一、鸡呼肠孤病毒分离与鉴定（论文文献综述）
孔桂慧[1]（2021）在《鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究》文中研究指明鸭新型呼肠孤病毒病是由鸭新型呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）引起的一种鸭禽传染病,其典型病变特征为肝脏肿大出血、脾脏坏死、鸭只体重减轻。2017年11月,菏泽地区商品鸭场的10日龄樱桃谷鸭出现以肝脏肿大出血、脾脏坏死为特征的传染病,对养殖业造成了巨大损失。本研究为该病的有效防控提供了技术支持。主要内容包括:1.NDRV的分离鉴定无菌取菏泽地区10日龄商品代樱桃谷肉鸭的肝脏、脾脏并研磨,将病料过滤后分别接种SPF鸡胚、SPF鸭胚、鸭胚成纤维细胞（DEF细胞）和非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）,培养3～5 d后,收集死亡胚体尿囊液和病变细胞上清液使用NDRVσC基因特异性引物进行RT-PCR鉴定及测序分析。结果显示,分离到1株NDRV,命名为NDRV017株,该分离株与NCBI上9株NDRV参考毒株的相似性在95.3～99%之间。2.灭活疫苗的初步研制将病毒液接种到Vero细胞,待细胞病变程度达80%时,使用3‰甲醛灭活36h,制备NDRV油乳剂灭活疫苗。3.灭活疫苗的免疫原性探究将种鸭二免后28 d的种蛋孵化出的1日龄雏鸭作为试验鸭,同时设同批次未免疫种鸭的后代作为阴性对照,人工感染用NDRV株为NDRV017E3株。阴性对照组腿肌接种灭菌PBS 0.8 m L,其余三组分别腿肌接种等体积8个ELD50的NDRV017E3株（病毒含量为4.50×105/羽）,攻毒10 d后处死动物并采集脾脏组织。以脾脏是否坏死作为判断指标,发现母源抗体对雏鸭的保护率为53.3%,卵黄抗体对雏鸭的保护率为40%,与阳性对照组相比,母源抗体可有效降低雏鸭感染NDRV风险（P<0.05）,对雏鸭具有较好地保护作用;统计各组体重的增重情况,结果显示,与阴性对照组相比,阳性对照组雏鸭体重降低16%（P<0.05）,母源抗体组、卵黄抗体组分别降低4.57%（P>0.05）、9.43%（P>0.05）。结果表明,樱桃谷种鸭免疫该疫苗28 d后,50%以上的后代雏鸭可通过携带的母源抗体获得保护,优于市场上商品疫苗的免疫保护效果。
姚忠慧[2]（2021）在《鸡源呼肠孤病毒变异株的分离鉴定及感染性克隆的构建》文中指出鸡病毒性关节炎是由禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）引起的一种传染病,该病可侵害不同日龄及不同品种的鸡,尤其是商品肉鸡,造成鸡的跗关节肿胀甚至瘫痪,饮水量和采食量下降并伴有死亡。近年来鸡病毒性关节炎的发病率不断增加,严重危害着我国养鸡业的健康发展。本研究从山东烟台地区疑似ARV感染的患鸡肌腱中分离出一株ARV,命名为SDYT,并对SDYT株进行全基因组序列分析及致病性研究,同时以实验室已分离的LY383株为基础构建了ARV感染性克隆,为ARV的深入研究提供了理论依据,也为从分子水平上深入开展ARV的致病机理、传播机制和免疫防制等研究提供技术平台。主要研究内容如下:1、本研究对山东烟台地区疑似ARV感染的患鸡肌腱进行病毒的分离,病料接种鸡胚肝细胞后出现合胞体的细胞病变,RT-PCR检测及ARV S1基因测序结果表明该病毒为ARV,将其命名为SDYT,并进行全基因组序列分析。同源性分析结果显示,SDYT株与传统标准毒株S1133和1733的核苷酸同源性较低,分别为54.4%～93.2%和54.7%～93.1%,氨基酸同源性也较低,分别为49.2%～99.0%和49.8%～99.0%;将SDYT株与其他参考株进行核苷酸和氨基酸的同源性分析,其S1和S2基因与17203-M-06株同源性最高,分别为68.9%～93.4%和70.9%～99.0%;S3、M3、L2基因与LY383株同源性最高,分别为89.9%～97.8%和96.5%～99.5%;S4基因与878-Bi-05株同源性最高,分别为92.3%和99.2%;M1和L1基因与2408株同源性最高,分别为90.7%～93.2%和98.6%～99.2%;M2基因与D1104株同源性最高,分别为93.0%和97.9%;L3基因与138株同源性最高,分别为90.5%和96.8%。遗传进化分析结果显示,SDYT株与鸡源呼肠孤病毒亲缘关系较近;根据σC基因遗传进化分析,SDYT株属于基因4型ARV,传统标准毒株S1133和1733属于基因1型ARV;根据其他基因遗传进化分析,SDYT株与传统标准毒株S1133和1733除S3编码的σB、M1、L1和L2基因处于同一个分支外,其他6个基因片段均处于不同分支。综上,SDYT株是由不同鸡源ARV经片段重组进化而来的ARV变异株。2、120只1日龄健康罗斯308肉鸡随机分为4组,每组30只,A组为静脉攻毒组,B组为脚垫攻毒组,C组为口服攻毒组,D组为对照组。攻毒组每只接种0.4 m L(TCID50为10-5.401/0.1 m L)病毒液,对照组每只接种0.4 m L生理盐水,每日观察临床症状。于攻毒后3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d,21 d每组随机选取3只肉鸡,称重后采集泄殖腔棉拭子、采血并分离血清,剖检后收取各组织器官并对采集的样品进行检测。临床症状和剖检结果显示,SDYT株各攻毒组肉鸡均出现关节肿胀、卧地不起的症状,剖检可见跗关节皮下淤血,腱鞘内有黄色胶状黏液,十二指肠充血,脾脏肿大,肾脏肿大及胸腺充血,以A组和B组症状最严重;增重结果显示,各攻毒组体重增长缓慢,以B组最显着;抗体检测结果显示,各攻毒组抗体水平较对照组稍高;泄殖腔排毒检测结果显示,各攻毒组早期排毒量较高,随后降低;病毒血症检测结果显示,SDYT株可引起肉鸡病毒血症,攻毒后3 d即可在血液中检出病毒,6 dpi～9 dpi达到高峰,15 dpi后开始下降;各组织器管病毒载量检测结果显示,攻毒组各组织器官均能检测到病毒的存在,肌腱中的病毒载量较高,法氏囊和气管的病毒载量较低。以上试验表明,人工感染SDYT株可引起肉鸡病毒性关节炎、生长抑制及病毒血症。3、利用全长c DNA扩增及同源重组的方法对LY383株进行反向遗传操作。用高保真酶扩增出LY383株全基因组10个片段,对M1片段进行点突变以作为分子标签。改造p Blue Script II SK（+）载体（p BSK载体）,使其带有T7启动子和T7终止子,目的片段用同源重组的方法连接到载体的启动子和终止子之间。10个p BSK重组质粒在提取后按不同浓度共转染到BSR-T7细胞,培养72 h后收取细胞冻融3次,离心后将上清液无菌接种到SPF鸡胚盲传3代。收集鸡胚尿囊液进行鉴定,RT-PCR结果显示,盲传3代后仍能检测到拯救病毒S1基因的存在;分子标签检测结果显示已成功引入分子标签;对接种3代后的鸡胚进行观察,拯救毒与亲本毒鸡胚都出现卵黄破裂和胚体充血的现象。本研究成功克隆出鸡呼肠孤病毒LY383株全基因组10个重组质粒,优化了10个质粒共转染时的最佳配比,构建了ARV感染性克隆,为深入开展ARV的致病机理和免疫防制等研究提供了技术平台。
