一、IRIVs:具有免疫增强作用的重组流感病毒体（论文文献综述）
涂丽裙[1]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中认为转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
曾振,王海宁,张志芳,易咏竹[2]（2021）在《新型疫苗佐剂的研究进展》文中研究说明近年来,核酸疫苗、基因工程疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗的研究取得快速的发展,但这些疫苗与传统的灭活或活体疫苗相比,往往存在免疫原性差等问题,因此需要佐剂来增强其作用。佐剂已被证明是疫苗中的关键成分,佐剂种类众多,尚无统一的分类方法,目前应用最多的佐剂是铝佐剂和弗氏佐剂,但随着新型疫苗的开发,新型佐剂的开发必不可少。根据目前佐剂的研究现状,主要从免疫调节分子类佐剂、抗原递送类佐剂、复合佐剂3个方面进行分析阐述,以期对佐剂的研制提供参考。
年悬悬,张家友,杨晓明[3]（2020）在《流感疫苗佐剂现状及发展》文中认为流感疫苗接种是目前控制流感流行最有效的措施,佐剂的添加可以减少疫苗抗原的使用量,增强疫苗的免疫原性,甚至产生交叉保护作用。本文就流感疫苗佐剂相关文献进行分析总结,概述已经批准使用的以及正在研发的流感疫苗佐剂及其作用机制和安全性,为新型流感疫苗的研发提供参考。
汪灿,王汀[4]（2020）在《脂质纳米粒在疫苗递送中的应用》文中研究说明脂质纳米粒是基于脂质材料制备的粒径在纳米范围的各种形态粒子。脂质纳米粒在疫苗抗原递送方面表现出诸多优越性,使其受到越来越多研究者的关注。脂质纳米粒不仅具有良好的生物可降解性,还具有缓慢释放抗原、保护抗原不被快速降解、靶向免疫细胞等功能,从而能够促进抗原提呈,提高疫苗接种效率。本文综述了几种用作疫苗-佐剂递送系统（VADS）的脂质纳米粒,主要包括脂质体、古菌体、病毒体、脂质卷、立方体、免疫刺激复合物等,重点介绍了这些载体的特点及最新研究进展,并对其在发展过程遇到的各种挑战进行讨论。
王心怡[5]（2020）在《寨卡病毒EDⅢ亚单位疫苗的有效佐剂筛选以及非中和性表位的探讨》文中研究指明研究背景:寨卡病毒（ZIKV）最早于1947年在乌干达的恒河猴体内分离。1953年,人感染寨卡病毒首先于尼日利亚发现。迄今为止,全世界范围内已有超过60个国家报道了ZIKV感染病例。ZIKV可引起神经系统疾病,例如格林-巴利综合症和先天性寨卡综合症,症状包括小头畸形,脑部异常和其他先天性畸形等。该病毒由伊蚊传播,与黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒同属于黄病毒属。ZIKV是一种有包膜的单股正链RNA病毒,含约11kb的基因组,具有三种结构蛋白:衣壳蛋白（capsid,C）,膜蛋白（membrane,M）和包膜蛋白（envelope,E）,其中E蛋白在感染和发病机制中起着重要作用。E蛋白是一种跨膜蛋白,由DⅠ、DⅡ和EDⅢ三个结构域、一个融合环（FL）和一个茎环结构（S）组成。其中DⅠ和DⅡ结构域可以诱导与其他黄病毒（如登革热病毒和西尼罗河病毒）发生交叉反应的抗体,而EDⅢ结构域却能诱导产生ZIKV特异性抗体。因此,EDⅢ结构域是研制疫苗和治疗性抗体的重要靶点。目前正在开发的ZIKV候选疫苗包括灭活病毒、减毒活疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗、病毒样颗粒（VLP）和各种亚单位疫苗等。这些疫苗仍处于临床试验阶段,没有一个获得最终批准。本课题组前期已设计制备了基于ZIKV的EEDⅢ结构域与人Ig G Fc段的融合蛋白亚单位疫苗,并验证其可在小鼠体内诱导特异性中和抗体。研究目的:本研究旨在比较佐剂MF59、Alum、MPL和AS04（Alum+MPL）对ZIKA EEDⅢ亚单位蛋白疫苗的辅佐效果,鉴定出能够诱导平衡的免疫应答和有效抵抗ZIKV感染的佐剂或佐剂组合,并进一步寻找EEDⅢ亚单位疫苗的非中和性优势表位,优化亚单位疫苗的设计。研究方法:（1）利用真核蛋白表达系统,表达ZIKV-M375N/E377T-Fc EEDⅢ重组蛋白,经Protein A层析柱纯化,然后将该蛋白与不同佐剂混合,分别免疫小鼠,三周后加强免疫一次,并在最后一次免疫后第7天收集血清;通过ELISA法检测小鼠免疫血清中EEDⅢ蛋白特异性Ig G抗体滴度、E蛋白特异性Ig G抗体滴度以及h Fc的Ig G抗体滴度;通过空斑减少中和实验测定免疫血清中针对三种寨卡病毒株R103451、PAN2016、PRVABC59的中和抗体;利用流式细胞术检测免疫小鼠中活化并分泌细胞因子的CD4+T和CD8+T细胞频率;在活病毒攻击试验中,分别用空斑实验和q PCR法检测免疫小鼠血清以及各组织中病毒的滴度和RNA拷贝数。（2）寻找寨卡病毒EEDⅢ亚单位疫苗的非中和性优势表位。根据蛋白晶体结构及功能特点,选取7个在ZIKV EEDⅢ上不同的独立表位,利用定点突变PCR法在相应位点形成N糖基化基序以封闭该表位,在293T细胞中表达并纯化这些突变蛋白;利用Western Blot鉴定糖基化的形成;通过ELISA法检测ZIKV突变蛋白的免疫反应性;通过免疫BALB/c和A129小鼠,检测突变蛋白诱导的特异性抗体、中和抗体、中和免疫原性、主动免疫保护作用和被动免疫保护效应。研究结果:（1）通过小鼠免疫实验,分析不同佐剂对ZIKV EEDⅢ蛋白疫苗功效的影响。