一、评价早期肺缺血再灌注损伤敏感性的细胞因子探讨（论文文献综述）
杨一柳[1]（2021）在《缺血预处理联合右美托咪定对肢体缺血再灌注患者肺功能的影响》文中研究指明目的本研究旨在探讨缺血预处理联合右美托咪定对肢体缺血再灌注患者肺功能的影响。方法选择择期在腰硬联合麻醉下行下肢手术需要上止血带的患者75例,年龄50～89岁,BMI<40kg/m2,ASA分级Ⅱ或Ⅲ级,止血带总时间为60～150min,将患者按随机数字表法分成四组:对照组（C组）、缺血预处理组（IP组）、右美托咪定组（D组）和缺血预处理联合右美托咪定组（IPD组）。所有患者均于L2-3或L3-4间隙行腰硬联合阻滞,整个研究过程控制感觉阻滞平面在T8以下,IP组在手术前24h上肢绑止血带并充气至200mmHg,持续5min,放气5min,如此重复3个循环。D组麻醉后先静脉输注负荷量右美托咪定0.5μg?kg-1（15min输注完毕）,然后以0.5μg?kg-1?h-1的速率静脉输注至术毕。IPD组右美托咪定与缺血预处理联合应用,方法同IP组、D组。对照组给予与D组相同速度和容量的生理盐水。记录四组患者上止血带前（T0）和止血带松开后（T1）以及术后24h（T2）的平均动脉压（MAP）、心率（HR）。分别于T0、T1行动脉血气分析,记录pH值、动脉血氧分压（Pa O2）、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）和乳酸（Lac）浓度;计算Pa O2/Fi O2、肺泡-动脉血氧分压差(PA-aDO2)及呼吸指数（RI）;并测定血清中Clara细胞分泌蛋白16（CC16）和丙二醛（MDA）水平。观察并记录患者围术期不良反应发生情况以及术后有无肺功能损伤临床表现。结果1四组病人年龄、性别、身高、BMI、吸烟情况及止血带时间比较差异无统计学意义（P>0.05）。2四组患者不同时点血流动力学参数的比较:与C组相比,D组和IPD组T1时HR降低（P<0.05）,T1～T2时MAP比较差异无统计学意义（P>0.05）,IP组T0～T2时HR及MAP比较差异无统计学意义（P>0.05）。3四组患者不同时间点血气分析参数的比较:与T0时相比,4组T1时pH值降低,Lac升高差异有统计学意义（P<0.05）;与C组比较,D组和IPD组T1时Pa CO2升高（P<0.05）,IP组和IPD组T1时Pa O2和Pa O2/Fi O2升高,RI降低（P<0.05）,IP组T1时Lac降低（P<0.05）;与IP组比较,D组T1时Pa O2和Pa O2/Fi O2降低,差异有统计学意义（P<0.05）。4四组患者血清CC16和MDA的浓度的比较:与T0时比较,C组T1时CC16和MDA增加,IP组和IPD组T1时MDA降低（P<0.05）。与C组比较,IP组、D组和IPD组T1时CC16和MDA降低（P<0.05）,差异有统计学意义。5四组患者围术期高血压、心动过缓、恶心呕吐和咳嗽咳痰等不良反应发生率比较差异无统计学意义（P>0.05）。6四组患者术后均未出现新发的咳嗽或（和）咳痰、非正常的呼吸音、体温≥38℃、胸片提示肺膨胀不全或肺炎等肺功能损伤的临床表现。结论缺血预处理、右美托咪定均可减轻脂质过氧化反应与抑制CC16分泌,对肢体缺血再灌注患者产生肺保护作用,但二者联合与单独应用效果并不明显。
李晨[2]（2021）在《电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用》文中指出目的 基于“中医治未病”思想及“心胸内关谋”经典理论,在前期研究基础上,以心肌缺血再灌注损伤模型大鼠为研究对象,从细胞凋亡、细胞焦亡以及细胞自噬的角度出发,观察电针“内关”“足三里”“关元”穴预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其作用机制。并借用FXR/SHP凋亡信号通路激动剂GW4064及抑制剂Z-guggulsterone从FXR/SHP信号转导通路的角度探讨其作用机制,以及细胞凋亡、焦亡和自噬的联系,为电针预处理防治MIRI提供新的理论依据和治疗靶点。方法 一理论探讨:以中医学和现代医学理论为基础,从心肌细胞焦亡、自噬及凋亡角度出发,探讨电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其机制;从FXR/SHP凋亡信号通路的角度出发,探讨FXR/SHP通路对心肌细胞凋亡、焦亡以及自噬的影响及其作用机制,以及三者间的联系。二动物实验:将Wistar大鼠80只（雄性,SPF级）按照“随机数字表法”进行随机分组,平均分为4组,分别是:正常组（N组）、假手术组（S组）、模型组（M组）和电针预处理组（EA组）,20只为一组。所有实验动物适应性喂养1周后,开始正式实验。通过左侧冠状动脉结扎法制备MIRI大鼠模型,每组大鼠给予相应的干预措施。再增加40只Wistar大鼠（雄性,SPF级）,随机分为2组,每组20只,分别为电针+GW4064激动剂组（EA+GW组）和电针+z-Guggulsterone抑制剂组（EA+Z组）,每组大鼠给予相应的干预措施。实验1:采用HE染色观察各组心肌组织的形态结构;采用TTC染色测量各组心肌梗死面积和心肌梗死质量;采用TUNEL染色计算各组心肌细胞凋亡指数,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法（ELISA法）进行各组心肌损伤标志物（LDH、CK和c Tn I）的测定;从而探讨电针预处理对MIRI大鼠的保护作用。实验2:采用Western-blot法检测各组NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白等焦亡相关指标的表达,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞焦亡通路的调节作用实验3:采用Western-blot法检测各组Beclin1、LC3I、LC3Ⅱ蛋白表达以及LC3Ⅱ/LC3I比值,研究电针预处理对心肌细胞的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞自噬通路的调节作用。实验4:采用Western-blot法检测各组Bcl-2、Bax蛋白表达,同时用荧光定量PCR法检测各组Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,研究电针预处理对MIRI大鼠模型的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞凋亡通路的调节作用。实验5:采用TUNEL染色法计算各组心肌细胞凋亡指数,采用荧光定量PCR法检测凋亡相关指标FXRm RNA、SHPm RNA表达,采用Western-blot法检测各组凋亡相关指标Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达,焦亡相关指标Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达以及自噬相关指标Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,探讨电针预处理对MIRI模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响,以及FXR/SHP信号通路对细胞凋亡、焦亡、自噬的影响及三者间的联系。结果 实验1电针预处理对MIRI大鼠心肌损伤标志物、心肌细胞凋亡指数及形态学影响（1）HE染色:光镜下观察与比较各组大鼠心肌细胞形态学结果如下:N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。（2）心肌梗死面积:与N组相比较,S组梗死面积变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死面积显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死面积显着减小（P<0.01）。（3）心肌梗死质量;与N组相比较,S组梗死质量变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死质量显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死质量显着减小（P<0.01）。（4）心肌细胞凋亡指数:N组和S组心肌组织中,可见极少量凋亡细胞核,M组中存在大量凋亡细胞,细胞核形态不规则,成碎片状,EA组可见少量凋亡细胞核。与N组和S组比较,M组心肌细胞凋亡指数明显上升（P<0.01）,与M组比较,EA组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.01）。（5）血清LDH、CK、c Tn I含量:与N组相比较,S组血清LDH、CK、c Tn I含量变化不大,差异均无统计学意义（均P>0.05）;与N组比较,M组、EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均上调（均P<0.01）,EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均低于M组（均P<0.01）。实验2电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠焦亡通路的调控作用（1）心肌组织NLRP3、ASC蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的NLRP3、ASC蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组NLRP3、ASC蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。（2）心肌组织Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。实验3电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠自噬通路的调控作用（1）心肌组织Beclin-1蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Beclin-1蛋白表达明显升高（P<0.05）,与M组相比,EA组Beclin-1蛋白表达明显降低（P<0.05）。（2）心肌组织LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（P<0.05）。实验4电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠细胞凋亡的影响（1）心肌组织Bcl-2蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）。与M组比较,EA组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。（2）心肌组织Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组和EA组Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达显着升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组的Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。实验5电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响（1）心肌细胞凋亡指数:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数均明显降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.05）,EA+GW组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）。（2）心肌组织FXRm RNA、SHPm RNA表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组及EA+GW组大鼠心肌细胞FXRm RNA、SHPm RNA表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组的FXRm RNA、SHPm RNA表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组FXR、SHPm RNA表达水平显着降低（P<0.05）,EA+GW组FXR、SHPm RNA表达水平明显升高（P<0.05）。（3）心肌组织Bcl-2、Bax、Caspases-3蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GM组及EA+Z组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显着升高（均P<0.05）。与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Bcl-2蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,EA+GW组Bax、Caspases-3蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。（4）心肌组织Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。（5）心肌组织Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组大鼠心肌细胞Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。结论 1.电针预处理能使MIRI模型大鼠心肌梗死面积及梗死程度明显下降,降低凋亡指数,病理形态学检测提示电针可显着改善受损心肌组织的病理损害程度。2.电针预处理能下调MIRI模型大鼠血清中LDH、CK及c Tn I的含量,保护大鼠心肌组织。3.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达,通过抑制细胞焦亡,保护心肌组织。4.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值过度升高,通过抑制细胞过度自噬,保护心肌组织。5.电针预处理能下调MIRI模型大鼠Bax蛋白表达、Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,上调Bcl-2蛋白表达,通过抑制细胞凋亡,保护心肌组织。6.电针预处理能通过抑制FXR/SHP凋亡信号通路从而抑制心肌细胞凋亡,抑制凋亡,能起到抑制细胞焦亡和抑制细胞过度自噬的作用,从该角度探讨三者间的联系,进一步说明电针预处理对MIRI的保护机制可能是多层次、多途径的综合效应。
