一、乳腺癌患者外周血RNA提取方法的探讨（论文文献综述）
于秀艳,李铤,丛占杰,王文龙,张晓伟,吴雪峰[1]（2022）在《乳腺癌患者外周血中hMAM、SBEM和CEACAM19 mRNA联合检测及其临床意义》文中指出目的:探讨外周血中人乳腺珠蛋白（hMAM）、乳腺小黏蛋白（SBEM）和癌胚抗原相关黏附因子19 （CEACAM19） mRNA联合检测在乳腺癌诊断中的作用,阐明其临床意义。方法:收集104例乳腺癌患者（乳腺癌组）、52例乳腺良性病变患者（良性乳腺病组）和50名健康人（健康对照组）的外周血,采用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）法检测受试者外周血有核细胞中hMAM、SBEM和CEACAM19 mRAN表达水平并计算其阳性表达率,分析其与乳腺癌患者临床病理特征的关系。结果:乳腺癌组患者外周血中SBEM和CEACAM19 mRNA阳性表达率与淋巴结转移有关联（P<0.05）, CEACAM19 mRNA阳性表达率与雌激素受体（ER）表达有关（P<0.05）, hMAM mRNA阳性表达率与人表皮生长因子受体2 （HER-2）表达有关（P<0.05）。与健康对照组和良性乳腺病组比较,乳腺癌组患者外周血中hMAM单独或联合SBEM和CEACAM19 mRNA检测阳性表达率均明显升高（P<0.05）。三者联合检测,hMAM mRNA阳性表达率从39.4%升高至66.3%。TNM分期Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌患者外周血中hMAM单独或联合SBEM和（或） CEACAM19 mRNA检测阳性表达率均高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者（P<0.01）;三者联合检测,TNM分期Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA阳性表达率从20.40%升高至48.98%,TNM分期Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA阳性表达率从56.40%升高至81.82%。结论:乳腺癌患者外周血hMAM mRNA阳性表达率不高,联合SBEM和CEACAM19 mRNA检测可以提高其阳性表达率,对于乳腺癌诊断具有一定的临床意义。
李小丰[2]（2021）在《PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究》文中研究表明背景:目前,肺恶性肿瘤仍是威胁人类健康的最大敌人之一,中国癌症发病和死亡统计显示,2015年我国肺癌的新发病例数为78.7万,死亡人数为63.1万,均列癌症首位。根据临床和病理特点的不同,肺癌分为小细胞肺癌（占13%）和非小细胞肺癌（占87%）,其5年总生存率仅为18.2%。传统的治疗方法包括手术、化疗、放疗等,但对于晚期肺癌患者均疗效不佳。近年来,随着分子靶向治疗的兴起,非小细胞肺癌的无进展生存期和总生存期都得到了显着改善。具有敏感基因突变的肺癌患者,分子靶向治疗是最有效的治疗方式之一,而对于没有敏感突变或在靶向治疗过程中发生靶基因耐药突变的患者而言,发现新的肿瘤生物学标志物和新的治疗靶点显得尤为重要。鱼精蛋白-1（PRM1）是肿瘤-睾丸抗原（CTA）的一种,CTA在正常情况下只在睾丸组织中表达,而其它组织不表达或极低表达,但当机体出现肿瘤时则可以在某些肿瘤组织中高表达,肿瘤-睾丸抗原也因此得名。既往对于PRM1的研究主要集中在男性生殖领域。近年来,随着CTA在肿瘤领域研究的深入,关于PRM1在恶性肿瘤中的作用也逐渐被重视,研究发现PRM1是结肠癌相关的肿瘤-睾丸抗原基因,利用RT-PCR技术分析PRM1在结肠癌和癌旁组织的表达水平,发现肠癌组织中PRM1-m RNA水平明显高于癌旁和正常组织。也有研究发现PRM1在慢性淋巴细胞白血病患者中高表达,PRM1也被认为是慢性淋巴性白血病的CTA基因。另有研究表明,PRM1在恶性肿瘤中的异常表达,可能与肿瘤的生长侵袭相关。