一、不同配方的神经营养因子对神经干细胞存活和增殖能力的影响(论文文献综述)
牛玉虎[1](2021)在《人间充质干细胞外泌体对海马神经再生及阿尔兹海默症动物模型治疗效应及机制的研究》文中研究指明背景:神经退行性疾病是一类以衰老为诱因的,进行性不可逆并严重影响相应神经系统功能的疾病。以阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)为代表,由于病人海马及皮层区的大量神经元死亡导致的脑萎缩,AD病人呈现了逐步退化的学习记忆能力并严重影响了其认知功能及身体健康。到目前为止,由于AD病因尚未明确,因此针对其病因进行治疗的手段尚未得到显着突破。而在哺乳动物脑内,本身存在一批特异性的成体神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),这些干细胞持续分裂分化以维持生理水平的神经可塑性。因此,如何利用这类NSCs使其成为神经修复及神经再生的资源并完成对AD及其他神经退行性疾病的治疗任务是目前学界急需进一步解决的科学问题之一。间充质干细胞(MSCs)是一类以免疫调控、稳定自我更新及多向性分化为特征的成体干细胞。目前越来越多的研究认为MSCs外泌体是其行使细胞治疗功能,实现远端细胞细胞交互作用的重要细胞学基础。而是否MSCs外泌体能够达到调控神经再生,启动神经修复并恢复AD动物模型行为学的功能目前尚未可知。理解MSCs外泌体对AD动物模型的治疗效应及相关的生物学机制能够为未来神经退行性疾病的新药开发及相关分子靶点的选择提供新的理论依据。目的:外泌体是间充质干细胞行使其治疗学功能的关键生物学基础。本研究为探索人间充质干细胞(Human umbilical cord meschenymal stem cells,h UC-MSCs)来源的外泌体所富集的蛋白组学成分及相关功能,同时为了进一步研究其神经生物学意义,拟解决以下科学问题:1.MSCs外泌体的蛋白质组学成分及功能有哪些?2.MSCs外泌体是否具有促进神经分化的作用?3.MSCs外泌体是否能够改善动物在神经损伤后的行为学变化?4.MSCs外泌体对阿尔兹海默症(AD)动物模型是否具有治疗学效应?5.MSCs外泌体是否能够恢复AD动物模型的海马功能?6.MSCs外泌体对AD动物模型治疗效应的分子机制为何?方法:1.在本研究中,通过制备人脐带间充质干细胞,获得其外泌体并通过蛋白组学分析其主要蛋白及多肽的成分和功能。2.利用流式细胞仪检测了人脐带间充质干细胞关键生物学标记物的表达。通过蛋白免疫印迹,酶联免疫吸附等手段检测目标蛋白在不同处理中的表达。3.以小鼠为模型,通过行为学检测及脑片免疫荧光染色探索外泌体处理对小鼠认知,情绪行为的调控及海马神经再生的调控能力。4.利用链脲佐菌素(STZ)及Abeta淀粉样蛋白海马定点注射手段,构建急性海马损伤及AD模型。5.进一步通过siRNA敲降实验研究MSCs外泌体对AD神经保护的分子机制。结果:通过分离人脐带以制备人脐带间充质干细胞获得MSCs外泌体,流式细胞检测显示,MSCs高表达了MSCs特异性的生物标记物CD105,CD44和CD29低表达CD35,CD45,并同时具备MSCs的脂肪及骨分化功能。同时,通过蛋白质组学分析发现MSCs外泌体包含942中蛋白成分,主要富集调控代谢功能的蛋白及多肽成分。其中67中此前未见报道。通过外泌体注射发现,MSCs外泌体能够调控外周及中枢关键代谢因子脂联素的水平并同时能够改善小鼠海马区神经干细胞的生长及分化功能,而在生理状态下MSCs外泌体未能显着影响小鼠行为学。同时,MSCs外泌体能够对STZ导致的急性海马损伤具有显着的行为学保护效应,并能够相应的增强STZ处理小鼠海马区神经再生。在Abeta海马注射诱导的AD模型中,MSCs外泌体注射有效缓解了认知功能的减退及伴随的抑郁及焦虑情绪。同时,MSCs外泌体有效加速了AD模型海马组织新生神经元的生长及分化速度。通过ELISA实验发现,MSCs处理后的小鼠海马脑源性神经营养因子BDNF水平显着提高。同时,通过Dil染色结合BDNF抗体免疫荧光发现BDNF存在于MSCs外泌体中。而BDNF敲降后导致了MSCs外泌体对AD模型认知功能及情绪行为改善作用的下调。结论:MSCs外泌体富含大量代谢调控相关功能的蛋白及多肽成分,这些成分可能是有效促进海马神经再生的关键。在急性脑损伤状态下,MSCs外泌体能够有效促进海马神经再生并保护小鼠认知功能及抗抑郁能力免受STZ损伤。在AD模型导致的海马功能损伤中,MSCs外泌体具有显着的行为学保护作用,而MSCs外泌体对海马神经再生的促进作用是这种保护作用的神经生物学基础。同时,神经营养因子BDNF及相关的分子通路是MSCs外泌体对AD行为学保护效应的关键分子机制。
杜颖珊[2](2021)在《应用生理电场调控神经干细胞在体外构建小鼠三维工程化神经组织》文中认为目的:在体外使用Matrigel为三维(Three-dimensional,3D)支架材料、小鼠NSCs为种子细胞,通过生理电场的导向性作用,诱导神经分化和神经突起平行有序生长,构建小鼠3D工程化神经组织,并建立优化数据库,为工程化神经组织的产业化奠定实验基础。方法:以小鼠NSCs为种子细胞,以Matrigel为3D基质支架,通过150 m V/mm生理电场的调控作用,在体外构建工程化神经组织。本研究根据分化培养基的不同和是否施加电场刺激分为四组。分化培养基分为BNb培养体系(b FGF(20ng/ml)、B27(1:50)、N2(1:100))和10%FBS培养体系。分组如下:BNb加电组(BNb+EF)、BNb不加电组(BNb)、FBS加电组(FBS+EF)和FBS不加电组(FBS)。应用细胞凋亡检测技术、免疫荧光化学染色技术、电子显微镜技术以及图像分析法检测不同条件下构建的工程化神经组织中细胞的存活、凋亡、神经分化比率、神经细胞的形态、突起的长度以及突触和髓鞘的形成,建立基于生理电场诱导条件的小鼠3D工程化神经组织的优化培养体系。结果:(1)NSCs以不同细胞密度接种在不同厚度的Matrigel胶中培养7d,显微镜下观察细胞生长状态,以20个/mm3的密度接种于300μm厚度的Matrigel中的神经元及突起生长状态最佳。(2)根据细胞存活与凋亡检测结果显示,在150m V/mm的EFs下,每天施加EFs 1h,连续3d。EFs组仅有5.47%±0.74%的细胞死亡率。EF组与No EF组在细胞死亡率没有明显的差距。(3)Tuj1/GFAP免疫荧光双重染色结果显示,FBS组中,Tuj1阳性细胞的比率仅为6.21%±0.94%。当给予150 m V/mm的EFs刺激时,Tuj1阳性细胞的比率增加到74.80%±2.25%。(4)对神经突起长度的分析结果表明,FBS组的神经元突起仅为18.87±1.57μm(n=28),FBS+EF组的神经元突起平均长度为42.6±4.37μm(n=36),FBS组突起长度明显短于EF组。(5)BNb组的神经突起平均长度可达到47.55±2.29μm,这明显长于FBS组的突起长度(18.87±1.57μm)。施加电刺激后,神经突起的长度明显增加:在FBS+EF组,神经突起的平均长度为42.6±4.37μm;BNb+EF组中,神经突起长度达到67.13±3.11μm。(6)BNb组的神经元分化率与FBS+EF组的结果分别为60.2%±2.89%和74.8±2.25%,BNb组的细胞分化率低于FBS+EF组的。同时,BNb+EF组的Tuj1分化率达到了最高(82.2%±5.65%)。(7)Tuj1阳性细胞形态分析结果表明,Tuj1阳性细胞中包括椭圆形细胞、平行排列的细胞、具有短突起的神经元(<30μm)和具有长突起的神经元(≥30μm)等四种形态。统计各组不同形态细胞的所占比例:FBS+EF组中,平行排列细胞达31.47±5.18%。BNb组椭圆形细胞数量显着减少,为25.7±2.18%,而长突起神经元数量显着增加,为15.9±1.27%。在FBS组中,椭圆形细胞和长突起神经元的比例分别为92.4±4.58%和1.83±0.93%。在BNb+EF组中,长突起的神经元占57.1±4.3%。(8)电镜结果显示,在工程化神经组织培养14d后,可观察到典型的神经元。BNb+EF组中神经突起分支延伸到更广泛的区域。FBS组突起短小。此外,也观察到神经元的突触前膜和突触后膜厚度增加。培养21d后,BNb+EF组中神经元含有高度发达的粗面内质网、典型的突触结构以及髓鞘。结论:(1)150m V/mm的生理电场刺激对3D水凝胶支架中NSCs的存活率没有影响;(2)150m V/mm的生理电场刺激可以诱导3D水凝胶内的神经干细胞向神经元定向分化;(3)150m V/mm的生理电场刺激可以引导3D水凝胶内神经突起的平行长向生长;(4)碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)的协同作用进一步促进了神经突起的长向生长;(5)生理电场诱导的工程神经组织内形成了具有大量突触和髓鞘的神经网络。