杜鹃[3]（2021）在《CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究》文中提出1 研究背景急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）是以肾滤过功能快速丧失为特点的临床综合征,表现为尿素氮、肌酐等代谢产物的蓄积和/或尿量的减少,其病理特点主要为急性肾小管坏死。研究发现住院患者的发生率约为2-21%,其在社区医院发病率约为2%,而在大型医院发病率可达20%,重症监护病房（Intensive care unit,ICU）的发病率可达50%以上。AKI导致死亡率增加,住院时间延长,以及慢性肾病（Chronic kidney disease,CKD）的发病率增加。总之,AKI给公共卫生及社会资源带来巨大的压力,成为严重的健康问题。传统与新发现的肾病生物学标志物,如血尿素氮、血肌酐、尿NGAL、KIM-1及TIMP2-IGFBP7乘积等,可协助进行AKI的预测和诊断。但它们都仅仅指向预测肾功能降低或肾损伤的发生,缺乏预测肾功能恢复的能力。患者肾损伤的持续时间及肾功能转归可显着影响患者远期预后,因此,早期预测、识别患者的恢复表型,及早干预,促进肾功能早期恢复、改变恢复表型,或能显着改善AKI患者的预后。在预测肾功能恢复的生物学标志物方面,存在较大空白。目前临床亟需理想的生物标志物预测AKI肾功能的转归。外泌体是由细胞分泌的直径为30-150nm的微小囊泡,其中包含完整的膜蛋白（尤其是糖蛋白）、外周膜蛋白、胞质、核蛋白以及细胞内组分,如miRNA,mRNA和代谢产物。同时外泌体通过受体与配体的相互作用,与靶细胞膜的附着/融合或被受体细胞内化,来进行细胞间通讯以及蛋白质和核酸的细胞间交换,从而发挥细胞间信使的作用,参与增殖、凋亡、免疫、凝血等多种生理及病理过程。尿液外泌体主要起源于肾单位管腔和泌尿道内衬的细胞,循环外泌体难以穿过肾小球滤过膜。多项研究发现,尿液外泌体RNA,miRNA和蛋白质可以较尿液其他生化成分更早的反映肾脏疾病中基因表达的变化。尿液外泌体有望成为一种有效且非侵入性的肾脏疾病生物标记物。同时,临床前研究提示外源性外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进修复,提示外泌体可能直接参与肾脏损伤与修复过程。因此,较其他尿液中的分子,外泌体更及时、更直接地体现肾脏细胞的病理生理状态,在预测预后方面更具有优势。CD26,又称为二肽基肽酶 Ⅳ（Dipeptidyl-peptidase 4,DPP4）,是广泛表达于多种细胞表面的一种糖蛋白,可以裂解多种底物的N端二肽基,包括神经肽、肽激素、血管活性肽、趋化因子以及一些生长因子和细胞因子。另外CD26是多功能蛋白,除蛋白水解作用外,以多种方式发挥多种促增殖、免疫和炎症调节等作用。但CD26在AKI中的作用仍待阐明。最近的一项蛋白组学研究发现,与其他尿液及血清蛋白相比,尿CD26在AKI后发生显着变化,推荐尿CD26,尤其尿细胞外囊泡的CD26,为AKI候选生物标志物,值得进一步研究。多项尿液外泌体的组学研究也发现尿液外泌体富含CD26,主要由CD26表达极为丰富的远端肾小管上皮细胞及其他肾脏细胞所释放。尿液中外泌体结合CD26较尿液游离CD26更具有肾脏特异性,且已证实与外泌体结合是尿CD26的主要存在形式,因此,尿外泌体CD26可能对肾功能转归的预测更具有优势。综上,与AKI的早期预测相比,预测肾功能转归的生物标志物仍有较大空白,为临床所亟需。尿外泌体有可能成为新的肾损伤、肾功能转归预测的生物标志物,尿外泌体CD26能否作为AKI的预后标志物有待进一步研究。2目的（1）比较重症AKI患者与重症非AKI患者之间尿外泌体CD26水平的变化,探索尿外泌体CD26是否与AKI相关;（2）探讨尿外泌体CD26是否与AKI分期相关;（3）探讨尿外泌体CD26是否与90天内主要肾脏不良事件相关;（4）（4）探讨尿外泌体CD26是否与AKI肾功能恢复相关;（5）探讨尿外泌体CD26对AKI肾脏功能恢复的预测价值。3方法3.1研究设计该研究为单中心前瞻队列观察性研究。我们同时也收取了入住ICU的非AKI患者作为对照,首先比较两组间尿外泌体CD26表达的差异,以探讨尿外泌体CD26表达与AKI发生是否相关,并通过多元线性回归分析各临床因素对尿外泌体CD26表达有无影响。在AKI患者中按CD26+尿外泌体比率分为CD26高表达和低表达组,首先通过双向比较研究尿外泌体CD26与AKI分期、住院死亡率的关系,继而用生存分析的方法比较尿外泌体CD26表达的高/低与90天内主要肾脏不良事件（MAKE）的关系。其中MAKE包含3个成分,即死亡、接受肾脏替代治疗及肾功能持续恶化,对3个终点和组合终点分别进行分析及检验。应用同样的方法分析尿外泌体CD26表达水平与28天内肾功能恢复的关系,并进一步应用Cox回归分析进行多因素分析;进而在AKI存活者中对3个肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复）进行分析,通过单因素和多因素分析验证尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复和院内肾功能恢复之间的关系。最后,在AKI存活者中检验尿外泌体CD26对早期肾功能恢复,出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测价值,并进行亚组分析。3.2研究对象研究连续纳入2017年1月至2018年1月入住山东大学齐鲁医院ICU,符合AKI诊断的成年患者,构成研究队列。AKI的诊断按照2012 KIDIGO指南推荐的诊断标准。排除标准为:（1）无尿;（2）严重的尿路感染;（3）泌尿系结石或肿瘤;（4）既往应用CD26/DPP4抑制剂;（5）患者或法定代表人拒绝。对照组的患者通过连续筛查2017年1月-2017年3月入住ICU的不符合AKI诊断标准的成年重症患者。排除标准同AKI组。入选患者均按照2012 KIDIGO指南的推荐进行治疗。3.3临床资料的采集采集患者的一般情况,包括:性别,年龄,身高、体重;采集患者的慢性病史及急性合并症;采集患者用药史;生命体征;采集入住ICU 24h内的Scr、尿量,及血常规、血生化、肝功能等数值。计算入住ICU第一天的APACHEII评分及非肾脏APACHE II。3.4临床终点的定义及随访本研究定义的主要终点是90天主要肾脏不良事件（MAKE）,包含:死亡、接受肾脏替代治疗（RRT）和持续肾功能恶化（较入组时肌酐≥200%）。次要终点为肾功能恢复。肾功能恢复的定义为不再符合AKI和CKD的任何一条诊断标准。肾功能恢复终点包含:早期肾功能恢复（7天内）,出院肾功能恢复（出院时处于肾功能恢复状态）和院内肾功能恢复（住院期间发生过肾功能恢复）。随访患者至90天,随访其存活与否,有无接受肾脏替代治疗（RRT）及肌酐数值等。若发生以上事件,记录事件发生的时间,以进行分析。3.5标本采集及保存入组患者在入住ICU的24小时内留取新鲜尿液15ml。常温下,以300g转速离心10min,弃沉渣,取上清,放入-80℃冰箱备用。3.6外泌体分离纯化通过差速超速离心法对尿液标本中的外泌体进行分离和纯化。3.7电镜观察外泌体显微结构样品前处理后,透射电镜观察AKI患者尿液外泌体的超微表征。3.8检测外泌体特征性蛋白利用Western blot及流式细胞术检测外泌体特征性蛋白。3.9乳胶微球辅助的流式细胞术检测尿液外泌体中CD26醛/硫酸盐乳胶微球吸附分离提纯的尿液外泌体,荧光素标记的流式抗体孵育结合的乳胶微球,流式细胞仪检测CD26阳性的尿液外泌体的阳性率。3.10统计学方法对采集的临床资料及检验数据,连续变量用中位数及四分位间距描述,分类变量的描述为病例数（n）和百分比（%）。对于连续变量,采用Student’s t-test检验用于呈正态分布的数据比较,Mann-Whitney检验和Kolmogorov-Smirnov检验用于呈非正态分布的数据比较。对于分类变量,用Pearson’s chi-squared检验进行数据间的比较。首先对AKI组和对照组间进行CD26+尿外泌体比率进行比较,探讨在AKI发生时尿外泌体CD26表达是否发生改变。进而纳入所有患者,以CD26+尿外泌体比率为因变量,纳入临床因素为自变量,进行相关及多元线性回归分析,来除外各临床因素对尿外泌体CD26表达的影响。为研究尿外泌体CD26与90天内MAKE及28天内肾功能恢复间的关系,我们应用类似生存分析KM曲线的方法,并对28天内肾功能恢复应用Cox进行多元回归分析,探讨其独立影响因素。在AKI存活者中进行双向比较,按临床终点分类（早期肾功能恢复/早期肾功能未恢复,出院肾功能恢复/出院肾功能未恢复,院内肾功能恢复/无院内肾功能恢复）,比较两个结局间CD26+尿外泌体比率;分别应用单因素和多因素的方法研究尿外泌体CD26与三个AKI肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复、院内肾功能恢复）的关系。单因素分析将尿外泌体CD26表达水平与三个肾功能恢复终点分别进行单因素chi-squared检验,多因素分析分别以三个肾功能恢复终点为因变量,自变量纳入尿外泌体CD26表达水平和各临床因素进行多元Logistic回归分析。最后进行敏感性分析,在AKI存活者中,通过制作ROC曲线,研究尿外泌体CD26对三个肾功能恢复终点的预测能力,并分亚组进行分析。以上分析,生存分析和ROC曲线应用GraphPad Prism 8进行分析,余统计过程均应用SPSS 17.0进行。4 结果4.1研究对象纳入研究对象为山东大学齐鲁医院重症医学科住院的成年患者,共入组AKI队列133人,非AKI对照组68人。4.2提取的外泌体形态与大小应用透射电镜和动态光散射测量结果显示提取的尿液外泌体形态与大小符合文献报道的经典外泌体特征,不含细胞碎片、微粒等其他细胞成分,可以用于下一步检测。4.3提取的外泌体生物标志物Western blot与流式细胞检测术显示 CD63,CD81,GRP94,Calnexin,CD61以及TSG101在所提取的外泌体中表达丰富。4.4 AKI队列与对照组临床特征及尿外泌体CD26的比较基线特征进行比较:两组间年龄、性别、非肾脏APACHEII评分匹配。AKI组住院死亡率显着增高。两组间住院时间和住ICU时间相比较,均无明显差异。AKI组CD26+尿外泌体比率显着低于对照组,6.4%（1.2%-22.0%）vs.23.9%,（6.6%-64.5%）;p<0.001。4.5尿外泌体CD26与临床指标的相关性分析CD26+尿外泌体比率与非肾脏APACHE II评分、糖尿病、慢性肾病（CKD）及AKI呈负相关,与外科术后呈正相关,与余临床指标不相关。多元线性相关分析显示,仅AKI与CD26+尿外泌体比率独立相关adjusted β=-15.95（-23.60,-8.29）,p<0.001。4.6尿外泌体CD26表达高/低两组间临床特点的比较以中位数为界值,定义CD26+尿外泌体比率≥6.4%为尿外泌体CD26高表达（n=67）,CD26+尿外泌体比率<6.4%为尿外泌体CD26低表达（n=66）。尿外泌体高表达和低表达组之间进行临床特点的比较,显示两组间年龄、性别、APACHEII评分及非肾脏APACHE II评分相匹配。比较两组间住院时间、住ICU时间及住院死亡率无显着性差异。高表达组院内接受RRT比率显着低表达组（p=0.016）,早期肾功能恢复、院内肾功能恢复显着高于低表达组（p<0.05）,而出院肾功能恢复率无显着性差异。4.7尿外泌体CD26表达与AKI分期之间的关系尿外泌体CD26表达高/低两组间比较AKI 3个分期的构成,结果显示无统计学差异（p=0.084）。将CD26+尿外泌体比率作为连续变量,在AKI 3个分期间进行比较,两两比较各组无差异。因此,尿外泌体CD26与AKI的分期无显着性关系。提示,尿外泌体CD26表达与肾损伤的严重程度无关。4.8尿外泌体CD26表达与AKI患者预后的关系4.8.1尿外泌体CD26与MAKE 90的关系针对复合终点MAKE的组成成分逐一进行分析。为分析尿外泌体CD26与死亡终点的关系,首先在出院存活与死亡患者间比较CD26+尿外泌体比率无显着性差异。尿外泌体CD26表达高/低两组间比较住院死亡率无显着差异。最后在高表达组和低表达组间比较90天死亡率,Kaplan-Meier分析显示CD26高表达组与CD26低表达组90天死亡率无显着差异（p=0.907）。以上结果提示,尿外泌体CD26与近期死亡无关。对MAKE的另一成分——接受RRT治疗,与尿外泌体CD26的关系进行分析。CD26高表达组较低表达组院内应用RRT的比率显着降低（p=0.016）。KM分析显示,CD26高表达组90天内接受RRT比率显着低于低水平组（p=0.013）。提示,CD26高表达预示90天内RRT应用风险较低。