CYLD在FIGO I-II与III-IV期存在差异有意义外（P<0.05）,其余基因差异均无意义（P均>0.05）。Log Rank分析发现卵巢癌组织VHL、PERP、CYLD基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异均无统计学意义（P分别为0.183、0.493、0.271）。COPS2基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异有统计学意义（P=0.005）。COX回归模型多因素生存分析提示FIGO分期、病理分级进入模型（P分别为0.045、0.028）;淋巴结转移及COPS2、PERP、CYLD、ING1基因表达沉默等参数均未进入模型（P分别为0.907、0.476、0.754、0.728、0.304）。结论:结论CYLD、DNAJA3基因表达沉默可作为卵巢癌与卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织鉴别诊断的一个潜在的指标,COPS2、PERP、CYLD、ING1不能作为卵巢癌独立的预后因素。
柳福海[10]（2009）在《Ezrin在大肠癌侵袭转移中的作用及黄芩素对其表达的影响》文中认为背景和目的大肠癌的侵袭以及肝转移是影响患者预后的重要因素,深入研究其机制对于改善大肠癌患者的总体预后有重要作用。大肠癌的侵袭转移以及肝转移是一个多步骤、多环节共同参与的过程,包括原发瘤脱落、进入血管的肿瘤细胞聚集成微瘤栓以及与内皮细胞粘附着床并形成转移灶。进入血管内的肿瘤细胞其肿瘤细胞间的同型粘附和肿瘤细胞与血管内皮细胞以及血液细胞的异型粘附均增强,促进肿瘤微癌栓的形成。而相对于单个细胞,肿瘤微癌栓更易于在循环系统中存活并着床,更加利于肿瘤侵袭转移和门静脉癌栓的形成。因此,研究肿瘤细胞粘附的相关机制对于了解肿瘤侵袭转移和门静脉癌栓形成是十分必要的。材料和方法人大肠癌细胞株SW620。收集我院2002年病理诊断为大肠癌的手术切除标本41例及相应癌旁组织和9例同期良性大肠病组织。应用免疫组化技术检测不同大肠癌组织标本的Ezrin蛋白表达水平及分布,并运用脂质体转染反义寡核苷酸SW620细胞Ezrin表达,比较转染前后细胞粘附、运动和侵袭能力的改变,并用Western Blot和RT-PCR检测黄芩素干预后肿瘤细胞Ezrin蛋白及Ezrin mRNA表达的变化。结果1.免疫组化检测不同大肠癌组织中Ezrin蛋白表达和分布,随着腺癌分化程度的降低ezrin表达的强阳性率增加,并且伴有亚细胞定位的改变。伴有肝转移的结直肠癌免疫染色阳性率高于不伴有肝转移的结直肠癌,且强阳性的比例也增加。2.脂质体转染反义寡核苷酸抑制SW620细胞表达Ezrin脂质体转染反义寡核苷酸技术能够显着抑制SW620细胞的Ezrin表达水平。选择合适的反义寡核苷酸浓度（300M/l）、合适的脂质体浓度（6μg/L）以及足够的转染时间48h,脂质体转染Ezrin反义寡核苷酸能达到90%以上的转染率,并能达到60%以上的抑制率。同时,细胞毒性较低,细胞死亡率无明显增加。3.抑制Ezrin表达对SW620细胞粘附、运动和侵袭能力的影响。抑制Ezrin表达明显抑制SW620细胞体外粘附,侵袭,运动能力。4.黄芩素对SW620细胞增殖的抑制作用随时间的延长和药物浓度的增加,抑制作用逐渐增强,呈明显的时间和剂量依赖性;Western Blot和RT-PCR结果显示,黄芩素明显降低Ezrin、磷酸化Ezrin及Ezrin-mRNA在SW620细胞中的表达。
二、联合运用基因芯片和反义寡核苷酸技术筛选骨肉瘤转移相关基因（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、联合运用基因芯片和反义寡核苷酸技术筛选骨肉瘤转移相关基因（论文提纲范文）
（1）TFF3在骨肉瘤中的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨肉瘤的概述 |
| 1.2 骨肉瘤的临床特点及治疗进展 |
| 1.3 骨肉瘤的研究热点 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 数据来源 |
| 2.2 差异表达基因和差异表达DNA甲基化位点的筛选 |
| 2.3 差异表达基因的生存分析 |
| 2.4 基因富集分析 |
| 2.5 相关性分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 差异表达基因的筛选 |
| 3.2 差异表达基因的生存分析 |
| 3.3 基因富集分析 |
| 3.4 TFF3 表达量与DNA甲基化的关系 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨肉瘤的诊疗规范与临床进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 胃癌流行病学 |
| 1.2 胃癌治疗现状 |
| 1.3 LncRNA的分类与功能 |
| 1.4 LncRNA在胃癌发病中的作用 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 生物信息学鉴定CASC19与胃癌进展和预后相关 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据的来源与获取 |
| 2.1.2 差异lncRNA筛选过程 |
| 2.1.3 加权基因共表达网络构建过程 |
| 2.1.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.1.5 核心lncRNA与 GC临床性状之间的联系 |
| 2.1.6 核心lncRNA的预后分析 |
| 2.1.7 核心lncRNA的 GSEA分析 |
| 2.1.8 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者的基线资料 |
| 2.2.2 差异lncRNA筛选结果 |
| 2.2.3 加权基因共表达网络构建结果 |
| 2.2.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.2.5 CASC19与GC临床性状之间的联系 |