ELISA结果显示:使用MPL+Alum佐剂组合能显着提高免疫血清中EEDⅢ特异性抗体水平,且Ig G1/Ig G2a比率更低,诱导的Ig G抗体反应更均衡;空斑中和实验显示:MPL+Alum佐剂组诱导的针对3种ZIKV病毒株的中和抗体滴度更高;流式细胞分析显示:相比于使用单一佐剂,MPL+Alum佐剂组可显着提高EEDⅢ蛋白诱导的Th1、Th2、Th17以及IFN-γ+/CD8+T细胞和IL-4+/CD8+T细胞的频率;（2）MPL+Alum佐剂组能显着增强疫苗诱导的免疫保护作用,能保护小鼠抵御更高剂量ZIKV的攻击;（3）探讨EEDⅢ亚单位疫苗的非中和性优势表位,初步检测了ZIKV EEDⅢ蛋白的7个关键位点糖基化修饰对疫苗免疫保护作用的影响。蛋白抗原性分析显示:位于366位的糖基化突变蛋白可与所用5种中和性抗体结合,而不与非中和性单抗ZV-2结合;位于393位的糖基化突变完全阻断了EEDⅢ蛋白与其中的3种中和抗体的结合;位于333位的糖基化突变也能完全阻断EEDⅢ蛋白与其中3种中和抗体的结合;中和抗体分析显示:带有333或366糖基化位点的EEDⅢ突变蛋白免疫小鼠能显着提高中和抗体滴度,带有309或393糖基化位点的EEDⅢ突变蛋白则能够降低免疫小鼠内中和抗体滴度,其他带有315、351和369位点糖基化的EEDⅢ突变蛋白所诱导的中和抗体滴度与野生型DEIII蛋白相比没有显着差异;（4）小鼠活病毒攻击实验显示:带有333或366糖基化位点的EEDⅢ突变蛋白能够显着提高疫苗的主动免疫保护作用以及被动免疫保护作用,而带有309或393糖基化位点的EEDⅢ突变蛋白则能有效降低疫苗的免疫保护作用。结论:相比于单一佐剂的使用,Alum和MPL佐剂组合（AS04）能显着增强ZIKV EEDⅢ亚单位疫苗的免疫原性和小鼠对寨卡病毒感染的免疫保护力,可作为ZIKV EEDⅢ亚单位疫苗的有效佐剂。四个关键位点（333、366、393和309位）的糖基化能有效改变EEDⅢ亚单位疫苗的免疫保护功效。通过糖基化修饰ZIKA EEDⅢ亚单位的333或366关键位点可以成功封闭非中和性优势表位,提高疫苗诱导中和抗体的效能以及免疫原性和免疫保护性。
陶晓莉[6]（2020）在《纳尔逊海湾正呼肠孤病毒复制对细胞自噬的影响及相关非结构蛋白研究》文中提出目的:纳尔逊海湾正呼肠孤病毒（Nelson Bay orthoreoviruses,NBV）最初是40多年前从澳大利亚果蝠中分离出来的,独立形式存在且不与任何疾病发生关联。然而,最近已经证实了有几株NBV是人类呼吸道感染的病原体,并从一些急性呼吸道疾病患者的体内分离出的病原体显示,NBV已经进化为人畜共患病的形式,且可在人类中传播。致病性NBV能引起人类急性呼吸道及肠道炎症,并且在东南亚地区呈逐步漫延的趋势。2007年日本学者TAKAHIRO等首次利用RNA病毒的反向遗传学系统,成功制备出重组NBV-MB,为深入研究NBV致病机理奠定基础。自噬是一种真核细胞为维持细胞自身稳态进行的一种生理性代谢代偿过程。自噬是一种进化保守的细胞自救行为,对维持细胞稳态和应激条件下细胞的存活有重要意义。自噬是真核细胞中进化上保守的过程,降解细胞内底物,参与多种生理过程,并维持细胞稳态。此外,自噬还具有清除感染细胞内细菌和病毒的重要功能。正常情况下,自噬程序处于基础水平状态,但是受到各种胞内和胞外刺激时会被激活。然而,某些病毒显然不受自噬的影响,许多病毒已进化为逃避或利用此机制以各种方式促进其存活和复制。自噬在病毒感染宿主过程中的作用因病毒的不同而不同。据报道自噬能够促进哺乳动物呼肠孤病毒（Mammalian orthoreovirus,MRV）和禽呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus,ARV）复制,另有研究发现,猪瘟病毒、轮状病毒（Rotavirus,RV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）等几种病毒一方面能够诱导自噬,另一方面自噬也能反过来在病毒生命周期和发病机理中起着重要作用。但是到目前为止,尚无关于NBV感染与细胞自噬的研究报道。由于先前的研究,已知每种病毒能够形成病毒工厂（viral factories,VF,也叫包涵体）的病毒都有一个或两个非结构蛋白是其形成病毒工厂结构所必须的。对MRV和ARV的研究结果表明,光学显微镜下在细胞中单独表达的非结构蛋白μNS形成的VF与感染细胞中形成的VF相似。研究表明,MRV和ARV的病毒非结构蛋白,μNS和σNS在病毒包涵体的形成以及其他复制和组装所需的病毒蛋白和RNA的募集中起着关键作用。基于这些研究,我们知道呼肠孤病毒的复制和重组都是发生在VF中。但目前尚无发表有关NBV的μNS和σNS的报告,μNS和σNS蛋白在NBV复制过程中的具体功能还不清楚。本课题首先根据TAKAHIRO开发的NBV反向遗传技术,通过质粒共转成功获得了NBV重组毒株并进行检测（为了与野生毒株区分将其命名为NBV-MB）,为进一步研究NBV的致病机制提供了材料;并通过研究细胞自噬与病毒感染和复制的关系,揭示自噬在NBV在机体内发病机理中的作用;另外,μNS作为NBV的一种主要非结构蛋白,其作用可能与病毒的包涵体形成有关,而在自噬的研究中发现,μNS蛋白可能与NBV-MB感染细胞而增强细胞自噬的过程有关。因此,本研究进一步研究了σNS与μNS蛋白的表达及其生物学特性。