对MAKE的最后一个成分——持续肾功能恶化进行分析。KM分析显示,90天内持续肾功能恶化在两组间无统计学差异（p=0.717）。对复合终点MAKE进行分析,CD26高表达组90天内MAKE的发生率显着低于CD26低表达组,具有统计学差异（p=0.018）,主要是RRT应用这一结局的影响。提示,尿外泌体CD26高表达预示近期内MAKE发生风险较低,较好的肾脏相关预后。4.8.2尿外泌体CD26与肾功能恢复的关系4.8.2.1尿外泌体CD26与28天内肾功能恢复的关系Kaplan-Meier分析比较AKI患者尿外泌体CD26高/低表达组间28天内肾功能恢复发生率,结果显示高表达组28天内肾恢复率显着高于CD26低表达组（p<0.001）。进一步的多因素Cox回归分析,尿外泌体CD26 表达水平进入方程（HR,1.90;95%CI,1.15-3.14;p=0.012）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进AKI肾功能恢复。4.8.2.2 AKI存活者中尿外泌体CD26与肾功能恢复终点的关系AKI组81名存活者,依据3个肾功能结局进行分组,分别为早期肾功能恢复组/早期肾功能未恢复组、出院肾功能恢复组/出院肾功能未恢复组、院内恢复组/院内肾功能未恢复组,分别比较3组CD26+尿外泌体比率,显示各良好结局组CD26+尿外泌体比率均显着高于不良结局组（p<0.05）。在CD26表达高/低两组间比较肾功能早期恢复的差异,高表达组29（72.5%）例患者早期恢复,而低表达组仅有15（3 6.6%）例患者早期恢复,卡方检验显示两组间早期肾功能恢复存在显着差异（OR=4.57,p=0.001）。逐步多元Logistic回归分析显示,早期肾功能恢复与AKI分期及尿外泌体CD26表达水平独立相关（OR=4.67,p=0.007）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进早期肾功能恢复的因素。在CD26高/低表达两组间比较肾功能出院恢复的差异,高表达组34（85.0%）名患者出院恢复,而低表达组有23（56.1%）名患者出院恢复,卡方检验显示两组间出院肾功能恢复存在显着差异（OR=4.44,p=0.004）。以出院肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期和尿外泌体CD26表达水平（OR=3.50,p=0.039）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进出院肾功能恢复的因素。在CD26表达高/低两组间比较院内肾功能恢复,高表达组35（87.5%）例患者院内肾功能恢复,低表达组有23（56.1%）例患者在院期间肾功能恢复,存在显着差异（OR=5.48,p=0.002）。以院内肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期以及CD26表达水平（OR=4.66,p=0.019）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进院内肾功能恢复。4.8.3尿外泌体CD26对肾功能恢复终点的预测价值CD26+尿外泌体比率在AKI存活者中分别预测早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复,经ROC方法检测仅对早期肾功能恢复的预测具有统计学意义,曲线下面积（AUROC）为0.65（0.53-0.77）,p=0.021。对于出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测不能达到统计学意义。利用预测早期肾功能恢复的ROC曲线选取曲线上最佳截断值,为6.8%。利用该值计算尿外泌体CD26对3个肾功能恢复终点的预测能力,显示其对出院肾功能恢复和院内肾功能恢复有较高的特异性和阳性预测值。分析显示,大于此截断值的患者其中90%的患者将在院期间发生肾功能恢复。提示,尿外泌体CD26对肾功能转归的预测具有一定的临床应用价值。进一步在亚组中检测尿外泌体对3个肾功能恢复终点的预测能力。因为脓毒症是AKI最重要的病因,按是否合并脓毒症分类后,显示在非脓毒症相关AKI的患者中尿外泌体CD26的预测价值显着提高,预测早期肾功能恢复:AUROC=0.71,p=0.046;预测出院肾功能恢复:AUROC=0.79,p=0.009;预测院内肾功能恢复:AUROC=0.83,p=0.003。提示,在非脓毒症相关AKI患者,尿外泌体CD26对肾功能恢复有较强的预测价值,值得进一步研究。5结论（1）尿外泌体CD26表达的降低与重症患者AKI的发生相关,但尿外泌体CD26表达水平与AKI肾损伤的严重程度不相关;（2）尿外泌体CD26与近期死亡率不相关,但尿外泌体CD26与90天内主要肾脏不良事件发生率相关,尿外泌体CD26高表达预示着较低的90天内主要肾脏不良事件发生风险;（3）尿外泌体CD26与肾功能恢复独立相关,尿外泌体CD26高表达可预测AKI早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复。利用尿外泌体CD26早期预测肾功能转归,实现个体化精准治疗,以期能改善患者的长期预后。1 研究背景急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是住院患者尤其重症患者的严重并发症,除导致住院死亡率显着升高外,会导致长期死亡率升高和慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）及终末期肾病的发病率增加,造成沉重的疾病负担。目前对于AKI尚无有效的预防或治疗措施,仍为支持治疗。外泌体是一种细胞外囊泡,广泛存在于各种体液中。其脂质双分子层携带来源细胞的蛋白及核酸的结构使其作为一种细胞间信使,通过与受体细胞结合,广泛参与各种生理及病理过程的调节。外泌体作为疾病诊断和预后标志物越来越受到重视,已发现数种外泌体蛋白及RNAs与AKI有关。晚近的几项研究发现,外源性的外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进肾功能恢复,但其作用机制及关键分子尚不清楚。论文I的研究发现,与对照组相比,AKI患者尿外泌体CD26表达显着降低;而AKI患者队列内部,尿外泌体CD26高表达组比低表达组有更高的出院肾功能恢复率;经过校正性别、年龄、慢性合并症、急性病因、危重程度、AKI分期之后,尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复等肾脏预后仍有独立的关联。因肾小球滤过膜的存在,尿外泌体较少来自于循环,肾脏细胞是尿外泌体的主要来源。由此我们推断表达CD26的肾脏细胞来源的外泌体可能有减轻肾脏损伤、促进肾脏修复的功能。CD26是细胞表面的跨膜糖蛋白,通常也被称作Dipeptidyl peptidase-4（DPP4）。其具备丝氨酸蛋白酶活性,广泛表达于多种类型的细胞中,在肾脏其表达于肾小球足细胞的基底膜,并高度表达于远端肾小管上皮细胞（TEC）的刷状缘微绒毛。研究发现CD26与细胞增殖、炎症调节等过程相关。TEC的再生是AKI修复的主要环节,研究发现CD26有促进细胞增殖的作用。并且CD26参与炎症反应的调节,其底物包含一些系列趋化性细胞因子。AKI主要病理过程发生于TEC,尤其远端TEC的损伤、坏死或凋亡,进而炎症细胞浸润、间质炎症反应的发生。肾脏修复主要过程为TEC的增生,替代丧失的TEC、修复肾小管上皮组织,炎症反应参与调控这一过程。良好的增生和调控,导致完全的修复和肾功能的恢复;反之则导致纤维化的加重,最终导致CKD。因此,我们假设CD26+外泌体可能通过促进TEC增生,抑制炎症反应,减轻纤维化,减轻肾损伤、促进肾脏修复。由此,我们拟通过体外培养小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1,通过体外模拟AKI的主要致病过程缺血再灌注（ischemia/reperfusion injury,IR）,获取培养基上清中的生理外泌体（ExoNormal）,IR程序获取ExoIR,探索生理与IR条件下尿液中CD26的表达。过表达CD26腺病毒载转染TCMK1,构建TEC来源的CD267过表达的外泌体（ExoCD26）;利用手术构建IR相关的AKI小鼠动物模型,进一步利用外泌体进行干预,通过与对照组在肾脏功能、组织病理及增生、炎症等指标对照间的比较,探讨CD26+外泌体对AKI肾脏修复的影响,及其可能的机制。2 目的（1）体外实验中探讨缺血再灌注对肾小管上皮细胞（TEC）外泌体中CD26表达的影响;（2）利用CD26过表达的腺病毒载体转染肾小管上皮细胞,构建CD26过表达的TEC外泌体;（3）IR-AKI动物体内,示踪TEC外泌体能否被肾脏细胞摄取;（4）通过体内实验,探讨CD26过表达外泌体能否减轻肾损伤、促进肾脏修复,并探讨其可能的机制。3方法3.1细胞培养及病毒转染TCMKI细胞分别常规培养及缺血缺氧程序培养,两种培养条件下的细胞均按标准程序转染CD26过表达腺病毒与空载体。留取细胞培养基上清。3.2外泌体分离纯化及表达鉴定用超速差速离心法提取TCMK-1小鼠肾小管细胞上清中的外泌体。分别对常规培养细胞释放的外泌体ExoNormal,缺氧培养细胞释放的外泌体ExoIR,正常培养条件下CD26转染后细胞释放外泌体ExoCD26,及缺氧培养并转染的细胞释放的外泌体ExoIR+CD26,分别进行CD26表达的检测。外泌体与抗CD26抗体和荧光素结合的二抗充分反应后,加入流式细胞分析。3.3 AKI（IR）动物模型的建立C57BI/6雄性成年小鼠（8周）,戊巴比妥麻醉后,显微镜下,一侧肾蒂紧密结扎后,将肾脏切除;对侧肾动脉用动脉夹夹闭,观察肾脏变色,呈缺血改变,覆盖湿润纱布,夹闭30分钟。3.4外泌体的体内示踪避光条件下操作,使用PKH26标记外泌体,经尾静脉注入IR小鼠体内;分别于注射15分钟、2小时及12小时在麻醉下取肾脏组织;OCT包埋组织块,制成冰冻切片;切片经双蒸水水化、PBS清洗后,应用BSA终止反应;加入AQP1一抗,4度湿盒孵育过夜后,PBS清洗,加入荧光素偶联的AQP1二抗,37℃孵育30分钟,PBS清洗,DAPI染色、封片,即刻荧光显微镜下观察。3.5 IR小鼠干预措施及分组分为对照组,IR+BSA 组,IR+ExoNormal 组,1IR+ExoIR组,IR+ExoCD26组,每组各10只;对照组不做肾脏处理,余操作同IR手术各组;IR各组于手术后12h分别经尾静脉注入等蛋白质量的BSA,ExoNormal,ExoIR及ExoCD26进行干预。3.6 肾功能指标检测干预后72h,取血样。各血样离心后,保存血清。分别应用尿素氮和肌酐试剂盒进行检测,以得出尿素氮和肌酐的浓度数值。3.7 肾脏组织病理学检测干预后72h,进行肾脏取材。各肾脏组织分别进行HE染色和PAS染色,显示肾小管上皮损伤情况,并用半定量的方法,在各组间进行比较。3.8 肾脏增殖指标的检测免疫荧光技术检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）在各组肾脏的表达;Western blot的方法检测p21和p53在肾脏的表达。3.9 肾脏炎症指标的检测免疫荧光技术分别应用抗MOMA2抗体、抗neutrophil抗体及抗CXCR4抗体显示巨噬细胞、中性粒细胞在肾脏的浸润和趋化性细胞受体CXCR4在肾脏的表达。并应用Western blot的方法检测趋化性细胞因子SDF-1（CXCR4的配体）在肾脏的分布。3.10肾脏纤维化指标的检测Western blot的方法测定1型胶原在各组肾脏中的表达。4 结果4.1 外泌体鉴定电镜下可见纯化成分为双凹圆盘状的高电子密度囊泡,大多直径位于30-150nm;使用动态光散射技术检测微粒的粒径大小,结果提示分离纯化的囊泡直径呈单峰分布,平均直径在30-100nm左右。结果提示,使用经典的超速差速离心方法获得的为典型的外泌体囊泡,可用于下一步功能试验。4.2外泌体中CD26表达分析流式细胞分析显示,生理条件下TCMK-1细胞培养液上清中分离纯化的外泌体ExoNormal中CD26表达量较少,经过IR程序的TCMK-1细胞上清外泌体ExoIR中CD26表达轻度增加。分别向TCMK-1细胞系（常规条件培养）转染空载体病毒Vector和过表达CD26的病毒（VirusCD2）。病毒转染后,细胞系培养液上清分离纯化外泌体,流式测得该外泌体高度表达CD26,阳性率大于70%,即ExoCD26。同样方法转染缺氧条件下培养的TCMK-1细胞系,从细胞培养液上清采集的外泌体（ExoIR+CD26）,也高度表达CD26,与ExoCD26相似。各组外泌体进行western blot检测,显示ExoNormal对CD26的表达均少,ExoIR对CD26的表达较ExoNormal轻度增加;常规培养的细胞系转染VirusCD26后释放的外泌体（ExoCD26）对CD26表达显着增加;缺氧条件下培养的细胞系,转染VirusCD26后,其外泌体（ExoIR+CD26）对CD26的表达也显着增加,与ExoCD26无明显差异。4.3 AKI动物模型的鉴定经过一侧肾动脉钳夹,对侧肾脏切除,72h后小鼠血尿素氮、肌酐显着升高,肾脏组织出现IR病理学改变,证实AKI造模成功。4.4动物体内外泌体示踪PKH26标记的外泌体通过尾静脉注入IR小鼠体内,2h后取材,制冰冻切片,荧光标记AQP1。显示肾小管上皮细胞内可见外泌体荧光标记,肾脏其他类型细胞内未见外泌体荧光标记。提示,肾小管上皮细胞（TEC）来源的外泌体选择性的被TEC所摄取。4.5外泌体对肾脏功能指标的影响IR小鼠血清尿素尿素氮及肌酐水平显着增高:与BSA相比,ExoNormal及ExoIR对肾功能指标无影响,而ExoCD26显着降低了血清尿素氮和肌酐水平。4.6外泌体对肾脏组织损伤的影响HE染色及PAS染色显示,IR小鼠肾脏出现明显损伤,包含肾小管扩张,刷状缘缺失,肾小管上皮细胞的坏死,管型的形成等;与BSA相比,ExoNomal及ExoIR未能减轻肾脏损伤,而ExoCD26显着降低了肾损伤评分和损伤肾小管分数,减轻了肾脏组织损伤。