朱业淘[3](2021)在《联用神经因子对重型颅脑创伤大鼠神经细胞和神经功能的影响研究》文中进行了进一步梳理背景:重型颅脑创伤是目前世界上导致青年人死亡和残疾的主要原因之一,重型颅脑创伤后常导致神经功能废损,而传统治疗方法的效果往往难以令人满意;因此如何改善重型颅脑创伤的预后一直是医疗界的难题。早些年已有相关研究证实在重型颅脑创伤后,损伤脑组织中有部分新生神经细胞生成,但数量极为有限,并不能使受损的神经功能得到充分的改善。神经因子作为一类对神经细胞营养作用且能够调节神经细胞存活的蛋白质,已经被多项研究证实可以在体外促进神经细胞的增殖和抗神经细胞凋亡以改善受损的神经功能,并且在神经缺血性和退行性疾病的邻域已经得到了较为宽泛的研究,在治疗颅脑创伤的研究方面,则少见有研究神经因子对重型颅脑创伤后大鼠神经细胞的影响,而将神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联用应用观察对重型颅脑创伤大鼠神经细胞和神经功能影响的研究更是罕见。目的:探索联合应用不同的神经因子对重型颅脑创伤大鼠神经细胞和神经功能的影响,观察不同实验组大鼠肢体功能恢复差异,探索外源性神经因子治疗重型颅脑创伤的合适策略及机制。方法:将48只SD大鼠随机分为四个组,即神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组、联用神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子组以及对照组。颅脑创伤模型参照改良Feeney法制作,在造模一天后,对照组通过脑室注射途径注射生理盐水,各个实验组分别由脑室途径注入相应的神经因子。采用免疫组化法、免疫荧光法比较各组大鼠脑内损伤皮层、室管膜下区、海马齿状回以及损伤对侧相应区域阳性细胞的表达;采用前肢放置实验和平衡实验观察大鼠的肢体功能情况,比较各组大鼠肢体功能恢复情况的差异。结果:(1)在造模3 d、7d、14d后神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组、联合组相应区域的神经元、神经胶质细胞数量明显多于对照组,差异有显着性意义(P<0.05),同时神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组神经元、神经胶质细胞明显少于联合组(P<0.05),而神经生长因子组和碱性成纤维细胞生长因子组对应的各个区域阳性细胞数量没有明显差异;(2)在造模5天后,行为学实验评分对比中,对照组评分均高于神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组以及联合组,差异具有统计学意义(P<0.05),且联合组评分低于碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:联合应用外源性神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子较单用二者之一更能促进神经细胞的增殖和大鼠肢体功能的恢复。
乔奕胜[4](2021)在《芍药甙对小胶质细胞的影响及其分子机制以及促进神经干细胞向多巴胺神经元分化的研究》文中研究指明目的:探讨芍药甙(PF)对激活小胶质细胞的影响及促进神经干细胞(NSCs)向多巴胺(DA)能神经元分化的影响并初步探寻其可能的分子机制,试想为帕金森病(PD)的神经干细胞移植治疗寻找新的思路。方法:1.原代小胶质细胞的培养及鉴定 解剖分离2天内SD乳鼠大脑皮质区域,使用胰蛋白酶消化及机械吹打制成单细胞悬液,接种于含有10%FBS的完全培养基中培养;在8-11天后经摇床震摇和轻拍法纯化小胶质细胞,并用小胶质细胞特异性荧光CD11b/c对小胶质细胞进行免疫荧光鉴定。2.胚胎中脑腹侧原代神经干细胞培养及鉴定 用孕14d的SD大鼠,脱颈法处死后酒精充分消毒腹部,取出珠状胚胎,严格遵守无菌操作,分离胚胎中脑腹侧组织;将脑组织充分剪碎至≤1mm3,用NSCs完全培养基,火焰抛光消毒吸管并吹打后,通过200目过滤网过滤,形成单细胞悬液,离心(1200rpm,5min)后收集细胞。加入完全培养液重悬后,细胞密度控制为每毫升2×105个接种于T25细胞培养瓶,置于于37℃、5%CO2培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞的形态和情况。根据细胞代谢情况,每2-3d加1次液。原代经过大约3-5天培养后,使用特异性荧光蛋白巢蛋白(Nestin)对其进行鉴定。3.CCK法检测差异浓度芍药甙对MG活率的影响纯化小胶质细胞后,芍药甙溶于 DMSO,并分别以 0.25 mM,0.5 mM,1 mM,2mM 处理,37℃、5%CO2条件培养24 h,对照组加入相同体积的DMSO。将芍药甙预处理后的小胶质细胞每孔104接种于24孔板。37℃、5%CO2条件培养1-2 d。严格按照CCK-8试剂盒(碧云天)说明操作,490 nm波长,在酶标仪上测各孔OD值。4.ELISA法检测芍药甙对激活MG的影响实验分组:A.正常小胶质细胞组(MG):不施加任何处理因素。B.激活小胶质细胞组(LPS+MG):以LPS诱导活化小胶质细胞,不施加其他处理因素。C.PF作用正常小胶质细胞组(MG+PF)。D.PF作用活化小胶质细胞组:以LPS诱导活化小胶质细胞后,向细胞培养液加入PF(浓度参照第3步结果,作用时间同前)。收集细胞培养液,ELISA法检测各组细胞培养液中炎症相关因子:白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α);以及神经营养因子:脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-line derived neurotrophic factor,GDNF)的表达水平。参照ELISA试剂盒说明(CUSABIO,96T),分别设标准品孔(7个浓度)、空白对照孔和待测样品孔依次加样、显色、终止、读板。在反应终止后5 min内立即移至酶标仪处,在波长为490 nm检测各孔的OD值。5.不同状态MG对NSCs存活、生长和分化的影响采用Transwell系统,下层培养神经干细胞,上层为MG,并进行如下分组:(1)NSCs单独培养组;(2)NSCs与MG共培养组;(3)PF处理过的NSCs与MG组。在共培养3d、6d、9d时,观察NSCs的存活、生长以及向DA能神经元分化的情况。在以上时间采用ELISA法检测各组神经营养因子的分泌情况;采用免疫荧光染色检测各组NSCs向DA能神经元的分化情况;WB检测各组神经干细胞向DA能神经元分化的相关标记基因和蛋白(Pitx3,TH,DAT)的表达水平。结果:1.胶质细胞混合培养至7-10d时,细胞充分多层生长。经轻拍法得到纯化小胶质细胞,经特异性标志物CD11b/c免疫细胞化学鉴定为阳性,纯度在96%左右。2.CCK法结果显示,在PF处理48小时,PF浓度在0.5mM时,对小胶质细胞活性增加(t=2.598,P<0.05)。3.ELISA检测结果显示,PF可显着抑制脂多糖引起的小胶质细胞的过度激活,显着减少炎症相关因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的分泌,并能增加BDNF、GDNF等神经营养因子的分泌。4.Western blot结果显示:在LPS在刺激小胶质细胞后,mTOR、HIF-1α和p-NF-κB表达水平均增加;加入PF后,mTOR、HIF-1α、p-NF-κB表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.原代NSCs培养7d后,可形成大量并悬浮的神经球,特异性标志物巢蛋白(Nestin)染色阳性。6.Transwell共培养后,ELISA检测结果显示,与其他各组相比,PF处理过的MG+NSCs共培养组分泌更多的神经营养因子BDNF、GDNF。7.Transwell共培养后,免疫荧光检测结果显示,与其他各组相比,PF处理过的MG+NSCs共培养组有更多的NSCs向DA能神经元分化。8.Transwell共培养后,Western blot显示,与其各组相比,PF处理过的NSCs+MG共培养的DA能神经元分化标志基因及蛋白(DAT,Pitx3,TH)的表达量显着升高。结论:芍药甙(PF)可经过抑制小胶质细胞的过度激活,在抑制炎症相关因子IL-1、IL-6和TNF-α产生的同时,促进其分泌GDNF、BDNF等神经营养因子进而促进共培养的NSCs向多巴胺能神经元分化;其机制与其对mTOR、HIF-1α、p-NF-κB信号通路的抑制有关。PF有望成为PD治疗的潜在药物。
