一、以雄性生殖细胞为载体建立转基因动物的研究进展（论文文献综述）
李讨讨[1]（2021）在《基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控》文中进行了进一步梳理绵羊睾丸发育和精子发生直接决定着公羊的繁殖力。藏绵羊作为我国青藏高原及其毗邻地区最重要的家畜品种之一,具有繁殖力低、性成熟晚等生殖特点。因此,研究其睾丸发育和精子发生的调控机理对绵羊生殖生物学研究具有重要意义。然而目前在绵羊（尤其藏绵羊）上有关睾丸功能维持的分子生物学认识仍然非常欠缺。本研究以3月龄（性成熟前）、1岁龄（性成熟后）、3岁龄（成年）藏绵羊睾丸组织作为研究材料,进行如下研究:1)借助RNA-seq技术及生物信息学分析对3个发育阶段睾丸组织中的m RNA、circ RNA和mi RNA表达谱进行分析,并进行差异表达分析和功能富集分析;2)根据“ce RNA假说”及circ RNAs、mi RNAs和m RNAs的表达变化趋势,构建ce RNA调控网络;3)基于3月龄和1岁龄组的睾丸转录组数据,对潜在的免疫稳态维持相关候选基因进行鉴定,并对这些基因所富集的mi RNA-m RNA模块及circ RNA-mi RNA-m RNA调控网络进行分析;4)原代分离培养绵羊睾丸支持细胞,以研究精子发生关键基因及相关的circ RNA-mi RNA-m RNA轴在绵羊睾丸细胞中的生物学作用。研究的主要结果如下:1.在3月龄vs 1岁龄、1岁龄vs 3岁龄、3月龄vs 3岁龄睾丸中,分别鉴定到26084（10247个上调,15837个下调）、57个（27个上调,30个下调）、25535个（10017个上调,15518个下调）差异表达m RNAs;分别鉴定到3982（2079个上调,1903个下调）、414（201个上调,213个下调）和4060个（2107个上调,1953个下调）差异表达circ RNAs;分别鉴定到715个（561个上调,154个下调）、57个（46个上调,11个下调）、790个（628个上调,162个下调）差异表达mi RNAs。随机选择的10个m RNAs、10个circ RNAs和12个mi RNAs的RT-q PCR验证结果表明RNA-seq获得的转录组数据是可靠的。差异表达m RNAs、差异表达circ RNAs来源基因、及二者共享基因的GO和KEGG分析结果均显示,它们主要参与生长、发育、生殖、免疫、代谢等相关生物学过程;显着富集在m TOR、TGFβ等生殖相关,以及紧密连接、减数分裂等细胞连接或细胞发育密切相关的信号通路上。2.基于circ RNAs、mi RNAs和m RNAs共表达ce RNA网络分析发现,差异表达circ RNAs的靶基因主要涉及细胞发育、生殖等生物学过程以及粘附连接、局部粘附、ECM-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调节、MAPK、Wnt、TGFβ等信号通路。在此基础上,构建了睾丸功能（如精子发生、生殖细胞发育、细胞周期、减数分裂、血-睾屏障等）密切相关基因的ce RNA调控网络;通过RT-q PCR、Western blot、免疫荧光染色和双荧光素酶分析发现,BOLL基因主要表达于减数分裂后的圆形和长形精子细胞中,并且其表达受到circ＿029155/mi R-760-3p信号轴的调控。3.基于性成熟前、后藏绵羊睾丸的转录组测序和功能富集数据,共筛选出1118个免疫相关差异表达m RNAs（包括873个下调和245个上调的m RNAs）。GO和KEGG富集分析结果显示,它们主要富集在免疫系统发育、细胞粘附/连接、刺激反应调节、免疫反应调节等生物学过程,以及细胞粘附、T细胞和B细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、趋化因子、NF-κB、PI3K/Akt等信号通路上。在此基础上,构建了与睾丸免疫稳态维持相关候选基因的潜在mi RNA-m RNA网络和circ RNA-m RNA-m RNA网络。此外,双荧光素酶分析证实了ITGB1/circ＿013761/circ＿014236与mi R-29b以及ITGB1/circ＿001254与mi R-1185-3p间存在靶向关系。4.由构建的ce RNA网络可知,IGF1基因受到oar-mi R-29b和circ＿026259的潜在调控。RT-PCR、RT-q PCR、荧光原位杂交和免疫荧光分析显示,它们在发育的藏绵羊睾丸中具有相似的RNA分布模式:广泛分布于生殖细胞、间质细胞和支持细胞中。随后,采用两步酶消化法成功分离获得了绵羊睾丸支持细胞。RNase R酶消化法、PCR和Sanger测序证实了circ＿026259的环化特征,即由绵羊KLHL5基因第2-5个外显子产生,且由第2和第5个外显子反向剪接形成环化结构（将circ＿026259命名为circ KLHL5）。通过一系列双荧光素酶、过表达、敲低、CCK-8、Ed U染色、细胞流式分析发现,circ KLHL5可通过靶向oar-mi R-29b促进支持细胞中IGF1基因的表达,进而诱导支持细胞的增殖并抑制其凋亡。综上所述,转录组测序结合相关分子生物学方法揭示了许多差异表达基因在发育的藏绵羊以年龄依赖的表达模式参与生殖细胞发育、减数分裂、血-睾屏障、免疫稳态等生物学过程,并且这些基因中的大多数表达可能受到mi RNAs和/或circ RNAs的调控,以响应不断发育的睾丸内环境及持续的精子发生过程。同时,鉴定到一个由绵羊KLHL5基因产生的新的环状RNA circ KLHL5,并证实其通过靶向oar-mi R-29b调节IGF1基因的表达和睾丸支持细胞的发育。这些发现填补了有关绵羊睾丸组织circ RNAs认识的空白,丰富了现有的绵羊转录组信息,并为进一步理解绵羊及其他高原哺乳动物睾丸发育和精子发生机制提供了理论依据。
李小英[2]（2021）在《基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制》文中认为不育症是严重影响哺乳动物繁殖能力的一类生殖系统疾病。营养缺乏、饲养管理不当、季节性原因、遗传原因（如杂交不育）和疾病等均可导致不育。在引起哺乳动物不育的因素中,雄性因素约占一半左右。无精子症、少精子症、弱精子症、精子无力症等是引起雄性不育的主要病因。少精症是以精子数量显着稀少为特征的雄性不育症类型,病因复杂发生机制仍不十分明确。遗传因素和环境因素均可导致精子数量减少,遗传因素对精子数量的影响主要通过精子形成过程中相应基因的表达和调控作用来实现。因此,寻找影响精子形成的特异性靶基因（蛋白）并阐释其作用机制,对于少精症的精准治疗和预后具有重要的理论价值和意义。4.1R蛋白是一种由epb41基因编码的细胞膜骨架蛋白组分,在红细胞和多种非红细胞组织中发挥作用。本文从以下三个方面阐述4.1R蛋白基于睾丸支持细胞在少精症发生中的作用机制:（1）以雷公藤多苷溶液诱导雄性C57BL/6J小鼠（7周龄）构建的少精症模型小鼠为研究对象,利用western blotting、q-PCR和免疫荧光技术检测4.1R蛋白在少精症小鼠睾丸内的表达特点。利用异硫氰酸荧光素（FITC）睾丸活体注射检测少精症模型小鼠血睾屏障完整性,并检测血睾屏障形成相关蛋白的表达,阐述4.1R蛋白表达与睾丸支持细胞（Sertoli）连接功能间的相关性。检测Wnt/β-catenin信号通路组分在少精症模型小鼠睾丸内的表达特点,阐述4.1R蛋白表达与Sertoli细胞增殖间的相关性。少精症小鼠模型研究结果:western blotting检测显示epb41基因在正常C57BL/6J小鼠睾丸内表达135k D和80k D两种亚型。即4.1R-135k D蛋白和4.1R-80k D蛋白。与对照相比较,少精症模型小鼠睾丸内4.1R-135k D蛋白表达显着下降（P<0.05）,4.1R-80k D蛋白表达无显着变化;epb41m RNA表达降低,差异不显着;4.1R蛋白在少精症模型小鼠睾丸Sertoli细胞膜上表达下降,而各级生精细胞细胞膜上的表达则无显着差异。少精症模型小鼠血睾屏障受损,FITC从基底室进入近腔室并分散其中。与对照组相比较,少精症模型小鼠睾丸内β-catenin蛋白表达显着下降,而E-cadherin表达增加。血睾屏障相关蛋白ZO-1表达显着下降（P<0.05）,occludin和claudin-11表达均下降;Wnt/β-catenin信号通路组分Wnt3a、β-catenin表达显着下降（P<0.05）,GSK3β、c-myc和CDK4表达也下降,但差异不显着。（2）以小鼠epb41基因第3外显子为模板,设计2对sg RNAs并构建p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP重组质粒载体。转染N2a细胞,验证第3外显子基因序列与4.1R蛋白亚型表达之间的相关性。以小鼠epb41基因为模板构建LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体和LV-Epb41-sg RNA（05765-1）基因敲除慢病毒载体,分别转染TM4细胞（正常小鼠睾丸支持细胞系,即Sertoli细胞）和原代Sertoli细胞。检测细胞中4.1R蛋白、血睾屏障相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路组分表达水平,阐述4.1R蛋白在体外培养Sertoli细胞增殖和连接中的作用机制。研究结果显示:重组质粒载体转染的N2a细胞中4.1R-135k D蛋白不再表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41-sg RNA（05765-1）慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,4.1R-135k D蛋白被抑制表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,显着提高4.1R-135k D蛋白（P<0.05）和4.1R-80k D蛋白的表达,证实已成功实现Sertoli细胞内4.1R-135k D蛋白的抑制表达和过表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除的TM4细胞中血睾屏障相关蛋白β-catenin、E-cadherin和ZO-1表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin、c-myc、GSK3β和Cyclin D1均显着下降（P<0.05）,CDK4表达也下降,CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达TM4细胞中β-catenin、ZO-1和occludin表达均上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β和Cyclin D1表达均上升,CDK4和CDK6表达则下降,差异均不显着。4.1R-135k D蛋白基因敲除原代Sertoli细胞中,血睾屏障相关蛋白β-catenin、ZO-1和occludin表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin和CDK4均显着下降（P<0.05）,c-myc和GSK3β表达也下降,Cyclin D1和CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达原代Sertoli细胞中β-catenin,ZO-1和occludin表达上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β,CDK4和CDK6表达均上升,Cyclin D1表达则下降,差异均不显着。（3）以7周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象,将p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP质粒载体及LV-Epb41（43286-1）载体分别通过活体原位电穿孔转染法和慢病毒载体注射法作用于小鼠睾丸,比较两种载体转染方法的蛋白表达效率和靶向性,并利用免疫荧光法检测载体处理后睾丸组织中4.1R蛋白及血睾屏障相关蛋白的表达水平。阐述4.1R蛋白在活体水平对Sertoli细胞连接的调节作用与机制。质粒载体和慢病毒载体睾丸活体转染结果显示:质粒载体电转染法比慢病毒载体注射法更快在活体内表达,即质粒载体转染后3天,即在睾丸组织中高效表达,使Sertoli细胞中4.1R蛋白表达降低。慢病毒载体注射法表达相对较慢,注射后5天才可以在睾丸中表达。过表达慢病毒载体可显着提高4.1R蛋白在Sertoli细胞中的表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除载体作用于活体睾丸,BTB相关蛋白表达变化规律与少精症模型小鼠中的变化规律相同。4.1R-135k D蛋白过表达载体作用于睾丸活体,显着提高BTB相关蛋白的表达,E-cadherin表达除外。综上得出结论:（1）小鼠睾丸和Sertoli细胞中均表达4.1R-135k D和4.1R-80k D两种4.1R蛋白亚型,4.1R-135k D蛋白表达下降与精子细胞数量显着减少相关。（2）小鼠Sertoli细胞系中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起β-catenin表达下降,从而使Wnt/β-catenin信号通路组分表达异常,抑制睾丸支持细胞增殖。（3）成年小鼠睾丸组织Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起血睾屏障相关蛋白表达异常,导致细胞连接异常,精子细胞形成的微环境受损。因此,由于Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,可引起Sertoli细胞数量减少或血睾屏障受损,导致精子数量显着减少。