周雨洁[3]（2021）在《一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及竞争ELISA检测方法的建立》文中提出禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）,属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属,可引起鸡的病毒性关节炎（Avain viral arthritis）,感染率可达100%,发病率为5%～20%,死亡率为1%～3%,能够引起肉鸡胴体品质下降和蛋鸡产蛋率下降。近年来,该病在我国流行呈上升趋势,ARV变异毒株更是给家禽业造成了严重的经济损失。竞争ELISA（Competitive ELISA,C-ELISA）是定量小分子时常用的方法。在该方法中,将与靶标功能相同的标记的竞争分子与检测样本共同孵育,随着样本中靶标分子的浓度增加,能与固相抗原结合的竞争分子呈现下降趋势,此时C-ELISA的信号降低。通过检测信号干扰量,观察预期信号输出的干扰程度来测定待测样本中抗体的浓度,能够有效避免间接ELISA潜在的二抗交叉反应,特异性强,灵敏度高。本研究采用鸡胚肝细胞分离方法对疑似感染病料进行病毒分离,通过RT-PCR检测、同源性比较、遗传进化分析等方法进行病毒的鉴定。病料研磨液接种鸡胚肝细胞后能够引起细胞融合,与典型细胞病变特征相吻合。RT-PCR检测结果与目标条带一致。通过对分离株S1～4基因的同源性和遗传变异分析发现,该分离株S1基因与经典毒株S1133、1733和2048的同源性分别只有76.4%、76.5%和76.5%,S2基因与经典毒株S1133、1733同源性能达到91.6%和91.5%,S3基因与经典毒株S1133、1733、2048同源性为88.93%、89.10%和88.22%,S4基因与经典毒株S1133、1733同源性能达到80.4%和80.5%,且均离经典毒株遗传距离较远。以上数据结果均显示本研究分离得到的是一株ARV变异毒株,将其命名为:ARV-8毒株。动物回归试验表明该毒株能够导致鸡的关节发生肿胀,关节腔有明显渗出,胸腺、脾等免疫器官肿大,且肉鸡比蛋鸡更为易感。利用本实验室构建的σC-pET-32a重组表达质粒,转入E.coli BL21（DE3）表达菌,优化诱导表达融合蛋白。通过镍柱亲和层析法进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳确定目的蛋白的表达形式为包涵体,通过蛋白质印迹（Western blot）、BCA浓度测定,证明重组蛋白表达特异性良好,反应性高。免疫14日龄的SPF鸡,每隔两周进行二免和三免,采集三免后的鸡血清,制备标准阳性血清。酶联免疫吸附试验（ELISA）测定阳性血清的效价为1:8000;通过间接免疫荧光（IFA）、Western blot、无菌性检测,证实其特异性、纯净性良好。通过方阵法确定蛋白最佳包被浓度为1:400,单抗最佳稀释浓度为1:500;血清最佳稀释浓度为1:50,羊抗鼠Ig G-HRP酶标二抗最佳稀释浓度为1:4000,封闭液选择为5%脱脂奶粉,最佳包被时间为4℃过夜,最佳封闭时间为2h,血清、单抗最佳孵育时间为1h,二抗最佳孵育时间为1h,显色液最佳时间为20min。将本研究建立的方法初步应用于临床检测,效果良好。综上所述,本研究从疑似感染的病鸡中分离鉴定出一株ARV变异野毒株,原核表达其主要结构蛋白σC,制备ARV阳性和阴性血清,建立了检测ARV抗体的竞争ELISA方法,为ARV变异毒株的检测,以及流行病学调查和疫苗评估提供了技术支持。
张旭杰[4]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用》文中认为近几年来,我国多个省份广泛流行由新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）感染引起的以脾脏坏死为主要特征的传染性疾病。NDRV感染会对雏鸭脾脏和其他免疫器官造成损害,抑制免疫系统,导致雏鸭对其他病原体易感性增强,诱发混合感染。该病毒可感染多个品种的雏鸭,日龄越小,发病率和死亡率越高。患病雏鸭临床常表现为精神倦怠、喜卧、拉稀、发育受阻、生长缓慢,饲料返还率大幅降低。本研究使用鸡胚肝细胞对实验室保存的新型鸭呼肠孤病毒SDYC株进行病毒扩增,获得大量抗原液后制备灭活疫苗免疫开产蛋鸡,收集卵黄样品制备新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体,为NDRV的预防和治疗提供支持和保障。新型鸭呼肠孤病毒SDYC株接种鸡胚肝细胞,病毒感染36h后收取细胞病毒液,离心后取上清液作为制备灭活疫苗的抗原液。对抗原液进行毒力效价、纯净度检测和动物回归试验,均符合疫苗制备要求。选择终浓度为0.2%甲醛溶液37°C灭活抗原液24h,灭活后与Tween-80按94:6的比例混合配制疫苗水相。无菌操作加入2份水相、3份油相乳化疫苗,制成油乳剂灭活疫苗。对疫苗的安全性、剂型、物理性状、储存条件进行检测,疫苗剂型为油包水型,物理性状稳定,未检测到细菌以及支原体等微生物,可在4°C保存12个月。灭活疫苗免疫开产蛋鸡,连续免疫4次,每次免疫间隔14d,4次免疫后每隔1周收集蛋黄样品进行ELISA抗体效价检测。结果显示免疫蛋卵黄抗体水平不断升高,至第三周达到最大值后抗体水平逐渐下降。收取免疫蛋经蛋壳消毒、蛋黄分离、一次灭活、醋酸酸化、辛酸萃取、二次灭活、粗滤、除菌细滤、超滤浓缩、三次灭活、除菌细滤后制备成防治新型鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体。对卵黄抗体的物理性状、p H值、安全性、抗体效价进行检测,均符合抗体生产标准。进行动物免疫保护试验检验新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体对雏鸭的保护效力,结果显示雏鸭注射抗体后机体抗体水平迅速升高,第4d左右机体抗体水平达到最高峰。雏鸭注射1.0 m L卵黄抗体后第21d检测血清抗体效价仍呈阳性,卵黄抗体持续保护时间完全覆盖雏鸭整个易感期,可大大降低新型鸭呼肠孤病毒对雏鸭的感染率。健康雏鸭人工感染新型鸭呼肠孤病毒后当天开始排毒,临床表现反应迟缓、喜卧、扎堆、饮食量下降。剖检发病雏鸭,脾脏坏死、肝脏出血症状明显。患病雏鸭注射卵黄抗体后,排毒雏鸭数量不断减少直至患病雏鸭不再排毒,精神状态良好,采食量、饮水量恢复正常。剖检雏鸭发现肝脏出血和脾脏坏死症状明显减轻,部分雏鸭恢复正常。综上所述,新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体制作流程简单、成本较低、安全性好、保护效果明显、治愈率高,可以有效用于预防和治疗鸭群爆发的以脾脏坏死为主要症状的新型鸭呼肠孤病毒感染,对新型鸭呼肠孤病毒感染的预防及治疗极具应用价值。
李静[5]（2020）在《新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及油乳剂灭活疫苗的制备》文中指出新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）病是一种以脾脏肿大、出血、坏死为主要特征的疾病,自2017年以来,发病率和死亡率相对较高,给我国养鸭业造成了严重的经济损失。本研究从临床疑似样品中分离到NDRV,对分离株进行分离鉴定,构建病毒感染模型,制备油乳剂灭活疫苗,为NDRV的防控提供技术支持。本实验室在2017年2019年对来自山东、安徽等地送检的30份疑似患病样品进行RT-PCR检测,结果显示10份样品为阳性。对这10份阳性样品进行病毒分离,接种SPF鸡胚胚体明显出血,接种鸡胚肝细胞产生合胞体病变。分离株测序后对其进行同源性比对分析并绘制遗传进化树,同源性比对结果显示:10株分离株的同源性在97.4%99.4%之间,分离株与DRV经典毒株的同源性在94.6%96.5%之间,说明NDRV较DRV发生明显的变异。遗传进化树结果显示:分离株与水禽源呼肠孤病毒位于同一分支,说明NDRV与水禽源呼肠孤病毒的遗传关系相对较近。通过对分离株进行同源性比对及遗传进化树分析,SDYC株与DRV的同源性差异最大,并根据其致病性及免疫原性的分析,筛选出SDYC株作为疫苗株,对筛选株进行动物回归试验,通过腿部肌肉接种1日龄雏鸭,结果表明,接种0.2mL(TCD50为10-7.2)病毒液后雏鸭出现精神沉郁,食欲减退等临床症状,剖检可见脾脏出血、坏死,肝脏有坏死点等特征性病理变化。将SDYC株病毒液接种鸡胚肝细胞,病毒感染后48h72h收取细胞病毒液。本研究选用转瓶培养方式进行细胞培养和病毒增殖,该方法可快速扩增出大量的抗原液。选用甲醛将抗原液灭活后与吐温-80以94:6的比例混合制备疫苗水相。按照3:2的油水相比进行乳化,制备NDRV油乳剂灭活疫苗。对该疫苗的理化性状,最佳免疫剂量,免疫保护效果及免疫后雏鸭血清中抗体水平变化进行检测。结果表明,最佳灭活条件为0.2%的甲醛溶液37°C灭活24h。疫苗的理化性状及安全性检测结果显示,疫苗剂型为油包水型,物理性状稳定,未检测到细菌以及支原体等微生物,可在4°C保存12个月。对5日龄雏鸭颈部皮下注射1.0mL该灭活疫苗,未出现局部炎性反应及全身性不良反应,表明该疫苗安全性良好。免疫保护试验的结果显示该疫苗的最佳剂量为0.3mL/羽。ELISA OD450值达到0.508时,中和抗体水平达到24时,即可有效抵御NDRV的感染。攻毒保护试验中,非免疫组大部分样品检测结果为阳性,21d以内均检测到样品阳性,说明非免疫组雏鸭长期带毒且排毒。0.1mL免疫组也检测出部分阳性样品。0.3mL1.0mL免疫组仅检测出一个阳性样品,保护率在96%以上。综上所述,本研究制备的NDRV油乳剂灭活苗具有良好的免疫保护效果,能够有效抵抗NDRV的感染。