在动物实验中,给裸鼠皮下注射PRM1蛋白可明显提高小鼠肠道肿瘤的发生率。目前为止,尚无关于PRM1在非小细胞肺癌中表达情况的报道,课题组的前期工作已证实,与正常组织比较,PRM1在非小细胞肺癌组织中的表达明显升高。同时,PRM1对非小细胞肺癌细胞具有促进增殖作用。本研究中,我们检测了PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达情况,分析了PRM1蛋白水平与临床特征的相关性;并评估了PRM1在非小细胞肺癌中的诊断价值;通过过表达和敲低PRM1基因观察其对细胞增殖、凋亡及周期的影响;建立非小细胞肺癌裸鼠转移瘤模型,检测转移瘤裸鼠外周血PRM1蛋白的表达水平,观察外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。旨在评估PRM1作为新的生物学标志物对非小细胞肺癌的诊断价值,研究PRM1对非小细胞肺癌细胞的促增殖作用,并对其机制作初步探讨。方法:1、收集110例非小细胞肺癌肿瘤组织、配对正常组织、术前血清和健康者血清标本,应用RT-PCR法、免疫组织化学染色法和ELISA法检测其中PRM1基因和蛋白水平,应用卡方检验统计分析患者肿瘤组织和外周血中PRM1蛋白水平与临床特点的相关性。2、评估PRM1的诊断价值,应用SPSS软件统计分析外周血中PRM1蛋白水平对非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌的诊断价值,并与临床常用的肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1进行比较,评估PRM1诊断价值的优劣性。3、观察细胞内PRM1表达水平对细胞增殖的影响,通过质粒构建技术及si RNA转染技术,过表达和敲低A549、NCI-H460细胞的PRM1基因,应用RTPCR和ELISA法检测细胞PRM1基因和蛋白表达水平,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。4、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对细胞增殖的影响,将人源重组PRM1蛋白和PRM1抗体加入到A549、NCI-H460细胞培养液中,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况。5、观察细胞在不同营养状态下PRM1的表达情况,将A549、NCI-H460细胞培养于含不同浓度血清的培养液中,应用RT-PCR法和ELISA法检测细胞的PRM1基因及蛋白水平。6、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对动物转移瘤生长的影响,制备裸鼠转移瘤模型,将非小细胞肺癌细胞A549皮下注射到裸鼠背部偏右侧,肿瘤形成后,（1）应用ELISA法检测转移瘤裸鼠和健康裸鼠外周血PRM1蛋白水平,并分析其差异性;（2）分别经尾静脉注射人源重组PRM1蛋白、PRM1抗体及两者混合剂,每3日测量并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。（3）第33天于麻醉下处死裸鼠,取出肿瘤组织,测量重量并计算肿瘤体积,分析外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。结果:1、非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1的m RNA和蛋白水平较配对正常组织明显升高。统计分析显示:随着肿瘤组织中PRM1蛋白水平的增加,肿瘤T分期越晚,淋巴结转移阳性率越高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润无相关性;2、非小细胞肺癌患者外周血中PRM1蛋白水平较健康者显着升高。统计分析显示,淋巴结转移阳性和临床分期较晚的患者外周血中的PRM1蛋白水平更高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润不相关。