彭腊如[3]（2020）在《应用CRISPR/Cas9技术敲除鸡GDF8基因的研究》文中指出家禽是人类重要的动物蛋白来源,提高家禽的饲料转化效率和生长速度,是家禽养殖业者和畜牧科技人员不断探索追求的目标。生长分化因子8（GDF8,又名MSTN）高度表达于动物肌肉组织中,是骨骼肌生长发育的负调控因子。GDF8基因突变可引起动物的“双肌”表型,因此,利用生物技术对GDF8基因进行调控,是提高经济动物的产肉性能和生长速度的一个策略。在本研究中,我们借助CRISPR/Cas9基因编辑技术,探索适合家禽基因组的编辑策略,研制GDF8基因缺陷的转基因生殖系嵌合体鸡。首先,为了解鸡GDF8基因进化特征及其功能,我们对禽类和哺乳类GDF8基因序列进行同源性分析。分析结果显示,GDF8基因在各物种间进化保守,推测禽类与哺乳动物的GDF8基因行使相同的功能。对鸡GDF8基因进行功能富集分析也表明,鸡GDF8基因功能与哺乳动物一样主要是机体创伤后损伤修复。利用定量PCR对鸡胚中不同组织的GDF8基因表达情况鉴定发现,GDF8基因高表达于腿和胸等肌肉组织中,证实了鸡GDF8基因与骨骼肌生长发育是密切相关的。第二,为在家禽细胞中实现对GDF8基因高效率的编辑,我们对CRISPR/Cas9系统进行了优化。本研究针对GDF8基因1号外显子设计了4条sg RNA,将其构建到PX459质粒上,并转染DF-1细胞进行基因敲除。通过T7E1连接酶检测发现,所构建的4个PX459-sg RNA质粒都能实现GDF8基因敲除,其中PX459-sg RNA2敲除效率最高。为探索更高的敲除效果,本研究将3个sg RNA组合到同一质粒-PX459-multisg RNA,经过验证,PX459-multisg RNA质粒在DF-1和原始生殖细胞（PGCs）上都取得比单个sg RNA更好的敲除效果。通过挑取单个阳性细胞进行PCR测序,表明PX459-multisg RNA可以对鸡GDF8基因造成大片段缺失的基因敲除效果。第三,为便于追踪GDF8突变鸡的制备,本研究采用定点插入m Cherry荧光报告基因的方式实现对GDF8基因敲除。首先,我们比较了HMEJ（同源介导的末端加入）、HR（同源直接修复）和HITI同源独立的靶向整合)三种基因整合策略,对CRISPR/Cas9介导的基因定点整合方法进行优化。通过将GDF8-HMEJ、GDF8-HDR和GDF8-HITI三种供体质粒分别与Cas9-sg RNA2共转染到DF-1细胞,在转染15天后,对三组策略的阳性细胞的PCR结果显示三种策略均能实现基因定点整合,同时通过流式细胞仪检测三组m Cherry+细胞比例分别为:HMEJ组13.75%、HDR组2.14%的和HITI组的1.23%,这表明HMEJ策略比HR和HITI的整合效率更高。最后,我们利用PGC细胞介导法制备GDF8敲除鸡。通过将GDF8-HMEJ质粒和Cas9-sg RNA2质粒共转染鸡原代PGCs,而后通过两次流式细胞仪分选获得m Cherry+PGCs。通过鸡胚注射将GDF8突变的m Cherry+PGCs注射到发育至H15期的受体鸡胚。对注射后7天的受体鸡胚性腺进行解剖,可以观察到左右性腺存在大量的m Cherry+细胞,这表明本研究成功制备了GDF8基因突变的生殖系嵌合体鸡胚胎。通过将嵌合体鸡胚继续孵化,我们最终获得了7只小鸡。综上所述,本研究证明多sg RNA介导的CRISPR/Cas9技术可对鸡GDF8基因造成大片段缺失的敲除效果。同时研究通过HMEJ整合策略构建了定点插入GDF8基因一号外显子的供体质粒,并初步应用于PGC法介导的转基因鸡的制备获得GDF8突变的生殖系嵌合体鸡。研究结果为研究GDF8基因在为改善肉质和提升生长性能中的作用及新品种培育奠定了基础。
王曼[4]（2019）在《H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进鸡PGCs形成的机制研究》文中研究指明原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）作为精子和卵子的祖细胞,对物种的延续和繁衍具有重要作用,并且PGCs为发育生物学研究、移植治疗、转基因动物生产等方面提供了巨大的便利。然而,如何迅速有效地获取大量PGCs来满足研究和生产实际的需要,是突显在人们面前的问题。为此,研究者们致力于体外诱导分化为PGCs的研究,试图使得PGCs能源源不断地通过体外分化产生,但由于PGCs诱导分化效率低,诱导细胞技术体系不成熟,难以获得大量PGCs,其关键在于不完全清楚哪些因素能影响PGCs的形成,所以亟需建立健全PGCs发生的具体机制。长期以来,人们对PGCs形成的具体调控机制的研究主要局限于遗传学因素包括信号通路和关键基因的研究上,然而随着理论发展和技术手段的不断深入,研究人员更加清晰地认识到生殖干细胞发育过程是一个极其精密而复杂的调控过程,除了遗传学因素,研究者们还发现PGCs的形成离不开细胞特异性的组蛋白甲基化修饰。所以,从表观遗传修饰的角度探索组蛋白甲基化如何联系遗传学参与PGCs命运决定过程,将有助于人们更加全面地揭示PGCs的发生。为此,本研究基于本课题组前期对鸡胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ESCs）、PGCs和精原干细胞（Spermatogonial stem cel1s,SSCs）三种细胞进行的全基因组RNA-seq和H3K4me2的ChIP-seq结果,以调控PGCs形成的关键信号通路和组蛋白H3K4me2修饰为切入点,对RNA-seq筛选的候选信号通路和ChIP-seq富集的关键信号通路进行联合分析,从中筛选出参与PGCs形成的关键信号通路—Wnt信号。利用分子生物学方法探索组蛋白甲基化修饰如何协同信号通路调节PGCs形成相关基因表达进而影响PGCs形成。该研究为弄清PGCs形成的机制提供理论依据,并为后续深入研究其表观遗传调控机制奠定基础。研究结果如下:（1）H3K4me2 通过 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2 信号链调控 PGCs 形成的研究对 ESCs、PGCs和SSCs三种细胞的RNA-seq和ChIP-seq结果进行联合分析,确认PGCs发生过程中受H3K4me2调控的关键信号通路—Wnt信号通路及其关键信号分子Wnt5A、β-Catenin和TCF7L2。通过体内外实验在RNA水平和蛋白水平上验证PGCs形成过程中Wnt5a介导Wnt5a/β-Catenin/Tcf712信号链的激活,并成功构建了 Myc标记的Tcf712融合表达载体,通过免疫共沉淀实验验证了鸡β-Catenin和TCF7L2蛋白之间的互作关系,从而确定了鸡PGCs形成过程中Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号链的存在,为后续探究具体调控PGCs形成的机制做铺垫。通过ChIP-qPCR在ESCs和PGCs两种细胞中验证了 H3K4me2在Wnt5A启动子区存在 2 个富集位点（P1:3.072±0.513 和 17.3±1.924；P2:2.40±0.094 和 9.97±0.625）、在β-Catenin 启动子区存在 4 个富集位点（P1:7.41±0.413 和 12.23±1.952;P2:2.23±0.155 和11.54±1.602;P3:4.19±0.516 和 7.75±0.619;P4:5.61±0.641 和 9.68±0.547）、在 TCF7L2 启动子区存在 2 个富集位点（P1:3.02±0.032 和 15.8±1.63;P2:5.9±0.413 和 8.59±0.31）,且 H3K4me2修饰在PGCs上的富集水平显着高于ESCs（P<00.5）,进一步研究发现LSD1和MLL2能够介导Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区发生差异性H3K4me2富集。以上结果在RNA水平和蛋白水平上验证了 H3K4me2正向调节Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号传导,为深入探究组蛋白如何介导信号通路参与PGCs的调控研究奠定基础。（2）H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28A/B促进PGCs形成通过生物信息学分析对Wnt信号下游TCF7L2转录因子的靶基因进行预测,并根据GO功能注释筛选其中参与生殖细胞发育及干细胞分化的高度保守的靶基因Lin28A和Lin28B;体内外实验证实Wnt5A/β-Catenin信号和组蛋白H3K4me2能够正向促进Lin28A和Lin28B的转录。成功构建了重组表达载体pEGFP-Lin28A/B,以此确定长片段具有启动活性;同时成功构建缺失载体PGL3-Lin28A/B,并确定Lin28A启动子核心调控区域为-584+100bp和Lin28B启动子核心区域为-1431bp-1034bp;进一步分析发现,Lin28A/B核心启动子核心区存在TCF7L2结合位点,将结合位点突变发现Lin28A/B启动子核心区域的活性几乎完全丧失。接下来,通过双荧光素报告基因检测系统证实Lin28A和Lin28B核心启动子区能够响应Wnt信号;通过ChIP-qPCR在PGCs中验证了 β-Catenin在Lin28A启动子区存在2个富集位点（P1:26.52±2.14;P2:8.32土 1.20）,在 Lin28B 启动子区存在 3 个富集位点（P1:9.33土0.88；P2:4.90±0.53;P3:1.20土0.23）,且β-Catenin水平变化能够差异性富集Lin28A/B启动子区,以上实验确定Lin28A/B是Wnt信号的直接靶基因。成功构建Lin28A/B过表达载体和干扰载体,并通过体内外实验探究Lin28A/B对PGCs形成的影响,结果发现:在过表达组诱导第4d出现类胚体,第6d类胚体数量变多,并且同时过表达Lin28A和Lin28B诱导第2天便开始出现较大的EB,第4d类胚体数量变大变多,第6d类胚体出现大量的细胞分裂,与 0d（1±0）相比,第 6d PGCs 标记基因 Cvh、C-kit 和 Blimp1 显着上升至 1.61±0.07、2.21±0.07和3.08±0.09（P<0.05）,干扰组在同样的条件下则不能。体内对经Lin28A/B不同处理孵化至4.5d的鸡胚生殖嵴进行qRT-PCR检测发现相同的结果。流式细胞分析发现相较BMP4和BMP4+NC（3.31%±0.37和4.21%±0.21）组,体外同时过表达Lin28A/B显示较高的CVH阳性率（5.86%±0.35）,而同时敲低Lin28A/B,CVH阳性率（1.91%±0.02）极显着下调（P<0.01）;体内流式细胞分析结果出现类似表达趋势:与Blank和NC（54.7%±3.12和52.6%±2.18）组相比,同时过表达Lin28A/B显示较高的CVH 阳性率（66.7%±4.31）,而同时敲低Lin28A/B,CVH阳性率（37.1%±1.97）极显着下调（P<0.01）。以上结果表明Lin28是受H3K4me2和Wnt信号调控的直接靶基因,且Lin28能正向调控PGCs的形成。（3）β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录通过ChIP-qPCR验证H3K4me2在Lin28A核心启动子区TCF7L2结合元件附近存在2个富集位点（P1:14.96±1.41;P2:11.74±1.41）,在Lin28B核心启动子区TCF7L2结合元件附近存在2个富集位点（P1:3.08±0.041;P2:6.39±0.522）,且 MLL2 和 LSD1 能够介导 Lin28A/B 启动子区 H3K4me2的差异富集;双荧光素报告基因检测发现H3K4me2甲基化能增强Lin28A/B启动子区对Wnt信号的响应,而H3K4me2去甲基化则降低Lin28A/B启动子区对Wnt信号的响应。成功构建LSD1-flag融合表达载体,并将LSD 1分别与TCF7L2和β-Catenin进行共转染DF1细胞,COIP验证发现LSD1能够与TCF7L2蛋白结合而不是β-Catenin蛋白,进一步将LSD1、TCF7L2和β-Catenin以不同组合形式转染DF1细胞,COIP检测发现β-catenin能够与LSD1竞争结合TCF7L2。以上实验结果表明β-catenin能够与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录,解除LSD1对靶基因Lin28启动子区的H3K4me2去甲基化作用,激活Lin28表达。（4）Lin28A/B通过抑制gga-let7a-3p促进PGCs形成标记基因Blimp1的转录在线软件预测筛选了 micRNA-let7 家族 17 个鸡的 micRNA-let7s 成熟体（gga-let7s）,在 ESCs、PGCs和DF1三种细胞中进行同时干扰或过表达Lin28A/B处理,通过qRT-PCR筛选处关键候选的micRNA,即gga-let-7a-2-3p。进一步预测发现gga-let7a-3p共有558个靶基因,根据Target Score由高到低对靶基因进行筛选,发现调控PGCs形成的关键标记基因Blimp1。对Blimpl 3’UTR区域的gga-let7a-3p三个结合位点进行全部缺失,成功构建了 Blimp1 3’UTR野生型和突变型载体,即Blimp1-3’UTR-WT和Blimp1-3’UTR-Mut;通过双荧光素酶报告基因检测验证gga-let-7a能够结合到Blimp1的3’UTR区域抑制其表达。以上结果表明Lin28A/B可能通过抑制gga-let7a-3p促进Blimp1的转录进而调控PGCs形成。
余昕健[5]（2019）在《lncRNA-CEPT8调控鸡原始生殖细胞形成研究》文中提出原始生殖细胞是精子和卵子的祖细胞,具有分化成精原细胞或卵原细胞的潜能。原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC）具有多能性,能分化为精原细胞或卵原细胞最终形成配子。通过对原始生殖细胞由浅入深的逐渐探索,其在动物遗传领域和生殖医学领域的价值越来越重要。研究原始生殖细胞有助于揭示生殖细胞发生发育过程中相关基因作用机制和表观遗传学修饰调控机制,为生产转基因动物提供材料,也辅助指导生殖疾病的相关研究;然而,目前对原始生殖细胞的形成机制的研究尚不完全清楚,难以在体外诱导获得大量的原始生殖细胞,阻碍了其在动物遗传学和生殖医学领域的应用。近年来,随着测序技术的发展人们对表观遗传学修饰有了更全面的认识,其中lncRNA与雄性生殖方面的研究尤为受到关注。研究表明在雄性哺乳动物的睾丸组织中存在着大量特异性表达的lncRNA,其中多条lncRNA与精子发生紧密相关,并且在雄性生殖细胞增殖、分化的过程中起到重要调控作用。由于PGC细胞是精子的祖细胞,所以推测lncRNA对PGC的形成和分化起关键调控作用。然而目前针对lncRNA与生殖过程相关的研究主要集中在哺乳动物或果蝇,斑马鱼等模式生物上,在家禽上的研究十分欠缺,因此深入挖掘lncRNA在鸡PGC形成中的功能并揭示其调控机制显得尤为重要。因此本课题前期以如皋黄鸡为对象,取鸡胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ESC）、PGC等进行了单细胞高通量测序,依据结果筛选出了一些在PGC中特异性高表达的lncRNA,其中一条lncRNA是在鸡ESC细胞和PGC细胞中差异表达,存在于鸡6号染色体上且预测靶向Trim8基因,因此将其命名为lncRNA-CEPT8并推测该lncRNA参与调控PGC的形成。为了研究lncRNA-CEPT8的在鸡PGC形成过程中的功能和调控机制,本研究利用RNA干扰技术,qRT-PCR技术等,分析了 lncRNA-CEPT8的理化性质,从体内和体外两个水平验证了其在鸡PGC细胞形成中的功能,并对其预测靶基因和关联信号通路进行了验证,研究了其启动子受到的转录因子和表观遗传学修饰的影响。为提高体外诱导获得PGC效率提供理论基础。研究结果如下:（1）lncRNA-CEPT8全长扩增,亚细胞定位与编码能力鉴定:基于高通量测序结果筛选出在鸡PGC中特异性高表达的lncRNA,命名为lncRNA-CEPT8,通过RACE实验获得lncRNA-CEPT8全长（共1248bp）,qRT-PCR验证其在鸡PGC细胞中特异性高表达（ESC:2.562±0.285,PGC:6.447±0.837,SSC:3.852±0.261）,与转录组测序结果（ESC:0.074,PGC:1.477,SSC:0.100）结果相符,亚细胞定位发现lncRNA-CEPT8在细胞质中富集（77.1%）,通过ORFFinder线上软件对lncRNA-CEPT8序列进行开放阅读框预测,获得一个共计246bp的ORF,共编码81个氨基酸,构建原核融合表达载体并通过Western Blot检测lncRNA-CEPT8编码能力,发现lncRNA-CEPT8能够编码一个长度约为9KD的小肽,证明lncRNA-CEPT8具有编码能力。