4.7外泌体对TECs增生的影响免疫荧光染色示,IR小鼠肾脏增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）显着降低;与 BSA 相比,ExoNormal 及 ExoIR 未能增加PCNA的表达,而ExoCD26显着增加了 PCNA的表达,PCNA沿肾小管分布。此外,IR小鼠肾脏p21和p53表达显着升高,提示细胞分裂增生的阻滞;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能降低p21和p53的表达,但ExoCD26显着降低了两者的表达。以上结果提示,ExoCD26促进了 TECs细胞的增生。4.8外泌体对肾脏炎症反应的影响免疫荧光显示,IR肾脏中性粒细胞、巨噬细胞浸润显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着降低中性粒细胞和巨噬细胞的浸润,而ExoCD26显着降低了两种炎症细胞的浸润。同时,Western blot和免疫荧光结果显示,SDF-1和CXCR4这一对趋化因子及受体在IR肾脏表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能明显改变其表达,但ExoCD26显着降低了两者表达。提示,ExoCD26能降低趋化性细胞因子及受体的表达,并改善炎症细胞的浸润。4.9外泌体对肾脏纤维化的影响Western blot结果显示,IR肾脏1型胶原表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着改变其表达,而ExoCD26显着降低了 1型胶原表达。提示,ExoCD26抑制早期肾纤维化。5.结论（1）缺血再灌注使肾小管上皮细胞系来源的外泌体CD26的表达增加;（2）肾小管上皮细胞系来源的外泌体在IR-AKI小鼠动物模型体内,可被TEC摄取;（3）ExoCD26可改善AKI小鼠肾脏功能指标,减轻肾脏损伤,其可能的机制是ExoCD26被TEC摄取后,促进TEC增殖,减轻肾脏炎症反应和纤维化,从而促进肾脏的修复。
文超[4]（2021）在《三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤机制研究及三七总皂苷对PCI心肌保护作用的系统评价》文中进行了进一步梳理研究目的1.实验部分通过Langendorff实验装置,建立大鼠离体心脏的缺血再灌注损伤模型,并观察三七三醇皂苷对大鼠心脏缺血再灌注损伤造成的影响,同时探究其是否通过PI3K/Akt信号通路及其相关的机制发挥作用。2.临床部分采用Meta分析研究方法,系统评价三七总皂苷治疗急性冠脉综合征患者经PCI后心肌缺血再灌注损伤的疗效及安全性,旨在提供进一步的循证医学证据。研究方法1.实验部分实验一:将40只健康雄性Wistar大鼠采用随机数字表法,随机分为对照组、I/R模型组和低、中、高剂量三七三醇皂苷组（PTSL组、PTSM组、PTSH组）,各8只。对照组穿线,但不结扎冠状动脉,以K-H液持续灌流105min;IR模型组穿线并结扎冠状动脉左前降支近分支30 min后松开结扎线,以K-H液复灌75 min;PTSL组、PTSM组、PTSH组穿线并结扎冠状动脉左前降支近分支处30 min后,分别给予含5、10、20 mg/L三七三醇皂苷的K-H液复灌75 min。收集5组大鼠平衡灌注20 min、心肌缺血30 min和再灌注15min、再灌注75 min的灌流液,检测大鼠灌流液中肌酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）水平。比较5组平衡灌注20 min、局部缺血30 min、再灌注15min和再灌注75 min通过多导生理仪记录的心脏血流动力学参数水平,包括心率（HR）、左心室收缩末压（LVESP）、左心室舒张末压（LVEDP）、左心室发展压（LVDP）、左心室内压上升/下降最大速率（±dp/dtmax）,以及LVESP、LVDP、+dp/dtmax与平衡末差值占比。实验二:将40只健康雄性Wistar大鼠采用随机数字表法,分为对照组、I/R组、PTS组、LY294002组、LY294002+PTS组,各8只。通过Langendorff离体心脏灌流装置建立心脏缺血/再灌注模型,对照组只穿线不结扎,平衡20min后以K-H液持续灌流105 min;I/R模型组平衡20min后穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处,令左前降支局部停灌30 min,开放结扎线,K-H液复灌75 min。LY294002组平衡20min后,穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30min,后开放结扎线,以含15 μmol/L LY294002的K-H液复灌75min。PTS组平衡20min后,穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30min,后开放结扎线,以含10mg/L三七三醇皂苷的K-H液复灌75min。LY+PTS组平衡20min后,穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30min,后开放结扎线,先以含15 μmol/LLY294002的K-H液复灌15min,再以含10mg/L PTS的K-H液复灌60min。收集不同时刻的灌流液测量心肌酶学指标（CK-MB、LDH）,并记录不同时刻左心室血流动力学参数（HR、LVESP、LVEDP、LVDP、±dp/dtmax）;Western-blot 检测心肌组织中 Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的表达,免疫组化检测Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达。2.临床部分评价三七总皂苷治疗冠心病急性冠脉综合征PCI患者的有效性和安全性。通过全面搜索 CNKI、WanFang Date、Sinomed、VIP、PubMed、Embase 数据库。筛选并纳入自建库到2021年1月1日以来三七总皂苷联合西医常规治疗冠心病急性冠脉综合征PCI患者的随机对照试验,后根据Cochrane协作网系统评价员5.1.0版进行评估,并对相关结局指标利用RevMan5.3软件进行Meta分析。研究结果1.实验部分实验一:I/R模型组再灌注15、75 min灌流液中CK-MB和LDH水平均高于对照组[CK-MB:（234±51）U/L 比（12±6）U/L,（203±63）U/L 比（14±3）U/L;LDH:（63.9±9.4）U/L 比（6.2±4.6）U/L,（52.1±9.5）U/L比（6.3±4.8）U/L];PTSL、PTSM、PTSH组再灌注75 min灌流液CK-MB水平和再灌注15 min LDH水平均低于IR模型组,PTSL、PTSH组再灌注75 min LDH水平均低于I/R模型组（均P<0.05）。对照组不同时刻灌流液心肌酶指标水平比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。与对照组比较,I/R模型组再灌注15、75 min LVDP、+dp/dtmax 均降低,LVEDP、-dp/dtmax 以及 LVESP、LVDP、+dp/dtmax 与平衡末差值占比均升高（均P<0.05）。与I/R模型组比较,PTSL组、PTSM组、PTSH组再灌注15 min LVEDP,PTSL 组再灌注 75 min LVEDP 均降低,PTSM 组再灌注 75 min LVDP、+dp/dtmax均升高,局部缺血30 min,再灌注75 min-dp/dtmax均降低,PTSL组、PISM组、PTSH组LVESP,LVDP、+dp/dtmax与平衡末差值占比均显着降低（均P<0.05）。PTSL组、PTSH组心率在平衡灌注20 min,PTSM组在平衡灌注20 min,局部缺血30 min和再灌注15、75 min均高于IR模型组（均P<0.05）。实验二:（1）血流动力学参数:对照组HR不同时点无明显变化（P>0.05）,其余各组均不同程度上升,且I/R模型组、LY组、PTS组、LY+PTS组在再灌注75min时均无明显差异（P>0.05）。对照组不同时点LVESP、LVEDP、LVDP、±dp/dtmax无明显变化,其余各组随时间延长出现不同程度下降。再灌注75min时,PTS组明显低于模型组（P<0.05）,而LY294002+PTS组与模型组无明显差异,与PTS组差异显着（P<0.05）。（2）CK-MB、LDH:对照组不同时点无显着变化,其余各组再灌注后心肌酶水平均较缺血30min有显着提升（P<0.05）。各组平衡20min时无明显差异（P>0.05）;局部缺血30min时,各组CK-MB无统计学差异（P>0.05）,而各组LDH较对照组有所升高（P<0.05）;再灌注15min、75min时,各组均较对照组明显升高,PTS组明显低于模型组,LY294002+PTS组高于PTS组（P均<0.05）。（3）Akt、pAkt、GSK-3β、pGSK-3β的表达:缺血再灌注损伤后,各组心肌组织Akt、GSK-3β表达无统计学差异（P>0.05）,pAkt、pGSK在PTS组中表达较模型组有显着提高（P<0.05）,在应用LY294002的2组中表达较模型组显着下降（P<0.05）,且LY294002+PTS 与 PTS 组差异存在统计学意义（P<0.05）。（4）Bax、Bcl-2、Caspase-3 的表达:模型组 Bax、Caspase-3 显着高于对照组（P<0.05）,PTS 与 LY+PTS2 组 Bax、Caspase-3表达低于模型组（P<0.05）。对照组Bcl-2强阳性,模型组显着低于对照组（P<0.05）,PTS组较模型组显着提高（P<0.05）,LY294002+PTS组显着低于PTS组（P<0.05）。2.临床部分最终纳入35篇研究,研究地点均在中国,累计病例共计2963例,其中观察组1488例,对照组1475例,共涉及三七总皂苷制剂4种。统计结局指标:CK-MB、cTnT、LVEF、LVEDD、BNP、hs-CRP、IL-6、TNF-α、TC、TG、LDL-C、HDL-C、冠脉灌注 TIMI血流分级进行连续性变量的Meta分析,结果分别为:CK-MB（SMD=-2.09,95%CI:[-3.04,-1.13],I2=97%,P<0.0001）、cTnT（SMD=-2.37,95%CI:[-3.31,-1.43],I2=97%,P<0.00001）、LVEF（WMD=3.97,95%CI:[2.58,5.36],I2=83%,P<0.00001）、LVEDD（WMD=-3.18,95%CI:[-4.33,-2.04],I2=85%,P<0.00001）、BNP（SMD=-1.89,96%CI:[-2.68,-1.11],I2=96%,P<0.00001）、hs-CRP（SMD=-1.46,95%CI:[-2.02,-0.90],I2=96%,P<0.00001）、IL-6（SMD=-1.87,95%CI:[-2.33,-1.41],I2=91%,P<0.00001）、TNF-α（SMD=-1.22,95%CI:[-1.85,-0.59],I2=94%,P<0.0001）、TC（WMD=-0.57,95%CI:[-0.87,-0.27],I2=84%,P=0.0002）、TG（WMD=-0.27,95%CI:[-0.46,-0.08],I2=84%,P=0.005）、LDL-C（WMD=-0.32,95%CI:[-0.61,-0.03],12=85%,P=0.03）、HDL-C（WMD=0.02,95%CI:[-0.13,0.17],I2=84%,P=0.75）、冠脉灌注 TIMI 血流分级（WMD=0.34,95%CI:[0.26,0.42],I2=30%,P<0.00001）。MACEs 发生率、不良反应发生率进行二分类变量的Meta分析,结果分别为:MACEs发生率（RR=0.48,95%CI:[0.33,0.70],I2=4%,P=0.0002）、不良反应发生率（RR=0.73,95%CI:[0.51,1.04],I2=0%,P<0.08）。提示PNS制剂联合西医常规治疗对PCI患者心肌存在一定的保护作用,尤其是在改善冠脉再灌注情况、降低心血管不良事件发生率方面作用显着。但是纳入研究数量偏少、样本量较小、方法学质量偏低,为进一步评价PNS制剂治疗MIRI的有效性,仍需要未来有更多大样本、高质量的随机对照研究提供更可靠的循证医学证据。研究结论1.在大鼠离体心脏局部I/R损伤模型中,三七三醇皂苷具有减少心肌酶的释放、减轻左心室收缩和舒张功能障碍的作用,可能与其调节PI3K/Akt信号通路有关。2.三七总皂苷制剂对PCI患者心肌保护作用疗效肯定,尤其是在改善冠脉灌流、心血管不良事件方面作用显着。