刘创[6]（2020）在《鹅细小病毒和鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及其二联灭活疫苗的初步研制》文中提出鹅细小病毒病是由鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）引起的一种急性或亚急性的败血性传染病,主要侵害420日龄的雏鹅,以肠道形成栓塞为主要特征。鹅呼肠孤病毒病（goose reovirus,GRV）又称为“鹅出血性坏死性肝炎”,主要侵害23周龄雏鹅,被感染雏鹅主要的病理变化是肝脾坏死、胰腺出血、肾脏坏死等。这两种病毒通常混合感染,发病急,死亡率较高。本研究对GPV及GRV毒株进行分离鉴定,研制了鹅细小病毒-呼肠孤病毒二联灭活疫苗。主要内容如下:1、GPV和GRV的分离与鉴定本研究对实验室采集的疑似患有GPV病料、GRV病料进行了病原的分离鉴定,并分别命名为GPV毒株（AHDY株）和GRV毒株（JSXZ株）。对以上两种毒株分别进行了序列的测定与分析、动物回归试验等。通过DNAStar软件对AHDY分离株VP3基因、JSXZ分离株σC基因与相应参考株进行序列同源性比对和进化树的构建。结果表明,AHDY分离株与近年来分离GPV参考株同源性在92.1%以上,与MDPV参考株处于不同的分支上,同源性在74.6%80.4%。JSXZ分离株的核苷酸序列与水禽源呼肠孤病毒的有很高的同源性,可达95.9%98.0%,而与鸡源呼肠孤病毒同源性仅42.9%46.6%。JSXZ分离株与水禽源呼肠孤病毒遗传关系较近,而与鸡呼肠孤病毒遗传关系相对较远。动物回归试验表明,2周龄的健康雏鹅感染以上两种毒株后,可分别表现出与自然发病病例一致的临床症状和剖检变化。表明两株分离毒株较好的免疫原性,可用于二联疫苗的研制。2、GPV和GRV二联灭活疫苗的初步研制及免疫效力试验GPV、GRV种毒进行集中大量扩繁并分别进行毒力测定。将以上两种经透析浓缩的抗原液等体积混合后,与吐温-80以96:4的比例混合,按照油水比2:1进行乳化,制备鹅细小病毒-呼肠孤病毒二联灭活疫苗,理化性状检验、安全性及保质期检验结果显示,符合油乳剂灭活疫苗制备标准。为了评价试制二联灭活疫苗的免疫效力,该疫苗接种非免疫种鹅,对其最小免疫剂量、免疫持续期进行了监测。结果表明,在一定范围内,GPV、GRV血清抗体水平均与免疫剂量呈正相关,而且其抗体水平也均随着免疫时间的延长而逐渐升高。以0.8mL/只免疫种鹅时,至免疫后2周,GPV、GRV血清抗体即可上升至阴阳临界值之上,其中1mL免疫剂量组抗体水平更高。免疫持续期试验结果表明,GPV血清抗体水平免疫后3周上升至较高水平,在免疫后4周上升至最高,直至监测至免疫后8周仍为阳性;GRV血清抗体水平在免疫后3周上升至较高水平,在免疫后5周达到峰值,在免疫后7周血清抗体为阳性,而到免疫后第8周就处于阴阳临界值之下。终上所述,以0.8mL/只免疫种鹅,GPV、GRV血清抗体水平至少持续7周。结果表明,本研究研制的二联疫苗免疫种鹅有良好的免疫原性,为进一步开展二联灭活疫苗的研究提供一定的理论依据。
张玉杰,刘东,刘红祥,宫晓,李陆梅,赵子曈,邹敏,范根成,杜元钊[7]（2020）在《肉鸡呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究》文中研究指明【目的】从临床发病的疑似感染鸡呼肠孤病毒的白羽肉鸡病料中分离鉴定获得1株鸡源呼肠孤病毒SD18,对SD18株进行致病性及传播特性研究,为该病毒的深入研究和综合防治奠定基础。【方法】无菌采集疑似感染鸡呼肠孤病毒发病鸡跗关节处的肌腱和渗出物,分离病原物,在LMH细胞上培养,并连续盲传3代,经无菌生理盐水倍比稀释,采用Reed-Muench法测定病毒鸡胚半数致死量(ELD50)和组织细胞半数感染量(TCID50);对分离毒株进行理化特性和血凝特性测定;利用设计的鸡呼肠孤病毒L1和S1基因特异性引物,对提取的病毒总RNA进行RT-PCR扩增,经PCR鉴定为阳性的菌落进行基因测序以及核苷酸同源性比对和系统遗传进化分析;用该分离株病毒对SPF鸡和白羽肉鸡进行动物回归试验,并用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定攻毒后的SPF鸡血清中呼肠孤病毒抗体滴度。【结果】从疑似感染鸡呼肠孤病毒发病鸡跗关节处的肌腱和渗出物中分离获得1株鸡源呼肠孤病毒SD18,其ELD50为10-6.5/0.1 mL,TCID50为10-7.36/0.1 mL。RT-PCR结果显示,目的基因片段长度分别为1 100,750,265 bp,依次为鸡呼肠孤病毒的S1、σC和L1基因片段。核苷酸同源性比对结果显示,该分离株SD18与Ⅴ群鸡源呼肠孤病毒TW-918（台湾株）的S1基因序列同源性达92.7%,与Ⅰ群鸡病毒性关节炎疫苗S1133株的同源性仅为59.0%。核酸序列遗传进化分析表明,该分离株SD18与Ⅴ群鸡源呼肠孤病毒TW-918（台湾株）处于同一进化分支上,与Ⅰ群鸡源呼肠孤病毒S1133株处于不同的进化分支上,说明新分离的肉鸡呼肠孤病毒SD18株属于基因Ⅴ群,可能是Ⅰ群经典鸡源呼肠孤病毒S1133株的变异毒株。SPF鸡和白羽肉鸡回归试验表明,SD18株病毒能够引起鸡病毒性关节炎,与临床发病一致,并能水平传播。接种试验表明,病毒SD18能致死鸡胚,打开死亡鸡胚可见其绒毛尿囊膜增厚、尿酸盐沉积、胚体出血等症状,符合呼肠孤病毒的致病特点。【结论】该分离株SD18为新型肉鸡呼肠孤病毒,能够引起鸡发生病毒性关节炎。
于可响,刘存霞,宫晓,路晓,胡峰,郭效珍,马秀丽,李玉峰,黄兵,宋敏训[8]（2019）在《一株肉鸡呼肠孤病毒变异株的分离鉴定》文中研究说明旨在研究肉鸡呼肠孤病毒分离株致病与基因组变异情况。2017年从山东潍坊地区跗关节肿胀、出血严重商品肉鸡中收集病料,进行病毒分离,通过RT-PCR检测、电镜观察对病毒进行鉴定;将分离到的病毒回归商品肉鸡;设计18对引物对分离株全基因组扩增测序,并进行了遗传进化分析;将分离毒株与经典毒株S1133进行血清交叉中和试验。结果表明分离到一株禽呼肠孤病毒（命名为WF17）,回归商品肉鸡能完全复制出临床症状,并能从试验鸡中重新分离到该病毒。该分离株基因组完全符合禽呼肠孤病毒基因组结构特点,主要抗原σC蛋白基因与台湾918株最接近,相似性为92.7%,与S1133株的相似性只有55.9%。WF17株与S1133株的抗原相关指数（R值）只有0.19。目前以S1133株为主的商品化疫苗无法对禽呼肠孤病毒变异株产生有效保护。