| 2.2.6 CASC19 过表达GC患者预后差 |
| 2.2.7 CASC19相关的信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 CASC19在人胃癌组织中的表达及临床意义 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 临床样本收集 |
| 3.1.2 纳入与排除标准 |
| 3.1.2.1 纳入标准 |
| 3.1.2.2 排除标准 |
| 3.1.3 临床病理参数 |
| 3.1.4 组织总RNA提取及质检 |
| 3.1.4.1 组织总RNA提取 |
| 3.1.4.2 组织总RNA质检 |
| 3.1.5 qRT-PCR实验 |
| 3.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 3.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 3.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 3.1.6 HE染色 |
| 3.1.6.1 石蜡包埋 |
| 3.1.6.2 切片 |
| 3.1.6.3 HE染色步骤 |
| 3.1.7 IHC实验 |
| 3.1.7.1 石蜡包埋 |
| 3.1.7.2 切片 |
| 3.1.7.3 IHC步骤 |
| 3.1.8 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 患者临床病理资料 |
| 3.2.2 CASC19在GC组织和癌旁组织中的表达 |
| 3.2.3 CASC19 表达与GC患者临床病理参数之间的关系 |
| 3.2.4 CASC19 表达与NPM1 表达之间的关系 |
| 3.2.5 CASC19在GC诊断中的意义 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 CASC19对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.1.1 细胞复苏 |
| 4.1.1.2 细胞传代 |
| 4.1.1.3 细胞冻存 |
| 4.1.2 慢病毒制备 |
| 4.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 4.1.2.2 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 4.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 4.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 4.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 4.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 4.1.5 qRT-PCR实验 |
| 4.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 4.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 4.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 4.1.6 cDNA末端快速扩增实验 |
| 4.1.6.1 CASC19 PCR扩增及回收 |
| 4.1.6.2 3 ’RACE获取CASC19的3’全长 |
| 4.1.6.3 5 ’RACE获取CASC19的5’全长 |
| 4.1.7 CCK-8细胞增殖实验 |
| 4.1.8 细胞克隆形成实验 |
| 4.1.9 EdU细胞增殖实验 |
| 4.1.10 细胞划痕实验 |
| 4.1.11 Transwell迁移实验 |
| 4.1.12 Transwell侵袭实验 |
| 4.1.13 流式凋亡实验 |
| 4.1.14 蛋白质免疫印迹实验 |
| 4.1.14.1 细胞总蛋白提取 |
| 4.1.14.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 4.1.14.3 电泳 |
| 4.1.14.4 电转 |
| 4.1.14.5 显色 |
| 4.1.15 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 CASC19在GC细胞系中的表达水平 |
| 4.2.2 RACE获得CASC19在GC细胞中的全长 |
| 4.2.3 CASC19的非编码分析 |
| 4.2.4 CASC19慢病毒敲减和过表达效率检测 |
| 4.2.5 CCK-8 实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.6 克隆形成实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.7 EdU实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.8 划痕实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.9 Transwell迁移实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.10 Transwell侵袭实验检测CASC19对GC细胞侵袭的影响 |
| 4.2.11 流式细胞实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.12 WB实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.13 WB实验检测CASC19对GC细胞EMT的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 CASC19表达对胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞培养 |