邵亚丽[5](2020)在《梓醇延迟给药对局灶性永久性脑缺血大鼠的效应及促神经新生作用研究》文中研究指明背景梓醇是中药地黄的主要有效成分之一,既往研究表明,梓醇在脑缺血急性期给药具有神经保护作用,能够改善脑缺血大鼠神经行为学功能,促进缺血区周围血管新生和成体神经干细胞增殖存活,但梓醇延迟给药对于脑缺血大鼠的效应以及对神经干细胞的分化作用暂未研究。基于治疗脑缺血疾病药物匮乏的现状,且目前唯一公认有效的静脉溶栓药物组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t PA)的治疗时间窗狭窄(3-4.5 h),该时段内极大多数患者不能及时就医。梓醇作为缺血性脑损伤的潜在保护剂,如果在t PA治疗时间窗外能够保护缺血脑区及周围组织,研究其药效学作用及对新生神经干细胞的分化作用,具有重要的科学价值和临床意义。本课题受国家自然科学基金项目(81873034)资助。目的观察梓醇延迟给药对局灶性永久性脑缺血大鼠的神经行为学影响以及神经新生效应和神经干细胞分化作用研究。方法1.SD大鼠随机分为6组,分为假手术组,模型组,造模后6 h首次给药组(5 mg/kg和10 mg/kg),造模后4 d首次给药组(5 mg/kg和10 mg/kg),电凝法制备局灶性永久性脑缺血(permanent middle cerebral artery occlusion,p MCAO)模型,给药组腹腔注射梓醇,对照组注射同等剂量生理盐水,每日一次,连续7天。各组大鼠分别于给药后1,4,7,14,21,28天进行体重测量及Bederson评分,神经功能缺损评分(modified neurologic severity score,m NSS),肌力测试评分(muscle strength),对神经功能恢复进行评价。2.结合Brd U体内标记细胞增殖,梓醇给药7,14,21,28天后各组大鼠取材,免疫荧光双标Brd U/Nestin检测室管膜下区(subventricular zone,SVZ)神经干细胞增殖存活情况,Brd U/GFAP,Brd U/DCX和Brd U/Neu N荧光双标检测神经干细胞分化为星形胶质细胞及神经元情况;免疫印迹法(Western Blot,WB)检测各组损伤侧SVZ区Nestin/DCX以及损伤侧皮层GFAP和Neu N的蛋白表达。3.由于新生鼠SVZ数量少且难以分离,本研究选择原代培养24 h内新生鼠海马区神经干细胞,进行纯化鉴定,Brd U标记细胞增殖,cck-8检测不同浓度的梓醇对神经干细胞活力的影响,加入分化培养基诱导干细胞分化,免疫荧光MAP-2,GFAP,MBP检测细胞分化,WB检测分化表型相关蛋白的表达。结果1.成功制备局灶性脑缺血模型,梗死体积为9.62±2.43%。行为学实验结果表明,梓醇给药组不同程度促进脑缺血大鼠体重增长,降低脑缺血大鼠Bederson和神经功能缺损评分,提高肌力测试评分,6h,5mg/kg组肌力测评分在14天时有显着差异(P<0.05,vs model),21天时各组神经功能基本恢复至假手术水平,各给药组间无显着差异(P>0.05,vs sham)。2.梓醇给药后不同时点促进局灶永久性脑缺血大鼠损伤侧SVZ区神经干细胞增殖存活,Brd U/Nestin荧光结果提示脑区成体神经干细胞存在的事实。脑缺血后7天及14天,星形胶质细胞数量显着增加(P<0.05,vs model),新生神经干细胞与神经元数量与模型组相比显着增加(P<0.05,vs model),14天时DCX表达增强,6 h,5 mg/kg剂量组与模型组相比有显着差异(P<0.05,vs model),其余给药组与假手术相比有显着差异(P<0.05,vs sham),21天时各给药组GFAP表达降低,Nestin,Neu N表达增强,与模型组相比有显着差异(P<0.05,vs model),与行为学结果基本一致。3.海马神经干细胞培养7 d后可增殖为直径为200μm左右的神经球,神经球呈现Brd U/Nestin免疫双标阳性;cck-8筛选出促进神经干细胞生长的梓醇浓度为0.1,1,10,100μM;用不同浓度的梓醇诱导P3代神经干细胞分化7天,可见MAP-2阳性的神经元,GFAP阳性的星形胶质细胞及MBP阳性表达的少突胶质细胞;10μM梓醇促进NSCs向神经元方向分化,0.1μM促进向星型胶质细胞方向分化。结论1.梓醇延迟给药促进局灶性永久性脑缺血大鼠体重增长,改善神经行为学评分。2.梓醇延迟给药促进局灶性永久性脑缺血大鼠损伤侧SVZ区神经干细胞增殖,促进缺血区域附近神经元存活,减少星形胶质细胞增殖。3.原代培养的海马神经干细胞具有旺盛的自我增殖和多向分化潜能,梓醇对神经干细胞向神经元和胶质细胞分化的作用有剂量效应。
赵祥,魏翠兰,张业廷[6](2021)在《神经发生和炎性环境在运动条件下的改变与调节》文中研究表明背景:研究发现,运动可以调节神经炎症、成年海马神经发生,并改善认知功能,然而运动和神经炎症引起的海马神经发生及相关认知功能变化之间的相互作用并不清楚。目的:分析总结神经炎症介导运动改善成年海马神经发生及认知的作用机制。方法:以中文检索词(运动;神经炎症;神经发生;阿尔兹海默病;衰老;抑郁;脑缺血;创伤性脑损伤;认知)及英文检索词(exercise;neuroinflammation;neurogenesis;Alzheimer’s disease;aging;depression;cerebral ischemia;traumatic brain injury;cognition)分别检索CNKI、Web of Science(核心合集)等国内外数据库,查询运动对神经炎症、成年海马神经发生及认知影响或机制的相关文献,并对其进行研究,然后按照一定逻辑进行分析和综述。结果与结论:神经炎症会引起神经发生损伤,并可能导致认知功能的障碍,而运动能有力地在大脑中产生抗炎作用,促进成年海马神经发生,进而提高认知能力。运动除了能够直接增加大脑海马中神经营养因子的表达及促进海马神经发生外,还可以通过其抗炎机制影响到海马中神经营养因子的表达及海马神经发生过程。但是,想要更好地理解神经发生和炎性环境在运动条件下的改变与调节,以及如何和是否可以调节这种改变的过程来促进认知,仍然还有很多的工作要做。
王艳秋[7](2020)在《川芎嗪联合神经干细胞移植干预局灶性脑缺血大鼠的作用机制研究》文中研究指明研究目的:前期实验研究发现,脑缺血后可以一定程度的刺激脑内内源性神经发生,参与缺血后的自发性修复,但是内源性神经发生并不能产生足够数量的成熟神经元和神经胶质细胞,因此对神经干细胞(NSCs)移植的关注与研究逐渐增多。课题组前期研究表明川芎嗪(TMP)对大脑中动脉阻塞(MCAO)模型大鼠神经发生及NSCs向缺血损伤区定向迁移有明显促进作用。SDF-1/CXCR4是经典的促进干细胞迁移的调控通路,Nrf2作为正性调节因子能够促进SDF-1的受体CXCR4的转录来促进骨髓干细胞迁移。本研究通过观察TMP联合移植NSCs对MCAO模型大鼠的干预作用,并基于干细胞生物学行为调控探讨TMP联合移植NSCs对缺血性脑卒中的作用机制。研究方法:使用线栓法建立大鼠MCAO模型,缺血后90min后再灌注。造模成功的大鼠按照神经功能评分随机分层分为模型组(Model)、川芎嗪(TMP)组、神经干细胞(NSCs)移植组、TMP联合NSCs移植组。同时设立伪手术(Sham)组做为对照。TMP及TMP+NSCs移植组术后次日进行腹腔注射给药TMP 40mg/kg,1次/d;NSCs移植组及TMP+NSCs移植组术后3天向缺血侧纹状体移植NSCs 3*107个/只。术后3d及取材前3d连续腹腔注射50 mg/kg BrdU。进行神经功能评分(mNSS)、肌力测验、网格行走、旷场实验及强迫游泳实验来考察TMP对大鼠神经功能和行动能力的改善;免疫荧光法检测 BrdU+、BrdU+/DCX+、BrdU+/NeuN+、BrdU+/GFAP+细胞分布情况观察NSCs的增殖、迁移、分化情况;PKH26+染色检测移植的NSCs的存活及迁移情况。