高斌[9]（2019）在《新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究》文中研究说明最近几年,在我国肉鸭养殖地区出现一种以脾脏坏死为特征的疾病,该病主要造成患鸭大群精神状态差,饮水、采食均出现下降并伴有死亡,脾脏坏死后机体免疫力下降容易继发感染造成更高的死亡率,耐过鸭发育受阻、生长缓慢,成为僵鸭。目前,大多数研究者认为新型鸭呼肠孤病毒（New type duck reovirus,NDRV）是造成该病的主要病原,针对该病发病日龄小、病情发展快、容易快速传播的特点,急需建立一种快速、精确、可靠的检测方法应用于该病早期定性与定量诊断。本研究从患鸭的坏死脾脏中分离到一株NDRV,对分离的毒株进行了序列分析及致病性研究。针对该病建立了TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并利用该方法对病毒在感染肉鸭不同组织器官中的分布、排毒规律及病毒血症情况进行了监测,为该病的防控提供了理论依据。根据NDRV S2基因序列设计一对引物和一条特异性探针,扩增长度85 bp。将扩增的片段连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、测序鉴定后,倍比稀释作为标准品,优化反应条件后构建标准曲线,建立检测NDRV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法。该方法的标准曲线有良好的线性关系,线性回归方程为y=-3.3468x+41.681,相关系数R2为0.9988;敏感性良好,最小检出模板浓度为10 copies/μL,是普通PCR的1000倍;特异性良好,仅能检测NDRV,与其他病毒无交叉反应现象;批间和批内变异系数均在3%以下,重复性良好。以上试验表明,本研究建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高,特异性强、重复性好,可用于NDRV的临床检测。180只1日龄健康樱桃谷雏鸭随机分为3组,肌肉接种组、口服接种组和对照组各60只,口服接种组和肌肉接种组1日龄每只接种0.2 mL病毒液,对照组每只接种0.2 mL无菌生理盐水。观察记录雏鸭感染后的临床症状及剖检变化,每隔2d称重用来监测体重增长变化;采集各组泄殖腔棉拭子和抗凝血3份,检测肉鸭的排毒情况及病毒血症情况。于攻毒后12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d、21 d、24 d、27 d、30 d,每组随机抽取3只剖杀,将病变组织器官制备石蜡切片,观察其组织病理学变化,同时收取各组织进行病毒载量的测定。结果显示,试验组雏鸭均出现脾脏肿大、出血和坏死;试验组雏鸭体重增长缓慢,以口服接种组最为显着;棉拭子排毒规律结果显示,两组均在感染早期出现排毒;血液中病毒载量变化结果显示,两组均在感染早期检测到病毒存在,且含量变化与棉拭子排毒规律基本一致;组织病毒载量结果显示,人工感染SDYC株后,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、十二指肠、胃、法氏囊、胸腺、脑中均能检测到病毒,两组病毒含量较高的器官为脾脏、胸腺和法氏囊,可作为检测该病的优选器官。1日龄健康罗斯308肉鸡和SPF鸡随机分为肌肉接种组、口服接种组和对照组,口服接种组和肌肉接种组1日龄每只接种0.2 mL病毒液,对照组每只接种0.2 mL无菌生理盐水。观察记录雏鸡感染后的临床症状及剖检变化。结果显示SPF雏鸡和肉鸡攻毒后肌肉接种组均出现精神沉郁和死亡,其中SPF雏鸡肌肉接种组死亡率高达100%,肉鸡肌肉接种组死亡率达到71.4%;口服接种组和对照组无明显变化。死亡雏鸡剖检病变大体一致,主要包括:腹腔有大量腹水;肝脏和脾脏肿大、出血、出现大面积坏死灶。说明NDRV在生产中有跨种传播感染鸡群的可能,要加强生物安全的防范。
李璐瑶[10]（2019）在《一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及防污染RT-LAMP检测法的建立》文中研究说明禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属,可引起鸡的病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病、免疫抑制等。导致肉鸡饲料转化率低、增重下降、生长不齐,蛋鸡除跛行外还会引起产蛋量下降、孵化率下降等,增加了养殖成本。自1985年我国首次报道禽呼肠孤病毒感染以来,此后多个省市地区均出现了该病的报道,感染情况日益加重,严重危害养禽业的发展。深化该病的研究对于我国养鸡产业的健康和稳定发展具有积极的意义。本研究从疑似ARV感染的免疫肉鸡体内分离得到一株ARV,对该毒株进行了序列分析及理化性质的研究。同时建立了一种快速可消除携带污染的UDG-RT-LAMP检测方法,并对该方法的反应条件进行了优化,为ARV感染的防控及快速检测提供了理论依据和新思路。本研究分别利用SPF鸡胚和鸡胚肝细胞（CEL）对山东潍坊地区疑似ARV感染的免疫肉鸡关节病料进行了病毒病原的分离,将分离株命名为WF株,对分离毒株进行了序列的测定与分析、毒力的测定、动物回归试验、理化性质的测定等试验。鸡胚和CEL细胞接种病料处理液后出现的特征性病变均与报道相符。分别提取RNA,RT-PCR反应扩增产物的条带大小与预期相符。σC基因的遗传进化分析表明,该分离株属于第四分支,与参考株核苷酸同源性为50.3%74.7%,氨基酸同源性为22.7%54.3%,其中与常用疫苗株1733、2408、S1133的同源性均较低。分离株的ELD50为10-5.25/0.2mL,TCID50为10-5.29/0.1mL,对60℃、70℃敏感,对50℃、氯仿不敏感,在pH 3.09.0范围内保持稳定。动物回归试验表明,1日龄健康SPF雏鸡感染该毒株后,临床表现及剖检变化与自然发病病例一致。根据ARV M1基因设计了一套特异性LAMP扩增引物,初步建立了ARV检测的UDG-LAMP体系,并进行了反应条件的优化。优化结果为dNTP浓度为1.2 mM,MgSO4浓度为8 mM,Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶浓度为320 U/mL,65℃扩增60 min。该方法特异性好,仅能对ARV进行扩增;灵敏度高,最低检测限为3×102拷贝/μL,是PCR方法的100倍;防携带污染作用明显。在临床样品检测中,UDG-RT-LAMP法的阳性检出率比RT-PCR法高16.7%,表明建立的UDG-RT-LAMP检测法在临床检测应用中更具有优势。
二、鸡呼肠孤病毒分离与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡呼肠孤病毒分离与鉴定（论文提纲范文）
（1）鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究（论文提纲范文）
| 符号及缩略词说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 呼肠孤病毒发展 |
| 1.2 DRV的病原学特点 |
| 1.2.1 形态和结构 |
| 1.2.2 宿主 |
| 1.2.3 理化特性及血凝性 |
| 1.3 DRV的致病性 |
| 1.3.1 流行病学特点及临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.4 DRV的诊断 |
| 1.4.1 分离与鉴定 |
| 1.4.2 分子生物学鉴定 |
| 1.4.3 血清学诊断 |
| 1.5 呼肠孤病毒病防控的研究进展 |
| 1.5.1 弱毒疫苗 |
| 1.5.2 灭活疫苗 |
| 1.5.3 其他生物制品 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料背景 |
| 2.1.2 试验用胚、试验动物 |
| 2.1.3 试验毒株 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 试验相关溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物的合成 |