3、PPM1对于非小细胞具有较高的诊断价值。SPSS软件统计分析显示:（1）外周血中PRM1蛋白水平在非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌中均具有较高的诊断价值。（2）在肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在肺鳞癌中,PRM1的诊断价值明显强于SCC且与CYFRA21-1相当;（3）含有PRM1的肿瘤标志物组合的诊断价值明显高于传统组合;（4）在早期的肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在早期肺鳞癌中,PRM1诊断价值高于SCC且不劣于CYFRA21-1。提示PRM1具有较高的非小细胞肺癌诊断价值。4、非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的PRM1 m RNA水平较人正常肺上皮细胞株BEAS-2B明显升高;同样,A549、NCI-H460细胞内和培养液中的PRM1蛋白水平较BEAS-2B细胞均显着升高。5、成功构建PRM1过表达和敲低的A549、NCI-H460细胞株模型,与对照组比较,过表达PRM1促进A549和NCI-H460细胞的增殖,而敲低PRM1则抑制细胞的增殖。6、外源性PRM1重组蛋白能够促进非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞的增殖,而PRM1抗体则抑制细胞增殖。7、不同营养状态下PRM1的表达存在差异。实验结果显示,随着细胞培养液中血清浓度的降低,A549和NCI-H460细胞PRM1表达水平显着增加。8、细胞周期检测结果提示,过表达PRM1使细胞周期中G0/G1期比例降低,S期细胞比例增加,肿瘤细胞增殖活跃;而敲低PRM1则使细胞周期发生G0-G1期阻滞,S期细胞比例降低,肿瘤细胞增殖受抑;细胞凋亡结果显示,敲低PRM1对A549和NCI-H460细胞的凋亡水平无显着影响。9、动物实验结果:（1）与健康对照组比较,转移瘤裸鼠外周血中PRM1蛋白水平明显升高,也证实了动物实验和体外细胞实验结果与人体组织实验结果一致。（2）外源性PRM1重组蛋白具有促进裸鼠转移瘤生长的作用,而PRM1抗体则抑制转移瘤生长。实验结果提示,与对照组比较,经尾静脉给予外源性PRM1重组蛋白的裸鼠肿瘤生长速度快,肿瘤体积大,而给予PRM1抗体的裸鼠肿瘤生长速度较慢,且肿瘤体积较小。结论:1、PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的特异性高表达,及其对非小细胞肺癌特别是早期患者的诊断价值,使其具备了成为非小细胞肺癌血清学肿瘤标志物的潜质。2、过表达和敲低PRM1基因双向验证了其对非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的促增殖作用,这种作用与增加细胞周期中S期细胞比例相关,而非抑制细胞的凋亡。3、细胞内外PRM1蛋白水平的增加均可促进细胞的增殖,提示PRM1促增殖作用可能存在多条途径,为进一步研究PRM1的作用机制提供线索。4、营养供应差时细胞PRM1的表达水平反而增加,这种负反馈调节作用在一定程度上解释非小细胞肺癌在血供不良的情况下仍快速生长的原因。5、外源性PRM1重组蛋白和抗体对裸鼠转移瘤生长的影响,进一步在生物体内验证了PRM1促进肿瘤生长的作用,同时,PRM1抗体的抑瘤作用也为其成为肿瘤治疗靶点提供直接的理论支持。