Western blot检测SDF-1、CXCR4的蛋白表达及信号通路Nrf2、KEAP1、HO-1、NQO1的蛋白表达,实时荧光定量PCR检测CXCR4、SDF-1、VEGF和NGF基因的mRNA水平,研究NSCs发生迁移的作用机制。研究结果:1.TMP联合NSCs移植对MCAO模型大鼠神经修复效果评价:与伪手术组相比,缺血后MCAO模型大鼠体重、肌力、旷场行动能力明显下降,神经行为学评分显着升高,缺血病变对侧前肢错步指数升高,游泳静止时间变长,证明我们成功复制MCAO模型。TMP、NSCs移植、TMP+NSCs移植治疗后的大鼠神经功能行为学评分降低,肌力恢复,行动能力提升,错步指数下降,游泳时间增加,尤其以TMP+NSC移植组的治疗效果最佳。2.TMP联合NSCs移植对MCAO模型大鼠外源性NSCs存活、迁移和分化的影响:通过免疫荧光检测法观察到PKH26阳性的细胞,提示NSCs成功注射到纹状体并存活;而且除移植位点外,在附近也可以观察到PKH26阳性的细胞,提示存活的NSCs发生一定范围的迁移,且TMP+NSCs移植组迁移细胞数量更多、迁移距离更远。同时我们还检测了 PKH26分别与NeuN、GFAP双标的细胞,并没有发现双标阳性的细胞,提示移植到脑内的NSCs在目前检测范围内,未发现分化为神经元和星型胶质细胞。3.TMP联合NSCs移植对内源性NSCs增殖、迁移、分化的影响:缺血后,与伪手术组比较模型组 BrdU+、BrdU+/DCX+、BrdU+/NeuN+、BrdU+/GFAP+细胞数有所升高。与模型组相比,TMP、NSCs移植单独治疗以及两者联合组的BrdU+、BrdU+/DCX+、BrdU+/NeuN+、BrdU+/GFAP+细胞数均明显升高,且以联合治疗组最明显。4.TMP和NSCs移植对Nrf2/HO-1/CXCR4通路的影响:TMP组、NSCs移植组和TMP+NSCs移植组的CXCR4蛋白的表达均显着升高,同时三个治疗组Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表达上调、KEAP1蛋白表达降低。与模型组相比,TMP组、NSCs移植组和TMP+NSCs移植组可以上调SDF-1、CXCR4、VEGF、NGF基因。研究结论:1.TMP、NSCs移植以及TMP联合NSCs移植均可改善MCAO模型大鼠的神经行为学变化,尤以TMP联合NSCs移植作用最佳;2.提高移植到MCAO模型脑内NSCs的存活、迁移和分化,为TMP联合NSCs移植治疗MCAO模型大鼠的作用途径之一;3.促进脑区神经营养因子分泌,改善脑内微环境,并促进内源性NSCs增殖、迁移和分化,为TMP与联合NSCs移植对MCAO模型大鼠发挥神经保护的另一重要途径;4.激活Nrf2/HO-1/CXCR4通路,可能是TMP联合NSCs移植促进内源神经发生以及外源移植性NSCs存活、迁移和分化的部分作用机制。
张洁[8](2020)在《过表达BDNF的神经干细胞移植对受照大鼠海马区BDNF下游受体表达及突触形成的影响》文中研究表明第一部分 神经干细胞体外分离培养、诱导分化及鉴定实验背景及目的:海马区神经发生减少被认为是放射性认知功能障碍发生机制中最重要的研究内容,近年来有研究认为神经干细胞(neural stem cell,NSCs)移植有望成为改善放射性认知功能障碍最有效的方法。神经干细胞能够自我更新,多向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。因此研究关键在于体外分离培养具有该能力的细胞。方法:课题组前期已经从孕龄14-16天的Sprague Dawley(SD)大鼠的胎鼠脑中分离出了神经干细胞,本研究除了体外扩增外,需进行诱导分化,并使用免疫荧光染色技术分别鉴定神经十细胞特异性标基物神经巢蛋白(Nestin),诱导分化后神经元标志物β Ⅲ微管蛋白(Tuj1)和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果:悬浮状态生长的神经球表达标志物Nestin蛋白,在含血清条件下可以贴壁生长并分化,具有神经细胞形态,并表达标志物Tuj1蛋自和GFAP蛋自。结论:在体外培养条件下,本课题组分离培养出的神经干细胞具有自我分裂、扩增及多向分化的能力,为下一步实验做准备。第二部分过表达BDNF的神经干细胞移植对受照大鼠海马区BDNF下游受体表达的影响实验背景及目的:脑源性神经营养因子(BDNF)主要通过结合下游受体发挥神经保护作用,课题组前期已经发现过表达BDNF的神经干细胞移植到受照大鼠海马区后BDNF表达升高,本实验主要观察BDNF下游受体酪氨酸激酶受体B(TrkB)、P75神经营养因子受体(P75NTR)的表达情况。方法:大鼠全脑给予单次20Gy照射。取40只1月龄SD大鼠,按随机数字表法分为四组:空白对照组(C组)、20Gy照射组(R组)、20Gy照射后GFP修饰的神经干细胞移植组(R+GFP-NSCs组)和20Gy照射后GFP-BDNF修饰的神经干细胞移植组(R+GFP-BDNF-NSCs组)。照后4周移植神经干细胞,分别于移植后2周、8周、14周,采用PCR及Western Blot法检测BDNF、TrkB、P75NTR的含量及表达水平。结果:在移植后2周、8周、14周,与R组相比,R+GFP-BDNF-NSCs组大鼠海马内BDNF蛋白表达水平明显升高;在移植后2周、8周、14周,R+GFP-BDNF-NSCs组大鼠海马内TrkB mRNA表达水平及蛋白表达水平明显升高;在移植后2周,与R组相比,R+GFP-BDNF-NSCs组P75NTR mRNA水平及蛋白表达水平下降,其余时间点未见明显改变。结论:过表达BDNF的神经干细胞移植到受照大鼠海马区后,可以促进海马区BDNF下游受体TrkB的表达,对P75NTR的表达影响不大。第三部分过表达BDNF的神经干细胞移植对受照大鼠海马区突触形成的影响实验背景及目的:BDNF可通过突触前、突触后的作用机制影响突触形成的数目、功能及神经元轴突树突形态。突触形成是神经环路建立的基础,神经环路的建立作为放射性认知功能障碍改善的亚细胞水平的依据。本实验探讨过表达BDNF的神经干细胞移植到受照大鼠海马区后是否对突触形成产生影响。方法:给予大鼠全脑单次20Gy照射。本实验部分取40只一月龄SD大鼠,随机分为四组:空白对照组(C组)、20Gy照射组(R组)、20Gy照射后GFP修饰的神经干细胞移植组(R+GFP-NSCs组)和20Gy照射后GFP-BDNF修饰的神经干细胞移植组(R+GFP-BDNF-NSCs组)。照后4周进行神经干细胞移植,采用PCR及Western Blot法检测移植后2周、8周、14周突触前蛋白突触素(Synaptophysin)和突触后蛋白突触后致密物95(PSD95)的含量,用免疫荧光染色技术观察移植后8周、14周海马DG区Synaptophysin表达水平。结果.:在移植后2周、8周、14周,与R组相比,R+GFP-BDNF-NSCs组大鼠海马内Synaptophysin mRNA表达水平及蛋白表达水平明显升高;在移植后14周,R+GFP-BDNF-NSCs组大鼠海马内PSD95 mRNA水平及蛋白表达水平明显升高;在移植后8周、14周,R+GFP-BDNF-NSCs组DG区Synaptophysin表达水平明显增高。结论:过表达BDNF的神经干细胞移植到受照大鼠海马区后,Synaptophysin表达水平明显升高;移植后14周,PSD95表达也升高,可以一定程度上促进海马区突触生长。