实验结果证实了σNS与μNS蛋白存在相互作用,并且确定了σNS蛋白的结合区域,从而为后续进一步研究呼肠孤病毒的致病机理奠定了基础。研究方法:1.病毒的制备及检测:培养BKH（Baby hamster kidney,BHK）细胞和小鼠成纤维L929细胞,利用反向遗传系统通过将含有10个NBV病毒基因cDNA质粒和可编码T7聚合酶蛋白pcDNA3.1-T7RNAPO1质粒共同转染BKH细胞,来制备重组病毒NBV-MB,并通过L929细胞进行传代扩增;应用病毒空斑检测方法,检测重组病毒的滴度;通过免疫荧光技术、western blotting、病毒RNA垂直电泳几种方法对重组NBV-MB进行检测;2.病毒感染与细胞自噬的研究:重组病毒感染BHK细胞后,利用western blotting检测BHK细胞中自噬相关蛋白LC3-II表达量的方法来评估NBV-MB对自噬的影响;用自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）及氯喹（Choroquine,CQ）或GFP-LC3质粒转染处理细胞后再感染NBV-MB,检测BHK细胞中LC3基因表达的变化和LC3-II蛋白表达量的变化;在用诱导剂和抑制剂处理BHK细胞后分别用病毒非结构蛋白μNS的质粒pCAG M3和σNS的质粒pCAG S3转染后,通过空斑方法测定病毒滴度的变化,检测自噬诱导剂和抑制剂处理或转染对病毒复制的影响;3.μNS和σNS蛋白生物学特性的研究:培养BHK细胞并分别转染pCAG M3和pCAGS S3质粒,通过免疫荧光法检测μNS和σNS蛋白在细胞内的表达情况;将pCAG M3和pCAGS S3质粒共同转染到BHK细胞后,通过免疫荧光法检测μNS和σNS蛋白在细胞内的表达情况,同时通过western blotting检测μNS和σNS蛋白在感染细胞中的表达;构建σNS的N末端1-60个氨基酸（aa）残基缺失的质粒,测序验证并通过western blotting检测各质粒转染BHK细胞后的蛋白表达情况;通过免疫荧光法检测μNS和σNS蛋白在细胞内共定位的结合区域;最后通过酵母双杂交实验验证μNS和σNS蛋白相互作用的结合区域。结果:1.病毒的制备及检测:成功制备出重组病毒NBV-MB,通过L929细胞扩增传代后其滴度达到108 PFU/ml;免疫荧光法和western blotting检测结果显示,NBV-MB感染的细胞中均有病毒非结构蛋白σNS或μNS的表达;病毒RNA垂直电泳结果显示,与野生毒株相比,NBV-MB的RNA条带分布与数量均一致;2.病毒感染能够促进细胞自噬:NBV-MB感染会诱导宿主细胞自噬,而病毒复制能够促进自噬的发生;μNS蛋白能够促进NBV-MB感染过程中细胞自噬;3.μNS和σNS蛋白存在相互作用:亚细胞定位结果显示NBV的μNS在没有其他病毒蛋白的情况下会形成包涵体结构,而σNS弥散地分布在整个细胞质中;μNS能够通过和σNS蛋白互作在感染细胞的病毒包涵体中共定位;免疫荧光检测及酵母双杂交检测都证实了μNS与σNS蛋白结合的基本区域位于σNS N末端区域的60个aa残基区域内。结论:本课题通过NBV病毒的反向遗传技术,成功制备了具有感染性的重组病毒NBV-MB并且进行检测,使重组病毒能够满足后续实验的要求;实验结果发现NBV-MB感染促进了自噬的发生,而且病毒的复制是诱发自噬的关键;细胞自噬也能够促进NBV复制;病毒非结构蛋白μNS能够促进细胞自噬,μNS和σNS蛋白存在相互作用,σNS能够通过与μNS相互结合而共定位于感染细胞的病毒包涵体中,并确定了互作的σNS结合区域。
李宗霖,廖国阳[7]（2020）在《流感疫苗新型佐剂的研究进展》文中指出每年流感在全球范围内引起约50万的死亡病例和超过300万的重症病例,流感疫苗是预防控制流感暴发和流行的最经济、有效的方法。将佐剂应用至流感疫苗中,不但能有效降低抗原用量,减轻经济负担,而且良好的佐剂能显着提高机体体液免疫应答及细胞免疫应答。因此研究和开发流感疫苗佐剂具有重要意义,国内外的研究者均进行了深入和广泛的研究。本文对流感疫苗佐剂的应用现状及研究进展进行综述,旨在为开发新型佐剂提供参考。
陈敏囡,邱昌露,王汀,王宁[8]（2019）在《脂质载体用作黏膜疫苗佐剂-传递系统》文中提出目的综述近年来纳米脂质载体用于黏膜疫苗佐剂-传递系统的研究进展情况。方法通过"Pubmed"和"中国知网"搜索"脂质纳米载体"、"疫苗"、"黏膜免疫"、"疫苗佐剂"和"传递系统"等一系列关键词,查阅了近十年来有关黏膜疫苗发展的学术论文。结果通过检索获得了许多有关黏膜疫苗佐剂-传递系统（VADSs）的文献,并引用了大量相关重要成果,综述了脂质体、免疫刺激复合物、病毒体、微泡和乳剂不同脂质载体的黏膜疫苗佐剂-传递系统研究进展。作者重点论述了载体的主要功能,如靶向黏膜传递抗原、保护抗原免于降解、促进抗原的提呈、增强抗原特异性免疫应答以及他们在黏膜疫苗接种中的优缺点。结论尽管基于纳米脂质载体的黏膜疫苗佐剂-传递系统已取得了巨大的发展并在免疫病原体方面具有很大的潜力,但仍存在一些挑战有待克服。