（2）lncRNA-CEPT8在鸡PGC形成过程中的功能探究:根据已经获得的lncRNA-CEPT8全长序列设计三个RNA干扰位点,将干扰RNA序列连接至pGMLV-SC5载体,转染至DF-1细胞中检测干扰效率,结果表明shRNA2-CEPT8干扰效率最高（65.78%±4.6%）,因此使用shRNA2-CEPT8进行慢病毒包裹进行实验;克隆lncRNA-CEPT8全长,连接pcDNA3.0载体完成构建过量表达pcDNA3.0-CEPT8载体。体内实验:为了研究lncRNA-CEPT8在PGC细胞形成中的功能,分别将干扰载体和过表达载体注射进孵化至1.5天的鸡胚血管内,孵化至4.5天时收集生殖嵴分离PGC细胞qRT-PCR检测PGC细胞标记基因Cvh和C-kit后发现,干扰组（Cvh:5.94±5.87,C-kit:6.57士1.69）的表达量显着低于空白对照组（Cvh:6.14±1.43,C-kit:8.74±1.88）和过表达组（12.90±4.08,C-kit:11.43±3.86）（P<0.01）;流式细胞分析结果表明干扰组（4.12%±1.45%）的阳性细胞率显着低于空白对照组（51.1%±9.73%）和过表达组（56.2%±8.65%）（P<0.01）;鸡胚石蜡切片免疫组织化学染色后显微镜下观察发现过量表达组（14±1.667个,400×背景）的阳性细胞数量多于空白对照组（9±1个,400×背景）和干扰组（2个,400×背景）,干扰组阳性细胞数量仍然少于对照组;体外实验:为了证明体内实验结果的准确性,分别将干扰和过表达载体转染鸡ESC细胞,在BMP4诱导下观察各组细胞形态学变化,结果表明干扰lncRNA后类PGC形成数量显着少于空白对照组和过表达组;qRT-PCR检测转染4天后PGC细胞标记基因Cvh和C-kit后发现,干扰组（Cvh:14.56±3.22,C-kit:3.67±0.85）的表达量显着低于空白对照组（Cvh:15.74±3.67,C-kit:3.82±0.50）和过表达组（Cvh:19.65±1.53,C-kit:2.996±2.35）（P<0.01）;流式细胞分析结果表明干扰组（0.19%±1.21%）的阳性细胞率显着低于空白对照组（1.55%±1.89%）和过表达组（1.08%±5.50%）（P<0.01）;间接免疫荧光结果表明过表达组的核表达载体pCEPT8-EGFP,转染DF-1细胞后发现克隆片段能够表达荧光,证明其具有启动子活性;分别构建启动子逐段缺失载体pl～p5,启动子活性检测结果表明p3段启动子活性最高为启动子关键正向调控区域;筛选可能存在的转录因子结合位点并进行转录因子重复载体构建,转染后检测相对荧光表达量,结果表明PAX2,PAX5正向调控lncRNA-CEPT8表达,Klf4正向调控lncRNA-CEPT8的表达;在转染了 pGL3-p3（启动子区564bp-763bp区域）的DF-1细胞培养基中添加甲基化抑制剂5’Azadc和乙酰化抑制剂TSA,结果表明启动子活性均显着下降。综上,lncRNA-CEPT8启动子关键正向调控区域在lncRNA-CEPT8上游564bp-763bp处,关键正向调控区域存在多个转录因子调控启动子活性,甲基化和乙酰化均对启动子活性具有调控作用。
杨蕙铭[6]（2016）在《经典microRNA途径在雌性果蝇幼虫性腺发育中的功能研究》文中研究指明雌性果蝇幼虫性腺的形态建成主要依赖于体细胞和生殖细胞两大细胞谱系的协同发育,这也是成虫卵巢形成正确数目的微环境-生殖干细胞单元,即卵巢管（ovariole）所必需的。在幼虫发育早期,性腺前体细胞（somatic gonadal precursor）和原始生殖细胞（primordial germ cell）都进行增殖,其中原始生殖细胞的数目从胚胎性腺中的12个增加至三龄幼虫中期的100个左右。从三龄幼虫中期开始,体细胞谱系中的端丝细胞（terminal filament cell）开启分化模式,直到三龄幼虫晚期形成1620垛端丝。在幼虫发育晚期,端丝和由端丝基部诱导的帽细胞形成体细胞微环境。此时,位于微环境远端的原始生殖细胞启动分化并形成生殖系胞囊。许多研究已经证明,在幼虫发育过程中,蜕皮激素（ecdysone）、胰岛素（insulin）、激活素（activin）、BMP和EGFR信号通路所组成的调控网络协调性腺中体细胞和生殖细胞两大细胞谱系的发育。毫无疑问,研究并发现参与这一过程的更多基因或调控机制将有助于阐明该性腺发育的内在机理。经典MicroRNA（miRNA）途径负责miRNA的生成及其功能行使,进而在细胞及生物学过程中起重要作用。已知该途径核心组分Ago-1、Dcr-1、Drosha和Pasha是果蝇卵母细胞形成和生殖细胞分裂所必须的,而Dcr-1、Loqs和Ago-1又调控了果蝇卵巢生殖干细胞的细胞命运。为探讨经典miRNA途径在雌蝇幼虫性腺发育中的可能作用及其机理,我们开展了相关基因突变遗传分析及分子检测研究。结果表明,drosha或pasha基因的功能失活突变在三龄幼虫晚期之前会导致生殖干细胞的前体细胞,即原始生殖细胞的增殖缺陷,同时促进三龄幼虫晚期原始生殖细胞的分化。进一步的研究证实,Drosha和Pasha同时以细胞自治性和细胞非自治性的方式调控原始生殖细胞的分化,而根据分子及遗传学研究推论Drosha和Pasha在原始生殖细胞分化调控上的作用至少部分涉及独立于BMP/Bam的分子机制。与此同时,Drosha或Pasha的功能丧失会扰乱性腺体细胞谱系的发育,不仅导致端丝形成缺陷,还影响早期幼虫时期端丝前体细胞的积累（增殖）。此外,我们同步检测了经典miRNA途径中其他核心因子的基因突变表型,经比较分析发现,Dcr-1、Loqs和Ago1具有类似于上述Drosha和Pasha突变系列表型,即性腺生殖细胞和体细胞谱系发育均发生缺陷。上述结果提示经典miRNA途径在幼虫性腺发育过程中具有重要的调控作用。鉴于经典miRNA途径在miRNA生成中的关键作用,本研究还对性腺发育可能涉及的功能性miRNA进行了分析鉴定。基于微阵列芯片分析的高通量筛查及遗传学分析研究发现,雌蝇幼虫性腺组织中存在一组包括miR-8、miR-14、miR-33、miR-184、miR-317和let-7-C在内的功能性miRNA分子,该组miRNA的生成受Drosha控制,miRNA基因突变可导致性腺中两大细胞谱系发育的异常。综上,本研究发现经典miRNA途径在雌蝇幼虫性腺发育中起重要的调控作用,进而证实除蜕皮激素等系统性因子及BMP和EGFR信号通路外,miRNA介导的调控也参与性腺的形态建成过程。更为重要的是,本研究可望为探讨器官发育中的miRNA调控机理提供理想的工作平台。
王利[7]（2015）在《黄羽鸡原始生殖细胞的分离培养及转基因的初步研究》文中进行了进一步梳理作为精子和卵子的前体细胞,禽类的原始生殖细胞（Primordial Germ Cells,简称PGCs）在生产转基因鸡和保存濒危物种的遗传资源中具有广阔的应用前景,而建立一个能使禽类PGCs有效增殖和传代的体外培养系统是这些应用的前提条件。黄羽鸡是我国重要的肉鸡品种,在广西及中国南方各省广泛养殖。为了更好的保护和利用这一地方家禽品种资源,本研究尝试从黄羽鸡分离PGCs,建立黄羽鸡PGCs的体外培养体系,并探索利用这一细胞工具进行黄羽鸡基因修饰的可能性。从黄羽鸡鸡胚血液或性腺中分离PGCs,与MEF或BRL饲养层直接接触培养或在BRL饲养层存在时,在细胞培养小室中培养。结果表明,跟直接和饲养层接触培养的PGCs相比,经细胞培养小室培养的PGCs的增殖速度更快,可以获得高达33%（1/3）的建系成功率。尽管最初是从多个混合性别的鸡胚分离而来,但是最终建系的每个PGCs株都是雄性而表现出雌性PGCs的缺失,这间接表明体外培养的雄性PGCs比雌性PGCs增殖得快。这些PGCs经长期体外培养后仍呈AP染色阳性。免疫荧光染色分析显示这些PGCs表达生殖细胞相关的标记物 SSEA-1 和 EMA-1。RT-PCR 分析表明它们表达 Nanog、PouV、CVH、CDH和DAZL这些多能性基因。PKH26标记的体外培养两个月的PGCs仍能定居到性腺。然后用脂质体LTX&PLUS试剂将构建在转座子质粒中的GFP基因导入培养的PGCs中,得到8.5%的转基因效率。用嘌呤霉素筛选GFP阳性的PGCs,并将这些阳性细胞注射到13～15期的鸡胚血液中,结果发现,这些遗传修饰后的PGCs仍能迁移到性腺。总之,本研究成功分离出黄羽鸡PGCs并建立了一套黄羽鸡PGCs的体外长期扩增培养的方法。这些PGCs不仅能在体外有效增殖,表达所有测试的标记物而且即使在进行遗产修饰后,还具有较高的性腺定居能力。因而,本研究分离获得的黄羽鸡PGCs将为地方家禽品种遗传资源的保存及生物育种提供一套有用的细胞平台。
李明辉[8]（2014）在《罗非鱼基因敲除技术的建立及其在性别决定与分化研究中的应用》文中提出行有性生殖的生物都有两种不同的性别,发育过程中都涉及到性别决定。因此,性别决定与分化及其分子机制是最基础的生物学问题之一。哺乳类性别决定与分化是由一系列转录因子和信号传导因子连接成网构成的协同作用通路,而硬骨鱼类还不清楚。许多经济动物（养殖鱼类）生长速率有明显的性别差异,如尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）雄鱼比雌鱼生长快50%,单性鱼养殖具有较高的经济价值,因此养殖鱼类性别决定与分化的分子机制及性别控制成为水产动物学研究的热点,可以兼顾基础和应用研究。随着大片段基因组文库的构建和高通量DNA测序技术的发展,罗非鱼基因组序列已经公布,但缺乏Y染色体信息,有必要构建含Y染色体信息的大片段基因组文库。长期以来,养殖鱼类缺乏有效的基因敲除手段严重阻碍了其性别决定和分化分子机制的研究。近几年,人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术TALEN和CRISPR/Cas9的出现使我们能对任意物种的基因组进行定点编辑。因此,本研究将探索在罗非鱼建立这两种基因敲除技术,并用于对dmrt1、foxl2、igf3和nanos等基因敲除,研究它们在性别决定与分化中的作用及分子机制。主要研究结果如下：1.以pCC2FOS为载体构建罗非鱼XY个体Fosmid基因组文库,共挑选115200个单菌落,保存在300块384孔板中,构建4800个行池、7200个列池、300个板池和25个超级池,形成微阵列,并对其进行复制备份。该文库插入片段平均长度为40kb左右,覆盖约罗非鱼基因组的3倍。连续传代实验表明,文库具有良好的稳定性。通过构建超级池—板池—行、列池三级池系统形成微阵列,能快速、准确、有效的筛选目的基因,仅需77个PCR反应（超级池25+板池12+行池16+列池24）就能筛到含有目的基因的克隆,解决了普遍存在的文库筛选难题。通过该文库尝试筛选了20个与性别分化相关基因,均获得2-5个阳性克隆,说明文库具有较好的实用性。罗非鱼XY基因组大片段文库的构建,为性别特异分子标记的筛选、性别决定候选基因的克隆、基因组编辑和遗传育种等研究提供了基础。2. TALEN基因组编辑技术已成功运用于多种模式生物。本研究在非模式生物罗非鱼中建立TALEN靶向基因敲除技术,它能高效的对dmrt1和foxl2进行敲除,且最高敲除率达到81%,亚克隆测序证实靶位点产生多种删除或插入不同数目碱基的突变类型。此外,TALEN诱导的高突变率个体在当代（G0）就能产生明显的表型。通过常规组织学、免疫组化、real-time PCR和激素测定等方法检测了Dmrt1和Foxl2缺失对性腺性别分化及相关基因表达的影响,结果显示：XY个体Dmrt1缺失使精巢不能正常发育,如输精管发育异常,精原细胞退化,甚至没有生殖细胞,类固醇生成细胞增生等。Dmrt1缺失的XY个体无性逆转发生。此外,与对照组精巢相比,Dmrt1缺失使精巢中foxl2、雌激素合成酶Cyp19a1a/cyp19a1a和血清雌激素（17β-雌二醇）水平升高。相反,XX个体Fox12缺失使卵母细胞退化,Cyp19a1a/cyp19a1a和血清雌激素水平显着降低；更重要的是,部分Fox12缺失的XX个体发生性逆转,并伴随Dmrt1和雄激素合成酶Cyp11b2的表达。该研究证实TALEN能高效应用于养殖鱼类罗非鱼的基因敲除；Dmrt1和Foxl2在性腺中拮抗性的参与罗非鱼性别分化,它们主要通过调控Cyp19ala的表达和雌激素的水平来影响性别分化。3.新兴的CRISPR/Cas9已在多个模式生物中证实能有效进行基因组编辑。本研究采用CRISPR/Cas9成功在非模式生物罗非鱼进行nanos2、nanos3、dmrt1和foxl2的敲除,最高突变率达到95%。CRISPR/Cas9诱导的基因突变在当代（G0）也能产生明显的表型。通过GFP-vasa’3UTR标记和生殖细胞特异表达Vasa染色证实,XY性腺缺失Nanos2和XX个体性腺腺缺失Nanos3均导致生殖细胞缺失,且性腺成中空管状结构。免疫组化结果显示Nanos2缺失的XY精巢仍然表达Dmrt1和Cyp11b2;而Nanos3缺失的XX性腺体细胞雄性化,表达Dmrt1和Cyp11b2,司时伴随着敲除鱼血清雄激素（11-KT）的上调和雌激素的下调。该结果表明无论基因型如何,生殖细胞缺失均导致性腺体细胞的雄性化。此外,CRISPR/Cas9敲除Dmrtl和Foxl2所产生的表型与TALEN敲除结果一致。CRISPR/Cas9诱导的foxl2和dmrt1突变能通过生殖细胞高效传递到F1代。F1代中检测到移码和非移码的foxl2突变体,这与其XX亲本的突变类型相一致；然而,与dmrt1XY亲本突变类型不一致,敲除鱼的精子以及受精获得的F1代中仅检测到非移码的突变,这说明Dmrt1对罗非鱼精子发育和成熟具有重要作用。这些结果表明CRISPR/Cas9可用于罗非鱼基因的高效、快速编辑,而且是可遗传的。4.最近,本实验室发现一个仅在硬骨鱼类存在的igf3,它只在性腺表达,然而,它在性腺发育过程中的表达模式、转录调控及在性腺分化中的作用还有待阐明。我们通过real-timePCR检测发现igf3在孵化后5天到孵化后40天卵巢的表达量高于精巢,而孵化后50天到孵化后70天低于精巢的表达。通过制备Igf3多克隆抗体,免疫组化检测显示Igf3在孵化后10天到成体雌雄性腺的体细胞中表达。利用Igf3重组蛋白处理原代培养的卵巢和精巢细胞,real-time PCR检测发现Igf3以时问、剂量依赖的方式增强性腺分化相关转录因子foxl2、 dmrt1、 nr5a1（sfl）和类固醇酶cyp19a1a、cyp11b2、cyp11a1、hsd3b2和cyp17a1的表达。通过CRISPR/Cas9成功在XX、XY罗非鱼敲除igf3基因,单条鱼的突变率最高达到95%。Igf3缺失导致3月龄XY性腺中无精母细胞和精细胞、但存在精原细胞,精巢只有少量Cyp11b2表达；而对照组XY精巢存在各级生精细胞,且有大量Cyp11b2表达。Real-time PCR结果显示：敲除鱼性腺dmrt1、nr5a1和cyp11b2mRNA的表达水平也明显低于对照鱼。与此相吻合,激素测定进一步证实敲除鱼血清雄激素水平明显低于对照鱼。另一方面,Igf3缺失导致3月龄XX卵巢中存在大量卵原细胞,极少的Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞,卵巢只有少量Cypl9ala表达；而对照组XX卵巢已有大量各时相卵母细胞,只有边缘存在少量卵原细胞,卵巢中大量的Cyp19a1a表达于间质细胞。Real-time PCR结果也显示：敲除鱼foxl2、nr5a1和cyp19a1a mRNA的表达水平也明显低于对照鱼。与此相吻合,激素测定进一步证实敲除鱼血清雌激素水平明显低于对照鱼。这些体外和体内研究都表明Igf3参与调控性别分化相关转录因子和类固醇酶的表达,且Igf3参与调控罗非鱼生殖细胞的减数分裂。最后,利用Fosmid文库获得的igf3启动子序列,构建双荧光素酶报告基因载体在HEK293细胞中进行启动子分析发现：igf3能直接被Nr5a1（Sfl）激活,而Fox12、NrOb1a （Dax1）和NrOblb （Dax2）单独转染没有作用,但与Nr5al共转染时均能增强Nr5al激活的igf3转录活性；然而,Dmrt1、雌激素在与受体共转染时抑制igf3的转录。Forskolin能增强Nr5al和igf3的转录。此外,igf3在Dmrt1和Foxl2TALEN敲除鱼的表达升高。这些结果表明Igf3能调控foxl2、dmrtl、nr5a1和类固醇合成酶的表达,反之,igf3的表达又受到Foxl2、Dmrt1、Nr5a1和雌激素的调控,它们之间形成紧密的调控环作用于罗非鱼生殖细胞的减数分裂。综上所述：本研究建立了罗非鱼微阵列Fosmid基因组文库、TALEN和CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术,通过TALEN和CRISPR/Cas9研究了Dmrt1、Foxl2、Nanos2、Nanos3以及新发现的Igf3在硬骨鱼类性别决定与分化的功能,证明其在研究硬骨鱼类性别决定与分化的分子机制方面具有独特的优势。目前这些技术已广泛用于本实验室罗非鱼基因筛选和基因编辑。TALEN和CRISPR/Cas9技术的建立为养殖鱼类的基因功能以及性别控制研究提供有效的技术手段。