吴秋丽[9](2019)在《低强度脉冲超声介导iPS-NSCs修复脊髓损伤的研究》文中研究说明【目的】脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是一种严重的创伤性疾病,修复手段主要有手术治疗、药物治疗、细胞移植等。神经干细胞移植能够有效促进SCI后神经功能的恢复,是当前研究的热点。iPSCs诱导的神经干细胞(induced Pluripotent Stem Cells-Neural Stem Cells,iPS-NSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,自体取材避免了伦理学争议和免疫排斥,应用于细胞移植治疗脊髓损伤具有显着的优势。然而干细胞在体内存活率低、向神经方向分化较难,因此如何更好的促进其增殖、定向分化是众多研究者关注的焦点。国内外研究表明低强度脉冲超声(Low Intensity Pulsed Ultrasound,LIPUS)是一种可以促进多种细胞增殖、分化的物理刺激手段,本研究旨在明确LIPUS对iPS-NSCs细胞特性的影响以及LIPUS介导的iPS-NSCs对脊髓损伤的修复作用,为干细胞的优化和SCI的治疗提供一种新的策略。本研究通过:1)体外培养iPS-NSCs,将自主研制的LIPUS激励系统作用于iPS-NSCs细胞,观察细胞的形态学、增殖、分化和神经营养因子(Neurotrophic Factors,NTFs)分泌含量的改变,明确LIPUS最佳的刺激参数,并初步探索LIPUS干预后细胞增殖的调控机制;2)建立脊髓损伤的动物模型,于脊髓损伤局部移植iPS-NSCs和LIPUS-iPS-NSCs细胞,评价细胞移植后SCI大鼠损伤局部组织学形态、神经营养因子含量以及运动功能的改变,初步探讨LIPUS介导iPS-NSCs细胞移植修复脊髓损伤的效果。【方法】本实验研究分为体外实验和体内实验两部分:体外实验:利用自主搭建LIPUS细胞激励系统,以不同的刺激参数干预iPS-NSCs细胞,观察细胞的形态,采用CCK-8检测其增殖活性的改变,明确LIPUS最佳的刺激参数;借助最佳的激励参数,通过TUNEL、ELISA、Western Blot以及免疫组化等方法,观察LIPUS对iPS-NSCs细胞凋亡、分化以及NTFs分泌的影响,并初步探讨细胞增殖与Notch信号通路的潜在关系。体内实验:采用Impactor model-Ⅲ打击器建立Wistar大鼠脊髓损伤动物模型,分为假手术组、单纯损伤组、iPS-NSCs移植组和LIPUS-iPS-NSCs移植组,在大鼠脊髓损伤后7天进行细胞移植。术前1天、术后1天至8周,采用BBB评分评估大鼠后肢运动功能恢复情况;术后8周大鼠进行灌注取材切片,采用HE染色观察损伤局部空洞的面积,免疫荧光染色观察神经再生和胶质瘢痕形成的情况,ELISA检测局部脊髓组织中营养因子的含量。数据由统计学软件SPSS20.0进行分析,结果以均数±标准差(Mean±SD)形式表示,p<0.05表示具有统计学意义。【结果】1.本实验成功搭建了LIPUS细胞激励系统,LIPUS体外刺激iPS-NSCs细胞可以提高其增殖活性,且最佳的刺激参数为1MHz、8V(69.3 mW/cm2);2.在最佳刺激参数下,LIPUS可以提高iPS-NSCs细胞活性,而对细胞凋亡没有产生明显的影响,因此1MHz、8V(69.3 mW/cm2)的LIPUS是一种安全、无创的物理刺激因子,同时能够促进iPS-NSCs细胞向神经元方向分化,促进上清液中BDNF、NGF的表达;3.在最佳刺激参数下,LIPUS干预可以促进iPS-NSCs细胞中受体Notch1和靶基因HES1蛋白水平的表达;4.在脊髓损伤体内实验中,细胞移植后,尤其是LIPUS-iPS-NSCs移植组,脊髓组织的空洞减小,轴突增生活跃,反应性星形胶质细胞减少,脊髓组织局部BDNF、NGF表达水平提高;5.功能学评分结果显示LIPUS-iPS-NSCs移植组大鼠的后肢运动功能恢复明显优于其他损伤组,差异具有统计学意义。【结论】1.本研究中自主搭建的LIPUS激励系统可以明显提高体外培养的iPS-NSCs细胞的增殖活性,增加细胞中神经营养因子的表达,促进其向神经元方向分化,其中Notch信号通路可能是调控LIPUS促进iPS-NSCs细胞活性的潜在机制;2.移植LIPUS优化的iPS-NSCs种子细胞,可以明显的改善脊髓损伤大鼠的后肢运动功能,减少局部胶质瘢痕的形成,促进轴突的再生和NTFs表达。本研究证明LIPUS是一种安全、无创的体外激励方法,可以提高iPS-NSCs细胞在脊髓损伤修复中的作用,为优化细胞移植的种子细胞提供了新策略,为脊髓损伤修复提供新思路。
王宇强[10](2019)在《透明质酸水凝胶缓释雪旺细胞外泌体修复坐骨神经长节段缺损的实验研究》文中认为目的:(1)体外分离新生SD大鼠雪旺细胞并培养,超速离心法提取雪旺细胞分泌的外泌体并进行特异性蛋白鉴定。透射电镜观察雪旺细胞外泌体的粒径和分布。(2)研究雪旺细胞外泌体对神经元及雪旺细胞的生物学作用。观察和研究透明质酸凝胶缓释外泌体的生物学特征参数。(3)探讨透明质酸水凝胶包裹缓释雪旺细胞外泌体填充PCL神经导管修复大鼠坐骨神经长节段缺损的形态学和功能学效果。方法:(1)采用0.1%Ⅳ型胶原酶消化法提取原代大鼠雪旺细胞,并采用DMEM/F12完全培养基培养和纯化。采用S100和Sox10进行纯度鉴定。采用CCK-8试剂盒对雪旺细胞的增殖状态进行检测。采用超高速离心法提取雪旺细胞分泌的外泌体,利用BCA试剂盒检测外泌体中蛋白的含量。Western blot法对雪旺细胞分泌外泌体表面标志物CD63、TSG101、CD9、Rab5和Na+/K+ATP酶进行鉴定。(2)构建1%浓度的透明质酸水凝胶,并将雪旺细胞外泌体进行包裹。体外放置于PBS中采用BCA试剂盒检测外泌体的缓释曲线。应用雪旺细胞外泌体干预雪旺细胞和神经元,CCK-8试剂盒检测外泌体对雪旺细胞的增殖作用,以及对两种细胞生物活性蛋白分泌的作用。ELISA法检测培养第1、3、5天后,外泌体干预的雪旺细胞表达神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、髓鞘零蛋白(P0)、细胞极性蛋白Par-3的水平。同时ELISA法检测外泌体干预后第1、3、5天时神经元中生长相关蛋白43(Growth-associatedprotein-43,GAP-43)、神经丝蛋白-200(Neurofilament-200,NF-200)、βIII–Tubulin的表达水平。(3)静电纺丝制备PCL神经导管,并采用扫描电镜观察导管的大体形态及显微结构,测量纤维丝的直径。采用小量程的力学仪器检测PCL神经导管的的杨氏模量、最大应力、最大载荷、最大断裂张力等力学参数。采用透明质酸水凝胶包裹雪旺细胞外泌体填充PCL神经导管,制备15mm长节段大鼠坐骨神经缺损,并进行端端吻合。采用单纯透明质酸填充PCL导管作为对照组,自体神经移植组也进行对照。在术后4、8、12周时检测大鼠坐骨神经指数、再生神经电生理功能。荧光金逆行示踪检测大鼠神经元胞体的存活情况及神经再生的情况。透射电镜观察三组再生神经的有髓轴突的直径、有髓轴突的数量、再生轴突的面积。NF-200和S100对各组再生神经的免疫荧光染色,观察期神经结构再生情况。HE染色观察三组大鼠腓肠肌肌纤维直径的差异。结果:(1)雪旺细胞在光镜下可以看到呈梭型,体积不大,存在双极,细胞核在中间,比较明显,有折光性。细胞多呈纵行排列的形态。雪旺细胞在接种2小时后,贴壁的比率约为23.5%,6小时时的贴壁比率增加到47.9%,而在12小时的时候有88.9%的细胞贴壁,在16小时以后细胞贴壁的比率均高于99%。在培养3天时,雪旺细胞数量较最初增长了3.9倍,而培养7天时增长了11.4倍。S-100和Sox-10双标荧光染色对雪旺细胞鉴定的纯度为97%。外泌体粒径主要分布在100-160 nm之间,本研究测得的外泌体的平均直径在125 nm。Western blot检测显示外泌体特异性蛋白CD63、TSG101、CD9在本研究所提取的雪旺细胞外泌体中均有表达,而非外泌体表达蛋白Rab5和Na+/K+ATP酶则未见表达。(2)外泌体在透明质酸凝胶中前3天释放比率较大,第一天释放比率为34%,第三天达到41%,随着时间的延长,释放逐渐缓慢。在第4、5、6、8、16、32天时的累积释放比率为43%、47%、51%、53%、75%、90%,而在第64天时候检测得出累积释放率为99%,几乎完全释放。对照组轴突数量为35.4±4.3,而外泌体刺激组为126.3±14.4(P<0.05)。在轴突生长长度方面,外泌体组的平均长度长达(1563.0±132.5)μm,显着高于对照组的(864.3±77.4)μm(P<0.05)。外泌体干预组雪旺细胞在培养后的第3、5、7天时细胞增殖水平均显着高于对照组(P<0.05)。外泌体刺激后的雪旺细胞分泌NGF、BDNF、髓鞘零蛋白(P0)、细胞极性蛋白Par-3的水平在培养后第3天和第5天较第1天时均显着升高,而第5天的表达量也均显着高于第3天的水平(P<0.05)。外泌体刺激后的DRG神经元细胞分泌的标志性蛋白进行检测,结果发现GAP-43、NF-200、βIII–Tubulin的水平在培养后第3天和第5天较第1天时均显着升高,而第5天的表达量也均显着高于第3天的水平(P<0.05)。