| 5.1.2 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 5.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.1.5 实验分组 |
| 5.1.6 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 5.1.7 裸鼠活体成像实验 |
| 5.1.8 组织总RNA提取及质检 |
| 5.1.8.1 组织总RNA提取 |
| 5.1.8.2 组织总RNA质检 |
| 5.1.9 qRT-PCR实验 |
| 5.1.9.1 反转录合成cDNA |
| 5.1.9.2 qRT-PCR检测 |
| 5.1.9.3 qRT-PCR引物 |
| 5.1.10 移植瘤HE染色 |
| 5.1.11 移植瘤IHC实验 |
| 5.1.12 移植瘤WB实验 |
| 5.1.12.1 组织总蛋白提取 |
| 5.1.12.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 5.1.12.3 电泳 |
| 5.1.12.4 电转 |
| 5.1.12.5 显色 |
| 5.1.13 统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 CASC19 在稳转MKN-45 细胞株中的表达水平 |
| 5.2.2 CASC19下调可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长 |
| 5.2.3 CASC19 下调对移植瘤HE染色的镜下改变 |
| 5.2.4 CASC19 下调对移植瘤中Ki-67 蛋白表达的影响 |
| 5.2.5 CASC19 下调对移植瘤中PCNA蛋白表达的影响 |
| 5.2.6 CASC19 下调对移植瘤中HDAC1 表达的影响 |
| 5.2.7 CASC19 下调对移植瘤中NPM1 表达的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 基于芯片技术鉴定CASC19调控的下游靶基因及信号通路 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验设计及样本的制备 |
| 6.1.1.1 细胞培养与感染 |
| 6.1.1.2 细胞总RNA提取 |
| 6.1.1.3 细胞总RNA质检 |
| 6.1.2 芯片的制备 |
| 6.1.3 芯片实验 |
| 6.1.3.1 反转录合成cDNA |
| 6.1.3.2 体外转录合成标记cRNA |
| 6.1.4 芯片的杂交 |
| 6.1.5 芯片的洗染和扫描 |
| 6.1.6 差异分析 |
| 6.1.7 IPA分析 |
| 6.1.8 qRT-PCR验证芯片结果 |
| 6.1.9 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 芯片数据的质量评估 |
| 6.2.2 差异分析结果 |
| 6.2.3 IPA分析结果 |
| 6.2.3.1 IPA的经典通路分析结果 |
| 6.2.3.2 IPA的上游调控分析结果 |
| 6.2.3.3 IPA的疾病和功能分析结果 |
| 6.2.3.4 IPA的调控效应分析结果 |
| 6.2.3.5 IPA的相互作用网络分析结果 |
| 6.2.4 qRT-PCR验证结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 CASC19 通过募集HDAC1 来抑制NPM1 表达的机制研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞培养 |
| 7.1.1.1 细胞复苏 |
| 7.1.1.2 细胞传代 |
| 7.1.1.3 细胞冻存 |
| 7.1.2 慢病毒制备 |
| 7.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.2 HDAC1 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.3 MYC shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.4 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.5 HDAC1过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.6 MYC过表达慢病毒制备 |
| 7.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 7.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 7.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 7.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 7.1.5 qRT-PCR 实验 |
| 7.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 7.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 7.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 7.1.6 核质分离实验 |
| 7.1.6.1 分离细胞核和细胞质 |
| 7.1.6.2 RNA抽提及反转录 |
| 7.1.6.3 qRT-PCR检测 |
| 7.1.7 WB 实验 |
| 7.1.7.1 细胞总蛋白提取 |
| 7.1.7.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 7.1.7.3 电泳 |
| 7.1.7.4 电转 |
| 7.1.7.5 显色 |