赵丽玲[9]（2013）在《慢病毒载体精子介导法生产转基因鸡研究》文中指出本研究探索并建立基于慢病毒载体精子介导法高效制备生产转基因鸡的技术体系。构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体和慢病毒表达载体,并对293T细胞进行转染分析对比。用慢病毒感染原代培养细胞鸡生殖细胞和鸡胚小肠上皮细胞,并用实时荧光定量PCR对感染慢病毒的细胞进行目的基因检测。用性成熟公鸡生殖器官组织做切片后,运用微创手术方法,将以绿色荧光蛋白为报告基因的慢病毒载体连续导入性成熟公鸡睾丸,进行精液检查,观察到精子中绿色荧光的表达后,进行人工授精、种蛋孵化,以期在鸡胚和小鸡中检测到目的基因。研究结果：成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体PcDNA3.1-GFP和慢病毒表达载体并在293T细胞中表达。用慢病毒感染的细胞进行实时荧光定量PCR检测结果：293T细胞感染复数最高,达6.08×107TU/mL;鸡胚小肠上皮细胞5.36×105TU/mL;鸡胚生殖细胞0.84×102TU/mL。用性成熟公鸡生殖器官组织切片,观察公鸡睾丸实质由细精管组成呈网状,适合睾丸注射。应用微创手术法将慢病毒载体连续导入性成熟公鸡睾丸中,在精子中检测到了绿色荧光,将表达绿色荧光的精子体外授精,授精蛋进行孵化,并在第一代转基因鸡中检测到外源基因绿色荧光蛋白的表达。
王爱珍[10]（2013）在《吉富罗非鱼精原干细胞分离与体外培养的研究》文中指出精子的发生是一个复杂而精细的过程，精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）在雄性性腺中受神经内分泌和环境因子的协同作用而有条不紊的进行自我更新和分化，以维持机体正常的生精功能。精子作为向子代传递遗传信息的载体是进行遗传物质改良的最好材料，而生殖干细胞又是形成精子的前提细胞，可利用基因工程技术生产饲料转化率高、抗病力强及具有优质蛋白质的转基因动物。尽管人们对精子发生的一般过程和调节机制有所了解，但对多数动物精子发生的特点和调节机制仍然认识不清楚。因此在体外模拟雄性动物性腺微环境培养SSCs对揭秘精子的发生过程和调节机制具有重要意义，为体外生产精子并以精子为载体生产转基因细胞、组织和动物提供材料和技术，不仅可保护濒临灭绝的遗传资料也可以生产具有商业价值的新品种或转基因动物。哺乳动物SSCs体外分离、克隆及诱导等的研究取得了较大的进展，而鱼类SSCs的研究仅限于斑马鱼和青鳉鱼等少数鱼类，国内罗非鱼SSCs体外分离培养的相关研究鲜有报道，关于罗非鱼SSCs分离、克隆及冻存的方法还需进一步优化和探讨，因此本研究以雄性吉富罗非鱼为模型动物，取精巢为试验材料做如下研究：1.采用不同消化液和不同分离方法获得SSCs和SCs，探讨CO2和Hepes浓度对罗非鱼精巢细胞原代培养时的影响，然后从形态学及HE、油红O及AKP染色等方法对SSCs和SCs做初步的鉴定；2.用差速贴壁法、克隆环法和机械法对SSCs和SCs进行纯化，用不同饲养层培养罗非鱼SSCs并选择出有利于SSCs增殖的饲养层，然后探讨分别添加吉富罗非鱼精巢提取液、斑马鱼胚胎提取液、EGF或bFGF时，对以SCs为饲养层培养的SSCs增殖的影响，并绘制生长曲线，以建立吉富罗非鱼SSCs的扩增体系；3.用不同的冻存液和降温方式冻存吉富罗非鱼SSCs和SCs，然后用相同的方法解冻并检测SSCs和SCs的解冻存活率，最后选择出有利于SSCs和SCs冷冻保存的冻存液和降温方式。试验结果表明：1．用胰蛋白酶消化吉富罗非鱼精巢组织后所得的总细胞数和活细胞数都显着高于0.1%胶原酶Ⅳ和0.04%EDTA·Na2（P<0.05），而首次贴壁时间比0.1%胶原酶Ⅳ和0.04%EDTA·Na2组明显缩短（P<0.05）；胰蛋白酶组与组合酶（胶原酶和胰蛋白酶，下同）组相比总细胞数、活细胞数和首次贴壁时间都无显着差异（P>0.05），但胰蛋白酶组消化时间比三个组都短，因此用胰蛋白酶可高效、快速的分离到吉富罗非鱼精巢细胞，用L-15+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L谷氨酰胺+1mmol/L非必需氨基酸+1%罗非鱼血清+10%FBS培养分离的细胞，由于组织块培养后得到的杂细胞较多，进一步纯化SSCs和SCs较困难因而不宜采用；添加5%CO2浓度时不利于吉富罗非鱼SSCs和SCs的生长，SSCs和SCs培养的前3d宜在pH为7.2-7.4的培养液中生长，随着培养时间的延长，较高的pH更有助于SSCs和SCs的增殖。经鉴定胰蛋白酶分离所得的细胞主要为SSCs和SCs，显微镜观察和HE染色发现SSCs依附在SCs上呈圆形或卵圆形，体积较大，胞质透明并以集落形式生长，油红O染色发现SSCs胞质中几乎没有脂滴，AKP染色呈阳性，而SCs呈三角形或多边形，胞质中含有丰富的脂滴，AKP阴性不着色。2．采用机械法纯化后SSCs和SCs的纯度分别为85%和88%；当有60%-70%SCs贴壁时可对其进行传代，一般3-4d传一代，SCs共传了5代；当饲养层上有大量SSCs集落时对SSCs进行传代，发现原代培养至第5-6d时是SSCs传代培养的最佳时期。由于SSCs增殖缓慢，一般7d传一代，已传至第5代，隔3d换一半的培养液，传代过程中SSCs和SCs均保持原来的形态。SCs饲养层与小鼠胎儿成纤维细胞和大鼠胰腺上皮样细胞饲养层相比显着促进SSCs增殖（P<0.05），而后两种饲养层几乎对SSCs的增殖没有影响，反而随着培养时间的延长抑制其生长。以L-15+1%罗非鱼血清+10%FBS为基础培养液，SCs为饲养层，分别添加不同浓度的罗非鱼精巢提取液、斑马鱼胚胎提取液、EGF或bFGF扩增吉富罗非鱼SSCs，采用CCK-8法测定第1-7d的细胞的光密度，绘制细胞生长曲线。结果显示上述添加物均能促进SSCs增殖，其中添加10%斑马鱼胚胎提取液、10ng/mL EGF或10ng/mLbFGF时显着促进SSCs增殖，以10ng/mL EGF和10ng/mL bFGF促增殖效果最为明显，而10ng/mL bFGF稍微优于10ng/mL EGF。3．冻存液为胎牛血清:DMSO=9:1和降温条件为4℃30min→-20℃1h→-80℃过夜（12h）→投入液氮时吉富罗非鱼SSCs可以较好的冻存，平均解冻存活率为78%。降温条件为4℃30min→-20℃1h→-80℃的过夜（12h）→投入液氮时，冻存液为胎牛血清:DMSO=9:1和胎牛血清:DMSO:培养液A=1:1:8都可用来冷冻吉富罗非鱼SCs，复苏率分别为82.5%和79%。
二、以雄性生殖细胞为载体建立转基因动物的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、以雄性生殖细胞为载体建立转基因动物的研究进展（论文提纲范文）
（1）基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1 睾丸的生物学功能概述 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 睾丸支持细胞的生物学功能 |
| 1.3 免疫豁免特性 |
| 1.3.1 血-睾屏障 |
| 1.3.2 免疫抑制 |
| 2 非编码RNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 2.1 miRNAs及其在哺乳动物睾丸中的研究进展 |
| 2.2 CircRNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 3 转录组测序技术在哺乳动物生殖系统中的应用研究进展 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 不同发育期藏绵羊睾丸circRNA/miRNA/mRNA表达谱特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品收集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 组织形态学分析 |
| 1.3.2 总RNA提取及质检 |
| 1.3.3 cDNA文库和小RNA文库的构建及测序 |
| 1.3.4 数据质控及mRNA、circRNA、miRNA的鉴定 |
| 1.3.5 差异表达分析 |
| 1.3.6 功能富集分析 |
| 1.3.7 RT-qPCR验证 |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同发育阶段藏绵羊睾丸组织形态学特征比较分析 |
| 2.2 mRNA、circRNA和miRNA测序数据概述 |
| 2.3 差异表达分析 |
| 2.3.1 差异表达mRNA分析 |
| 2.3.2 CircRNA表征及差异表达分析 |
| 2.3.3 差异表达miRNA分析 |
| 2.4 测序结果验证 |
| 2.4.1 mRNA测序结果验证 |
| 2.4.2 CircRNA测序结果验证 |
| 2.4.3 miRNA测序结果验证 |
| 2.5 功能注释与富集分析 |
| 2.5.1 差异表达mRNAs功能注释与富集分析 |
| 2.5.2 差异circRNAs来源基因功能注释与富集分析 |
| 2.5.3 差异circRNAs来源基因与差异mRNAs共享基因的功能富集分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 CircRNA-miRNA-mRNA整合分析及睾丸功能维持相关基因的ceRNA调控网络鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 CircRNA-miRNA-mRNA关联性分析 |
| 1.3.2 功能注释与富集分析 |
| 1.3.3 荧光素酶报告基因载体构建及鉴定 |
| 1.3.4 细胞转染及双荧光素酶活性检测 |
| 1.3.5 RT-qPCR检测 |
| 1.3.6 Western blot分析 |
| 1.3.7 组织免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CircRNA/miRNA/mRNA关联性分析 |
| 2.2 ceRNA网络中mRNAs的功能富集分析 |
| 2.3 CircRNA-miRNA-mRNA网络构建 |
| 2.4 Circ_015256/circ_029155-miR-760-3p-BOLL靶向关系验证 |
| 2.5 Circ_029155/miR-760-3p/BOLL在睾丸中的表达特征 |
| 2.6 BOLL蛋白在绵羊睾丸中的表达与分布特征 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 睾丸免疫特权维持相关基因的鉴定及其ceRNA调控网络研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 免疫相关差异表达基因鉴定与筛选 |
| 1.3.2 免疫相关miRNA-mRNA对及ceRNA共表达网络构建 |
| 1.3.3 RT-qPCR分析 |
| 1.3.4 Western blot分析 |
| 1.3.5 免疫荧光染色 |
| 1.3.6 双荧光素酶报告试验 |
| 1.3.7 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 性成熟前、后睾丸差异基因功能分类 |
| 2.2 免疫相关基因鉴定及表达特征分析 |
| 2.3 免疫相关差异基因的RT-qPCR验证 |
| 2.4 免疫相关基因编码蛋白的表达与定位 |
| 2.5 免疫相关基因功能注释分析 |
| 2.6 免疫相关基因的miRNA-mRNA调控网络分析 |
| 2.7 免疫相关差异miRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.8 免疫相关基因的circRNA-miRNA-mRNA互作网络分析 |
| 2.9 免疫相关差异表达circRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.10 靶向关系验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 CircKLHL5靶向miR-29b/IGF1信号轴对绵羊睾丸支持细胞发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品采集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 藏绵羊睾丸支持细胞的体外分离与纯化 |
| 1.3.2 支持细胞纯度鉴定 |
| 1.3.3 载体构建、细胞培养与转染 |
| 1.3.4 支持细胞核质分离 |
| 1.3.5 CircHLHL5成环鉴定 |
| 1.3.6 CCK-8分析 |
| 1.3.7 EdU染色 |
| 1.3.8 RT-qPCR |
| 1.3.9 Western blot |
| 1.3.10 细胞免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.11 酪胺信号放大-荧光原位杂交(TSA-FISH) |
| 1.3.12 流式检测细胞凋亡 |
| 1.3.13 双荧光素报告基因检测 |
| 1.3.14 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Circ_026259/miR-29b/IGF1轴的组织表达特征 |
| 2.2 绵羊睾丸支持细胞形态及免疫荧光鉴定 |
| 2.3 睾丸支持细胞中circKLHL5的鉴定 |
| 2.4 CircKLHL5转染效率检测 |
| 2.5 CircKLHL5可促进绵羊睾丸支持细胞增殖并抑制其凋亡 |
| 2.6 CircKLHL5与miR-29b靶向关系验证 |
| 2.7 Oar-miR-29b对睾丸支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.8 Oar-miR-29b与IGF1基因间靶向关系验证 |
| 2.9 IGF1转染效率检测 |