(3)PCL神经导管的内孔直径为1500μm左右,而管壁的厚度约为500μm,表面纤维丝均匀分布,纤维丝平均直径为4.9μm。PCL神经导管孔隙率为(89.7±2.6)%、最大应力为(7.5±0.6)MPa、杨氏模量为(22.4±2.1)MPa、最大断裂张力为(596.4±33.8)%、最大载荷为(5.6±0.8)N,符合神经再生要求。术后第4、8、12周时PCL/HA-EXO组大鼠的再生神经有髓轴突的直径、有髓轴突的数量、再生轴突的面积显着高于PCL/HA组,而G-ratio值则显着低于PCL/HA组(P<0.05)。而三个时间点中,PCL/HA-EXO的有髓轴突的数量、再生轴突的面积和G-ratio值均与自体神经移植组差异无统计学意义(P>0.05)。术后12周时可见PCL/HA-EXO组大鼠轴突沿着导管顺行生长,有明显的方向性。并且神经轴突及雪旺细胞的表达显着高于PCL/HA组,与自体神经移植组差异不明显。各组大鼠术后随着时间的延长,复合肌动作电位幅度、神经传导速度及潜伏期均有所改善,但PCL/HA-EXO组和自体神经组较PCL/HA组改善更为明显,术后4、8、12周三个时间点均显着高于PCL/HA组(P<0.05)。在术后第8周时,PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的神经传导速度及潜伏期均无显着性差异,而复合肌动作电位仍存在一些差异(P<0.05)。而术后12周时,三个指标则在PCL/HA-EXO组和自体神经移植组中无统计学差异(P>0.05)。PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的SFI指数在术后三个时间点均显着高于PCL/HA组(P<0.05),并且在术后第8,12周时PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的SFI指数相似,无统计学差异(P>0.05)。术后12周PCL/HA-EXO组和自体神经移植组的腓肠肌纤维直径分别为(68.4±6.2)μm和(72.3±7.6)μm,显着高于PCL/HA组(P<0.05),而PCL/HA-EXO组和自体神经移植组则无统计学差异(P>0.05)。结论:(1)本研究成功分离提取了新生SD大鼠雪旺细胞,纯度高,满足后续实验要求。采用超速离心法加超滤法能够成功提取雪旺细胞分泌的外泌体,经鉴定是雪旺细胞分泌的外泌体,纯度较高。(2)透明质酸水凝胶能够有效的包裹和缓释雪旺细胞分泌的外泌体,其缓释曲线与体内雪旺细胞增殖迁移及神经轴突再生的时间相似,能够更好的在体内应用。雪旺细胞分泌的外泌体能够有效的促进雪旺细胞增殖,促进雪旺细胞和神经元特异性蛋白分泌,能够较好的促进神经再生。(3)PCL/HA-EXO神经导管能够有效的促进大鼠长节段神经缺损的运动功能康复及组织学及电生理学明显改善。
二、不同配方的神经营养因子对神经干细胞存活和增殖能力的影响(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同配方的神经营养因子对神经干细胞存活和增殖能力的影响(论文提纲范文)
(1)人间充质干细胞外泌体对海马神经再生及阿尔兹海默症动物模型治疗效应及机制的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
常用缩写中英文对照 |
前言 |
第一章 人脐带间充质干细胞外泌体对小鼠海马损伤的改善作用及机制研究 |
引言 |
1 材料和方法 |
1.1 研究材料 |
1.1.1 脐带来源 |
1.1.2 主要试剂 |
1.1.3 主要耗材 |
1.1.4 主要仪器 |
1.1.5 主要溶液配制 |
1.2 研究方法 |
1.2.1 hUC-MSCs分离及培养 |
1.2.2 hUC-MSCs外泌体的分离 |
1.2.3 hUC-MSCs的鉴定 |
1.2.4 hUC-MSCs外泌体的电镜观测 |
1.2.5 hUC-MSCs外泌体的定量测定 |
1.2.6 免疫蛋白印迹实验 |
1.2.7 外泌体蛋白质组学分析 |
1.2.8 动物实验 |
1.2.9 酶联免疫吸附实验 |
1.2.10 行为学检测 |
1.2.11 免疫荧光实验 |
1.2.12 统计学分析 |
2 实验结果 |
2.1 MSCs外泌体制备及蛋白质组学分析结果 |
2.2 hUC-MSCs外泌体对脂联素水平的调控 |
2.3 生理条件下hUC-MSCs外泌体对动物认知无显着影响 |
2.4 hUC-MSCs外泌体处理增强海马神经分化功能 |
2.5 hUC-MSCs外泌体增加海马DG区神经元再生 |
2.6 hUC-MSCs外泌体对STZ导致的脑损伤的治疗作用 |
2.7 基于蛋白质谱分析探讨hUC-MSCs外泌体其他神经保护效应的可能性 |
3 讨论 |
第二章 人脐带间充质干细胞外泌体对阿尔兹海默式症动物模型的保护作用及机制的研究 |
引言 |
1 材料与方法 |
1.1 研究材料 |
1.1.1 实验动物 |
1.1.2 细胞及外泌体 |
1.1.3 主要试剂 |
1.1.4 主要耗材 |
1.2 研究方法 |
1.2.1 实验动物处理 |
1.2.2 行为学检测 |
1.2.3 BrdU标记及神经再生免疫荧光检测 |
1.2.4 小鼠应激性压力水平检测 |
1.2.5 神经营养因子表达水平检测 |
1.2.6 细胞培养与细胞免疫荧光染色 |
1.2.7 hUC-MSCs脑源性神经营养因子siRNA处理 |
1.2.8 BDNF敲降外泌体对AD小鼠行为学保护效应的研究 |
1.2.9 统计学分析 |
2 实验结果 |
2.1 hUC-MSCs外泌体对AD动物模型的行为学保护作用 |
2.2 hUC-MSCs外泌体对AD动物模型的神经再生促进作用 |
2.3 hUC-MSCs外泌体对细胞脑源性神经营养因子的促进功能 |
2.4 敲降脑源性神经营养因子水平阻止了hUC-MSCs外泌体对AD动物模型的行为学保护作用 |
3 讨论 |
研究总结 |
参考文献 |
综述 人间充质干细胞外泌体:神经再生及保护的新型载体 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介 |
(2)应用生理电场调控神经干细胞在体外构建小鼠三维工程化神经组织(论文提纲范文)
前言 |
中文摘要 |
abstract |
英文缩略词 |
第1章 文献综述 |
1.1 种子细胞 |
1.1.1 胚胎干细胞(ESCs) |
1.1.2 诱导性多能干细胞(i PSCs) |
1.1.3 雪旺细胞(SCs) |
1.1.4 间充质干细胞(MSCs) |
1.1.5 神经干细胞(NSCs) |
1.2 三维组织中神经干细胞的生长调控 |
1.2.1 培养微环境 |
1.2.2 支架材料 |
第2章 材料与方法 |
2.1 实验材料、仪器与试剂 |
2.1.1 实验材料 |
2.1.2 实验仪器 |
2.1.3 实验试剂 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 神经干细胞的原代培养 |
2.2.2 神经干细胞的体外培养 |
2.2.3 三维神经组织的构建 |
2.2.4 生理电场的施加 |
2.2.5 live/dead测定法 |
2.2.6 免疫荧光细胞化学染色实验(IFC) |
2.2.7 TUNEL染色 |
2.2.8 免疫荧光分析 |
2.2.9 电镜 |
2.3 图片分析 |
2.4 统计学分析 |
第3章 实验结果 |
3.1 mNSCs传代培养以及生长成细胞球的情况 |
3.2 神经干细胞的鉴定 |
3.3 培养体系和条件的优化 |
3.3.1 不同神经球种植密度下的细胞生长状况 |
3.3.2 不同Matrigel胶内生长状况 |
3.4 生理电场的刺激对神经干细胞的存活率影响 |
3.5 生理电场的刺激促进3D工程化神经组织中神经干细胞的神经分化和神经突起的生长 |
3.6 bFGF与生理电场协同作用促进3D工程化神经组织中的神经分化和神经突起生长 |
3.7 3D工程化神经组织中神经细胞的形态分析 |
3.8 工程化神经组织中神经网络的形成 |
3.9 3D工程化神经组织的超微结构 |
第4章 讨论 |
第5章 结论 |
参考文献 |
作者简介及在学期间取得的科研成果 |
致谢 |
(3)联用神经因子对重型颅脑创伤大鼠神经细胞和神经功能的影响研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
英汉缩略词对照表 |