| 7.1.8 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.8.2 制备生物素标记的RNA |
| 7.1.8.3 标记RNA探针 |
| 7.1.8.4 进行 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.5 蛋白质谱鉴定 |
| 7.1.9 RNA 纯化染色质分离实验 |
| 7.1.9.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.9.2 超声处理 |
| 7.1.9.3 进行 Ch IRP 实验 |
| 7.1.9.4 DNA分离鉴定 |
| 7.1.9.5 蛋白质分离鉴定 |
| 7.1.10 RNA 结合蛋白免疫沉淀实验 |
| 7.1.10.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.10.2 准备磁珠 |
| 7.1.10.3 RNA结合蛋白免疫沉淀 |
| 7.1.10.4 RNA纯化 |
| 7.1.10.5 qRT-PCR检测 |
| 7.1.11 染色质免疫共沉淀实验 |
| 7.1.11.1 细胞交联 |
| 7.1.11.2 染色质片段化 |
| 7.1.11.3 DNA纯化 |
| 7.1.11.4 免疫沉淀 |
| 7.1.11.5 解交联 |
| 7.1.11.6 qPCR或者测序 |
| 7.1.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 7.1.13 统计学分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 CASC19的亚细胞定位 |
| 7.2.2 RNA pull-down实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质 |
| 7.2.3 ChIRP实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质和基因 |
| 7.2.4 CatRAPID验证CASC19与HDAC1 蛋白相互作用 |
| 7.2.5 WB检测RNA pull-down富集蛋白中HDAC1 的表达 |
| 7.2.6 RIP实验证明CASC19 可以结合HDAC1 蛋白 |
| 7.2.7 HDAC1 的表达不受CASC19 的调控 |
| 7.2.8 ChIP-seq实验检测与HDAC1 相互作用的基因 |
| 7.2.9 CASC19 下调抑制HDAC1与NPM1 启动子的结合 |
| 7.2.10 NPM1 的表达受HDAC1 的调控 |
| 7.2.11 CASC19 通过募集HDAC1 抑制NPM1 的表达 |
| 7.2.12 CASC19上游的调控转录因子预测 |
| 7.2.13 CASC19 的表达受MYC的调控 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 全文结论 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 染色体8q24.21 区域的lncRNA在癌症中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）MicroRNA-1225-5p在喉癌中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 MIR-1225-5P对喉癌细胞生物学行为的影响 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MIR-1225-5P对喉癌细胞生物学行为的影响的机制研究 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 研究生在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）长链非编码RNA LINC00668在喉鳞状细胞癌中的表达、功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 喉鳞状细胞癌中长链非编码RNA表达谱筛选及表达验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 长链非编码RNA LINC00668 在喉鳞状细胞癌中的表达及临床相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 长链非编码RNA LINC00668 对喉鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 长链非编码RNA LINC00668 在喉鳞状细胞癌中靶向调控的相关mRNA预测和筛选 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在喉鳞状细胞癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）新疆维吾尔族和哈萨克族2型糖尿病差异microRNAs表达谱的建立及其功能的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 新疆维吾尔族和哈萨克族2 型糖尿病差异microRNAs表达谱的建立 |
| 引言 |
| 实验一 新疆维吾尔族和哈萨克族2 型糖尿病病人全血中差异microRNA芯片表达谱建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 不足与展望 |
| 实验二 利用实时荧光定量PCR对芯片结果的验证分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 不足与展望 |
| 实验三 新疆维吾尔族2 型糖尿病病人脂肪组织中microRNA的表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 不足与展望 |
| 小结 |
| 第二部分 新疆维吾尔族和哈萨克族2型糖尿病病人中各指标变化特点及其与microRNA的相关性分析 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 不足与展望 |