余晓颖[9]（2019）在《H3N2犬流感病毒M1蛋白胞内抗体的制备及活性研究》文中指出犬流感病毒（Canine influenza virus,CIV）属于正黏病毒科甲型流感病毒属,能感染犬引发犬流感,出现轻度咳嗽、流涕等轻度症状,以及高烧、呼吸急促、脓性鼻涕、厌食、抑郁和出血性肺炎等重度症状。目前,流行病学研究证实马源H3N8和禽源H3N2亚型犬流感病毒能够在犬类中稳定传播,流感病毒成功的实现由马到犬、由禽到犬的跨种间传播,犬逐渐成为流感病毒进化和繁衍的“温床”。犬作为人类的伴侣动物,在现代人类生活中具有特殊的地位,犬作为流感病毒的中间宿主存在着将病毒传染给人类的潜在风险,将给人类健康带来巨大的威胁。由于流感病毒易发生抗原漂移和抗原转移,针对病毒表面抗原的中和抗体及疫苗需要不断更新,疫苗的时效性存在很大的问题,因此通用型犬流感病毒抗体药物的研究迫在眉睫。本研究以流感病毒高度保守的M1蛋白为靶标,通过噬菌体抗体库筛选特异性抗M1蛋白的scFv,并对scFv进行免疫结合活性和生物学活性研究;然后将利用具有高效跨膜转导功能的TAT蛋白构建TAT-scFv穿梭胞内抗体,在细胞水平和SPF鸡胚中评价胞内抗体对A/Canine/Guangdong/05/2011（H3N2）、A/Duck/Guangdong/W12/2011（H3N2）和A/Beijing/1/1968（H3N2）三株异源流感病毒增殖的影响。1.H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定为制备犬流感病毒（H3N2）M1蛋白纯品,针对H3N2犬流感病毒M1蛋白高度保守序列设计引物,PCR扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21（DE3）,诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,Western blot检测纯化的M1蛋白。通过PCR成功扩增出大小为771bp的M1基因,成功构建pET-SUMO-M1表达质粒,经酶切纯化后获得M1蛋白纯品,为进一步制备通用型抗H3N2犬流感病毒抗体提供纯品抗原。2.抗H3N2犬流感病毒M1蛋白scFv的筛选及活性研究以M1为靶蛋白,采用固定相筛选法同时从噬菌体抗体库Tomlinson I库（库容量:1.47×108）和Tomlinson J库（库容量:1.37×108）中筛选抗M1蛋白的单链抗体,进行四轮生物淘洗后,显示每增加一轮筛选高亲和力阳性噬菌体克隆富集倍数都有所提高。通过间接ELISA法和PCR鉴定筛选阳性菌株,最终获得C2菌株与M1靶蛋白的免疫结合活性最显着,对C2菌株抗体基因进行分析,具有完整的单链抗体结构。C2菌株扩大培养并成功纯化出H3N2-scFv纯品,BCA检测蛋白浓度为1.6mg/mL,薄层扫描显示纯度为98.9%,利用WB法对纯化的scFv进行鉴定,结果显示制备的scFv和M1靶蛋白具有良好的免疫结合活性。在细胞水平和SPF鸡胚模型中生物学活性研究显示,scFv在浓度高达1.6mg/mL对细胞和鸡胚没有显着的毒性作用,对A/Canine/Guangdong/05/2011（H3N2）株犬流感病毒复制具有显着的抑制作用,呈现剂量依赖性特征,细胞水平IC50=0.290mg/mL,鸡胚水平IC50=0.120mg/mL,证明在鸡胚中,scFv的灵敏度更高。3.TAT-scFv重组穿梭胞内抗体的制备及活性研究以C2菌株pIT2-scFv质粒为模板,进行PCR扩增,成功获取867bp大小的scFv基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-28（a）-TAT中,构建重组表达质粒pET-28（a）-TAT-scFv,经PCR和双酶切鉴定显示插入的片段大小为867bp,证明pET-28（a）-TAT-scFv重组质粒构建成功。将重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中进行目的蛋白的诱导表达,经12%SDS-PAGE分析,32kDa大小处有条带,证明TAT-scFv重组蛋白成功表达,表达条件的优化结果显示表达菌在TB培养基中培养,0.6mmol/LIPTG条件下进行30℃诱导6h,重组蛋白表达量实现最高。表达菌进行中试发酵扩大培养后,精纯出浓度为2.0mg/mL的TAT-scFv重组蛋白,纯度为93.655%,利用WB法对纯化的TAT-scFv进行鉴定,结果显示在32kDa大小处出现特异性的免疫条带,证明成功制备TAT-scFv穿梭胞内抗体。利用间接ELISA法检测TAT-scFv和scFv与M1蛋白免疫结合活性的差异,结果显示在1:101:640稀释度两者都与M1蛋白具有良好的免疫结合活性,并且无显着差异,证明TAT细胞跨膜蛋白未对scFv单链抗体生物活性产生影响。用三株异源的H3N2流感病毒检测胞内抗体的活性,对三株H3N2流感病毒进行遗传进化分析,证实出三株H3N2流感病毒属于不同的进化分枝,分别属于犬类、禽类和人类。将三株异源H3N2流感病毒分别感染MDCK细胞和SPF鸡胚,研究不同浓度的TAT-scFv对流感病毒增殖的影响。毒性研究显示,TAT-scFv在浓度高达1.6mg/mL时对细胞和鸡胚没有显着的毒性,细胞存活率仍达到94.1%,鸡胚均发育正常,血管明显未出现死胚,也无其他病理变化,说明该蛋白本身对细胞和鸡胚均无毒性。生物活性研究显示,不论在MDCK细胞里还是在鸡胚中,TAT-scFv对三种H3N2流感病毒增殖都具有明显抑制作用,并且呈现量效关系。TAT-scFv对三种H3N2流感病毒增殖抑制作用大小分析:对A/Canine/Guangdong/05/2011（H3N2）和A/Duck/Guangdong/W12/2011（H3N2）抑制作用高于A/Beijing/1/1968（H3N2）,说明TAT-scFv对三种H3N2流感病毒增殖的抑制作用跟病毒进化过程中的分枝远近有关。