刘环秋[5]（2021）在《CCN1敲低通过ERK通路对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究》文中提出研究背景:肝缺血/再灌注损伤（HIRI）,是肝移植和肝切除后对肝脏造成不可逆损伤的重要的危险因素,是临床上一个非常具有挑战性的问题。器官缺血-再灌注损伤（IRI）是临床治疗中一个非常常见也非常棘手并且一直没有得到解决的难题。到目前为止,肝移植仍然是治疗终末期肝病和肝恶性肿瘤唯一有效的治疗手段,但是由于供体的短缺导致大量的病人不能如愿等到供体就已经死亡。活体肝移植虽然在很大程度上缓解了供体短缺的问题,但是关于供体供肝之后出现严重并发症的病例也有报道,因此人们对活体肝移植也变的越来越谨慎。近年来,人们不断尝试使用老龄化供肝、脂肪肝以及心脏死亡供肝等边缘性供肝来缓解供体的不足,然而这些边缘性供肝对缺血再灌注损伤更加敏感,也导致了临床上HIRI病例的增加。肝移植和肝切除术后肝IRI是导致患者术后并发症和死亡率增加的主要原因,大约有10%的早期移植失败是由肝IRI引起的,此外IRI还增加了肝功能障碍和器官排斥的风险。无肝期缺血以及新肝期再灌注引起的肝脏IRI是导致肝部分切除和肝移植术后肝功能衰竭的主要原因。然而到目前为止尚没有可以治疗肝IRI的有效方法。因此,对肝脏IRI的病理机制的研究,以及建立临床上有效并且易于实施的技术手段,对于肝脏IRI预防和治疗至关重要。CCN1/Cyr61是CCN蛋白家族的一员,通过结合不同的配体,调节不同的细胞过程,如细胞粘附、迁移、分化、增殖和凋亡,参与血管生成、炎症和纤维组织修复的过程。CCN1甚至被确定为心肌及肾损伤的早期生物标志物,根据肝IRI中CCN1水平的增加,我们推测CCN1可能参与调节肝IRI的过程。参与炎症反应和细胞凋亡的CCN1在肝缺血再灌注损伤时表达上调,但其内在的机制尚未知晓。内质网广泛存在于真核细胞,是负责蛋白质合成、折叠、转运和成熟的细胞器,内质网通过激活未折叠蛋白反应来抵抗由于内质网应激引起的细胞损伤,恢复细胞功能。据报道内质网应激在肝IRI的发病机制中起着至关重要的作用;研究显示细胞内CCN1可以通过内质网应激触发未折叠蛋白反应激活诱导肝星形细胞凋亡。因此我们拟通过在体内建立肝缺血-再灌注（IR）模型,体外建立了低氧/复氧（HR）模型,以探讨CCN1在肝IRI中是否通过ERK通路调节细胞凋亡、炎症反应或内质网应激。研究目的:（1）CCN1在肝缺血再灌注损伤中的作用;（2）CCN1敲低是否可以对肝缺血再灌注损伤起到保护作用;（3）肝IRI时,CCN1在内质网应激中的作用,以及它是否通过内质网应激调节肝IRI过程;（4）为肝缺血再灌注损伤提供进一步的理论基础;（5）为临床肝缺血再灌注损伤的预防和治疗提供新的方向。实验方法:（1）通过阻断肝脏左叶和中叶的血管,然后再灌注建立小鼠的缺血/再灌注损伤模型;（2）使用选取成年雄性C57BL/6小鼠建立小鼠肝缺血再灌注损伤模型,使用两个针对CCN1的小干扰RNA（si RNA）来敲低CCN1,分别通过组织形态学、免疫荧光、Western blot、实时定量PCR、TUNEL等技术检测Sham组、IR组、IR+si-NC组、IR+si-CCN1-1组和IR+si-CCN1-2组肝细胞功能状况、炎症因子及凋亡相关蛋白表达情况;（3）使用两个针对CCN1的小干扰RNA（si RNA）来敲低CCN1,分别在体外建立小鼠AML-12肝细胞系,建立缺氧/复氧模型,通过组织形态学、免疫荧光、Western blot、实时定量PCR、TUNEL等技术检测观察Sham组、IR组、IR+si-NC组、IR+si-CCN1-1组和IR+si-CCN1-2组肝细胞功能状况、炎症因子及凋亡相关蛋白表达情况。（4）数据以平均±SD,使用T检验或单因素方差分析方法进行统计,利用软件graphpad prism进行统计学分析,p值小于0.05有显着性差异。结果:（1）肝缺血再灌注损伤时CCN1的表达会上调,并且CCN1敲低后能够降低肝细胞损伤和凋亡的严重程度;（2）在敲低CCN1后,促炎因子如TNF-α、IL-6,促凋亡蛋白caspase-9,caspase-3,Bax和CHOP水平下降而抗凋亡因子Bcl-2的表达增加;（3）敲低CCN1也可以抑制激活ER应激和ERK通路激活的蛋白质的水平;（4）体外实验表明,敲低CCN1可以抑制炎症反应,细胞凋亡和ER应激,而在未改变CCN1水平的情况下,添加TPA能够使这种保护效应减弱或消失。结论:（1）CCN1敲低对肝IRI的肝细胞具有保护作用;（2）CCN1敲低主要通过抑制ERK通路激活来实现对肝细胞的保护作用;（3）CCN1敲低能抑制肝IRI时的炎症反应;（4）CCN1敲低能抑制肝IRI时细胞凋亡的发生。总体而言,CCN1敲低可以通过抑制ERK通路激活,抑制炎症、凋亡和ER应激,从而抑制肝IRI的程度,这可能是未来肝移植和肝切除引起的肝IRI临床预防和治疗的突破口。
彭永会[6]（2021）在《IVIM-DWI对兔小肠缺血再灌注损伤的评价》文中指出目的:对兔小肠缺血再灌注损伤（intestinal ischemia-reperfusion injury,IRI）模型进行IVIM-DWI成像及病理检查,观察分析成像参数与病理积分的相关性,探讨IVIM-DWI成像技术评估小肠IRI的价值。方法:成年新西兰大耳白兔64只,随机分为实验组（n=60）和对照组（n=4）,实验组分为缺血1h、2h、3h三个亚组（每组n=20）,每个亚组再分别灌注1h、2h、3h、4h、5h（每再灌注时间点n=4）,实验组开腹用无创动脉夹夹闭肠系膜上动脉（super mesenteric artery,SMA）主干制作兔肠缺血再灌注损伤模型,对照组仅开腹和分离SMA主干。造模结束后于各再灌注时间点行常规MRI平扫和IVIM-DWI检查,测量各时间点肠壁厚度和IVIM-DWI参数值,取相应小肠组织行病理学检查。采用单因素方差分析比较各时间点肠壁厚度、IVIM-DWI参数值及肠壁病理积分;用Pearson相关分析来比较实验组各参数值与肠壁厚度和病理积分的相关关系。结果:（1）肠壁厚度及IVIM-DWI参数值:实验组与对照组比较肠壁厚度及各IVIM-DWI参数值均有极显着性意义（P<0.001）;实验组同一缺血时间点肠壁ADC值、D值、f值随着再灌注时间延长逐渐降低,D*值逐渐增高,肠壁逐渐增厚,差异有极显着性意义（P<0.001）,其中缺血1h再灌注4h和5h肠壁ADC值和D值轻度升高（相对于再灌注3h）,D（9）值轻度降低;同一再灌注时间点肠壁ADC值、D值和f值随着缺血时间延长逐渐降低,D（9）值逐渐升高,肠壁逐渐增厚,差异有极显着性意义（P<0.001）;缺血和再灌注损伤时长相等时,缺血时间越长肠壁ADC值、D值、f值稍低,D*值稍高,肠壁稍厚,差异有显着性意义（P<0.05）。（2）病理结果:对照组肠壁颜色红润,血运良好,肠壁各层结构显示清晰,各时间点病理积分无统计学意义（P>0.05）。实验组缺血1h再灌注1-5h肠壁呈暗红色,肠管蠕动减弱,损伤主要在黏膜层和黏膜下层,再灌注3h损伤最重,镜下见固有层毛细血管暴露、溃疡形成,再灌注4h、5h肠壁损伤程度稍减轻,黏膜上皮早期修复;缺血2h再灌注1-5h肠壁颜色普遍呈暗红色,肠管痉挛明显,肠管扩张积液进行性加重,损伤向隐窝层延伸,黏膜上皮早期修复;缺血3h再灌注1-5h肠壁呈深红色,并逐渐变为炭黑色,肠管持续性痉挛,损伤累及肌层,再灌注4h后肠壁发生不可逆损伤。实验组与对照组比较差异均有极显着性意义（P<0.001）。IVIM-DWI参数值与肠壁厚度及病理积分有较好的相关关系,其中D值与两者的相关性最高（r1=-0.890;r2=-0.907）。结论:（1）IVIM-DWI成像技术能够间接反映小肠IRI的病理改变,可作为一种无创评价小肠IRI的成像技术;（2）小肠缺血3h再灌注4h肠壁发生不可逆损伤,为兔小肠IRI模型肠壁存活上限;（3）IVIM-DWI参数中D值对诊断小肠IRI的价值较大,r D值≥32.82%时提示肠壁发生不可逆的再灌注损伤。
康蕾[7]（2020）在《基于GEO数据库筛选脑梗死大鼠血清生物标志物及活血荣络方干预作用研究》文中提出目的:本实验从生物信息学角度分析,基于GEO数据库筛选脑梗死大鼠血清生物标志物,并通过动物实验探讨活血荣络方对MCAO再灌注损伤大鼠血清BDNF、b FGF的影响。方法:第一部分,基于GEO数据库筛选脑梗死大鼠血清生物标志物:（1）利用GEO数据库下载GSE119121大鼠血液芯片,采用R语言分析得到差异基因。（2）利用String功能蛋白关联数据库,进行脑梗死差异基因蛋白共表达网络（PPI）构建及聚焦,利用Degree、Closeness、Betweenness算法拓扑分析。（3）利用Web Gestalt、DAVID数据库,进行脑梗死差异基因的GO功能富集和KEGG通路富集。第二部分,探讨活血荣络方对MCAO再灌注损伤大鼠血清BDNF、b FGF的影响:将120只SD雄性大鼠随机分成4组:假手术组（sham组,n=30）、模型组（MCAO组,n=30）、活血荣络方组（MCAO+活血荣络方组,n=30）、丁苯酞组（MCAO+丁苯酞组,n=30）,每组分为3d、7d、14d三个亚组,每个亚组10只大鼠。制备MCAO再灌注损伤模型,术后进行神经功能缺损评分筛选。麻醉清醒后6小时首次灌胃（1m L/100g）。再灌注后3d、7d、14d,进行神经功能缺损评分;再灌注后7d,HE染色观察脑组织病理改变;再灌注后3d、7d、14d,ELISA试剂盒检测血清b FGF、BDNF的表达。结果:第一部分,基于GEO数据库筛选脑梗死大鼠血清生物标志物:（1）检索GEO数据库GSE119121大鼠血液芯片,利用R语言筛选出271个差异基因,其中102个基因表达下调,169个基因表达上调（包括BDNF、b FGF）。（2）利用String数据库及Cytoscape软件进行差异基因蛋白PPI构建及聚焦,进行Degree、Betweenness、Closeness算法拓扑分析。（3）利用Web Gestalt数据库对271个差异基因进行GO功能富集分析;利用DAVID数据库对271个差异基因进行KEGG信号通路富集分析,发现主要富集在造血细胞谱系、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、原发性免疫缺陷、MAPK信号通路等。第二部分,探讨活血荣络方对MCAO再灌注损伤大鼠血清BDNF、b FGF的影响:（1）神经功能缺损评分结果:假手术组无神经功能缺损;与模型组相比,活血荣络方组和丁苯酞组再灌注后3d、7d、14d的神经功能缺损评分显着降低（P<0.01）。（2）HE染色结果:光镜下可见（×400）,假手术组:大鼠缺血侧大脑皮层神经细胞形态正常,排列整齐致密,细胞呈圆形或椭圆形,未见明显肿胀;模型组:大鼠缺血侧大脑皮层神经细胞大量变性坏死、萎缩,细胞排列紊乱,细胞空泡化明显,细胞核与细胞质界限不清晰,胞核破碎或消失;与模型组相比,活血荣络方组及丁苯酞组均可不同程度的改善缺血侧大脑皮层神经元形态,神经细胞可见少许空泡样改变,排列尚整齐,周围间质损伤较轻。（3）血清BDNF、b FGF表达结果:与假手术组相比,模型组、活血荣络方组及丁苯酞组再灌注后3d、7d、14d,血清BDNF、b FGF含量显着增加（P<0.01）;与模型组相比,活血荣络方组及丁苯酞组再灌注后3d、7d、14d,血清BDNF、b FGF含量显着降低（P<0.01）。结论:第一部分,利用生物信息学分析GEO数据库原始基因芯片数据,能有效筛选脑梗死大鼠血清生物标志物,揭示了脑梗死的可能发病机制,提示与多靶点、多信号通路相关,为今后临床研究提供了新思路。第二部分,动物实验研究发现,BDNF、b FGF在MCAO再灌注损伤大鼠血清中表达上调,与利用生物信息学分析得到的数据结果相符;活血荣络方能促进脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复,减轻脑组织病理损害,下调血清BDNF、b FGF的表达,推测其作用机制可能与促BBB的修复有关。
王书凡[8]（2020）在《金丝桃苷通过激活PKC/mitoKATP信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究》文中研究说明目的:探讨金丝桃苷（Hyperoside,Hyp）改善大鼠心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）与心肌组织PKC（Protein kinase C）/mitoKATP（mitochondrial ATP channel）信号通路之间的关系。方法:1.在体实验:健康雄性SD大鼠72只适应性喂养一周后,采用结扎冠状动脉左前降支制备大鼠急性心肌缺血再灌注损伤（MIRI）模型,随机分为9组,分别是假手术组（Sham）、模型组（MIRI）、金丝桃苷组（Hyp,50 mg/kg）、Hyp+PKCα阻断剂BisI组（50 mg/kg+2.5 mg/kg）、Hyp+PKCε阻断剂CHE组（50mg/kg+8 mg/kg）、Hyp+mitoKATP阻断剂5-HD组（50 mg/kg+10 mg/kg）、PKCα抑制剂BisI组（2.5 mg/kg）、PKCε抑制剂CHE组（8 mg/kg）、mitoKATP抑制剂5-HD组（10 mg/kg）。除Sham、MIRI组大鼠给予生理盐水（Normal saline,NS）灌胃外,Hyp组及Hyp联用各抑制剂组均给予Hyp 50 mg/kg,灌胃10天。于第10天灌胃结束后,Hyp联用各抑制剂组及各单用抑制组于术前1 h腹腔注射上述各相应抑制剂。采用BL-420生物机能采集系统记录仪记录在缺血前,缺血30 min及再灌注2 h的大鼠心电图;再灌注2 h后腹主动脉取血,离心分离血清,运用ELISA法检测大鼠心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶（CK-MB）和超氧化物歧化酶（SOD）活性,氧化应激标志物丙二醛（MDA）以及腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量;采用HE、TTC及TUNEL染色观察大鼠心肌组织病理学变化、心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率。运用蛋白印迹免疫分析法（Western blot,WB）分别观察Hyp及PKCα、PKCε、mitoKATP特异性信号通路抑制剂对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中Nrf2、Caspase-3、PKCε及Kir6.2蛋白表达水平的影响。2.离体实验:体外细胞培养H9c2心肌细胞,随机分为9组,分别是正常组（Normal）、缺氧复氧组（Model）、Hyp组（50μmol/L）、Hyp+PKCα阻断剂BisI组（50μmol/L+1μmol/L）、Hyp+PKCε阻断剂CHE组（50μmol/L+4μmol/L）、Hyp+mitoKATP抑制剂GB组（50μmol/L+3 nmol/L）、PKCα抑制剂BisI组（1μmol/L）、PKCε抑制剂CHE组（4μmol/L）、mitoKATP抑制剂格列本脲（GB）组（3 nmol/L）。