| 5 小结 |
| 第三部分 microRNAs对3T3-L1 前体脂肪细胞的生物学功能研究 |
| 引言 |
| 实验一 microRNA10b、29a、143在3T3-L1 脂肪细胞诱导分化后的表达情况 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 不足与展望 |
| 实验二 转染microRNA的模拟物和抑制物对3T3-L1 前体脂肪细胞分化成脂和葡萄糖摄取及IL-10、IL-6、脂联素及瘦素的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 不足与展望 |
| 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 Micro RNAs与糖尿病及胰岛素抵抗关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）NKD1参与介导miR-195对骨肉瘤转移的抑制作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 骨肉瘤 |
| 2 miRNA |
| 3 Wnt 信号通路与骨肉瘤转移 |
| 4 Notch 信号通路与骨肉瘤转移 |
| 5 NKD1（naked cuticle homolog 1）与骨肉瘤转移 |
| 实验一 不同转移能力骨肉瘤细胞系中 NKD1 差异表达的验证 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 NKD1 干涉质粒的构建及稳转细胞系的筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 NKD1 对骨肉瘤细胞生物学特性的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 NKD1 是 miR-195 的直接靶基因 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 NKD1 在临床骨肉瘤样本中的表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）核仁素的表达在骨肉瘤细胞凋亡中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 核仁素和bcl-2在骨肉瘤细胞株中的表达 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 分析与讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 反义核仁素寡核苷酸以P53非依赖机制增强人骨肉瘤细胞顺铂化疗敏感性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 骨肉瘤细胞核仁素过表达增加bcl-2 mRNA稳定性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.3. 实验结果 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（9）卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药研究现况(文献综述) |
| 1 卵巢恶性肿瘤概述 |
| 1.1 卵巢癌的发病情况简述 |
| 1.1.1 卵巢癌的发病率及生存率 |
| 1.1.2 流行病学与致病因素 |
| 1.2 卵巢上皮恶性肿瘤的主要临床表现及诊断 |
| 1.2.1 肿瘤标志物 |
| 1.2.2 影像学检查 |
| 1.2.3 细胞学检查 |
| 1.2.4 腹腔镜探查术 |
| 1.2.5 联合诊断 |
| 1.3 卵巢上皮性癌一线常规治疗现况 |
| 1.3.1 卵巢癌手术治疗的研究近况 |
| 1.3.1.1 早、中期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.1.1.1 全面分期手术的定义与价值 |
| 1.3.1.1.2 早期卵巢癌的手术切除范围及注意事项 |
| 1.3.1.1.3 阑尾切除在卵巢上皮性癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.4 大网膜切除在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.5 腹膜后淋巴结清扫在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.6 卵巢癌的保守性手术现状 |
| 1.3.1.1.6.1 保守性手术的适应症与禁忌症 |
| 1.3.1.1.6.2 保守性手术的手术范围 |
| 1.3.1.1.6.3 保守性手术的价值 |
| 1.3.2 晚期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.2.1 肿瘤细胞减灭术的原由及范围 |
| 1.3.2.2 肿瘤细胞减灭术的注意事项 |
| 1.3.2.3 影响肿瘤细胞减灭术的因素及在晚期卵巢癌临床治疗中的价值 |
| 1.3.2.4 复发卵巢癌的手术治疗 |
| 1.3.2.4.1 手术的目的与意义 |
| 1.3.2.4.2 手术的适应症,禁忌症及范围 |
| 1.3.2.4.3 影响手术效果的预后因素 |
| 1.3.3 化疗 |
| 1.3.3.1 一线化疗药物及方案的选择 |
| 1.3.3.1.1 一线化疗的指征 |
| 1.3.3.1.2 一线化疗药物以及方案的选择 |
| 1.3.3.2 腹腔化疗 |
| 1.3.3.3 维持或巩固化疗的临床价值 |
| 1.3.3.4 新辅助化疗 |
| 1.3.3.5 影响化疗疗效的临床病理因素 |
| 1.3.3.5.1 FIGO 分期 |
| 1.3.3.5.2 病理类型 |
| 1.3.3.5.3 残余灶的大小 |
| 1.3.3.5.4 化疗的用药剂量 |
| 1.3.3.5.5 肿瘤细胞产生耐药性 |
| 1.3.3.5.6 其它因素 |
| 1.3.4 影响腹腔化疗临床应用的因素 |