TAT-scFv穿梭胞内抗体通过破坏H3N2流感病毒的M1基质蛋白,从而阻止流感病毒的装配及释放。通过观察鸡胚存活率完善对TAT-scFv抗病毒药物的评价,得到在8日内1.6mg/mL的TAT-scFv对分别感染100uLEID50的A/Canine/Guangdong/05/2011（H3N2）和A/Duck/Guangdong/W12/2011（H3N2）的鸡胚组可以实现100%保护;对于感染100uLEID50的A/Beijing/1/1968（H3N2）鸡胚组可以实现50%保护。本研究成功制备H3N2犬流感病毒M1蛋白,以M1蛋白为抗原成功筛选scFv,以TAT蛋白作为跨膜转运载体,成功制备TAT-scFv胞内抗体,研究显示TAT-scFv胞内抗体对不同种的H3N2亚型流感病毒的增殖具有抑制作用,说明TAT-scFv具备了成为通用型抗H3N2亚型流感病毒候选药物的可能。
侯永利[10]（2019）在《乙肝核心蛋白嵌合奈瑟菌表面蛋白A重组蛋白疫苗免疫效果研究》文中指出[目的]初步探究乙肝核心蛋白（HBc-N144）嵌合奈瑟菌表面蛋白A（Neisseria surface protein A,NspA）构成的重组蛋白疫苗（HBc-N144-NspA）在小鼠体内诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,特别是黏膜免疫应答水平及其免疫保护效果,为寻找高效黏膜免疫佐剂、研制高效B群流脑疫苗提供实验依据。[方法]1.构建HBc-N144-NspA病毒样颗粒。通过生物信息学查找及截取乙肝核心蛋白、奈瑟菌表面蛋白A基因序列,在截短的乙肝核心蛋白（HBc-N144）的免疫显性区域（MIR区）79-80位氨基酸之间插入NspA基因,获得测序正确的原核质粒pET28a-HBc-N144-Ns pA,再将该融合质粒表达重组蛋白HBc-N144-NspA,纯化后通过透射电镜观察其所形成的病毒样颗粒。2.评价HBc-N144-NspA重组蛋白疫苗的免疫效果。原核表达的重组蛋白HBc-N144-NspA,纯化后免疫雌性BALB/C小鼠,间接ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1和IgG2a以及生殖道分泌液中sIgA。分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测培养上清中IL-4、IFN-γ和IL-17A含量;流式细胞术检测脾淋巴细胞Th1和Th2亚群。血清体外杀菌试验检测免疫血清的体外杀菌活性;末次免疫后2周,以致死剂量的脑膜炎奈瑟菌MC58攻击,观察疫苗的免疫保护效果。通过采集小鼠免疫接种部位肌肉组织进行病理切片分析炎性浸润情况。[结果]1.成功构建了HBc-N144-NspA病毒样颗粒。通过透射电镜观察HBc-N144、HBc-N144-NspA呈颗粒样结构,它们大小较均一,粒径分别约为30nm及120nm;2.重组蛋白疫苗组HBc-N144-NspA+F（F为弗氏佐剂）、HBc-N144-NspA和rNspA+F分别免疫小鼠所产生的特异性IgG和sIgA在免疫后42天达到峰值,其中HBc-N144-NspA组明显高于rNspA/F组（p<0.05）,HBc-N144-NspA+F和HB c-N144-NspA组之间相比无显着性差异（p>0.05）。HBc-N144-NspA+F,HBc-N144-NspA,NspA+F组特异性IgG1/IgG2a比值均大于1。流式细胞术结果显示,HBc-N144-NspA+F,HBc-N144-NspA和Nsp A+F诱导的免疫应答均倾向于Th2型。细胞因子水平的定量检测结果显示,HBc-N144-NspA+F和HBc-N144-NspA组所产生的IL-4、I NF-γ和IL-17A水平无明显差异,但均高于NspA+F组。致死量MC58攻击试验小鼠72h后,HBc-N144-NspA+F,HBc-N144-NspA组均获得了良好的免疫保护效果,小鼠存活率均达90%,明显高于r NspA+F组75%的存活率。免疫后第六周血清体外杀菌抗体滴度,H Bc-N144-NspA+F组为1:16,HBc-N144-NspA和rNspA+F均为1:8。病理切片结果显示,HBc-N144-NspA+F组与NspA+F组均出现明显的炎性细胞浸润,而HBc-N144-NspA组未产生明显的炎性浸润。[结论]1、构建的HBc-N144-NspA病毒样颗粒具有良好的免疫原性,可以诱导小鼠产生较高水平的特异性体液免疫,尤其是黏膜免疫。2、HBc-N144-NspA重组蛋白疫苗组血清体外杀菌活性较高,对实验小鼠有较强的保护作用,且免疫保护效果明显高于NspA+F组。
二、IRIVs:具有免疫增强作用的重组流感病毒体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IRIVs:具有免疫增强作用的重组流感病毒体（论文提纲范文）
（1）转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）新型疫苗佐剂的研究进展（论文提纲范文）
| 1 免疫调节分子类佐剂 |
| 1.1 Cp G寡核苷酸 |
| 1.2 聚肌胞苷酸 |
| 1.3 细胞因子 |
| 1.4 细菌鞭毛蛋白 |
| 1.5 皂苷 |
| 1.6 脂多糖 |
| 2 抗原递送类佐剂 |