林杉[3]（2021）在《肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）是一群具有免疫调节功能的B细胞的统称,近年来的研究发现Breg细胞在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等多种疾病参与免疫调节反应。Breg细胞通过多种机制发挥促肿瘤作用,而肿瘤微环境中Breg细胞的分化机制尚不明确。乳酸是肿瘤细胞的代谢产物之一,乳酸影响多种免疫细胞的分化及功能,在肿瘤免疫耐受、免疫逃逸等方面发挥重要作用。而乳酸对B细胞分化及功能影响的研究较少,尚不明确。本课题通过对体外乳酸处理后B细胞免疫表型和功能的变化及其机制的研究,结合小鼠体内LDHA敲低D121细胞肺腺癌模型中B细胞及CD8+T细胞等其他免疫细胞的比率及活性研究,阐释了乳酸诱导B细胞向Breg样细胞分化及促进肿瘤进展的作用及其机制。研究方法:（1）磁珠分选小鼠脾脏B细胞,使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养B细胞2天,流式检测乳酸对B细胞中Bregs相关表型分子表达的影响。磁珠分选小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞,将上述两组B细胞分别与CFSE标记的CD3、CD28刺激的CD4+和CD8+T细胞共培养2-3天,流式评估乳酸处理的B细胞对T细胞增殖的影响。（2）使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养小鼠脾脏B细胞2天,荧光定量PCR检测两组B细胞内IL-10等免疫抑制分子以及PPARα、NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达差异。流式检测两组B细胞内IL-10、TGFβ、PD-L1以及ROS等分子的表达差异。蛋白免疫印迹检测两组B细胞内p40phox和p47phox蛋白表达差异。（3）磁珠分选小鼠脾脏B细胞体外培养2天,分为BAFF,BAFF+乳酸,BAFF+GPR81激动剂,BAFF+乳酸+GPR81抑制剂,BAFF+乳酸+PPARα抑制剂处理组,比较不同处理方法对B细胞免疫抑制功能的影响。此外,在体外乳酸诱导的B细胞与T细胞共培养体系中,分别加入anti-IL-10抗体,anti-TGFβ抗体,anti-PD-L1抗体,iNOS拮抗剂,arg-1拮抗剂或过氧化氢酶,流式评估上述分子对乳酸诱导Breg样细胞免疫调节功能的影响。明确乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能的分子机制。（4）应用慢病毒CRISPR/cas9技术敲低小鼠肺腺癌细胞系D121细胞内LDHA基因,分别给予B6小鼠接种NC组D121细胞和LDHA KD D121细胞得到肺腺癌小鼠模型。记录两组荷瘤鼠肿瘤大小,绘制肿瘤增长曲线,以此评估LDHA敲低对小鼠肿瘤增长的影响。第20天处死小鼠,流式检测两组荷瘤小鼠脾脏、肿瘤内CD8+INFγ+T细胞、CD8+GrB+T细胞、CD25+CD81+B细胞、IL-10+B细胞、Treg细胞和MDSCs的比例,以及B细胞内ROS表达水平,磁珠分选两组肿瘤内B细胞,荧光定量PCR比较两组B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达水平,明确乳酸对Breg样细胞分化的影响及其促进肿瘤增长的机制。（5）流式细胞分析法测定肺癌患者及健康对照组外周血中CD24hiCD38hiB细胞和IL-10+B细胞的比例,磁珠分选健康人外周血中T和B细胞,乳酸培养B细胞2天,B细胞与CFSE标记的CD3、CD28刺激的T细胞共培养3-5天,流式评估乳酸对B细胞IL-10、ROS及CD24、CD38表达的影响,流式评估乳酸诱导的Breg样细胞对T细胞增殖的影响。通过免疫荧光染色明确肺腺癌组织及癌旁组织内LDHA与ROS+CD19+B细胞的共定位关系,明确乳酸对表达ROS的Breg样细胞分化的影响。研究结果:（1）乳酸上调小鼠B细胞CD25和CD81的表达,使B细胞具有Breg样表型。（2）乳酸诱导的Breg样细胞显着抑制T细胞增殖。乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能与IL-10、TGFβ、PD-L1、arg-1、i NOS、IDO等效应分子无关。（3）乳酸通过NADPH氧化酶上调小鼠B细胞ROS的表达,乳酸诱导的Breg样细胞通过ROS发挥抑制T细胞增殖的免疫调节功能。