| 1.3.5 影响化疗疗效的分子病理因素 |
| 1.4 生物治疗 |
| 1.4.1 免疫治疗 |
| 1.4.2 过继性免疫治疗 |
| 1.4.3 抗体 |
| 1.4.4 细胞因子 |
| 1.4.5 肿瘤疫苗 |
| 1.5 基因治疗 |
| 1.5.1 自杀基因治疗 |
| 1.5.2 癌基因与抑癌基因治疗 |
| 1.5.3 免疫基因治疗 |
| 1.5.4 耐药基因治疗 |
| 1.5.5 抗肿瘤血管生成基因治疗 |
| 2 卵巢上皮恶性肿瘤的多药耐药 |
| 2.1 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的原因及机理 |
| 2.1.1 卵巢癌多药耐药的分子机理 |
| 2.1.1.1 细胞内化疗药物浓度降低 |
| 2.1.1.2 P-糖蛋白 |
| 2.1.1.3 多药耐药相关蛋白 |
| 2.1.1.4 肺耐药蛋白 |
| 2.1.1.5 乳腺耐药蛋白 |
| 2.1.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加 |
| 2.1.3 DNA 损伤修复能力增加 |
| 2.1.4 抗凋亡能力增加 |
| 2.1.5 p53 基因突变 |
| 2.1.6 信号传导通路 |
| 2.1.7 其它机制 |
| 2.1.7.1 细胞间连接 |
| 2.1.7.2 DNA 聚合酶 |
| 2.1.7.3 ATP7B |
| 2.2 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的诊断 |
| 2.2.1 卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 2.2.1.1 MDR-1 基因 |
| 2.2.1.2 肺耐药蛋白 |
| 2.2.1.3 GST-π |
| 2.2.1.4 mtP53 |
| 2.2.1.5 c-erbB-2 基因(HER-2 基因) |
| 2.2.1.6 DNA 错配修复基因 |
| 2.2.1.7 ATP7B |
| 2.2.1.8 多药耐药基因 SNPs 的检测 |
| 2.2.1.9 细胞凋亡相关基因 |
| 2.2.1.10 多基因联合检测在诊断多药耐药的价值 |
| 2.3 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐的治疗 |
| 2.3.1 卵巢癌多药咐药的分型及治疗原则和目的 |
| 2.3.1.1 卵巢癌多药耐药的分型 |
| 2.3.1.2 卵巢癌多药耐药的治疗原则 |
| 2.3.1.3 治疗的目标及价值 |
| 2.3.2 多药耐药的化疗 |
| 2.3.2.1 二线化疗药物及方案的选择及疗效评价 |
| 2.3.2.2 顽固型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.3 耐药型和难治型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.4 影响二线化疗疗效的主要因素 |
| 2.3.2.5 常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗 |
| 2.3.2.6 自体骨髓移植加大剂量化疗在卵巢癌多药耐药治疗中的应用 |
| 2.3.3 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 2.3.3.1 反义核酸技术 |
| 2.3.3.2 反义 RNA 技术 |
| 2.3.3.3 RNA 干涉技术 |
| 2.3.3.4 核酶基因转移技术 |
| 2.3.3.5 细胞因子基因逆转技术 |
| 2.3.3.6 针对 P-gp 的增敏治疗 |
| 2.3.3.7 针对 MRP 的增敏治疗 |
| 2.3.3.8 针对 BCRP 的增敏剂 |
| 2.3.4 多药耐药的手术治疗 |
| 2.3.5 多药耐药的的基因治疗 |
| 2.3.5.1 药物敏感基因 |
| 2.3.5.2 肿瘤免疫基因治疗 |
| 2.3.5.3 骨髓细胞修饰 |
| 2.3.6 多药耐药的综合治疗方案筛选及临床验证 |
| 2.3.6.1 单克隆抗体 |
| 2.3.6.2 腺病毒载体 |
| 2.3.6.3 中药治疗 |
| 2.3.6.4 亚致死量陡脉冲 |
| 3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因研究现况 |
| 3.1 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定技术 |
| 3.1.1 基因芯片技术 |
| 3.1.2 DDRT-PCT |
| 3.1.3 比较基因组杂交法 |
| 3.1.4 表达序列标签 |
| 3.1.5 基因表达的系列分析 |
| 3.1.6 消减杂交基因克隆技术 |
| 3.1.7 差异显示技术衍生的方法 |
| 3.1.8 差异基因的鉴定技术 |
| 3.2 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定现况及临床价值 |
| 3.2.1 基因芯片应用 |
| 3.3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定存在问题 |
| 4 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.1 基因甲基化的定义及主要检测手段 |
| 4.1.1 基因甲基化定义 |
| 4.1.2 主要检测手段 |
| 4.1.2.1 高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法 |
| 4.1.2.2 SssI 甲基转移酶法 |
| 4.1.2.3 免疫化学法 |
| 4.1.2.4 氯乙醛法 |
| 4.1.2.5 特异性位点的 DNA 甲基化的检测 |
| 4.1.2.5.1 甲基化敏感性限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.2 直接测序法 |
| 4.1.2.5.3 甲基化特异性的 PCR |