| 2.2.2 分离与鉴定 |
| 2.2.3 RT-PCR检测及测序分析 |
| 2.2.4 生物学及理化特性研究 |
| 2.2.5 一步生长曲线的绘制 |
| 2.2.6 灭活疫苗的研制 |
| 2.2.7 灭活疫苗的检验 |
| 2.2.8 灭活疫苗免疫父母代种鸭后抗体水平检测 |
| 2.2.9 母源抗体对商品代雏鸭的被动保护试验 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRV的分离与鉴定 |
| 3.1.1 病毒的分离与传代 |
| 3.1.2 RT-PCR鉴定结果 |
| 3.1.3 测序结果与分析 |
| 3.1.4 生物学及理化特性鉴定结果 |
| 3.1.5 一步生长曲线的绘制 |
| 3.2 灭活疫苗的研制 |
| 3.2.1 病毒液的制备 |
| 3.2.2 病毒液的纯净性检验 |
| 3.2.3 病毒含量(TCID_(50))的测定 |
| 3.2.4 疫苗的制备 |
| 3.2.5 灭活疫苗的检验 |
| 3.3 疫苗的免疫原性探究 |
| 3.3.1 灭活疫苗免疫父母代种鸭后抗体水平检测结果 |
| 3.3.2 母源抗体对商品代雏鸭的被动保护试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NDRV的分离与鉴定 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 灭活疫苗的免疫原性探究 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）鸡源呼肠孤病毒变异株的分离鉴定及感染性克隆的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒病原学概述 |
| 1.1.1 分类及形态学 |
| 1.1.2 理化特性及培养特性 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 临床症状及病理变化 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 ARV基因组特性 |
| 1.2.2 ARV主要蛋白 |
| 1.3 感染性克隆研究进展 |
| 1.3.1 感染性克隆研究背景 |
| 1.3.2 正链RNA病毒感染性克隆构建方法 |
| 1.3.3 负链RNA病毒感染性克隆构建方法 |
| 1.4 呼肠孤病毒感染性克隆研究研究进展 |
| 1.4.1 MRV感染性克隆的构建 |
| 1.4.2 BTV感染性克隆的构建 |
| 1.4.3 其他呼肠孤病毒感染性克隆的构建 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料、细胞和动物 |
| 2.1.2 载体、鸡胚和毒株 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.2 分离株对肉鸡的致病性研究 |
| 2.2.3 鸡呼肠孤病毒感染性克隆的构建 |
| 3.结果 |
| 3.1 ARV的分离鉴定 |
| 3.1.1 ARV的分离结果 |
| 3.1.2 SDYT株全基因组序列分析结果 |
| 3.1.3 SDYT株遗传进化分析 |
| 3.2 鸡呼肠孤病毒的致病性研究 |
| 3.2.1 病毒TCID50 的测定 |
| 3.2.2 人工感染肉鸡后临床症状 |
| 3.2.3 人工感染肉鸡后剖检变化 |
| 3.2.4 人工感染肉鸡后病理组织学变化 |
| 3.2.5 人工感染肉鸡后体重变化 |
| 3.2.6 人工感染肉鸡后各组织中ARV载量的测定 |
| 3.2.7 人工感染肉鸡后病毒血症及排毒规律 |
| 3.2.8 人工感染肉鸡后血清中ARV抗体水平变化 |
| 3.2.9 人工感染肉鸡后血清中细胞因子水平变化 |
| 3.3 鸡呼肠孤病毒感染性克隆的构建 |
| 3.3.1 ARV全基因组RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.2 重组质粒构建结果 |
| 3.3.3 病毒的拯救 |
| 3.3.4 拯救病毒的RT-PCR检测 |
| 3.3.5 拯救病毒分子标签的鉴定 |
| 讨论 |
| 4.1 鸡呼肠孤病毒变异株的分离鉴定分析 |
| 4.2 鸡呼肠孤病毒变异株对肉鸡致病性的研究 |
| 4.3 ARV感染性克隆的构建 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及竞争ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡源呼肠孤病毒病的概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 致病性 |
| 1.2 鸡呼肠孤病毒病的诊断及防控 |
| 1.2.1 病毒分离与鉴定 |
| 1.2.2 分子生物学诊断 |
| 1.2.3 血清学诊断 |
| 1.2.4 防控措施 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离及鉴定 |
| 2.2.2 σC蛋白的原核表达 |
| 2.2.3 阳性血清、阴性血清的制备 |
| 2.2.4 ARV抗体竞争ELISA方法的建立及应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 毒株的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 病毒分离情况 |
| 3.1.2 RT-PCR扩增结果 |
| 3.1.3 遗传进化分析 |
| 3.1.4 病毒纯净性检测结果 |
| 3.1.5 ELD_(50)的测定结果 |
| 3.1.6 TCID_(50)的测定结果 |
| 3.1.7 动物回归试验结果 |
| 3.2 σC蛋白的原核表达 |
| 3.2.1 SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.2.2 Western-blot鉴定结果 |
| 3.2.3 蛋白浓度的确定 |
| 3.3 阳性血清、阴性血清的制备 |
| 3.3.1 血清的特异性鉴定结果 |
| 3.3.2 ELISA效价检测结果 |
| 3.3.3 血清的质量检验结果 |
| 3.4 ARV抗体竞争ELISA方法的建立及应用 |
| 3.4.1 ARV抗体竞争ELISA方法的优化 |
| 3.4.2 ARV抗体竞争ELISA方法的建立 |
| 3.4.3 临界值的判定 |
| 3.4.4 特异性试验结果 |
| 3.4.5 敏感性试验结果 |
| 3.4.6 重复性试验结果 |
| 3.4.7 临床检测试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 呼肠孤病毒历史及分类 |
| 1.1.2 病毒形态学和理化特性 |
| 1.1.3 病毒培养特性 |
| 1.2 鸭呼肠孤病毒的基因组及主要蛋白 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床特征 |
| 1.3.3 病理学变化 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.2 分子生物学诊断 |
| 1.5 鸭呼肠孤病毒灭活疫苗 |
| 1.6 禽蛋的一般特性 |
| 1.6.1 卵黄的结构和组成 |
| 1.6.2 卵黄的乳化性 |
| 1.7 卵黄抗体 |
| 1.7.1 卵黄抗体技术发展简史 |