| 2.1 脂质体 |
| 2.2 纳米颗粒 |
| 3 复合佐剂 |
| 3.1 以载体为基础的复合 |
| 3.2 非载体佐剂的复合 |
| 4 展望 |
（4）脂质纳米粒在疫苗递送中的应用（论文提纲范文）
| 1 脂质体 |
| 2 古菌体 |
| 3 病毒体 |
| 4 脂质卷 |
| 5 立方体 |
| 6 免疫刺激复合物 |
| 7 总结与展望 |
（5）寨卡病毒EDⅢ亚单位疫苗的有效佐剂筛选以及非中和性表位的探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 文献综述 寨卡病毒疫苗及疫苗佐剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 常用佐剂对ZIKV EDⅢ亚单位疫苗免疫原性和功效的影响 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 ZIKV EDⅢ关键表位糖基化修饰对疫苗免疫保护作用的影响 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）纳尔逊海湾正呼肠孤病毒复制对细胞自噬的影响及相关非结构蛋白研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一部分 :纳尔逊海湾正呼肠孤重组病毒的制备及病毒复制对细胞自噬的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 重组病毒的制备 |
| 2.2.3 重组NBV-MB的传代扩增 |
| 2.2.4 空斑实验检测病毒滴度 |
| 2.2.5 重组病毒RNA的提取及垂直电泳检测 |
| 2.2.6 免疫荧光方法检测重组病毒μNS蛋白 |
| 2.2.7 western blotting方法检测病毒μNS蛋白表达 |
| 2.2.8 不同MOI值感染时对BHK细胞自噬的影响 |
| 2.2.9 病毒感染时间对BHK细胞自噬的影响 |
| 2.2.10 NBV-MB感染对BHK细胞自噬的影响 |
| 2.2.1 170℃热应激处理病毒对自噬的影响 |
| 2.2.12 自噬调节剂对NBV-MB复制的影响 |
| 2.2.13 μNS、σNS蛋白对NBV-MB复制及细胞自噬的影响 |
| 2.2.14 q RT-PCR检测自噬蛋白LC3 基因的表达 |
| 2.2.15 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组NBV-MB病毒株的检测 |
| 3.2 空斑检测NBV-MB的滴度 |
| 3.3 病毒RNA垂直电泳检测 |
| 3.4 western blotting检测 |
| 3.5 不同量的NBV-MB感染时细胞自噬蛋白LC3 的表达 |
| 3.6 不同感染时间检测自噬蛋白LC3的表达 |
| 3.7 免疫荧光检测自噬蛋白LC3的表达 |
| 3.8 70℃热处理NBV-MB对细胞自噬的影响 |
| 3.9 自噬调节剂对NBV-MB复制的影响 |
| 3.10 NBV-MB非结构蛋白有助于自噬诱导 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :NBV自噬相关蛋白μNS和σNS的表达及其生物学特性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 免疫荧光测定病毒感染性能 |
| 2.2.2 western blotting检测 |
| 2.2.3 免疫沉淀检测 |
| 2.2.4 N末端aa缺失质粒的载体构建 |
| 2.2.5 酵母双杂交检测 |
| 2.2.6 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 μNS和σNS蛋白的细胞中的表达 |
| 3.2 μNS和σNS在 BHK细胞中的共定位 |
| 3.3 免疫沉淀检测 |
| 3.4 σNS的 N末端aa缺失的质粒的构建 |
| 3.5 σNS与μNS共定位的结合区域的检测 |
| 3.6 病毒非结构蛋白μNS和σNS蛋白酵母双杂交检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）流感疫苗新型佐剂的研究进展（论文提纲范文）
| 1 铝佐剂 |
| 2 乳剂（emulsion) |
| 2.1 MF59 |
| 2.2 AS03 |
| 2.3 AF03 |
| 2.4 GLA-SE和W805EC |
| 3 细胞因子佐剂粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF) |
| 4 病毒体佐剂（Virosome) |
| 5 免疫刺激复合物（immunostimulating complex,ISCOM) |
| 6 脂质体佐剂DOTAP |
| 7 天然多糖佐剂 |
| 7.1 玉竹多糖（polygonatum odoratun polysaccharides,POP) |
| 7.2 蓝根总多糖（isatis indigotica polysaccharides,IIP) |
| 7.3 茯苓多糖 |
（8）脂质载体用作黏膜疫苗佐剂-传递系统（论文提纲范文）
| 1 黏膜免疫系统 |
| 2 黏膜疫苗接种的佐剂-传递系统 |
| 2.1 脂质体 |