| 4.1.2.5.4 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 |
| 4.1.2.5.5 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.6 甲基化敏感性单链构象分析 |
| 4.1.2.5.7 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳 |
| 4.1.2.5.8 荧光法 |
| 4.1.2.5.9 DNA 微阵列法 |
| 4.1.2.5.10 甲基化敏感性斑点分析 |
| 4.1.2.5.11 甲基化特异性多连接依赖性探针扩增 |
| 4.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.3 卵巢上皮癌多药耐药基因甲基化检测的临床意义 |
| 4.3.1 治疗反应的标志物 |
| 4.3.2 化疗耐药和预后 |
| 5 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.1 基因突变的定义及主要检测手段 |
| 5.1.1 基因突变的定义 |
| 5.1.2 基因突变主要检测手段 |
| 5.1.2.1 直接 DNA 序列分析法 |
| 5.1.2.2 单链构象多态性分析技术 |
| 5.1.2.3 温度梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.4 变性梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.5 变性高效液相色谱 |
| 5.1.2.6 异源双链分析 |
| 5.1.2.7 核酸分子杂交 |
| 5.1.2.8 核糖核酸酶切法 |
| 5.1.2.9 限制性内切酶酶谱分析 |
| 5.1.2.10 蛋白截短试验 |
| 5.1.2.11 聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析 |
| 5.1.2.12 等位基因特异性扩增法 |
| 5.1.2.13 等位基因特异性寡核苷酸分析法 |
| 5.1.2.14 毛细管电技术 |
| 5.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.3 卵巢上皮癌多药耐药基因突变检测的临床意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞筹异表达基因突变检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）Ezrin在大肠癌侵袭转移中的作用及黄芩素对其表达的影响（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 文献综述 |
| 综述一 埃兹蛋白与肿瘤转移 |
| 1 EZRIN 和EZRIN-RADIXIN-MOESIN(ERM)家族及其生理功能 |
| 2 埃兹蛋白与肿瘤转移 |
| 综述二 黄芩素及其抗肿瘤的作用 |
| 第3章 EZRIN 蛋白在大肠癌组织中的表达及意义 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果判定和统计学方法 |
| 3 免疫组化结果 |
| 4 大肠癌组织EZRIN 表达与临床病理因素之间的关系 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第4章 抑制SW620 细胞EZRIN 表达对细胞粘附、运动和侵袭能力的影响 |
| 第一节 脂质体转染反义寡核苷酸抑制SW620 细胞EZRIN 表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 试剂 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 第二节 抑制SW620 细胞EZRIN 表达对细胞粘附能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 试剂 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 第三节 抑制SW620 细胞EZRIN 表达对细胞运动能力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 第四节 抑制SW620 细胞EZRIN 表达对细胞侵袭能力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 第五节 讨论 |
| 第5章 黄芩素对人大肠癌SW620 细胞EZRIN 表达及活性的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
四、联合运用基因芯片和反义寡核苷酸技术筛选骨肉瘤转移相关基因（论文参考文献）
- [1]TFF3在骨肉瘤中的作用及相关机制研究[D]. 王伟豪. 汕头大学, 2021(02)
- [2]长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究[D]. 汪文杰. 兰州大学, 2020(01)
- [3]MicroRNA-1225-5p在喉癌中的功能及机制研究[D]. 孙朋. 苏州大学, 2019(04)
- [4]长链非编码RNA LINC00668在喉鳞状细胞癌中的表达、功能及机制研究[D]. 赵雷. 河北医科大学, 2019(01)
- [5]新疆维吾尔族和哈萨克族2型糖尿病差异microRNAs表达谱的建立及其功能的研究[D]. 龙梅. 新疆医科大学, 2015(05)
- [6]NKD1参与介导miR-195对骨肉瘤转移的抑制作用[D]. 闫康. 第四军医大学, 2013(02)
- [7]核仁素的表达在骨肉瘤细胞凋亡中的作用[D]. 张朝贵. 中南大学, 2011(12)
- [8]骨肉瘤肺转移相关基因的最新研究进展[J]. 汤国庆,燕太强,郭卫,杨荣利,彭长亮,赵会. 中国骨肿瘤骨病, 2010(04)
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