| 2.10 IGF1基因对支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.11 Oar-miR-29b可逆转circKLHL5对支持细胞表型的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1 少精症与动物模型 |
| 2 少精症与精子发生 |
| 3 4.1R蛋白与精子发生 |
| 4 血睾屏障与精子发生 |
| 5 Wnt/β-catenin信号通路与精子发生 |
| 6 研究意义与内容 |
| 7 试验方案 |
| 第二章 4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的表达与作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 少精症小鼠模型的建立 |
| 3.2 睾丸组织中4.1R蛋白表达水平检测 |
| 3.3 睾丸组织中epb41 基因转录水平检测 |
| 3.4 睾丸组织中4.1R蛋白表达分布检测 |
| 3.5 血睾屏障功能分析 |
| 3.6 统计方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 少精症模型小鼠精子密度测定 |
| 4.2 少精症模型小鼠附睾和睾丸形态学检测 |
| 4.3 4.1R蛋白在小鼠睾丸组织中的表达 |
| 4.4 少精症小鼠睾丸中epb41 基因转录水平检测 |
| 4.5 少精症小鼠睾丸组织中4.1R蛋白表达分布 |
| 4.6 少精症模型小鼠血睾屏障功能分析 |
| 4.7 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分转录检测 |
| 4.8 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 4.1R蛋白表达对睾丸支持细胞增殖和连接的调节作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 Epb41 基因CRISPR-cas9 质粒载体构建与验证 |
| 3.2 CRISPR-Cas9 慢病毒载体构建 |
| 3.3 过表达慢病毒载体的构建 |
| 3.4 TM4 细胞培养 |
| 3.5 原代睾丸支持细胞培养 |
| 3.6 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.7 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.8 过表达慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.9 过表达慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.10 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 Epb41-sg RNAs与 pGL3-U6-sg RNA-puromycin和 pSpCas9(BB)-2A-GFP载体连接 |
| 4.2 pGL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和 pSpCas9(BB)-epb41-sg RNAb-2A-GFP共转染N2a细胞 |
| 4.3 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP 慢病毒载体检测 |
| 4.4 过表达慢病毒载体的构建与验证 |
| 4.5 慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 4.6 慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 4.7 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 4.1R蛋白表达对体内睾丸支持细胞间连接的调节作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 质粒载体电转染小鼠活体睾丸组织 |
| 3.2 慢病毒载体睾丸活体转染 |
| 3.3 小鼠活体睾丸转染效果验证 |
| 4 结果 |
| 4.1 质粒载体活体电转染睾丸组织方法验证 |
| 4.2 重组CRISPR-Cas9 基因敲除质粒载体电转染睾丸 |
| 4.3 过表达慢病毒载体转染睾丸 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（3）应用CRISPR/Cas9技术敲除鸡GDF8基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 Abbreviation |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 GDF8基因研究进展 |
| 1.1.1 GDF8基因起源 |
| 1.1.2 GDF8基因的结构 |
| 1.1.3 GDF8功能 |
| 1.1.4 GDF8在动物生产中的研究 |
| 1.2 基因编辑技术-CRISPR/Cas9 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 系统的来源 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 系统的作用机制 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9 系统在家禽中的应用 |
| 1.3 转基因鸡的制备 |
| 1.3.1 逆转录病毒感染法 |
| 1.3.2 精子载体法 |
| 1.3.3 PGC介导法 |
| 1.3.4 转基因鸡的应用价值 |
| 1.4 目的和意义 |
| 第二章 鸡GDF8基因的功能分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 不同物种GDF8核酸序列的同源性分析 |
| 2.2.2 GDF8基因功能富集分析 |
| 2.2.3 鸡胚RNA提取并反转录为c-DNA |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR(q PCR) |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 不同物种GDF8基因核酸序列的同源性分析 |
| 2.3.2 鸡GDF8基因功能富集分析 |
| 2.3.3 检测GDF8 在鸡胚不同组织的m RNA水平 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CRISPR/Cas9 技术敲除GDF8 基因方法的优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 实验试剂和质粒 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PX459-GDF8-sgRNA载体构建 |
| 3.2.2 PX459-multi sgRNA质粒构建 |
| 3.2.3 PX458-GDF8-multi sg RNA质粒构建 |
| 3.2.4 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的准备 |
| 3.2.5 DF-1细胞传代和培养 |
| 3.2.6 细胞转染 |
| 3.2.7 T7E1内切酶鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 sgRNA载体的构建 |
| 3.3.2 sgRNA载体切割效率的验证 |
| 3.3.3 验证多个sgRNA载体转染细胞的切割效率 |
| 3.3.4 构建多合-multi-sg RNA载体 |
| 3.3.5 验证多合-multi-sg RNA载体基因敲除的效率 |
| 3.3.6 多合-multi-sg RNA质粒改造成携带荧光的多合-multi-sg RNA质粒质粒并验证编辑效率 |
| 3.3.6.1 构建携带荧光的多合-multi-sgRNA 载体质粒 |
| 3.3.6.2 携带荧光的多合-multi-sg RNA质粒在PGCs基因编辑效率的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 CRISPR/Cas9 介导的基因整合策略制备嵌合体鸡 |
| 4.1 实验 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂和质粒 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 鸡胚组织提取DNA |
| 4.2.2 GDF8-HDR供体质粒构建 |
| 4.2.3 GDF8-HMEJ供体载体构建 |
| 4.2.4 GDF8-HITI供体质粒载体构建 |
| 4.2.5 PX458-sg RNA2 载体的构建 |
| 4.2.6 DF-1细胞转染 |
| 4.2.7 原代原始生殖细胞的分离 |
| 4.2.8 原代PGCs的转染 |
| 4.2.9 原代PGC基因定点整合的验证 |
| 4.2.10 生殖系嵌合体鸡的制备 |
| 4.2.11 性腺分离 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 GDF8-HDR载体质粒构建 |
| 4.3.2 GDF8-HMEJ供体质粒载体的构建 |
| 4.3.3 GDF8-HITI供体质粒载体的构建 |
| 4.3.4 sgRNA2载体的构建 |
| 4.3.5 比较HITI、HDR和 HMEJ基因编辑策略的整合效率 |
| 4.3.6 通过HMEJ策略对原代PGC进行基因编辑 |
| 4.3.7 GDF8基因缺陷生殖系嵌合体鸡的产生 |
| 4.4 讨论 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（4）H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进鸡PGCs形成的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PGCs的发生及生物学特性 |
| 1.1 PGCs的发生 |
| 1.2 PGCs的生物学特性 |
| 2 PGCs发生的分子调控研究进展 |
| 2.1 细胞因子调节PGCs形成 |
| 2.2 RNA结合蛋白调节PGCs形成 |
| 2.3 关键基因调节PGCs形成 |
| 3 Wnt/β-catenin信号通路对雄性生殖细胞形成的研究进展 |
| 3.1 Wnt信号通路概述 |
| 3.1.1 经典Wnt信号通路 |
| 3.1.2 非经典Wnt信号通路 |
| 3.2 Wnt/β-catenin信号通路对靶基因转录的调控研究 |
| 3.2.1 β-catenin/TCF核心效应因子 |
| 3.2.2 表观遗传学机制 |
| 3.3 Wnt/β- catenin信号通路在雄性生殖细胞形成过程中的研究 |
| 4 PGCs形成过程的表观遗传调控 |
| 4.1 DNA甲基化在PGCs发育过程中的研究进展 |
| 4.1.1 哺乳动物PGCs发育过程的DNA甲基化 |
| 4.1.2 家禽PGCs形成过程的DNA甲基化 |
| 4.2 组蛋白甲基化修饰在PGCs发育过程中的研究进展 |
| 4.2.1 哺乳动物PGCs发育过程中的组蛋白甲基化修饰 |
| 4.2.2 家禽PGCs形成过程中的组蛋白甲基化修饰 |
| 4.3 组蛋白甲基化修饰发挥功能的机制研究 |
| 4.3.1 抑制性和激活性赖氨酸甲基化修饰 |
| 4.3.2 组蛋白赖氨酸甲基化修饰酶 |
| 5 本课题的前期研究发现 |
| 6 本研究的研究目的与意义 |
| 7 参考文献 |
| 第二章 PGCs形成过程中H3K4me2对Wnt5A/β-Catenin/ TCF7L2信号链的调控作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 细胞分离培养 |
| 1.5 ChIP-Seq和RNA-seq联合分析PGCs形成过程中关键信号通路 |
| 1.6 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号参与鸡PGCs形成的研究 |
| 1.6.1 细胞分组与处理 |
| 1.6.2 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.6.3 qRT-PCR检测Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号分子的表达变化 |
| 1.6.4 COIP检测β-Catenin和TCF7L2的结合 |
| 1.7 ESCs、PGCs中Wnt关键信号分子启动子区的H3K4me2富集检测 |
| 1.7.1 细胞分组与处理 |
| 1.7.2 ChIP-qPCR检测H3K4me2在Wnt关键信号分子启动子区的富集情况 |
| 1.8 PGCs形成过程中H3K4me2对Wnt信号分子的表达影响检测 |
| 1.8.1 细胞分组与处理 |
| 1.8.2 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.8.3 qRT-PCR检测Wnt5A/β-Catenin信号通路信号分子的表达变化 |
| 1.8.4 Westen blot检测Wnt通路关键信号分子的表达变化 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 实验结果及分析 |
| 2.1 PGCs形成关键信号通路的筛选 |
| 2.1.1 RNA-seq分析PGCs形成过程中关键信号通路 |
| 2.1.2 ChIP-Seq分析H3K4me2在PGCs形成过程中富集的关键信号通路 |
| 2.1.3 RNA-seq和ChIP-Seq联合分析筛选PGCs形成关键信号通路 |
| 2.2 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号链参与鸡PGCs形成过程 |
| 2.2.1 Wnt5A介导Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号 |
| 2.2.2 载体构建结果 |
| 2.2.3 β-Catenin与TCF7L2结合 |
| 2.3 ESCs、PGCs中Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区H3K4me2富集检测 |
| 2.3.1 ChIP的条件摸索 |
| 2.3.2 H3K4me2富集于Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区 |
| 2.3.3 H3K4me2在Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区差异富集 |
| 2.4 H3K4me2激活Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号促进PGCs的形成 |