| 2.2 免疫刺激复合物 (ISCOMs) |
| 2.3 病毒体 |
| 2.4 微泡 |
| 2.5 纳米乳 |
| 3 展望 |
（9）H3N2犬流感病毒M1蛋白胞内抗体的制备及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 犬流感病毒的研究进展 |
| 1.1 病原学特征 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.2.1 H3N8 亚型犬流感病毒 |
| 1.2.2 H3N2 亚型犬流感病毒 |
| 1.2.3 H3N8和H3N2 亚型犬流感病毒地理分布 |
| 1.3 发病 |
| 1.3.1 感染途径 |
| 1.3.2 病毒复制 |
| 1.3.3 孵化和脱落期 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 诊断 |
| 1.5.1 临床诊断 |
| 1.5.2 血清学诊断 |
| 1.5.3 分子生物学诊断 |
| 1.6 预防 |
| 1.6.1 病毒灭活疫苗 |
| 1.6.2 减毒活疫苗 |
| 1.6.3 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.7 治疗 |
| 1.8 公共卫生 |
| 1.9 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 H3N2 犬流感病毒M1 蛋白的原核表达及鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒、质粒和菌种 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 M1 基因的扩增及目的片段回收 |
| 1.2.3 重组表达质粒的构建 |
| 1.2.4 感受态细胞的制备和转化 |
| 1.2.5 重组质粒p ET-SUMO-M1 的鉴定及转化 |
| 1.2.6 目的蛋白M1 的诱导表达及表达鉴定 |
| 1.2.7 表达产物的初步纯化 |
| 1.2.8 纯化产物的Western blot鉴定 |
| 1.2.9 目的蛋白的精纯 |
| 1.2.10 M1 蛋白多抗的制备及效价测定 |
| 1.2.11 目的蛋白的Western blot鉴定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 M1 基因的扩增 |
| 1.3.2 重组表达质粒p ET-SUMO-M1 的构建及PCR鉴定 |
| 1.3.3 目的蛋白诱导表达及可溶性分析 |
| 1.3.4 重组融合蛋白的纯化和Western blot分析 |
| 1.3.5 目的蛋白的纯化 |
| 1.3.6 M1 蛋白多抗的制备 |
| 1.3.7 纯化的目的蛋白的Western blot分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 抗犬流感病毒H3N2-M1 scFv的筛选及活性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 噬菌体抗体库Tomlison I+J次级抗体库制备 |
| 2.2.2 抗H3N2-M1 单链抗体的筛选 |
| 2.2.3 抗H3N2-M1 单链抗体的表达 |
| 2.2.4 抗H3N2-M1 阳性菌株ELISA检测 |
| 2.2.5 抗H3N2-M1 阳性菌株PCR鉴定及测序 |
| 2.2.6 抗H3N2-M1-sc Fv的纯化 |
| 2.2.7 scFv的 WB鉴定和免疫结合活性分析 |
| 2.2.8 细胞水平sc Fv的活性研究 |
| 2.2.9 SPF鸡胚中sc Fv的活性研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 次级噬菌体抗体库的扩增结果 |
| 2.3.2 文库筛选结果 |
| 2.3.3 阳性菌株筛选和PCR鉴定结果 |
| 2.3.4 抗H3N2-M1 阳性菌株序列分析 |
| 2.3.5 抗H3N2-M1 单链抗体的纯化 |
| 2.3.6 scFv的 WB鉴定和免疫结合活性分析 |
| 2.3.7 细胞水平sc Fv的活性研究 |
| 2.3.8 SPF鸡胚中sc Fv的活性研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 scFv的筛选 |
| 2.4.2 scFv的纯化 |
| 2.4.3 scFv的活性研究 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 TAT-scFv重组穿梭胞内抗体的制备及活性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细菌、细胞及病毒 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 scFv基因的扩增及目的片段回收 |
| 3.2.3 scFv基因和质粒pMD-18T的连接 |
| 3.2.4 pMD-18T-scFv质粒和pET-28(a)-TAT质粒的双酶切、回收及连接 |
| 3.2.5 感受态细胞的制备和转化 |
| 3.2.6 pET-28(a)-TAT-scFv重组质粒的PCR及双酶切鉴定 |