（4）乳酸促进小鼠B细胞中GPR81 m RNA的表达,GPR81激动剂3,5-DHBA处理的B细胞高表达ROS,并抑制T细胞增殖,而GPR81阻断剂3-OBA可逆转乳酸诱导的Breg样细胞的免疫抑制功能,乳酸通过结合并激活GPR81受体诱导小鼠B细胞发挥免疫抑制功能。（5）乳酸通过结合小鼠B细胞表面GPR81受体,促进小鼠B细胞中PPARα的表达,诱导B细胞内ROS表达水平增高,PPARα阻断剂逆转乳酸诱导B细胞ROS的表达和免疫抑制功能的发挥,乳酸通过GPR81-PPARα-ROS通路诱导Breg样细胞分化并发挥免疫抑制功能。（6）LDHA敲低使荷瘤小鼠肿瘤体积减少,肿瘤组织内Ki-67表达降低,脾脏及肿瘤内CD25+CD81+B细胞和MDSCs比例降低,肿瘤组织内B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平降低,同时,肿瘤引流淋巴结、脾脏及肿瘤内CD8+INF-γ+T细胞及CD8+Gr B+T细胞比例增多,而肿瘤内Treg细胞比例降低。（7）肺腺癌患者外周血乳酸含量、CD24hiCD38hiBreg细胞和IL-10+Breg细胞比例高于健康对照组,乳酸上调B细胞CD24、CD38及IL-10的表达,并促进B细胞内NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平,乳酸培养的B细胞通过ROS抑制T细胞增殖。人肺腺癌肿瘤组织内LDHA表达水平高于癌旁组织,并与表达ROS的CD19+B细胞共定位。结论:乳酸通过GPR81/PPARα/NADPH氧化酶信号诱导B细胞分化为Breg样细胞,Breg样细胞通过ROS抑制T细胞增殖,促进肿瘤进展,敲低肿瘤细胞内LDHA减少Breg样细胞的产生及其ROS的表达,提示靶向降低肿瘤微环境内乳酸含量,可以减少Breg样细胞的分化,进而起到抗肿瘤的治疗作用。这为肿瘤内Breg细胞的致病作用提供新的理论依据,为临床治疗肿瘤提供新的思路。
胡泓[4]（2021）在《LncRNA-HISLA调控乳腺癌细胞耐药及进展的研究》文中指出乳腺癌已成世界范围内女性中发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。虽然我们已经发现了乳腺癌部分发病机理,但是我们仍然需要进一步探索从而为乳腺癌临床早期诊断及治疗乃至后期术后预后判断上开发出更为有效的生物标志物。大量研究证据表明长链非编码RNA在肿瘤的发生、发展及进展中发挥重要作用,其生物学功能及其对疾病的调控机理是目前肿瘤学研究的重点和难点。在本课题中,我们首先在低转移上皮性乳腺癌细胞（MCF-7）中建立了化疗耐受细胞系（MCF-7/ADR）,然后对其耐药性能进行了检测,确认其耐药性能后,随即采用高通量测序对MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞进行转录组测序,从中寻找差异表达的长链非编码RNA。随即通过实时荧光定量PCR技术,在乳腺癌及癌旁组织中,对差异表达最为显着的一批长链非编码RNA进行表达验证。并最终选择稳定HIF-1α的长非编码 RNA（HIF-1α-stabilizing long noncoding RNA,HISLA）作为我们的主要研究目标。.利用siRNA干扰技术在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中对HISLA的表达进行敲降,并通过荧光定量PCR技术验证其干扰效果,随即我们利用CCK-8检测耐药细胞株MCF-7/ADR耐药及增殖能力变化,及插入孔检测运动侵袭能力变化。发现干扰HISLA表达后,耐药细胞株MCF-7/ADR耐药及增殖能力均收到抑制,运动侵袭能力也被抑制。随后我们通过在临床收集的40例乳腺癌组织和20例癌旁组织样本中,应用实时荧光定量PCR技术测定HISLA的表达。结果显示,与癌旁组织中HISLA的表达相比,乳腺癌组织中HISLA的表达明显上升。并且,乳腺癌组织中高表达HISLA与乳腺癌患者进展成正相关,包括较高的乳腺癌分期和淋巴结转移。