| 2.4.1 体外验证H3K4me2正向调节Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号传导 |
| 2.4.2 体内验证H3K4me2正向调节Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号传导 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进PGCs形成 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号靶基因预测 |
| 1.5 体内外验证Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号对Lin28A/B的表达影响 |
| 1.5.1 β-Catenin慢病毒干扰载体构建及活性验证 |
| 1.5.2 细胞分组与处理 |
| 1.5.3 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.5.4 qRT-PCR检测Wnt信号分子及Lin28A/B表达情况 |
| 1.6 Lin28A/B启动子区域的生物学信息学分析 |
| 1.7 Lin28A/B启动子活性分析 |
| 1.7.1 pLin28A-EGFP、pLin28B-EGFP的构建 |
| 1.7.2 DF1细胞培养与转染 |
| 1.7.3 启动子活性定性分析 |
| 1.8 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 1.8.1 Lin28A/B启动子不同缺失片段PGL3-basic载体构建 |
| 1.8.2 PGL3-basic重组载体鉴定与命名 |
| 1.8.3 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 1.9 TCF7L2结合位点缺失对Lin28A/B的启动活性的影响 |
| 1.9.1 TCF7L2结合位点缺失的启动子报告基因载体的构建 |
| 1.9.2 双荧光素报告基因检测Lin28A/B转录因子结合位点缺失的启动活性 |
| 1.10 验证Lin28A/B是Wnt5 A/β-Catenin下游靶基因 |
| 1.10.1 双荧光素报告基因检测Lin28A/B对Wnt信号的响应 |
| 1.10.2 Chip-qPCR验证β-Catenin富集Lin28A/B核心启动子区 |
| 1.11 H3K4me2水平变化对Lin28A/B的表达影响的研究 |
| 1.11.1 细胞分组与处理 |
| 1.11.2 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.11.3 qRT-PCR检测Lin28A和Lin28AB的表达变化 |
| 1.12 Lin28A/B干扰载体构建及干扰效率验证 |
| 1.13 Lin28A/B过表达载体构建 |
| 1.14 Lin28A/B在PGCs形成过程中的功能研究 |
| 1.14.1 细胞分组与处理 |
| 1.14.2 鸡胚孵化分组与处理 |
| 1.14.3 荧光定量PCR检测PGCs形成相关基因表达 |
| 1.14.4 PAS染色法检测各组生殖嵴发育 |
| 1.14.5 流式细胞分析检测PGCs形成效率 |
| 1.15 数据分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号靶基因预测 |
| 2.1.1 不同物种TCF7L2靶基因预测 |
| 2.1.2 GO注释筛选与生殖分化相关的靶基因 |
| 2.2 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号正向促进Lin28A/B表达 |
| 2.2.1 β-Catenin干扰载体构建及活性验证 |
| 2.2.2 体内验证Wnt5A/β-Catenin信号正向调控Lin28A/B表达 |
| 2.2.3 体外验证Wnt5A/β-Catenin信号正向调控Lin28A/B表达 |
| 2.3 Lin28A/B启动子活性分析 |
| 2.3.1 真核表达载体pEGFP-Lin28A、pEGFP-Lin28B的构建 |
| 2.3.2 Lin28A/B启动子活性分析 |
| 2.4 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 2.4.1 Lin28A/B启动子不同缺失片段PGL3-basic载体构建 |
| 2.4.2 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 2.5 TCF7L2结合位点突变对Lin28A/B的启动活性的影响 |
| 2.5.1 转录因子TCF7L2结合位点突变的启动子报告基因载体的构建 |
| 2.5.2 双荧光素报告基因检测Lin28A/B转录因子结合位点缺失的启动活性 |
| 2.6 Lin28A/B是Wnt5 A/β-Catenin/TCF7L2信号链直接靶基因 |
| 2.6.1 双荧光素报告基因检测Lin28A/B对Wnt信号的响应 |
| 2.6.2 Chip-qPCR验证β-Catenin富集于Lin28A/B启动子区 |
| 2.7 H3K4me2正向调控Lin28A/B转录 |
| 2.7.1 体外验证H3K4me2正向调控Lin28A/B转录 |
| 2.7.2 体内验证H3K4me2正向调控Lin28A/B转录 |
| 2.8 Lin28A/B正向调控PGCs形成的功能研究 |
| 2.8.1 Lin28A/B干扰载体构建 |
| 2.8.2 Lin28A/B过表达载体构建 |
| 2.8.3 Lin28A/B正向调控PGCs的形成 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28转录 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 H3K4me2在Lin28A/B启动子区的富集检测 |
| 1.4.1 细胞分组与处理 |
| 1.4.2 ChIP-qPCR检测H3K4me2在Lin28/B启动子区的富集情况 |
| 1.5 荧光素酶报告基因检测H3K4me2对Lin28A/B响应Wnt信号能力的影响 |
| 1.6 H3K4me2去甲基化酶LSD1对β-catenin与TCF7L2的结合能力的影响 |
| 1.6.1 LSD1与β-catenin和TCF7L2的结合能力检测 |
| 1.6.2 LSD1对β-catenin与TCF7L2的结合能力的影响 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 H3K4me2富集于Lin28A/B的启动子区并差异性调节Lin28A/B转录 |
| 2.2 H3K4me2甲基化/去甲基化影响Lin28A/B对Wnt信号的响应 |
| 2.3 β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录 |
| 2.3.1 LSD1融合表达载体构建 |
| 2.3.2 LSDl 与 TCF7L2 互作而不是(3-Catenin |
| 2.3.3 β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 Lin28通过抑制gga-let-7a-2-3p促进PGCs形成标记基因Blimp1的转录 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 Lin28A/B靶向的gga-let7s筛选 |
| 1.4.1 鸡micRNA-let7s筛选 |
| 1.4.2 细胞分组与处理 |
| 1.4.3 qRT-PCR检测Lin28A/B靶向的gga-let7s筛选 |
| 1.5 gga-let-7a-2-3p靶基因筛选 |
| 1.6 检测gga-let-7a-2-3p对靶基因的靶向作用 |
| 1.6.1 gga-let-7a-2-3p模拟物、抑制物合成及效率验证 |
| 1.6.2 Blimp1 3'UTR野生型和突变型载体构建 |
| 1.6.3 双荧光素报告基因检测gga-let-7a-2-3p对Blimp1的靶向作用 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Lin28A/B靶向的关键micRNA let7的筛选 |
| 2.2 gga-let-7a-2-3p靶基因预测 |
| 2.3 gga-let-7a-2-3p负向调控Blimp1的表达 |
| 2.4 Blimp1 3'UTR野生型和突变型载体构建 |
| 2.5 gga-let-7a-2-3p对Blimp1的靶向作用 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 本文结论与创新 |
| 论文有待改进之处及下一步计划 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（5）lncRNA-CEPT8调控鸡原始生殖细胞形成研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRCAT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 原始生殖细胞 |
| 1.1 原始生殖细胞的生物学特性 |
| 1.2 原始生殖细胞研究进展 |
| 1.2.1 多细胞因子参与调控原始生殖细胞形成 |
| 1.2.2 多信号通路参与调控生殖细胞形成 |
| 1.2.3 JAK/STAT信号通路调控生殖细胞形成 |
| 2 lncRNA与雄性生殖细胞 |
| 2.1 表观遗传与雄性生殖细胞 |
| 2.2 lncRNA与精子发生 |
| 2.3 lncRNA与精子成熟 |
| 2.4 lncRNA在生物性腺和性染色体中的功能 |
| 3 研究目的及意义 |
| 4 参考文献 |
| 第二章 lncRNA-CEPT8的鉴定及理化性质分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂及仪器 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡生殖嵴总RNA提取 |
| 1.2.2 如皋黄鸡生殖嵴cDNA库的建立 |
| 1.2.3 RACE实验 |
| 1.2.4 鸡原始生殖细胞分离纯化 |
| 1.2.5 亚细胞定位 |
| 1.2.6 原核融合表达载体构建 |
| 1.2.7 菌液蛋白提取 |
| 1.2.8 Western Blot检测蛋白表达 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 lncRNA-CEPT8在不同组织和细胞中的表达差异 |
| 2.2 lncRNA-CEPT8编码能力鉴定 |
| 2.2.1 lncRNA-CEPT8亚细胞定位 |
| 2.2.2 lncRNA-CEPT8开放阅读框预测 |
| 2.2.3 lncRNA-CEPT8原核融合表达载体构建 |
| 2.2.4 Western Blot检测lncRNA-CEPT8编码小肽能力 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 lncRNA-CEPT8调节鸡PGC生成的生物学功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂及仪器 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 lncRNA-CEPT8干扰靶位点选择与干扰载体构建 |
| 1.2.2 lncRNA-CEPT8过量表达载体构建 |
| 1.2.3 干扰和过表达载体活性检测 |
| 1.2.4 鸡胚体干细胞分离培养 |
| 1.2.5 体内研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能 |
| 1.2.6 体外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能 |
| 2 结果 |
| 2.1 lncRNA-CEPT8干扰与过表达载体构建及活性检测 |
| 2.2 体内研究检测lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能 |
| 2.2.1 qRT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下PGC标记基因表达变化 |
| 2.2.2 流式细胞分析检测PGC形成效率 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色观察PGC形成效率 |
| 2.3 体外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能 |
| 2.3.1 不同lncRNA-CEPT8表达水平下类PGC形成细胞形态学观察 |
| 2.3.2 qRT-PCR检测PGC标记基因差异表达 |
| 2.3.3 流式细胞分析检测类PGC形成效率 |
| 2.3.4 间接免疫荧光实验观察第四天CvhC-kit蛋白表达变化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 lncRNA-CEPT8调节靶基因Trim8表达影响鸡原始生殖细胞形成机制初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂及仪器 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡生殖嵴总RNA提取 |
| 1.2.2 RT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下Trim8基因表达变化 |
| 1.3 Trim8干扰及过表达载体构建 |
| 1.4 干扰载体及过表达载体活性检测 |
| 1.5 体内实验研究Trim8在PGC形成中的功能 |
| 1.5.1 鸡胚血管注射 |
| 1.5.2 流式细胞分析检测PGC形成效率 |
| 1.5.3 RT-PCR检测PGC标记基因表达变化 |
| 1.6 体外实验检测验证Trim8基因功能 |
| 1.6.1 鸡胚干细胞体外诱导培养 |
| 1.6.2 RT-PCR检测PGC标记基因表达水平 |
| 1.6.3 流式细胞分析检测PGC形成效率 |
| 1.7 RT-PCR检测STAT信号通路标记基因STAT3和JAK2表达量 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR检测Trim8在lncRNA-CEPT8不同表达水平下基因表达量变化 |
| 2.2 Trim8干扰与过表达载体构建及活性检测 |
| 2.3 体内研究检测Trim8在PGC形成中的功能 |
| 2.3.1 qRT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下PGC标记基因表达变化 |
| 2.3.2 流式细胞分析检测PGC形成效率 |
| 2.4 体外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能 |
| 2.4.1 不同lncRNA-CEPT8表达水平下类PGC形成细胞形态学观察 |
| 2.4.2 流式细胞分析检测PGC形成效率 |