| 3.2.7 TAT-scFv重组表达菌的制备 |
| 3.2.8 目的蛋白TAT-scFv的诱导表达及鉴定 |
| 3.2.10 TAT-scFv表达菌的中试发酵 |
| 3.2.11 TAT-scFv重组蛋白的初步纯化 |
| 3.2.12 TAT-scFv重组蛋白的精纯 |
| 3.2.13 TAT-scFv的 WB鉴定和免疫结合活性分析 |
| 3.2.14 细胞水平TAT-scFv的活性研究 |
| 3.2.15 SPF鸡胚中sc Fv的活性研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 scFv基因的扩增 |
| 3.3.2 pET-28(a)-TAT-scFv重组质粒的PCR及双酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白TAT-scFv的诱导表达及可溶性分析 |
| 3.3.4 重组菌表达条件的优化结果 |
| 3.3.5 TAT-scFv重组蛋白的初步纯化 |
| 3.3.6 TAT-scFv重组蛋白的精纯 |
| 3.3.7 TAT-scFv的 WB鉴定和免疫结合活性分析 |
| 3.3.8 细胞水平TAT-scFv重组穿梭胞内抗体的活性研究 |
| 3.3.9 SPF鸡胚中TAT-scFv的活性研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 TAT细胞跨膜蛋白 |
| 3.4.2 TAT-scFv对三种H3N2 流感病毒抑制作用 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）乙肝核心蛋白嵌合奈瑟菌表面蛋白A重组蛋白疫苗免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语索引 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 实验材料 |
| 2.1 主要的实验仪器 |
| 2.2 菌株、抗体及相关试剂 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 rNspA的表达、纯化及Western blot鉴定 |
| 3.2 HBc-N144 的转化、表达、纯化及Western blot鉴定 |
| 3.3 重组蛋白HBc-N144 结构形态检测 |
| 3.4 HBc-N144-NspA的转化、表达、纯化及Western blot鉴定 |
| 3.5 重组蛋白HBc-N144-NspA结构形态检测 |
| 3.6 免疫小鼠以及采集标本 |
| 3.7 HBc-N144-NspA疫苗免疫活性检测 |
| 3.8 HBc-N144-NspA/F、HBc-N144-NspA以及rNspA免疫安全性分析 |
| 3.9 统计学处理 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 rNspA,HBc-N144,HBc-N144-NspA的表达、纯化及Westernblot鉴定 |
| 4.2 HBc-N144, HBc-N144-Nsp A结构特性检测 |
| 4.3 rNsp A/F, HBc-N144-Nsp A/F以及HBc-N144-Nsp A组疫苗的免疫活性 |
| 4.4 疫苗的免疫保护效果 |
| 4.5 疫苗免疫小鼠血清体外杀菌活性(serum bactericidal activity,SBA) |
| 4.6 免疫安全性评估 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 纳米佐剂在疫苗研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 作者攻读学位期间的科研成果 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
四、IRIVs:具有免疫增强作用的重组流感病毒体（论文参考文献）
- [1]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [2]新型疫苗佐剂的研究进展[J]. 曾振,王海宁,张志芳,易咏竹. 生物工程学报, 2021(01)
- [3]流感疫苗佐剂现状及发展[J]. 年悬悬,张家友,杨晓明. 中华微生物学和免疫学杂志, 2020(05)
- [4]脂质纳米粒在疫苗递送中的应用[J]. 汪灿,王汀. 中国药剂学杂志, 2020(03)
- [5]寨卡病毒EDⅢ亚单位疫苗的有效佐剂筛选以及非中和性表位的探讨[D]. 王心怡. 东南大学, 2020(01)
- [6]纳尔逊海湾正呼肠孤病毒复制对细胞自噬的影响及相关非结构蛋白研究[D]. 陶晓莉. 中国医科大学, 2020(01)
- [7]流感疫苗新型佐剂的研究进展[J]. 李宗霖,廖国阳. 中国生物制品学杂志, 2020(04)
- [8]脂质载体用作黏膜疫苗佐剂-传递系统[J]. 陈敏囡,邱昌露,王汀,王宁. 中国药剂学杂志(网络版), 2019(03)
- [9]H3N2犬流感病毒M1蛋白胞内抗体的制备及活性研究[D]. 余晓颖. 吉林农业大学, 2019(03)
- [10]乙肝核心蛋白嵌合奈瑟菌表面蛋白A重组蛋白疫苗免疫效果研究[D]. 侯永利. 南华大学, 2019(01)