| 1.7.2 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的优势 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 细胞及雏鸭 |
| 2.1.3 种毒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 新型鸭呼肠孤病毒的扩增与检测 |
| 2.2.2 油乳剂灭活苗的研制 |
| 2.2.2.1 新型鸭呼肠孤病毒灭活条件研究 |
| 2.2.2.2 油相的制备 |
| 2.2.2.3 水相的制备 |
| 2.2.2.4 乳化 |
| 2.2.3 灭活疫苗的质量检验 |
| 2.2.3.1 剂型检验 |
| 2.2.3.2 离心稳定性检验 |
| 2.2.3.3 无菌检验 |
| 2.2.3.4 粘度检验 |
| 2.2.3.5 保存期检验 |
| 2.2.3.6 疫苗安全性检验 |
| 2.2.3.7 灭活疫苗对蛋鸡的免疫程序 |
| 2.2.3.8 ELISA抗体测定 |
| 2.3 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.3.1 卵黄抗体制造 |
| 2.3.2 卵黄抗体效价测定 |
| 2.3.3 卵黄抗体性状检验 |
| 2.3.4 卵黄抗体pH值检测 |
| 2.3.5 无菌检验和安全实验 |
| 2.3.5.1 无菌检验 |
| 2.3.5.2 安全检验 |
| 2.4 雏鸭免疫保护试验 |
| 2.4.1 雏鸭卵黄抗体保护试验 |
| 2.4.2 雏鸭卵黄抗体治疗试验 |
| 2.4.3 卵黄抗体消长规律试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 新型鸭呼肠孤病毒扩增与检测结果 |
| 3.1.1 病毒扩增结果 |
| 3.1.2 扩增病毒纯净度检测结果 |
| 3.1.3 病毒细胞半数感染量(TCID_(50))测定结果 |
| 3.1.4 新型鸭呼肠孤病毒动物回归试验 |
| 3.2 油乳剂灭活疫苗的研制结果 |
| 3.2.1 确定抗原液最佳灭活条件 |
| 3.2.2 灭活疫苗的理化性状检验结果 |
| 3.2.2.1 灭活疫苗的剂型 |
| 3.2.2.2 灭活疫苗的稳定性 |
| 3.2.2.3 灭活疫苗的粘度 |
| 3.2.2.4 灭活疫苗无菌检验 |
| 3.2.2.5 保存期检验 |
| 3.2.2.6 灭活疫苗安全性检验 |
| 3.2.2.7 免疫蛋卵黄抗体效价测定 |
| 3.2.2.8 卵黄抗体效价测定 |
| 3.2.2.9 卵黄抗体物理性状检验结果 |
| 3.2.2.10 卵黄抗体p H值检测结果 |
| 3.2.2.11 卵黄抗体无菌检验结果 |
| 3.2.2.12 卵黄抗体安全性检验结果 |
| 3.2.2.13 雏鸭卵黄抗体保护效果 |
| 3.2.2.14 雏鸭卵黄抗体治疗试验结果 |
| 3.2.2.15 抗体消长规律结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 新型鸭呼肠孤病毒 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 卵黄抗体的制备 |
| 4.4 新型鸭呼肠孤卵黄抗体的保护效力检验 |
| 4.5 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体应用前景 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及油乳剂灭活疫苗的制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 鸭呼肠孤病毒历史及分类 |
| 1.1.2 病毒形态学和理化特性 |
| 1.1.3 病毒培养特性 |
| 1.2 鸭呼肠孤病毒的基因组及主要蛋白 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床特征 |
| 1.3.3 病理学变化 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.1.1 琼脂扩散试验 |
| 1.4.1.2 中和试验 |
| 1.4.1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4.2 分子生物学诊断 |
| 1.4.2.1 核酸探针技术 |
| 1.4.2.2 PCR技术 |
| 1.4.2.3 荧光定量RT-PCR技术 |
| 1.4.2.4 环介导等温扩增技术(LAMP) |
| 1.5 鸭呼肠孤病毒疫苗的研究进展 |
| 1.5.1 弱毒疫苗的研究 |
| 1.5.2 灭活疫苗的研究 |
| 1.5.3 基因工程疫苗的研究 |
| 1.6 预防与治疗 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 用胚及动物 |
| 2.1.3 种毒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 溶液的配制 |
| 2.1.6.1 电泳试剂 |
| 2.1.6.2 ELISA试剂 |
| 2.1.6.3 其他试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定 |
| 2.2.1.1 引物的设计合成 |
| 2.2.1.2 病毒的分离与传代 |
| 2.2.1.3 血凝试验 |
| 2.2.1.4 病毒RNA的提取 |
| 2.2.1.5 RT-PCR反应 |
| 2.2.1.6 目的片段的琼脂糖凝胶回收与纯化 |
| 2.2.1.7 连接与转化 |
| 2.2.1.8 阳性克隆鉴定与测序 |
| 2.2.1.9 病毒纯净度检测 |
| 2.2.1.10 病毒细胞半数感染量(TCID50)测定 |
| 2.2.1.11 动物回归试验 |
| 2.3 油乳剂灭活苗的研制 |
| 2.3.1 细胞在转瓶中的培养 |
| 2.3.2 转瓶的清洗及消毒 |
| 2.3.3 种毒增殖 |
| 2.3.4 鸭呼肠孤病毒灭活工艺的研究 |
| 2.3.4.1 抗原液最佳灭活条件的筛选 |
| 2.3.5 疫苗制备 |
| 2.3.5.1 油相的制备 |
| 2.3.5.2 水相的制备 |
| 2.3.5.3 乳化 |
| 2.3.6 灭活疫苗的质量检验 |
| 2.3.6.1 剂型检验 |
| 2.3.6.2 离心稳定性检验 |
| 2.3.6.3 粘度检验 |
| 2.3.6.4 无菌检验 |
| 2.3.6.5 保存期检验 |
| 2.3.6.6 疫苗安全性检验 |
| 2.3.7 最佳免疫剂量研究 |
| 2.3.8 免疫后抗体水平的监测 |
| 2.3.8.1 ELISA抗体测定 |
| 2.3.8.2 中和抗体测定 |
| 2.3.9 攻毒保护试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 病毒的分离与传代 |
| 3.1.2 血凝性结果 |
| 3.1.3 RT-PCR的检测结果 |
| 3.1.4 测序结果与分析 |
| 3.1.5 病毒的纯净性检测 |
| 3.1.6 病毒细胞半数感染量(TCID50)测定 |
| 3.1.7 动物回归试验 |
| 3.2 油乳剂灭活疫苗的研制 |
| 3.2.1 抗原液最佳灭活条件筛选 |
| 3.2.2 疫苗的理化性状检验结果 |
| 3.2.2.1 疫苗的剂型 |
| 3.2.2.2 疫苗的稳定性 |
| 3.2.2.3 疫苗的粘度 |
| 3.2.2.4 无菌检验 |
| 3.2.2.5 保存期检验 |
| 3.2.2.6 安全性检验 |
| 3.2.3 最佳免疫剂量的确定 |
| 3.2.3.1 间接ELISA抗体检测结果 |
| 3.2.3.2 中和抗体的检测结果 |
| 3.2.4 攻毒保护试验 |
| 3.2.4.1 免疫保护性试验结果 |