在对40例乳腺癌患者和20例健康对照个体间外周血中游离的HISLA表达进行比较发现,乳腺癌患者的血清中游离的HISLA表达明显更高。数据还表明,外周血中HISLA的上调与乳腺癌患者组织学分级,初始TNM分期,是否出现远处转移和HER2亚型有关。ROC曲线分析结果显示血清HISLA水平可以用来评估预后风险,并将乳腺癌患者与健康对照患者区分开。Kaplan-Meier预后生存分析结果显示,乳腺癌患者外周血循环HISLA表达水平越高的患者其预后总生存越短,表明循环HISLA升高可用于帮助准确预测乳腺癌患者的更差预后。总的来说,本研究通过构建乳腺癌阿霉素耐药的细胞株,并通过高通量测序技术筛选差异表达显着的长链非编码RNA,通过在临床样本中进一步检测验证,并结合临床预后资料分析了外周血中HIF-1 α的长非编码RNA-HISLA的表达与乳腺癌患者临床预后的关系。从而为后续继续深入研究其在乳腺癌耐药、增殖及侵袭转移中的作用机制与机理提供佐证。
杨旭[5]（2021）在《基于血浆游离DNA（cfDNA）分布特征的分类方法及其在乳腺癌良恶性区分、分子分型、淋巴结转移及新辅助治疗疗效预测中的应用》文中进行了进一步梳理一、研究背景过去的几年中,液体活检作为最具有代表性的精准医疗诊断技术越来越多应用于癌症的早期诊断,预后预测,复发风险评估,连续采样进行疾病进展监测和治疗反应评估等方向。液体活检技术同传统的组织活检技术相比具有无创性、均质化及连续采样等优势。目前液体活检技术主要基于外周血中的循环肿瘤细胞（circulating tumour cells,CTCs）、循环细胞游离 DNA（circulating cell-free DNA,cfDNA）及ctDNA等,其中临床应用较多的主要是检测ctDNA中的拷贝数变异（copy number variations,CNVs）、基因突变及甲基化模式。但只利用ctDNA仍有部分患者通过以上检测技术无法获得有效信息。cfDNA主要来自于凋亡细胞,因被核小体保护而未被降解。基因组的核小体印记与基因转录及基因表达水平密切相关,转录起始位点（Transcription start sites,TSSs）附近区域核小体的结合明显减少。而基于组织活检的基因表达技术已在乳腺癌临床治疗中有广泛的应用,如Oncotype DX 21基因检测、Mamma Print 70 基因检测、EndoPredict 11 基因检测、Prosigna PAM50 基因检测及 Breast Cancer Index（BCI）11基因检测。因此利用血浆中cfDNA的全基因组测序,分析TSSs区域覆盖度差异,对乳腺肿瘤的良恶性区分、分子分型、淋巴结转移及新辅助化疗疗效预测进行研究,为乳腺癌的无创检测及后续治疗提供更为广阔和可靠的数据来源,具有更大的前景。二、研究目的利用血浆中cfDNA全基因组测序,分析TSSs区域覆盖度预测基因表达,基于该技术建立无创的分类方法,对乳腺肿瘤的良恶性区分、分子分型、淋巴结转移及新辅助化疗疗效预测进行研究,为乳腺癌的治疗提供可靠的数据来源。三、研究方法第一章我们利用两株乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T-47D以及50例乳腺癌患者血浆进行cfDNA分布特征与基因表达之间的相关关系研究。该部分我们从以下3个方面进行研究:1.细胞上清液cfDNA分布特征与细胞沉淀的核小体定位的相关关系;2.细胞上清液cfDNA分布特征与细胞内基因表达的相关关系;3.乳腺癌患者血浆cfDNA分布特征与乳腺癌细胞系基因表达之间的相关性,是否为乳腺癌特异性的。为了确定以上关系,我们首先统计细胞上清液和乳腺癌患者cfDNA的转录起始位点TSSs±1k bp区域覆盖度,细胞内核小体测序的TSSs±1kbp区域覆盖度,筛选细胞内的差异表达基因及TCGA数据库中乳腺癌高表达基因,随后使用Spearman秩相关分析和置换检验（Permutation tests）对每两组进行相关关系进行研究。第二章我们进行了 cfDNA分布特征在乳腺癌诊断、分型及淋巴结转移预测的临床应用研究。