运用ELISA法检测缺氧复氧H9c2心肌细胞上清ATP和MDA含量及SOD和CK-MB活性。采用蛋白印迹免疫分析法分别观察Hyp及PKCα、PKCε、mitoKATP信号通路抑制剂对H9c2心肌细胞中Nrf2、Caspase-3、PKC?及Kir6.2蛋白表达水平的影响;采用流式细胞仪检测Hyp及PKC/mitoKATP信号通路抑制剂对缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡程度的影响;采用激光共聚焦技术检测Hyp及PKC/mitoKATP信号通路阻断剂对缺氧复氧H9c2心肌细胞Ca2+浓度的变化。结果:1.在体实验:（1）与Sham组相比,MIRI组大鼠在心肌缺血再灌注期间ST明显抬高（P<0.01）,肉眼可见结扎区心室壁呈灰白色,再灌注后ST段逐渐回落,表明造模成功。（2）ELISA检测法结果显示,与Sham组相比,MIRI组大鼠血清中MDA含量、CK-MB活性显着升高,SOD活性与ATP含量均显着降低（P<0.01）;与MIRI组比较,Hyp可显着降低血清MDA含量和CK-MB活性,升高SOD活性及ATP含量（P<0.01）。相比于Hyp组,Hyp联用各抑制剂组大鼠血清中MDA含量明显升高,SOD活性及ATP含量均显着降低（P<0.05,P<0.01）;相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组大鼠血清中MDA含量和CK-MB活性下降,SOD活性及ATP含量上调（P<0.01）。（3）HE染色结果显示,MIRI组心肌前壁可见大面积白色区域,嗜酸性变明显,细胞排列紊乱,细胞质充血,淡染;TUNEL染色结果显示,MIRI组大鼠心肌细胞凋亡指数明显上升;TTC染色结果显示,MIRI组心肌梗死面积较大。而用药后,与MIRI组比较,Hyp组及Hyp联合各阻断剂组心肌组织的病理损伤均明显好转,心肌细胞凋亡指数明显下降,心肌梗死面积显着减少。与Hyp组比较,Hyp联合各阻断剂组病理损伤仍较明显。（4）Western blot结果显示,相比于Sham组,MIRI组大鼠心肌组织中Nrf2、PKCε蛋白表达水平明显下降（P<0.01）,Kir6.2蛋白表达无明显变化（P>0.05）,Caspase-3蛋白表达水平明显上升（P<0.01）。相比于MIRI组,Hyp组大鼠心肌细胞中Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平明显上升（P<0.01）,Caspase-3蛋白表达水平明显下调（P<0.01）。相比于Hyp组,Hyp联用各抑制剂组的Nrf2、PKCε及Kir6.2蛋白表达水平均有一定程度的下调（P<0.05,P<0.01）,Caspase-3蛋白表达水平有一定程度的上调（P<0.05）;相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组的Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平均有一定程度的上调（P<0.05,P<0.01）,Caspase-3蛋白表达水平有一定程度的下调（P<0.01）。2、离体实验:（5）ELISA检测法结果显示,与Normal组相比,Model组H9c2心肌细胞上清中MDA含量及CK-MB活性显着升高,SOD活性及ATP含量均显着降低（P<0.01）;与Model组比较,Hyp可显着降低缺氧复氧H9c2心肌细胞上清中MDA含量及CK-MB活性,升高SOD活性及ATP含量（P<0.01）。相比于Hyp组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞上清中ATP含量明显降低（P<0.05）;相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞上清中MDA含量及CK-MB活性显着降低,SOD活性及ATP含量明显升高（P<0.01）。（6）相比于Normal组,Model组H9c2心肌细胞中Nrf2、PKCε蛋白表达水平明显下降（P<0.01）,Kir6.2蛋白表达无明显变化（P>0.05）,Caspase-3蛋白表达水平明显上升（P<0.01）。相比于Model组,Hyp组缺氧复氧H9c2心肌细胞中Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平明显上升,Caspase-3蛋白表达水平明显下调（P<0.01）。与Hyp组相比,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平有一定程度下调（P<0.05,P<0.01）,Caspase-3蛋白表达水平有一定程度上调（P<0.01）。相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞Nrf2、PKCε及Kir6.2蛋白表达水平明显上升（P<0.05,P<0.01）,Caspase-3蛋白表达水平明显下调（P<0.01）。（7）流式细胞仪检测结果显示,相较于Normal组,Model组H9c2心肌细胞凋亡率显着升高（P<0.01）;相较于Model组,Hyp组H9c2心肌细胞凋亡率呈下降趋势（P<0.01）;与Hyp组比较,Hyp联用各抑制剂组细胞凋亡率均显着提高（P<0.05,P<0.01）;相比于各相应抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组心肌细胞凋亡率显着降低（P<0.05,P<0.01）。（8）激光共聚焦检测结果显示,相比于Normal组,Model组H9c2心肌细胞Ca2+荧光强度明显上升（P<0.01）;相比于Model组,Hyp组心肌细胞Ca2+荧光强度显着下降（P<0.01）;相较于Hyp组,Hyp联用各阻断剂组H9c2心肌细胞的Ca2+荧光强度明显上升（P<0.05）。相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞Ca2+荧光强度显着降低（P<0.05,P<0.01）。结论:Hyp具有改善MIRI大鼠心肌组织损伤的作用,其机制可能与其激活大鼠心肌组织PKC/mitoKATP信号通路有关,进一步研究发现,其可能一方面是直接激活PKCα信号通路,另一方面是通过激活PKCε,继而开放mitoKATP通道,调节多种心肌细胞及其亚细胞的结构和功能,清除氧自由基,维持线粒体功能,恢复能量代谢,抑制Ca2+流向胞内,减少心肌细胞凋亡,从而发挥改善心肌损伤的保护作用。
户克庆[9]（2020）在《尼可地尔通过开放mitoKATP对缺血再灌注时冠脉微循环的影响及可能机制的研究》文中研究说明研究背景急性冠脉综合征（Acute coronary syndrome,ACS）作为冠心病的重要组成部分,已经成为人类全因死亡的重要原因。经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）,目前已成为ACS患者的有效治疗方法,能够有效恢复心肌灌注,缓解症状,改善临床预后。然而,尽管PCI技术不断成熟和改进,仍有部分患者未能在PCI治疗中获益,反而出现PCI术后无复流和低灌注,即心肌无复流（myocardial no-reflow,MNR）现象。MNR发生的具体机制尚不清楚,目前认为MNR现象是心肌缺血/再灌注损伤、微循环障碍的一种表现形式。MNR是ACS患者PCI术后近期和远期预后不良,以及主要心血管不良事件发生的强烈预测因子。如何有效预防MNR是临床心脏病专家迫切需要解决的问题。临床研究发现,PCI术前或术中冠脉内给予血管扩张剂硝酸甘油、尼可地尔、硝普纳、维拉帕米、地尔硫卓等可能减少无复流现象发生。尼可地尔同时具有类硝酸酯样及ATP敏感性钾通道（KATP）开放剂的双重作用,可显着改善冠脉微循环。近十年来,多位学者尝试静脉或冠脉内应用尼可地尔改善PCI术中冠脉微循环及心肌灌注,减轻心肌缺血再灌注损伤。急性心肌梗死患者行急诊PCI术前应用尼可地尔,可显着改善其冠脉血流、减少室性心律失常的发生,并可提高左室功能。虽然目前尚缺乏大规模、多中心、双盲对照临床研究数据,但多数临床研究显示,与硝酸甘油相比,尼可地尔能够更好的纠正冠脉无复流,增加心肌灌注,改善心脏功能。除了通过扩张冠脉微血管外,尼可地尔是否还通过其他作用机制改善PCI相关的心肌灌注障碍?目前尚不明确。为探讨尼可地尔改善PCI术后心肌灌注的可能作用机制,本研究纳入拟行PCI治疗的ACS患者,PCI术前经冠脉内给予尼可地尔,与未应用尼可地尔患者相比,观察PCI术前和术后炎症相关指标表达的动态变化情况,并采用蛋白组学分析方法筛查尼可地尔改善心肌灌注的可能分子作用机制。研究目的1.观察PCI术前经冠脉内给予尼可地尔对PCI术后炎症反应的影响;2.蛋白组学分析筛查冠脉内给予尼可地尔改善PCI术后心肌灌注的可能分子机制。研究方法1.研究人群:（1）入选标准:①年龄30-80岁的ACS患者;②冠脉造影证实冠脉中重度狭窄（>75%）,并拟行PCI术。（2）排除标准:①肝功能损伤:谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）高于正常值上限3倍及以上;②肾功能不全:血清肌酐水平>2.5mg/d1（221umol/L）;③罹患恶性肿瘤患者;④原发性或继发性血小板减少或功能障碍者;⑤中重度贫血患者:血红蛋白<90g/L;⑥既往有PCI或冠脉搭桥病史;⑦急性心力衰竭;⑧复杂冠脉病变（左主干病变、分叉病变、严重钙化病变）;⑨对尼可地尔过敏者。2.研究分组:冠脉造影前,向所有拟入组的ACS患者及家属告知研究的目的、方案,征得同意并签署知情同意书后,进行基础信息采集,并严格按照操作规程进行冠脉造影检查。根据冠脉造影结果决定是否需要行PCI术,拟行PCI术的患者纳入本研究,并按照1:1的原则随机分为尼可地尔组和对照组:（1）尼可地尔组（n=30）:行PCI术前在拟处理冠脉内给予尼可地尔2mg弹丸式注射1次;（2）对照组（n=30）:PCI术前冠脉内给予相等体积生理盐水注射1次;3.检测指标（1）血液学炎症指标所有患者均分别于PCI术前、术后24小时及术后7天留取静脉血15ml,离心后冻存于-80℃冰箱,检测各时间点炎症因子表达水平。炎症因子指标包括:TNF-α、IL-6、IL-1β、VCAM-1、ICAM-1、CXCL-1、CXCL-2、MCP-1、IL-18、IL-10、IL-19、IL-33、IL-1RA。（2）蛋白组学分析随机选取尼可地尔组及对照组各3例患者的PCI术前和术后24小时的血清进行蛋白组学分析,将术后蛋白表达倍数变化（fold change,FC）>2或FC<0.5作为差异表达蛋白（Differentially expressed proteins,DEPs）的统计标准,筛选出DEPs,对DEPs行基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。4.统计学分析计量资料以均数土标准误表示。两组间同一时间点相关指标比较采用独立t检验;同组两个时间点间相关指标比较采用配对t检验;多样本比较采用单因素方差分析,组间差异两两比较当方差齐时采用LSD（least significant difference）法,方差不齐时采用Dunnett T3法。计数资料以百分数表示,采用卡方检验分析,n<40时,采用Fisher’s Exact Test。P<0.05认为有统计学意义。所有统计学资料均采用 SPSS 16.0（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）软件包分析。研究结果1.PCI术前炎症因子表达水平PCI术前,对照组和尼可地尔组患者在各促炎症因子及抗炎因子表达水平上均两组间无统计学差异（P>0.05）;2.PCI术后炎症因子表达水平变化（1）对照组:与PCI术前相比,对照组在PCI术后24小时TNF-α、IL-6、IL-1β、VCAM-1、ICAM-1等促炎症因子表达水平显着升高,而抗炎因子IL-33、IL-10、IL-19表达水平显着降低（P<0.05）;在PCI术后7天时,促炎因子中IL-6、VCAM-1、ICAM-1仍呈持续高表达,而抗炎因子IL-33、IL-10、IL-19表达水平仍显着降低。（2）尼可地尔组:PCI术后24小时,尼可地尔组促炎症因子表达水平与PCI术前相比无显着变化,抗炎因子IL-10表达水平较术前显着升高（P<0.05）。3.PCI术后,两组炎症因子表达水平比较尼可地尔组在PCI术后24小时时促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、VCAM-1、ICAM-1、CXCL-2、MCP-1表达水平显着低于对照组同时间点炎症因子表达水平。4.蛋白组学分析结果（1）与PCI术前相比,PCI术后对照组中有53个蛋白表达显着变化,包括39种蛋白表达显着上调和14种蛋白显着下调;冠脉内预防性应用尼可地尔可逆转这些蛋白的异常表达。对两组间差异表达蛋白进行生物信息分析,基因本体论（GO）分析显示这些蛋白主要分布在胞外区域,即多为分泌蛋白;KEGG富集分析显示,这些差异表达的蛋白多富集在炎症相关信号通路。这提示调节炎症-免疫反应可能是尼可地尔预防心肌无复流、保护冠脉微循环的重要机制。结论1.PCI术后致炎因子表达水平显着增高,而抗炎因子表达水平显着降低,提示PCI术后机体炎症反应增强;2.PCI术前冠脉内应用尼可地尔可显着抑制促炎因子的表达,而升高抗炎因子的表达,这提示预防性应用尼可地尔可调节PCI术后机体炎症反应水平;3.蛋白组学分析发现预防性冠脉内应用尼可地尔可调节PCI术后炎症相关通路蛋白表达,提示尼可地尔调节PCI术后炎症反应可能是其预防心肌无复流、改善冠脉微循环的重要机制。研究背景临床研宄发现预防性应用尼可地尔可显着减少PCI术中冠脉无复流的发生。尼可地尔改善冠脉微循环的具体机制,目前尚不明确。论文I中,我们发现,PCI术后炎症反应增强,预防性应用尼可地尔可显着降低多种促炎因子表达,同时增加抗炎因子表达水平。