| 2.4.3 qRT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下PGC标记基因表达变化 |
| 2.5 RT-PCR检测STAT信号通路标记基因差异表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 启动子调控lncRNA-CEPT8表达影响初步探究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 lncRNA-CEPT8启动子区域生物信息学分析 |
| 1.2.2 全基因组提取 |
| 1.2.3 真核表达载体pEGFP-CEPT8及逐段截取各启动子片段载体构建 |
| 1.2.4 lncRNA-CEPT8启动子关键调控区域鉴定 |
| 1.2.5 启动子关键正向调控区域转录因子预测 |
| 1.2.6 转录因子影响lncRNA-CEPT8表达水平 |
| 2 结果 |
| 2.1 真核表达载体pEGFP-CEPT8与启动子逐段截取片段载体构建 |
| 2.2 lncRNA-CEPT8启动子活性定性分析 |
| 2.3 lncRNA-CEPT8启动子关键正向调控区域确定及转录因子结合位点预测 |
| 2.4 转录因子PAX2,PAX5及KLF4点突变载体构建及活性检测 |
| 2.5 添加甲基化/乙酰化抑制剂对lncRNA-CEPT8启动子区影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论与创新 |
| 全文结论 |
| 全文创新点 |
| 有待改进之处 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 附录 |
（6）经典microRNA途径在雌性果蝇幼虫性腺发育中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 黑腹果蝇:理想的模式生物 |
| 1.2 干细胞与微环境 |
| 1.2.1 干细胞的基本属性 |
| 1.2.2 干细胞的微环境 |
| 1.3 雌蝇幼虫性腺原始生殖细胞及其微环境 |
| 1.3.1 雌蝇幼虫性腺原始生殖细胞的增殖与分化 |
| 1.3.2 雌蝇幼虫性腺原始生殖细胞的微环境 |
| 1.3.3 雌蝇幼虫性腺生殖细胞的辨识 |
| 1.3.4 雌蝇幼虫性腺的形成 |
| 1.3.5 雌蝇幼虫性腺的后期发育——成体果蝇卵巢 |
| 1.4 雌蝇幼虫性腺中两大细胞谱系的增殖与分化调控 |
| 1.4.1 BMP/Bam信号通路 |
| 1.4.2 Nos/Pum途径 |
| 1.4.3 Ecdysone信号通路 |
| 1.4.4 Insulin信号通路 |
| 1.4.5 EGFR信号通路 |
| 1.4.6 表观遗传学调控 |
| 1.4.7 其他调控途径 |
| 1.5 经典mi RNA途径及其研究背景 |
| 1.5.1 miRNA的生物学功能 |
| 1.5.2 经典mi RNA途径 |
| 1.5.3 经典mi RNA途径的研究进展 |
| 1.6 本论文的研究目的、内容及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 果蝇品系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 果蝇遗传操作 |
| 2.2.2 幼虫发育时期的划分 |
| 2.2.3 雌蝇幼虫性腺解剖 |
| 2.2.4 免疫荧光染色 |
| 2.2.5 制片与观察成像 |
| 2.2.6 测量与计数方法 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 MiRNA表达谱分析 |
| 2.2.9 统计方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 经典mi RNA途径的核心因子Drosha和 Pasha作用于雌蝇幼虫性腺的形态建成 |
| 3.1.1 Drosha和 Pasha是雌蝇幼虫性腺器官生长及原始生殖细胞增殖所必需的 |
| 3.1.1.1 pasha基因广泛表达于雌蝇幼虫性腺组织细胞中 |
| 3.1.1.2 drosha或 pasha基因突变导致果蝇幼虫发育迟缓 |
| 3.1.1.3 drosha或 pasha突变影响幼虫期原始生殖细胞的增殖以及性腺的正常生长 |
| 3.1.1.4 小结 |
| 3.1.2 Drosha和 Pasha调节雌蝇幼虫性腺体细胞的分化发育 |
| 3.1.2.1 Drosha或 Pasha的功能丧失导致端丝形成缺陷 |
| 3.1.2.2 小结 |
| 3.1.3 Drosha和 Pasha是雌蝇幼虫性腺发育中原始生殖细胞有序分化所必需的 |
| 3.1.3.1 Drosha或 Pasha的功能丧失会促进原始生殖细胞的分化 |
| 3.1.3.2 Drosha或 Pasha的功能丧失不会导致原始生殖细胞的提前分化 |
| 3.1.3.3 Drosha和 Pasha以细胞自治及非自治性两种方式作用于幼虫期原始生殖细胞的分化调控 |
| 3.1.3.4 Drosha或 Pasha介导的原始生殖细胞分化调控涉及独立于Bam的分子机制 |
| 3.1.3.5 Drosha或 Pasha对原始生殖细胞分化的调控不依赖于BMP信号通路 |
| 3.1.3.6 Drosha或 Pasha对原始生殖细胞分化的调控可能不依赖于Nos/Pum途径 |
| 3.1.3.7 小结 |
| 3.2 经典mi RNA途径调控雌蝇幼虫性腺的发育 |
| 3.2.1 Drosha和 Pasha在原始生殖细胞分化调控中存在遗传学互作 |
| 3.2.2 经典mi RNA途径中多个核心因子均具有类似于Drosha和 Pasha的功能 |
| 3.2.3 Drosha控制雌蝇幼虫性腺中众多mi RNA的生成 |
| 3.2.4 Drosha控制的一组mi RNA作用于雌蝇幼虫性腺的形态发生 |
| 3.2.5 miRNA在幼虫性腺形态发生中的作用机理初探 |
| 3.2.5.1 功能性mi RNA的靶基因预测 |
| 3.2.5.2 A2BP1 是功能性miRNA的预测靶基因 |
| 3.2.5.3 转录因子Broad编码基因可能是功能性mi RNA的靶基因 |
| 3.2.6 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 miRNA途径对幼虫发育、器官生长和细胞增殖的作用 |
| 4.2 miRNA途径对雌蝇幼虫性腺体细胞发育的调控 |
| 4.3 miRNA途径对雌蝇幼虫性腺原始生殖细胞有序分化的调控 |
| 4.4 Drosha和 Pasha在性腺中对生殖细胞和体细胞两大细胞谱系协同发育的作用 |
| 4.5 在幼虫性腺形态建成中一组功能性mi RNA的鉴定 |
| 4.6 miRNA及其预测靶基因在幼虫性腺形态建成中的功能分析 |
| 4.6.1 miRNA与 A2BP1 的功能相关性分析 |
| 4.6.2 miRNA与 ecdysone信号通路的关系 |
| 4.6.3 miRNA与 p53 途径的关系 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 RNAi转基因果蝇品系的验证 |
| 附录2 miRNA表达水平的验证 |
| 附录3 补充图表 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表的论文 |
（7）黄羽鸡原始生殖细胞的分离培养及转基因的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 引言 |
| 1 禽类原始生殖细胞和干细胞 |
| 1.1 精原干细胞(SSCs)或卵原干细胞(OSCs) |
| 1.2 胚胎生殖细胞(EGCs) |
| 1.3 胚胎干细胞(ESCs) |
| 1.4 诱导多能性干细胞(iPSCs) |
| 1.5 ESCs和iPSCs在一定条件下可特化为PGCs |
| 2 禽类PGCs的起源、迁移和生物学形态 |
| 2.1 禽类PGCs的起源及迁移 |
| 2.2 形态特征及生物学特性 |
| 3 禽类PGCs的分离及体外培养 |
| 3.1 禽类PGCs的分离 |
| 3.2 禽类PGCs的体外培养 |
| 4 禽类PGCs的体外鉴定 |
| 4.1 形态鉴定 |
| 4.2 过碘酸雪夫氏试剂(PAS)染色检测 |
| 4.3 碱性磷酸酶活性(AP)检测 |
| 4.4 免疫荧光染色检测 |
| 4.5 嵌合体试验 |
| 5 禽类PGCs的研究进展及应用前景 |
| 5.1 种质资源保存 |
| 5.2 转基因应用 |
| 6 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 黄羽鸡原始生殖细胞的分离、培养及鉴定 |
| 引言 |
| 第一节 黄羽鸡原始生殖细胞的分离及培养 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器和耗材 |
| 1.4 主要溶液配置 |
| 1.5 MEF的分离、培养及冷冻 |
| 1.6 饲养层的制备 |
| 1.7 BRL条件培养液的制备 |
| 1.8 PGCs的分离 |
| 1.9 PGCs的体外培养 |
| 1.10 PGCs的冷冻保存及复苏 |
| 1.11 生长曲线的制作 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 饲养层的制备 |
| 2.2 血液来源的PGCs(cPGCs)的体外培养 |
| 2.3 性腺来源的PGCs(gPGCs)的体外培养 |
| 2.4 不同分离来源的PGCs之间的比较 |
| 2.5 细胞培养小室对PGCs体外培养的影响 |
| 2.6 不同饲养层对PGCs体外培养的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 饲养层的制备及对PGCs体外培养的影响 |
| 3.2 细胞培养小室对PGCs建系能力的影响 |
| 4 小结 |
| 第二节 体外培养的PGCs的生物学特性的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器及耗材 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 形态鉴定 |
| 2.2 多能性基因的RT-PCR鉴定 |
| 2.3 碱性磷酸酶染色鉴定 |
| 2.4 SSEA-1和EMA-1免疫荧光染色 |
| 2.5 性别鉴定 |
| 2.6 向性腺的迁移能力鉴定 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 形态观察 |
| 3.2 碱性磷酸酶活性检测 |
| 3.3 SSEA-1和EMA-1免疫荧光染色 |
| 3.4 RT-PCR分析多能性基因的表达 |
| 3.5 向性腺迁移能力的验证 |
| 3.6 性别鉴定雌性株的缺失 |
| 4 小结 |
| 第二章 鸡PGC转基因应用的初步研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器和耗材 |
| 1.4 脂质体转染法优化 |
| 1.5 电穿孔转染法优化 |
| 1.6 转染效率的计算方法 |
| 1.7 GFP基因导入PGCs |
| 1.8 GFP-PGCs的筛选建系 |
| 1.9 GFP-PGCs向性腺迁移 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 脂质体转染效率的优化 |
| 2.2 电转染效率的优化 |
| 2.3 GFP-PGCs细胞系的建立 |
| 2.4 GFP-PGCs向性腺迁移 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鸡PGCs转基因效率的优化 |
| 3.2 PGCs的基因修饰及向性腺的迁移 |
| 4 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 附录 重要缩略词中英文对照表 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（8）罗非鱼基因敲除技术的建立及其在性别决定与分化研究中的应用（论文提纲范文）
| 中英文缩略语对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大片段基因组文库的研究进展 |
| 1.1 噬菌体文库 |
| 1.2 Cosmid文库 |
| 1.3 Fosmid文库 |
| 1.4 BAC文库 |
| 1.5 YAC文库 |
| 1.6 大片段基因组文库的应用 |
| 2 反向遗传学技术研究概述 |
| 2.1 同源重组 |
| 2.2 RNAi |
| 2.3 Morpholinos |
| 2.4 TILLING |
| 2.5 ZFN |
| 2.6 TALEN |
| 2.7 CRISPR/Cas9 |
| 2.8 反向遗传学技术在性别决定与分化研究中的应用 |
| 3 脊椎动物性别决定与分化研究进展 |
| 4 科学问题的提出和本研究目的意义 |
| 第二章 罗非鱼微阵列Fosmid基因组文库的构建及基因筛选 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 尼罗罗非鱼XY个体基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 基因组DNA片段的末端修复 |
| 2.3.3 连接、包装和滴度计算 |
| 2.3.4 插入片段大小检测 |
| 2.3.5 文库的稳定性检测 |
| 2.3.6 克隆的挑取、池的构建及备份保存 |
| 2.3.7 基因筛选方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 抽提的DNA片段大小 |
| 3.2 DNA片段回收与载体的连接 |
| 3.3 文库滴度 |
| 3.4 插入片段大小 |
| 3.5 文库稳定性 |
| 3.6 文库克隆的保存和池的构建及备份 |
| 3.7 文库的应用—目的基因筛选结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Fosmid文库质量鉴定、保存及基因筛选策略 |
| 4.2 Fosmid文库在性别决定和分化研究中的应用 |
| 第三章 利用TALEN基因敲除技术研究Foxl2和Dmrt1功能 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂和TALEN载体 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 TALEN打靶序列的选择和载体构建策略 |
| 2.3.2 mRNA合成与显微注射 |
| 2.3.3 基因组DNA的提取、目的片段的扩增及酶切检测 |
| 2.3.4 阳性鱼筛选 |
| 2.3.5 组织学检测 |
| 2.3.6 免疫组化检测 |
| 2.3.7 Real-time PCR检测 |
| 2.3.8 RT-PCR检测 |
| 2.3.9 血清雌雄激素水平测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 TALEN成功敲除dmrt1和foxl2基因 |
| 3.2 Dmrt1缺失对XY个体罗非鱼性腺分化的影响 |