| 3.2.4.2 攻毒后排毒检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 疫苗的保护效力检验 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）鹅细小病毒和鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及其二联灭活疫苗的初步研制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鹅细小病毒概述 |
| 1.1.1 形态学和理化特性 |
| 1.1.2 分子生物学特征 |
| 1.1.3 流行病学特征 |
| 1.1.4 症状及病理变化 |
| 1.1.5 诊断方法 |
| 1.1.6 疫苗的研究进展 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒概述 |
| 1.2.1 形态学和理化特征 |
| 1.2.2 分子生物学特征 |
| 1.2.3 流行病学和致病性 |
| 1.2.4 诊断方法 |
| 1.2.5 疫苗的研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 毒株、载体和细胞 |
| 2.1.2 试验用胚及动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 试验主要溶液及培养基的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2.2 二联灭活疫苗的研制 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 病毒的分离情况 |
| 3.1.2 PCR鉴定结果 |
| 3.1.3 序列测定与分析 |
| 3.1.4 动物回归试验结果 |
| 3.2 二联灭活疫苗的研制结果 |
| 3.2.1 种毒的纯净性检测 |
| 3.2.2 病毒毒力的测定结果 |
| 3.2.3 抗原最佳灭活条件的确定 |
| 3.2.4 灭活疫苗物理性状检验 |
| 3.2.5 安全性检验 |
| 3.2.6 最小免疫剂量测定结果 |
| 3.2.7 免疫持续期试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GPV和 GRV的分离与鉴定 |
| 4.2 二联灭活疫苗的初步研制 |
| 4.3 疫苗的免疫效力试验 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）肉鸡呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.1.1 病料、细胞及试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 引物设计与合成 |
| 1.2 方 法 |
| 1.2.1 鸡呼肠孤病毒的分离 |
| 1.2.2 鸡呼肠孤病毒在LMH细胞上的培养 |
| 1.2.3 鸡呼肠孤病毒鸡胚半数致死量(ELD50)和组织细胞半数感染量(TCID50)测定 |
| 1.2.4 鸡呼肠孤病毒理化特性测定 |
| 1.2.5 鸡呼肠孤病毒血凝特性测定 |
| 1.3 鸡呼肠孤病毒的鉴定 |
| 1.3.1 病毒RNA的提取 |
| 1.3.2 PCR扩增和测序 |
| 1.4 动物回归试验 |
| 1.4.1 SPF鸡 |
| 1.4.2 白羽肉鸡 |
| 1.5 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鸡呼肠孤病毒的分离 |
| 2.2 鸡呼肠孤病毒SD18分离株的ELD50和TCID50 |
| 2.3 鸡呼肠孤病毒分离株SD18的理化特性和血凝特性 |
| 2.4 鸡呼肠孤病毒分离株SD18的鉴定 |
| 2.5 动物回归试验 |
| 2.5.1 SPF鸡 |
| 2.5.2 白羽肉鸡 |
| 3 讨 论 |
（8）一株肉鸡呼肠孤病毒变异株的分离鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与实验动物 |
| 1.2 病毒分离鉴定 |
| 1.2.1 病料来源 |
| 1.2.2 病原分离 |
| 1.2.3 病原鉴定 |
| 1.2.3.1 PCR鉴定: |
| 1.2.3.2 电镜观察: |
| 1.3 回归试验 |
| 1.4 基因组测序 |
| 1.5 基因组进化分析 |
| 1.6 血清交叉中和试验 |
| 2 结 果 |
| 2.1 病原分离与鉴定 |
| 2.1.1 病原分离 |
| 2.1.2 核酸检测 |
| 2.1.3 电镜观察 |
| 2.2 回归试验 |
| 2.3 基因组测序 |
| 2.4 基因组进化分析 |
| 2.5 血清交叉中和试验 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（9）新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒病原学概述 |
| 1.1.1 呼肠孤病毒的历史及分类 |
| 1.1.2 病毒形态学和理化特征 |
| 1.1.3 病毒培养特性 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒的基因组和主要蛋白 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 病原的分离与鉴定 |
| 1.4.2 血清学诊断 |
| 1.4.3 分子生物学诊断 |
| 1.5 荧光定量RT-PCR技术 |
| 1.5.1 实时荧光定量PCR技术原理 |
| 1.5.2 实时荧光定量PCR技术的分类 |
| 1.5.2.1 DNA染料法 |
| 1.5.2.2 探针法 |
| 1.5.3 实时荧光定量PCR技术定量方法 |
| 1.5.4 荧光定量PCR检测方法的应用 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 试验用胚及动物 |
| 2.1.3 试验种毒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 试验主要溶液及培养基的配置 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 鸭新型呼肠孤病毒的分离与鉴定 |
| 2.2.1.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.1.2 病料样品的处理 |
| 2.2.1.3 病毒的分离与传代 |
| 2.2.1.4 病毒RNA的提取 |
| 2.2.1.5 RT-PCR反应 |
| 2.2.1.6 目的片段的琼脂糖凝胶回收与纯化 |
| 2.2.1.7 连接与转化 |
| 2.2.1.8 阳性克隆鉴定与测序 |
| 2.2.1.9 病毒纯净度检测 |
| 2.2.1.10 血凝试验 |
| 2.2.1.11 病毒细胞半数感染量(TCID50)测定 |
| 2.2.1.12 动物回归试验 |
| 2.2.2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.2.2.1 引物、探针设计及合成 |
| 2.2.2.2 SDYC株病毒液总RNA的提取 |
| 2.2.2.3 目的基因的扩增及克隆测序 |
| 2.2.2.4 阳性质粒标准品的制备及鉴定 |
| 2.2.2.5 TaqMan探针荧光定量PCR反应条件的优化 |
| 2.2.2.6 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立 |
| 2.2.2.7 特异性试验 |