采用蛋白组学分析进一步筛查其可能的机制,发现PCI术后对照组中有53个蛋白表达显着变化,包括39种蛋白表达显着上调和14种蛋白显着下调;冠脉内预防性应用尼可地尔可逆转这些蛋白的异常表达。对两组间差异表达蛋白进行生物信息分析,结果显示这些蛋白多为分泌蛋白,且多富集在炎症相关信号通路。这提示调节炎症-免疫反应可能是尼可地尔预防心肌无复流、保护冠脉微循环的重要机制。那么,尼可地尔调节缺血再灌注后炎症反应的具体分子机制是什么呢?心肌无复流（myocardial no-reflow,MNR）是心肌缺血/再灌注损伤微循环障碍的一种表现形式。冠脉微血管结构或功能障碍、局部代谢改变如氧自由基作用、炎症以及微循环机械栓塞、冠脉痉挛等均有参与。其中炎症-氧化应激机制在MNR发生发展中扮演着关键角色。心肌缺血时,氧自由基清除系统功能减弱甚至消失,再灌注后活性氧类（reactive oxygen species,ROS）通过多种途径爆发式产生,超过了抗氧化防御系统的清除能力,导致ROS大量堆积。ROS可通过多途径导致MNR,如促进黏附因子表达、激发炎症反应等。血管内皮细胞被覆血管内表面,内皮的完整性和功能对冠脉微循环的发生发展和转归具有极其关键的作用。因此,千预氧化应激-炎症反应,保护血管内皮功能,有可能是预防和处理缺血再灌注时MNR现象的重要环节。线粒体呼吸链是ROS最主要的来源,占ROS来源的90%以上。正常情况下,机体自由基的生成受到抗氧化应激系统的严格调节,被控制在较低水平。缺血再灌注时,大量的ROS通过多个途径爆发产生,内源性的清除系统难以负荷,从而造成活性氧在体内积聚,引起氧化损伤。这提示线粒体在氧化应激反应中的核心位置。近年来研宄发现,线粒体膜上存在一种ATP敏感性钾离子通道（mitoKATP）参与调节氧自由基的生成。尼可地尔对细胞膜及线粒体ATP敏感性钾通道均有开放作用。它作用于心肌细胞mitoKATP,通过减轻线粒体内Ca2+超载,调节氧自由基生成,线粒体基质肿胀和呼吸链优化,抑制细胞凋亡等途径,减少缺血再灌注心肌损伤,具有药物预适应的心肌保护作用。因此,我们提出以下假说:尼可地尔通过作用于血管内皮细胞mitoKATP,调节缺血再灌注后内皮细胞的氧化应激-炎症反应,减轻内皮细胞损伤。这可能是尼可地尔减轻缺血再灌注后MNR、保护冠脉微循环的重要机制。研究目的1.观察尼可地尔对血管内皮细胞缺氧/复氧后细胞功能、氧化应激-炎症反应的影响;2.阐明尼可地尔调节血管内皮细胞缺氧/复氧后细胞功能和氧化应激-炎症反应的可能分子机制。研究方法1.体外培养人脐静脉内皮细胞;2.采用缺氧/复氧细胞模型体外模拟缺血再灌注:将HUVECs细胞接种于6孔板中培养24小时,更换950ml/LN2、50ml/L C02饱和的D-hanks液后,置于三气孵箱中（含94%N2、5%C02及1%02,37°C）为缺氧,模拟缺血,设置缺氧时间为2小时（2hrs）。2小时后从三气畔箱中取出培养板,放回正常孵箱（20%2、5%C02,75%N2,37°C）,即为复氧,模拟再灌注,设置复氧时间为4hrs。即缺氧2hrs/复氧4hrs。3.细胞分组:①正常对照组（Control组）;②缺氧复氧对照组（H/R组）:缺氧2hrs/复氧4hrs;③尼可地尔组（Nic组）:在缺氧开始前先给予尼可地尔lOOpM孵育2hrs,然后进行缺氧2hrs/复氧4hrs;④尼可地尔+5-羟葵酸组（Nic+5-HD组）:在缺氧开始前先用5-HD 500jiM孵育2小时,再加入尼可地尔lOOpM继续孵育2hrs,然后再进行缺氧2hrs/复氧4hrs;⑤PI3K抑制剂LY294002+尼可地尔组（Nic+LY）:采用PI3K特异性抑制剂LY294002（IO^iM）预处理细胞2小时,再加入尼可地尔100|iM继续孵育2hrs,然后进行缺氧2hrs/复氧4hrs,观察相应检测指标变化。实验结束后,分别收集细胞上清液和细胞,-80°C冻存留待后续检测。（4）检测指标①内皮细胞活力检测:采用CCK-8细胞活力检测法;②内皮细胞通透性:检测内皮细胞单层对白蛋白通透性大小,以内皮细胞单层对白蛋白通透性大小用通透系数Pa表示③氧化应激水平检测:收集各组细胞的细胞上清,采用硫代巴比妥酸法测定细胞上清中丙二醛（MDA）含量,黄嘌呤氧化酶法测定细胞上清中超氧化物歧化酶（SOD）活性。④炎症因子表达水平检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测各组细胞上清中炎症因子肿瘤坏死因子a（Tumornecrosis factor-a,TNFa）、白介素-ip（interleukin-ip,IL-ip）、IL-6的表达水平。⑤PI3K7Akt信号通路分子检测:各组细胞干预结束后收集细胞并提取蛋白,采用蛋白免疫印迹法（westernblot）检测PI3K、Akt总蛋白和怜酸化蛋白表达水平。（5）统计学分析计量资料以均数±标准误表示。多样本比较采用单因素方差分析;组间差异两两比较:当方差齐时采用LSD（least significant difference）法;方差不齐时采用DunnettT3法。所有统计学资料均采用SPSS 16.0（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）软件包分析。尸<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.尼可地尔对HUYECs缺氧/复氧后细胞存活率的影响与正常对照组相比,缺氧/复氧组细胞存活率较正常对照组显着下降;尼可地尔预处理,可显着提高细胞存活率（尸<0.05,vs.H/R）;5-HD预处理细胞后,尼可地尔提高缺氧/复氧后细胞存活率的作用被显着抑制。这提示尼可地尔对HUVECs缺氧/复氧后细胞活力的保护作用主要由其对mitoKATP的开放介导。2.尼可地尔对缺氧/复氧后HUVECs内皮细胞通透性的影响与对照组相比,缺氧/复氧组内皮细胞对白蛋白的通透性显着增加;采用不同剂量尼可地尔（50|aM-200KM）预处理细胞2hrs,均可显着减轻内皮细胞对白蛋白的通透性,在lOOM达到最大作用;mitoKATP特异性阻断剂5-HD500^M预处理细胞,可显着抑制尼可地尔改善HUVECs缺氧/复氧后细胞通透性的作用。这提示尼可地尔对HUVECs缺氧/复氧后细胞通透性的保护作用主要通过其开放mitoKATP所介导。3.尼可地尔对HUVECs缺氧/复氧后氧化应激作用的影响与正常对照组相比,缺氧2小时后细胞上清中MDA表达水平显着增加,SOD显着降低;复氧后,细胞上清中MDA含量较缺氧时增加更为显着,同时SOD水平较缺氧时降低更为显着。这提示缺氧/复氧后HUVECs氧化应激反应増加,抗氧化能力下降。采用不同剂量尼可地尔(5（HiM-200|aM）预处理HUVECs,均可显着降低细胞上清中MDA表达水平,增加SOD表达水平,提示尼可地尔可以减轻缺氧/复氧后HUVECs氧化应激水平,提高抗氧化能力。采用mitoK^rp特异性阻断剂5-HD预处理细胞后,尼可地尔降低MDA表达和提高SOD表达水平的作用均被显着抑制,提示尼可地尔减轻HUVECs氧化应激作用主要通过其开放mitoKATP介导。4.尼可地尔对HUVECs缺氧/复氧后炎症因子表达的影响与正常对照组相比,缺氧2hrs后细胞上清中炎症因子TNF-cu IL-lp、IL-6表达水平均显着升髙;复氧1小时后细胞上清中上述三种炎症因子表达水平均较未复氧组进一步升高,且随复氧时间延长在5小时内表达水平呈进一步上升趋势。这提示缺氧/复氧后,HUVECs炎症反应增强。采用不同浓度尼可地尔(50^iM-20（HiM）预处理HUVECs,可显着降低HUVECs缺氧/复氧后炎症因子表达,其中尼可地尔50PM即可显着降低HUYECs缺氧/复氧后细胞上清中TNF-ct和IL-1P水平,尼可地尔lOO^M可显着降低HUVECs缺氧/复氧后细胞上清中IL-6含量。这提示尼可地尔对HUVECs缺氧/复氧后炎症因子表达具有显着抑制作用。采用5-HD预处理细胞组,TNF-ou IL-ip、IL-6三种炎症因子表达水平均较尼可地尔组显着增加,与缺氧/复氧组相比无统计学差异。这提示尼可地尔对HUVECs缺氧/复氧后炎症因子表达的抑制作用主要通过开放mitoKATP介导。5.尼可地尔对HUVECs缺氧/复氧后PI3K/Akt磷酸化的影响与正常对照组相比,HUVECs缺氧2hrs/复氧4hrs后细胞中PI3K和Akt磷酸化水平均被显着抑制（P<〇.〇5）;尼可地尔预处理后,细胞中PI3K和Akt磷酸化水平较H/R组相比显着增高（P<0.05）,提示尼可地尔预处理可减轻缺氧/复氧对HUVECs PI3K和Akt怜酸化水平的抑制作用。采用5-HD预处理细胞,细胞中PI3K和Akt怜酸化水平较正常对照组和尼可地尔组均显着降低。这提示PI3K/Akt可能是尼可地尔调节HUVECs缺氧/复氧后氧化应激-炎症反应的重要途径。6.PI3K/Akt途径在尼可地尔调节HUVECs缺氧/复氧后氧化应激炎症反应中的作用采用PI3K抑制剂LY294002预处理细胞,细胞上清中MDA水平较尼可地尔组显着增加,SOD水平较尼可地尔组显着降低;炎症因子TNF-a、IL-lp、IL-6表达水平均较尼可地尔组显着增加（尸<〇.〇5）,与缺氧/复氧组相比无统计学差异（P>0.05）。这提示尼可地尔调节HUVECs缺氧/复氧后氧化应激-炎症反应作用通过PI3K/Akt途径介导。结论1.缺氧/复氧可显着降低HUVECs活力、增加细胞通透性,预防性应用尼可地尔可显着改善HUVECs缺氧复氧后细胞存活率和细胞通透性;2.缺氧/复氧后HUVECs氧化应激水平显着增加、抗氧化能力降低,尼可地尔预处理可显着降低HUVECs缺氧/复氧后氧化应激水平、提高抗氧化能力;3.缺氧/复氧后HUVECs表达炎症因子显着増加,尼可地尔预处理可显着抑制HUVECs缺氧/复氧后炎症因子表达;4.尼可地尔调节HUVECs缺氧/复氧后细胞功能的可能机制为:尼可地尔通过开放mitoKAip、促进PI3K/Akt磷酸化,抑制缺氧/复氧后细胞氧化应激-炎症反应。
杨龙[10]（2020）在《HIF-1调控线粒体自噬恢复七氟醚后处理减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤的机制研究》文中研究表明目的:心血管疾病是目前全球突出性的社会医疗问题,患病率持续上升,已成为全球范围内造成死亡的最主要原因。糖尿病作为心血管疾病的重要危险因素,合并有糖尿病的缺血性心脏病患者诱发心肌缺血再灌注损伤的几率是非糖尿病缺血性心脏病患者的23倍。七氟醚后处理（Sevoflurane Postconditionning,SPostC）能有效减轻健康心肌缺血再灌注损伤,但糖尿病状态下,SpostC的心肌保护作用弱化。前期研究证实糖尿病状态下七氟醚后处理保护作用弱化的原因可能在于受损的HIF-1信号通路,应用去铁胺（DFO）能够激活糖尿病状态下受损的HIF-1α重现七氟醚后处理保护作用,但具体机制不清。新近研究发现线粒体自噬在七氟醚后处理心肌保护作用中起关键作用,但在糖尿病状态下,线粒体自噬被抑制。如何重现糖尿病状态下SpostC心肌保护作用是目前急需解决的重要临床问题,而阐明HIF-1α/BNIP3介导的线粒体自噬是否参与恢复糖尿病状态下七氟醚后处理保护作用尤为重要。本研究在前期研究基础上探讨HIF-1调控的线粒体自噬在SpostC对抗缺血性心肌损伤中的作用,期望通过调控HIF-1介导的线粒体自噬恢复糖尿病状态下七氟醚后处理保护作用。方法:在离体层面,建立H9C2心肌细胞缺氧/复氧模型,在复氧初接受2.4%七氟醚后处理。通过测定细胞活力、LDH活性及流式细胞仪测定细胞凋亡反映细胞损伤情况;透射电镜观察自噬小体反映自噬情况;western blot检测HIF-1α、BNIP3、Beclin-1蛋白表达;利用干扰RNA技术沉默BNIP3观察其在促进自噬方面作用。在体水平,通过结扎大鼠冠脉前降支40分钟后复灌120分钟建立I/R模型。在缺血前24h腹腔内注射DFO（200mg/kg）,复灌初15分钟给与1MAC七氟醚后处理。复灌2h后测定心肌梗死面积、线粒体超微结构、自噬小体、ATP含量、膜电位、ROS产生率以及HIF-1α、BNIP3、LC3-II、Beclin-1、P62、LAMP2蛋白表达和心脏功能。结果:细胞实验缺氧复氧损伤后,与H/R组相比,SpostC能够上调HIF-1α、BNIP3蛋白表达（P<0.05,SPostC组vs H/R组）,促进自噬小体清除,细胞活力明显增加,LDH降低,但是这种保护作用在给与2ME2或沉默BNIP3后完全消除。糖尿病状态下,与I/R组相比,SpostC组保护作用弱化,给与DFO处理后,SPostC能够上调HIF-1α及其下游靶基因BNIP3蛋白表达（P<0.05）,同时降低自噬关键蛋白LC3-II、Beclin-1、P62的表达,增加LAMP2蛋白表达;自噬小体堆积明显减少,ROS产生率下降,ATP含量明显增加,膜电位提高,心肌梗死面积明显减小,心功能改善明显（P<0.05,SPostC组vs DFO+SpostC组）。结论:SPostC通过调控HIF-1α/BNIP3信号通路促进线粒体自噬减轻心肌细胞缺氧复氧损伤。主要机制在于SPostC能够上调HIF-1α的表达,进一步激化下游靶基因BNIP3,促进了BNIP3介导的线粒体自噬,通过清除自噬小体并增加细胞活力,降低LDH水平,抑制细胞凋亡,最终对抗细胞缺氧复氧损伤。糖尿病状态下,通过DFO预处理联合SPostC能够激活受损的HIF-1α并上调HIF-1α的蛋白表达,进一步促进HIF-1α/BNIP3介导的线粒体自噬,及时清除受损的线粒体,避免了线粒体来源的ROS对线粒体膜电位的攻击,使得线粒体功能得到稳定,心肌梗死面积明显减少,改善了心功能。
二、评价早期肺缺血再灌注损伤敏感性的细胞因子探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、评价早期肺缺血再灌注损伤敏感性的细胞因子探讨（论文提纲范文）