| 3.3 Foxl2缺失对XX个体罗非鱼性腺分化的影响 |
| 3.4 Dmrt1和Foxl2缺失对雌激素和雄激素合成的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 养殖鱼类罗非鱼TALEN靶向基因敲除技术的建立 |
| 4.2 Dmrt1缺失对精巢分化的影响 |
| 4.3 Foxl2缺失对卵巢发育的影响 |
| 4.4 Dmrt1和Foxl2拮抗性调控雌激素水平影响性别分化 |
| 第四章 利用CRISPR/Cas9基因敲除技术研究Nanos2和Nanos3的功能 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂和载体 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 靶序列的选择和gRNA合成 |
| 2.3.2 Cas9 mRNA合成与显微注射 |
| 2.3.3 基因组DNA的提取、目的片段扩增及突变检测 |
| 2.3.4 GFP-vasa 3'UTR载体构建和生殖细胞GFP标记 |
| 2.3.5 敲除阳性鱼的筛选 |
| 2.3.6 组织学检测 |
| 2.3.7 免疫组化检测 |
| 2.3.8 激素测定 |
| 2.3.9 dmrt1和foxl2突变F1代的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 CRISPR/Cas9成功敲除罗非鱼基因 |
| 3.2 敲除效率统计 |
| 3.3 Nanos缺失对生殖细胞和性别分化的影响 |
| 3.4 生殖细胞缺失对雌激素和雄激素合成的影响 |
| 3.5 dmrt1和foxl2突变F1代鱼检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CRISPR/Cas9高效敲除罗非鱼性别决定与分化关键基因 |
| 4.2 CRISPR/Cas9介导突变的可遗传性 |
| 4.3 生殖细胞缺失对性别分化的影响 |
| 4.4 CRISPR/Cas9在性别决定与分化研究的应用前景 |
| 附件 |
| 第五章 利用CRISPR/Cas9研究Igf3在性别分化中的功能 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和药品 |
| 2.3 igf3在性别分化早期表达模式检测 |
| 2.4 免疫组化检测Igf3表达的细胞类型 |
| 2.5 Igf3功能的离体研究 |
| 2.6 CRISPR/Cas9敲除igf3对性别分化的影响 |
| 2.7 荧光素酶报告基因和表达载体的构建 |
| 2.8 HEK283细胞培养、瞬时转染以及荧光素酶检测 |
| 2.9 Dmrt1和Foxl2缺失对igf3表达水平的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 igf3在罗非鱼性腺发育早期的表达模式 |
| 3.2 Igf3表达于罗非鱼性腺体细胞 |
| 3.3 Igf3调控性别分化相关类固醇酶和转录因子 |
| 3.4 CRISPR/Cas9介导的够敲除 |
| 3.5 igf3敲除对性别分化和相关基因表达的影响 |
| 3.6 igf3表达受性别分化相关转录因子和雌激素的调控 |
| 4 讨论 |
| 4.1 igf3、转录因子和类固醇酶之间的关系 |
| 4.2 Igf3与硬骨鱼类生殖细胞减数分裂 |
| 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的主要论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
（9）慢病毒载体精子介导法生产转基因鸡研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 制备转基因鸡的技术方法 |
| 1.1.1 基因显微注射法 |
| 1.1.2 鸡卵原始胚细胞的弹道转染 |
| 1.1.3 反转录病毒载体法 |
| 1.1.4 胚胎干细胞原生殖细胞操作法 |
| 1.1.5 精子载体法 |
| 1.2 慢病毒载体 |
| 1.2.1 慢病毒载体制备转基因动物的进展 |
| 1.2.2 慢病毒载体精子介导法生产转基因动物的研究进展 |
| 1.3 报告基因GFP |
| 1.4 本研究的目的、意义和主要内容 |
| 1.5 本研究的技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用鸡 |
| 2.1.2 实验仪器设备 |
| 2.1.3 主要药品、试剂及酶 |
| 2.1.4 常用溶液及试剂的配制 |
| 2.1.5 引物设计及分析软件 |
| 2.1.6 病毒、细胞系及质粒载体 |
| 2.1.7 原代细胞培养试剂及配置 |
| 2.1.8 组织切片器材及试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 对照质粒真核表达载体PcDNA3.1-GFP的构建 |
| 2.2.3 质粒转化提取 |
| 2.2.4 293T细胞的培养 |
| 2.2.5 以GFP为报告基因的慢病毒的生产 |
| 2.2.6 慢病毒滴度检测 |
| 2.2.7 真核表达载体PcDNA3.1-GFP转染293T细胞 |
| 2.2.8 鸡胚生殖细胞的分离、培养及感染慢病毒实验 |
| 2.2.9 鸡胚小肠上皮细胞原代培养及感染慢病毒实验 |
| 2.2.10 慢病毒感染细胞目的基因检测 |
| 2.2.11 公鸡生殖器官组织切片 |
| 2.2.12 微创法慢病毒载体连续导入性成熟公鸡睾丸 |
| 2.2.13 手术后定期采精观察检测及人工授精 |
| 2.2.14 授精蛋孵化及第一代转基因鸡检测 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 重组真核表达载体pcDNA3.1-GFP的鉴定 |
| 3.1.1 PCR技术扩增pGFP质粒中的GFP基因片段 |
| 3.1.2 重组质粒pcDNA3.1-GFP酶切鉴定 |
| 3.1.3 重组质粒pcDNA3.1-GFP在293T细胞表达 |
| 3.2 慢病毒包装结果 |
| 3.2.1 慢病毒感染和真核表达载体转染293T细胞表型的变化 |
| 3.2.2 慢病毒在不同细胞中的表达结果 |
| 3.3 鸡胚生殖细胞原代培养及慢病毒转染结果 |
| 3.3.1 不同时期鸡胚生殖细胞在不同消化体系中的分离效果分析 |
| 3.3.2 鸡胚生殖细胞形态特征 |
| 3.3.3 慢病毒感染鸡胚生殖细胞结果 |
| 3.4 鸡胚小肠上皮细胞原代培养及慢病毒转染结果 |
| 3.4.1 鸡胚小肠上皮细胞原代培养生长形态观察 |
| 3.4.2 鸡胚小肠上皮细胞生长曲线 |
| 3.4.3 慢病毒转染鸡胚小肠上皮细胞结果 |
| 3.5 公鸡生殖器官组织切片结果 |
| 3.6 微创手术睾丸内导入慢病毒载体结果 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 4.1 影响真核表达载体pcDNA3.1-GFP构建的因素 |
| 4.2 感受态细胞对转化以及内毒素对转染的影响 |
| 4.3 293T细胞培养的相关因素 |
| 4.4 细胞及脂质体对慢病毒包装的影响 |
| 4.5 影响慢病毒载体包装和表达效率的因素 |
| 4.6 影响原代鸡胚生殖细胞培养的因素 |
| 4.6.1 不同时期鸡胚生殖细胞在不同消化体系下分离效果的比较 |
| 4.6.2 支持细胞作为生殖细胞饲养层的依据 |
| 4.6.3 体外培养生殖细胞时间短的原因 |
| 4.7 影响原代培养鸡胚小肠上皮细胞的因素 |
| 4.7.1 消化酶及消化时间 |
| 4.7.2 鸡胚小肠上皮细胞生长的主要影响因素 |
| 4.8 慢病毒感染原代培养细胞影响因素 |
| 4.9 公鸡生殖器官组织切片的影响因素及意义 |
| 4.10 微创手术公鸡睾丸内导入慢病毒载体手术的影响因素 |
| 4.11 影响真核表达载体PCDNA3.1-GFP表达效率的因素 |
| 4.12 全文讨论分析 |
| 第五章 结论 |
| 考参文献 |
| ABSTRACT |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）吉富罗非鱼精原干细胞分离与体外培养的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 精原干细胞的研究进展 |
| 1.1.1 精原干细胞在动物体内的起源和分类 |
| 1.1.2 精原干细胞的生物学特性 |
| 1.2 鱼类性腺的发育及精子的发生 |
| 1.2.1 鱼类性腺的发育 |
| 1.2.2 鱼类精巢的结构 |
| 1.2.3 鱼类精子的发生 |
| 1.3 鱼类精原干细胞分离、培养、鉴定及冻存研究进展 |
| 1.3.1 鱼类精原干细胞的分离 |
| 1.3.2 鱼类精原干细胞的纯化 |
| 1.3.3 鱼类精原干细胞的培养 |
| 1.3.4 精原干细胞的鉴定 |
| 1.3.5 鱼类精原干细胞冷冻保存 |
| 1.4 精原干细胞诱导分化及应用 |
| 1.4.1 鱼类精原干细胞的诱导分化 |
| 1.4.2 哺乳动物精原干细胞的诱导分化 |
| 1.4.3 鱼类精原干细胞的应用 |
| 1.4.4 本研究的目的和意义 |
| 1.4.5 研究的创新之处 |
| 2 吉富罗非鱼精原干细胞分离、克隆方法 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂配制及仪器 |
| 2.1.2 吉富罗非鱼精巢细胞的分离方法 |
| 2.1.3 培养条件对吉富罗非鱼精巢细胞原代培养的影响 |
| 2.1.4 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的鉴定 |
| 2.2 数据统计 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同消化液对吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的影响 |
| 2.3.2 不同分离方法分离吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的效果 |
| 2.3.3 培养条件对吉富罗非鱼精巢细胞原代培养的影响 |
| 2.3.4 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 消化液和分离方法对精巢细胞的影响 |
| 2.4.2 培养条件对吉富罗非鱼对吉富罗非鱼精巢细胞原代培养的影响 |
| 2.4.3 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的鉴定 |
| 2.5 小结 |
| 3 吉富罗非鱼精原干细胞扩增体系的筛选和建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂配制及仪器 |
| 3.1.2 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的纯化方法 |
| 3.1.3 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的传代培养及饲养层的制备 |
| 3.1.4 不同饲养层对吉富罗非鱼精原干细胞生长特性的影响 |
| 3.1.5 添加物对吉富罗非鱼精原干细胞增殖的影响 |
| 3.2 数据统计 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 纯化方法对吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的影响 |
| 3.3.2 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞传代培养的生长行为 |
| 3.3.3 不同饲养层对吉富罗非鱼精原干细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 添加物对吉富罗非鱼精原干细胞增殖的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 纯化方法对吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的影响 |
| 3.4.2 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的传代培养及其饲养层的影响 |
| 3.4.3 添加物对吉富罗非鱼精原干细胞增殖的影响 |
| 3.5 小结 |
| 4 吉富罗非鱼精原干细胞和支持细胞的冻存方法 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂配制及仪器 |
| 4.1.2 吉富罗非鱼精巢精原干细胞冻存条件的探讨 |
| 4.1.3 吉富罗非鱼精巢支持细胞冻存条件的探讨 |
| 4.1.4 吉富罗非鱼精巢精原干细胞的解冻及解冻存活率的检测 |
| 4.1.5 吉富罗非鱼精巢支持细胞的解冻 |
| 4.2 数据统计 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同冻存液对吉富罗非鱼精巢精原干细胞冷冻保护效果的影响 |
| 4.3.2 不同降温处理对吉富罗非鱼精巢精原干细胞冷冻保护效果的影响 |
| 4.3.3 不同冻存液对吉富罗非鱼精巢支持细胞冷冻保护效果的影响 |
| 4.3.4 不同降温处理对吉富罗非鱼精巢支持细胞冷冻保护效果的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
四、以雄性生殖细胞为载体建立转基因动物的研究进展（论文参考文献）
- [1]基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控[D]. 李讨讨. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [2]基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制[D]. 李小英. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [3]应用CRISPR/Cas9技术敲除鸡GDF8基因的研究[D]. 彭腊如. 广西大学, 2020(02)
- [4]H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进鸡PGCs形成的机制研究[D]. 王曼. 扬州大学, 2019
- [5]lncRNA-CEPT8调控鸡原始生殖细胞形成研究[D]. 余昕健. 扬州大学, 2019
- [6]经典microRNA途径在雌性果蝇幼虫性腺发育中的功能研究[D]. 杨蕙铭. 上海交通大学, 2016(03)
- [7]黄羽鸡原始生殖细胞的分离培养及转基因的初步研究[D]. 王利. 广西大学, 2015(01)
- [8]罗非鱼基因敲除技术的建立及其在性别决定与分化研究中的应用[D]. 李明辉. 西南大学, 2014(10)
- [9]慢病毒载体精子介导法生产转基因鸡研究[D]. 赵丽玲. 山西农业大学, 2013(03)
- [10]吉富罗非鱼精原干细胞分离与体外培养的研究[D]. 王爱珍. 广东海洋大学, 2013(09)