神经因子对重型颅颅脑创伤后神经保护的研究进展 综述 |
参考文献 |
攻读硕士学位期间发表论文情况 |
致谢 |
(4)芍药甙对小胶质细胞的影响及其分子机制以及促进神经干细胞向多巴胺神经元分化的研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 芍药甙在临床中应用的研究进展 |
参考文献 |
攻读学位期间获得的学术成果 |
致谢 |
(5)梓醇延迟给药对局灶性永久性脑缺血大鼠的效应及促神经新生作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第1章 梓醇延迟给药对局灶性脑缺血大鼠神经行为学影响 |
引言 |
1.1 实验材料 |
1.1.1 实验主要试剂 |
1.1.2 实验主要仪器 |
1.1.3 主要试剂配制 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 实验动物 |
1.2.2 电凝法制备局灶性永久性脑缺血模型 |
1.2.3 药物干预 |
1.2.4 模型纳入标准 |
1.2.5 神经行为学评分 |
1.2.6 数据分析 |
1.3 实验结果 |
1.3.1 电凝法制备局灶性脑缺血模型 |
1.3.2 脑缺血损伤模型大鼠神经功能缺失 |
1.3.3 梓醇延迟给药对脑缺血大鼠体重的影响 |
1.3.4 梓醇延迟给药对脑缺血大鼠Bederson评分的影响 |
1.3.5 梓醇延迟给药对脑缺血大鼠肌力的影响 |
1.3.6 梓醇延迟给药对脑缺血大鼠mNSS评分的影响 |
1.4 讨论 |
1.5 结论 |
第2章 梓醇延迟给药对局灶性脑缺血大鼠缺血侧脑区神经干细胞分化作用研究 |
引言 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验主要试剂与材料 |
2.1.2 实验主要仪器 |
2.1.3 主要试剂的配制 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 实验动物 |
2.2.2 动物分组及药物干预 |
2.2.3 BrdU体内标记 |
2.2.4 脑组织取材 |
2.2.5 脑组织冰冻切片 |
2.2.6 免疫荧光染色 |
2.2.7 Western Blot检测相关蛋白表达 |
2.2.8 免疫荧光染色图像采集与量化分析 |
2.2.9 数据处理 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 梓醇对脑缺血大鼠SVZ区神经干细胞的影响 |
2.3.2 梓醇对脑缺血大鼠SVZ区未成熟神经元的影响 |
2.3.3 梓醇对脑缺血大鼠缺血周围区成熟神经元的影响 |
2.3.4 梓醇对脑缺血大鼠缺血周围区星形胶质细胞的影响 |
2.4 讨论 |
2.5 结论 |
第3章 梓醇对离体神经干细胞分化作用研究 |
引言 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 主要实验试剂及材料 |
3.1.2 实验主要仪器 |
3.1.3 主要试剂配制 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 神经干细胞的分离培养 |
3.2.2 神经干细胞的传代培养 |
3.2.3 免疫荧光鉴定NSCs |
3.2.4 免疫荧光鉴定NSCs增殖 |
3.2.5 cck-8 检测NSCs细胞活力 |
3.2.6 免疫荧光检测细胞分化 |
3.2.7 WB检测细胞分化相关蛋白表达 |
3.2.8 数据分析 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 细胞形态观察 |
3.3.2 神经干细胞鉴定 |
3.3.3 神经干细胞增殖能力测定 |
3.3.4 神经干细胞分化能力测定 |
3.3.5 梓醇对神经干细胞细胞活力影响 |
3.3.6 梓醇对神经干细胞分化作用影响 |
3.4 讨论 |
3.5 结论 |
全文总结 |
创新点及意义 |
思考与展望 |
参考文献 |
文献综述 神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究现状 |
参考文献 |
硕士学位期间科研工作汇报 |
致谢 |
附:中英文缩略名词对照表 |
(6)神经发生和炎性环境在运动条件下的改变与调节(论文提纲范文)
0引言Introduction |
1 资料和方法Data and methods |
1.1 资料来源 |
1.2纳入和排除标准 |
1.3 数据的提取 |
2 结果Results |
2.1 神经炎症与海马神经发生 |
2.2运动对海马神经发生及认知的影响 |
2.3 运动调节神经炎症对海马神经发生和认知的影响 |
2.3.1 衰老 |
2.3.2 阿尔茨海默病 |
2.3.3 创伤性脑损伤与脑卒中 |
3 总结与展望Summary and prospects |
(7)川芎嗪联合神经干细胞移植干预局灶性脑缺血大鼠的作用机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
中英文缩略词 |
第一部分 文献综述 川芎嗪对缺血性脑卒中神经保护作用的研究进展 |
1 抑制炎性反应 |
2 抑制细胞凋亡 |
2.1 Caspase-3途径 |
2.2 Bcl-2家族 |
3 维持血脑屏障完整性 |
4 抑制神经细胞兴奋性中毒 |
5 清除自由基降低氧化应激反应 |
6 促进神经结构恢复 |
6.1 增加VEGF表达 |
6.2 增加NGF表达 |
6.3 增加bFGF表达 |
6.4 增加BDNF表达 |
7 促进神经干细胞发挥作用 |
7.1 内源性神经干细胞 |
7.2 外源性神经干细胞 |
8 总结 |
参考文献 |
第二部分 实验研究 |
前言 |
一 材料和方法 |
1 实验材料与试剂 |
1.1 实验动物 |
1.2 实验药物及试剂 |
1.3 实验仪器 |
2 实验方法 |
2.1 MCAO大鼠模型制备 |
2.2 细胞培养 |
2.3 神经干细胞移植 |
2.4 分组及给药 |
3 体重及行为学检测 |
3.1 体重检测 |
3.2 行为学检测 |
4 实验动物取材及处理 |
4.1 新鲜组织取材 |
4.2 心脏灌流固定取材 |
4.3 动物组织切片及染色 |
4.4 Western blot法检测 |
4.5 实时荧光定量PCR法检测 |
5 图像分析 |
6 统计方法 |
二 结果与分析 |
1 对体重和神经功能影响 |
1.1 对体重的影响 |
1.2 对神经行为学的影响 |
2 对神经干细胞的影响 |
2.1 移植的NSCs在MCAO模型大鼠脑组织中的变化 |
2.2 对MCAO模型大鼠NSCs增殖的影响 |
2.3 对MCAO模型大鼠NSCs迁移的影响 |
2.4 对MCAO模型大鼠NSCs分化的影响 |
3 促进NSCs迁移的机制研究 |
3.1 Western Blot法检测Nrf2/HO-1/CXCR4通路的调控因子 |
3.2 实时荧光定量PCR法检测迁移调控因子及神经营养因子 |
三 讨论 |
1 TMP联合NSCs移植对MCAO模型大鼠的药效作用 |
2 外源性NSCs在MCAO模型大鼠中的作用 |
3 内源性NSCs在MCAO模型大鼠神经发生作用 |
4 NSCs迁移的机制探索 |
结语 |
不足与展望 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介 |
(8)过表达BDNF的神经干细胞移植对受照大鼠海马区BDNF下游受体表达及突触形成的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
序言 |
参考文献 |
第一部分 神经干细胞体外分离培养、诱导分化及鉴定 |
研究背景及目的 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 过表达BDNF的神经干细胞移植对受照大鼠海马区BDNF下游受体表达的影响 |
研究背景及目的 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分 过表达BDNF的神经干细胞移植对受照大鼠海马区突触形成的影响 |
研究背景及目的 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
全文结论 |
综述 放射性认知功能障碍诊断和防治方法的现状 |