（1）缺血预处理联合右美托咪定对肢体缺血再灌注患者肺功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 远隔缺血适应的器官保护作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌损伤标志物、凋亡指数和形态学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞自噬的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP通路的调控作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录一 文献综述 心肌缺血再灌注损伤相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图二 |
| 附录三 读博期间发表论文、科研情况 |
| 致谢 |
（3）CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ CD26阳性尿外泌体与重症患者急性肾损伤预后关系的前瞻性队列研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2 方法与材料 |
| 3 结果 |
| 4 讨沦 |
| 5 结论 |
| 6 局限性 |
| 附图与附表 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ CD26阳性外泌体对急性肾损伤后肾脏修复作用的机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5.结论 |
| 6.局限性 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞外囊泡与肾脏疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 发表论文1 |
| 发表论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤机制研究及三七总皂苷对PCI心肌保护作用的系统评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 心肌缺血再灌注损伤与PI3K/Akt信号通路 |
| (一) PI3K/Akt信号通路的结构与功能 |
| (二) PI3K/Akt信号通路的研究进展 |
| (三) 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 三七总皂苷与三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤研究进展 |
| (一) 三七总皂苷抗心肌缺血再灌注损伤机制的研究进展 |
| (二) 三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤机制的研究进展 |
| (三) 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 药品及试剂的配置 |
| 实验一 探讨不同剂量PTS对大鼠离体心脏MIRI的保护作用 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于PI3K/Akt信号通路探讨PTS对MIRI的作用 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 临床研究 三七总皂苷对PCI患者心肌保护作用的系统评价 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）CCN1敲低通过ERK通路对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 综述 肝缺血再灌注损伤的机制及预防和治疗策略 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肝缺血再灌注损伤的机制 |
| 1.2.1 无氧代谢、酸中毒与细胞程序性死亡 |
| 1.2.2 细胞内Ca~(2+)超载与细胞程序性死亡 |
| 1.2.3 线粒体通路在HIRI细胞程序性死亡中的作用机制 |
| 1.2.4 氧化应激在HIRI细胞程序性死亡中的作用机制 |
| 1.2.5 炎症反应与细胞程序性死亡 |
| 1.2.6 其他炎症介质 |
| 1.3 肝缺血再灌注损伤与细胞程序性死亡 |
| 1.4 HIRI中细胞程序性细胞死亡的类型 |
| 1.4.1 细胞凋亡(apoptosis) |
| 1.4.2 坏死性凋亡(necroptosis) |
| 1.4.3 细胞焦亡(pyroptosis) |
| 1.4.4 自噬(autophagy) |
| 1.5 HIRI的预防和治疗 |
| 1.5.1 药物预防与治疗 |
| 1.5.2 抗凋亡治疗 |
| 1.6 器官移植过程中的肝保护 |
| 1.6.1 缺血预处理(IPC)和缺血后处理(IPost C) |
| 1.6.2 离体肝脏机械灌注 |
| 1.6.3 低温机械灌注(Hypothermic machine perfusion,HMP) |
| 1.6.4 亚低温机械灌注(subnormothermic machine perfusion,SNMP) |
| 1.6.5 常温机械灌注(normothermic machine perfusion,NMP) |
| 1.7 总结与展望 |
| 第2章 CCN1敲低通过抑制ERK通路对肝缺血/再灌注损伤产生保护作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设备及材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要实验设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物模型的建立 |
| 2.3.2 病理检测 |
| 2.3.3 TUNEL检测 |
| 2.3.4 Western blot |
| 2.3.5 总RNA提取 |
| 2.3.6 试剂盒检测TNF-α、IL-6、MPO、AST与ALT |
| 2.3.7 细胞培养 |
| 2.3.8 病理TUNEL检测见在体实验部分 |
| 2.3.9 Weston blot见在体实验部分 |
| 2.3.10 总RNA提取见在体实验部分 |
| 2.3.11 Elisa检测TNF-α与 IL-6见在体实验部分 |
| 2.3.12 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足之处 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）IVIM-DWI对兔小肠缺血再灌注损伤的评价（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本研究局限性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:小肠缺血再灌注损伤诊断的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）基于GEO数据库筛选脑梗死大鼠血清生物标志物及活血荣络方干预作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 基于GEO数据库筛选脑梗死大鼠血清生物标志物 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 脑梗死差异基因(DEGs)筛选 |
| 1.2 脑梗死差异基因蛋白共表达网络(PPI)构建及聚焦 |
| 1.3 脑梗死差异基因GO和KEGG富集分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 脑梗死差异基因筛选结果 |
| 2.2 脑梗死差异基因蛋白共表达网络(PPI)构建及聚焦结果 |
| 2.3 脑梗死差异基因GO和KEGG富集分析结果 |
| 3.讨论 |
| 第二部分 探讨活血荣络方对MCAO再灌注损伤大鼠血清BDNF、bFGF的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物制备 |
| 1.3 主要实验试剂和材料 |
| 1.4 主要实验设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物模型的制备与评价 |
| 2.2 实验分组与给药 |
| 2.3 取材 |
| 2.4 观察指标及检测方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 神经功能缺损评价 |
| 3.2 HE染色观察脑组织病理改变 |
| 3.3 ELISA检测血清BDNF、bFGF的水平 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述:脑梗死血清生物标志物研究进展 |
| 参考文献 |
（8）金丝桃苷通过激活PKC/mitoKATP信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1.实验试剂与仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.实验内容 |
| 2.1 体内实验 |
| 2.2 体外实验 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介及读研期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（9）尼可地尔通过开放mitoKATP对缺血再灌注时冠脉微循环的影响及可能机制的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 预防性冠脉内应用尼可地尔对PCI术后炎症反应的影响及可能机制的研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 尼可地尔对人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧后氧化应激-炎症反应的影响及分子机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表SCI论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
（10）HIF-1调控线粒体自噬恢复七氟醚后处理减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 七氟醚后处理促进HIF-1/BNIP3 介导的线粒体自噬减轻H9C2 心肌细胞缺氧复氧损伤的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 研究方案 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 HIF-1/BNIP3 介导的线粒体自噬在七氟醚后处理减轻SD大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 研究方案 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 去铁胺预处理联合七氟醚后处理调控HIF-1/BNIP3 介导的线粒体自噬减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 研究方案 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
四、评价早期肺缺血再灌注损伤敏感性的细胞因子探讨（论文参考文献）
- [1]缺血预处理联合右美托咪定对肢体缺血再灌注患者肺功能的影响[D]. 杨一柳. 河北北方学院, 2021(01)
- [2]电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用[D]. 李晨. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [3]CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究[D]. 杜鹃. 山东大学, 2021(11)
- [4]三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤机制研究及三七总皂苷对PCI心肌保护作用的系统评价[D]. 文超. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]CCN1敲低通过ERK通路对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究[D]. 刘环秋. 吉林大学, 2021(01)
- [6]IVIM-DWI对兔小肠缺血再灌注损伤的评价[D]. 彭永会. 遵义医科大学, 2021(01)
- [7]基于GEO数据库筛选脑梗死大鼠血清生物标志物及活血荣络方干预作用研究[D]. 康蕾. 湖南中医药大学, 2020(03)
- [8]金丝桃苷通过激活PKC/mitoKATP信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究[D]. 王书凡. 皖南医学院, 2020(01)
- [9]尼可地尔通过开放mitoKATP对缺血再灌注时冠脉微循环的影响及可能机制的研究[D]. 户克庆. 山东大学, 2020(12)
- [10]HIF-1调控线粒体自噬恢复七氟醚后处理减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤的机制研究[D]. 杨龙. 新疆医科大学, 2020(07)