| 2.2.2.8 敏感性试验 |
| 2.2.2.9 重复性试验 |
| 2.2.2.10 临床样本的检测 |
| 2.2.3 鸭新型呼肠孤病毒对肉鸭的致病性研究 |
| 2.2.3.1 种毒的增殖 |
| 2.2.3.2 试验分组与攻毒 |
| 2.2.3.3 攻毒后的体重变化 |
| 2.2.3.4 病理组织切片的制备和观察 |
| 2.2.3.5 攻毒后血液中排毒规律的测定 |
| 2.2.3.6 攻毒后泄殖腔棉拭子中排毒规律的测定 |
| 2.2.3.7 攻毒后各组织器官中病毒载量的变化 |
| 2.2.4 鸭新型呼肠孤病毒对SPF鸡的致病性研究 |
| 2.2.5 鸭新型呼肠孤病毒对罗斯308 肉鸡的致病性研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸭新型呼肠孤病毒分离与鉴定结果 |
| 3.1.1 呼肠孤病毒分离情况 |
| 3.1.2 呼肠孤病毒σC基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.1.3 NDRVσC基因遗传进化分析 |
| 3.1.4 病毒纯净度检测结果 |
| 3.1.5 病毒的血凝试验结果 |
| 3.1.6 病毒毒力(TCID50)的测定 |
| 3.1.7 动物回归试验 |
| 3.2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立结果 |
| 3.2.1 NDRV-S2 基因扩增结果 |
| 3.2.2 重组质粒的鉴定结果 |
| 3.2.3 荧光定量RT-PCR反应条件的优化 |
| 3.2.4 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立 |
| 3.2.5 特异性试验结果 |
| 3.2.6 敏感性试验结果 |
| 3.2.7 重复性试验结果 |
| 3.2.8 临床样本检测结果 |
| 3.3 鸭新型呼肠孤病毒对肉鸭的致病性研究 |
| 3.3.1 人工感染肉鸭后的临床症状 |
| 3.3.2 人工感染肉鸭后的剖检变化 |
| 3.3.3 人工感染肉鸭后的体重变化 |
| 3.3.4 人工感染肉鸭后病理组织学变化 |
| 3.3.5 人工感染肉鸭后血液中排毒规律的测定 |
| 3.3.6 人工感染肉鸭后泄殖腔棉拭子中排毒规律的测定 |
| 3.3.7 人工感染肉鸭后各组织器官中病毒载量的变化情况 |
| 3.4 鸭新型呼肠孤病毒对SPF鸡的致病性研究 |
| 3.5 鸭新型呼肠孤病毒对罗斯308 肉鸡的致病性研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定分析 |
| 4.2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立分析 |
| 4.3 鸭新型呼肠孤病毒对肉鸭的致病性研究分析 |
| 4.4 鸭新型呼肠孤病毒对SPF鸡以及罗斯308 肉鸡的致病性研究分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（10）一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及防污染RT-LAMP检测法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒概述 |
| 1.1.1 病毒分类 |
| 1.1.2 培养特性 |
| 1.1.3 分子生物学 |
| 1.1.4 流行病学和分子流行病学 |
| 1.1.5 诊断方法 |
| 1.2 环介导等温扩增概述 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 反应过程 |
| 1.2.3 结果判定 |
| 1.2.4 LAMP反应中的污染及防污染研究 |
| 1.2.5 LAMP技术在动物病原检测中的应用 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器与设备 |
| 2.1.4 实验动物与鸡胚 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 一株禽呼肠孤病毒的分离与鉴定 |
| 2.2.2 一株禽呼肠孤病毒理化性质的测定 |
| 2.2.3 防污染RT-LAMP检测方法的建立及应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 一株禽呼肠孤病毒分离鉴定结果 |
| 3.1.1 病毒的分离结果 |
| 3.1.2 RT-PCR反应结果 |
| 3.1.3 σC基因的遗传进化分析 |
| 3.1.4 ELD_(50) 的测定结果 |
| 3.1.5 TCID_(50) 的测定结果 |
| 3.1.6 动物回归试验结果 |
| 3.2 一株禽呼肠孤病毒理化性质的测定结果 |
| 3.2.1 耐热性试验结果 |
| 3.2.2 酸碱度稳定性试验结果 |
| 3.2.3 氯仿敏感性试验结果 |
| 3.3 防污染RT-LAMP检测方法的建立结果 |
| 3.3.1 阳性质粒的构建结果 |
| 3.3.2 LAMP反应条件的优化结果 |
| 3.3.3 敏感性试验结果 |
| 3.3.4 特异性试验结果 |
| 3.3.5 防污染试验结果 |
| 3.3.6 临床样品检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及理化性质分析 |
| 4.2 防污染RT-LAMP检测方法的建立分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、鸡呼肠孤病毒分离与鉴定（论文参考文献）
- [1]鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究[D]. 孔桂慧. 山东农业大学, 2021
- [2]鸡源呼肠孤病毒变异株的分离鉴定及感染性克隆的构建[D]. 姚忠慧. 山东农业大学, 2021(01)
- [3]一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及竞争ELISA检测方法的建立[D]. 周雨洁. 山东农业大学, 2021(01)
- [4]新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用[D]. 张旭杰. 山东农业大学, 2021(01)
- [5]新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及油乳剂灭活疫苗的制备[D]. 李静. 山东农业大学, 2020(12)
- [6]鹅细小病毒和鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及其二联灭活疫苗的初步研制[D]. 刘创. 山东农业大学, 2020(10)
- [7]肉鸡呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究[J]. 张玉杰,刘东,刘红祥,宫晓,李陆梅,赵子曈,邹敏,范根成,杜元钊. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2020(04)
- [8]一株肉鸡呼肠孤病毒变异株的分离鉴定[J]. 于可响,刘存霞,宫晓,路晓,胡峰,郭效珍,马秀丽,李玉峰,黄兵,宋敏训. 畜牧兽医学报, 2019(05)
- [9]新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究[D]. 高斌. 山东农业大学, 2019(01)
- [10]一株鸡源呼肠孤病毒的分离鉴定及防污染RT-LAMP检测法的建立[D]. 李璐瑶. 山东农业大学, 2019(01)