参考文献 |
中英文缩略词对照表 |
攻读硕士学位期间科研经历及发表的论文 |
致谢 |
(9)低强度脉冲超声介导iPS-NSCs修复脊髓损伤的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略语/符号说明 |
前言 |
研究现状、成果 |
研究目的、方法 |
一、LIPUS激励iPS-NSCs最佳物理参数的研究 |
1.1 对象和方法 |
1.1.1 实验器械 |
1.1.2 实验试剂 |
1.1.3 低强度脉冲超声系统的搭建 |
1.1.4 iPS-NSCs传代培养及细胞鉴定 |
1.1.5 低强度脉冲超声激励细胞模型的建立 |
1.1.6 CCK-8 检测iPS-NSCs增殖活性 |
1.1.7 统计学分析 |
1.2 结果 |
1.2.1 成功搭建低强度脉冲超声激励系统 |
1.2.2 iPS-NSCs细胞的形态学观察及细胞鉴定 |
1.2.3 LIPUS对 iPS-NSCs增殖活性的影响以及最佳激励条件的确定 |
1.3 讨论 |
1.3.1 LIPUS在生物组织中的理学效应及其在骨科学中的应用 |
1.3.2 神经干细胞在神经系统中的起源、特点和作用 |
1.3.3 诱导神经干细胞的来源及诱导体系 |
1.3.4 LIPUS对细胞增殖的作用 |
1.4 小结 |
二、在最佳生物学参数下,LIPUS优化iPS-NSCs细胞特性的研究 |
2.1 对象和方法 |
2.1.1 实验器械 |
2.1.2 实验试剂 |
2.1.3 低强度脉冲超声系统的搭建 |
2.1.4 iPS-NSCs传代培养及细胞鉴定 |
2.1.5 低强度脉冲超声激励细胞模型的建立 |
2.1.6 TUNEL检测iPS-NSCs细胞凋亡的情况 |
2.1.7 ELISA检测iPS-NSCs细胞上清液中神经营养因子的含量 |
2.1.8 Western Blot检测Notch信号通路及细胞分化情况 |
2.1.9 统计学分析 |
2.2 结果 |
2.2.1 LIPUS激励iPS-NSCs后细胞凋亡率的变化 |
2.2.2 LIPUS激励iPS-NSCs后细胞中NTFs含量的变化 |
2.2.3 LIPUS激励iPS-NSCs后细胞分化的情况 |
2.2.4 LIPUS激励iPS-NSCs后 Notch信号通路相关蛋白含量的变化 |
2.3 讨论 |
2.3.1 LIPUS对 iPS-NSCs细胞生物特性的影响 |
2.3.2 LIPUS激励iPS-NSCs可能的作用机制 |
2.3.3 LIPUS修复神经损伤的潜力 |
2.4 小结 |
三、LIPUS介导iPS-NSCs细胞移植修复脊髓损伤的研究 |
3.1 对象和方法 |
3.1.1 实验器械 |
3.1.2 实验试剂 |
3.1.3 脊髓损伤动物模型建立 |
3.1.4 细胞移植 |
3.1.5 BBB运动功能评分 |
3.1.6 脊髓标本取出及制作切片 |
3.1.7 石蜡切片的制备 |
3.1.8 HE染色 |
3.1.9 免疫荧光观察移植细胞在体内分化情况 |
3.1.10 ELISA检测测定脊髓组织内的营养因子的表达情况 |
3.1.11 统计学分析 |
3.2 结果 |
3.2.1 HE染色结果 |
3.2.2 GFAP、NF200 免疫荧光染色结果 |
3.2.3 脊髓组织内的营养因子的表达情况 |
3.2.4 BBB评分结果 |
3.3 讨论 |
3.3.1 脊髓损伤动物模型的制备及运动功能评价指标的选择 |
3.3.2 NSCs在脊髓损伤修复中的作用及应用 |
3.3.3 多潜能干细胞在神经损伤等再生医学方面的应用 |
3.3.4 LIPUS介导的iPSc-NSCs修复脊髓损伤可能的作用机制 |
3.4 小结 |
全文结论 |
论文创新点 |
参考文献 |
发表论文和参加科研情况说明 |
附录 |
综述 低强度脉冲超声在神经修复中的应用 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(10)透明质酸水凝胶缓释雪旺细胞外泌体修复坐骨神经长节段缺损的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略语/符号说明 |
前言 |
研究现状、成果 |
研究目的、方法 |
一、外泌体的分离与鉴定 |
1.1 材料与方法 |
1.1.1 主要材料与试剂 |
1.1.2 主要仪器和设备 |
1.1.3 主要试剂配置方法 |
1.1.4 实验方法 |
1.1.5 统计学分析 |
1.2 结果 |
1.2.1 雪旺细胞的形态 |
1.2.2 雪旺细胞在体外的贴壁和增殖活性 |
1.2.3 雪旺细胞体外培养纯度鉴定 |
1.2.4 雪旺细胞分泌的外泌体的形态和粒径鉴定 |
1.2.5 雪旺细胞分泌的外泌体表面标志物的鉴定 |
1.3 讨论 |
1.4 小结 |
二、外泌体的体外生物学功能及体外缓释研究 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 主要材料与试剂 |
2.1.2 主要仪器和设备 |
2.1.3 主要试剂配置方法 |
2.1.4 实验方法 |
2.1.5 统计学分析 |
2.2 结果 |
2.2.1 透明质酸水凝胶包裹雪旺细胞外泌体及体外缓释曲线 |
2.2.2 雪旺细胞外泌体促进DRG组织轴突生长 |
2.2.3 雪旺细胞外泌体对雪旺细胞增殖的影响 |
2.2.4 雪旺细胞外泌体对雪旺细胞生物活性物质表达的影响 |
2.2.5 雪旺细胞外泌体对DRG神经元的生物活性物质表达影响 |
2.3 讨论 |
2.4 小结 |
三、雪旺细胞外泌体促进大鼠长节段坐骨神经缺损修复 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 主要材料和试剂 |
3.1.2 主要仪器和设备 |
3.1.3 实验动物及分组 |
3.1.4 实验方法 |
3.2 结果 |
3.2.1 扫描电镜观察电纺PCL导管大体及微细结构 |
3.2.2 静电纺丝PCL神经导管的力学参数和孔隙率 |
3.2.3 雪旺细胞外泌体促进神经轴突再生 |
3.2.4 NF-200和S100 对各组再生神经的免疫荧光染色 |
3.2.5 三组大鼠坐骨神经电生理参数比较 |
3.2.6 三组大鼠坐骨神经指数比较 |
3.2.7 三组大鼠荧光金逆行示踪 |
3.2.8 三组大鼠腓肠肌HE染色分析 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
全文结论 |
论文创新点 |
参考文献 |
发表论文和参加科研情况说明 |
附录 |
综述 外周神经损伤修复的材料与治疗进展 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
四、不同配方的神经营养因子对神经干细胞存活和增殖能力的影响(论文参考文献)
- [1]人间充质干细胞外泌体对海马神经再生及阿尔兹海默症动物模型治疗效应及机制的研究[D]. 牛玉虎. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]应用生理电场调控神经干细胞在体外构建小鼠三维工程化神经组织[D]. 杜颖珊. 吉林大学, 2021(01)
- [3]联用神经因子对重型颅脑创伤大鼠神经细胞和神经功能的影响研究[D]. 朱业淘. 西南医科大学, 2021(01)
- [4]芍药甙对小胶质细胞的影响及其分子机制以及促进神经干细胞向多巴胺神经元分化的研究[D]. 乔奕胜. 昆明医科大学, 2021
- [5]梓醇延迟给药对局灶性永久性脑缺血大鼠的效应及促神经新生作用研究[D]. 邵亚丽. 西南大学, 2020(05)
- [6]神经发生和炎性环境在运动条件下的改变与调节[J]. 赵祥,魏翠兰,张业廷. 中国组织工程研究, 2021(05)
- [7]川芎嗪联合神经干细胞移植干预局灶性脑缺血大鼠的作用机制研究[D]. 王艳秋. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]过表达BDNF的神经干细胞移植对受照大鼠海马区BDNF下游受体表达及突触形成的影响[D]. 张洁. 苏州大学, 2020(02)
- [9]低强度脉冲超声介导iPS-NSCs修复脊髓损伤的研究[D]. 吴秋丽. 天津医科大学, 2019(02)
- [10]透明质酸水凝胶缓释雪旺细胞外泌体修复坐骨神经长节段缺损的实验研究[D]. 王宇强. 天津医科大学, 2019(02)