首先我们对整体、局部染色质变量、及TSS±1k bp区域进行评估,即通过以下三个不同层面:5-Mb精度窗口、染色体不同功能区域、线粒体基因组拷贝数和TSSs±1kbp区域覆盖度。最终确定使用TSSs±1kbp区域覆盖度,基于logistic回归模型（logistic regression model）,开发分别针对乳腺肿瘤良恶性区分（乳腺良性肿瘤197例,乳腺癌263例）、分子分型（Luminal A 41例,Luminal B 82例,Her2 26例,三阴型24例）和淋巴结转移预测（淋巴结转移53例,淋巴结未转移51例）的分类器,并通过ROC曲线评价所建立的分类器的效果。第三章我们进行了 cfDNA分布特征与乳腺癌新辅助化疗疗效关系的探讨。我们首先对收取的两组共22例（12例应答者和10例非应答者）经新辅助化疗8个化疗周期的患者在化疗前,化疗初期（1个化疗周期后）,化疗中期（3或4个化疗周期后）和化疗末期（8个化疗周期后）的血浆样本,进行cfDNA分布特征分析,对两组随化疗周期的分布特征变化的基因进行差异分析和无监督聚类分析,最后进行相关的基因功能分析。随后我们尝试只分析38例（28例应答者和10例非应答者）新辅助化疗患者化疗前的血浆样本cfDNA分布特征差异,探讨在化疗前疗效预测的可行性。四、研究结果第一章中Spearman秩相关分析细胞上清液cfDNA分布特征与细胞沉淀的核小体定位图谱呈正相关,与细胞内基因表达呈负相关。置换检验（Permutation tests）评估细胞上清液 cfDNA 的 HTSSs（high coverage depth around TSSs）或LTSSs（low coverage depth around TSSs）与细胞核小体 DNA 的 HTSSs 或 LTSSs之间的overlaps（p<1e-22）都是显着富集的,细胞上清液的cfDNA的LTSSs与细胞内 HEGs 之间 overlaps（T-47D:p=9.116e-06;MDA-MB-231:p=1.981 e-05）和HTSSs 与细胞内 LEGs 之间 overlaps（T-47D:p=2.987e-06;MDA-MB-231:p=3.156e-10）具有较显着的富集。乳腺癌患者比健康人群cfDNA的TSSs周围-1k bp到+1kbp区域覆盖度低的基因与TCGA数据库中癌组织比癌旁组织高表达基因的overlaps有显着富集（p=0.014）。第二章中对cfDNA的整体、局部染色质和TSS±1 kb片段进行研究,发现cfDNA的TSSs±1k bp区域覆盖度最适合建立PPCET分类器;所建立的乳腺肿瘤良恶性区分、分子分型和淋巴结转移预测的分类器的准确性,特异性等均达到80%左右。第三章中通过新辅助化疗的系列血浆标本与疗效的相关关系的研究,结果发现相对于非应答者,应答者中有321个基因TSSs区域覆盖度因化疗而发生了变化,其中在化疗初期发生变化的基因有205个,93个基因TSSs区域覆盖度降低,112个基因TSSs区域覆盖度升高。到化疗中期发生变化的基因有116个,66个基因TSSs周围覆盖度降低,50个基因TSSs周围覆盖度升高。这321个基因随着化疗结束TSSs区域覆盖度趋于稳定,基因功能分析显示这些基因主要与对DNA损伤的应答、抑制细胞增殖及免疫应答相关;只分析化疗前乳腺癌血浆标本的cfDNA分布特征,应答者和非应答者间共有232个TSSs区域覆盖度差异显着的基因:100个基因TSSs区域在应答者中高覆盖,132个基因TSSs区域在非应答者中高覆盖。五、研究结论1.cfDNA分布特征与细胞内核小体足迹图谱呈正相关,与细胞内基因表达呈负相关;2.通过TCGA数据库分析乳腺癌患者cfDNA分布特征是乳腺癌特异性的;3.通过cfDNA的TSSs±1k bp 区域相对覆盖度对乳腺癌诊断、分子分型及淋巴结预测做了3个分类器,能够较好地把每个分组不同类别分开,为乳腺癌的非侵入性诊断提供了一种可行的“液体活检”方案;4.通过新辅助化疗的系列血浆标本与疗效的相关关系的研究,应答者化疗后发生改变的基因主要与抑制细胞增殖、对DNA损伤的应答和免疫应答相关;5.只分析新辅助化疗前的乳腺癌血浆标本cfDNA分布特征,发现应答者与非应答者存在差异,这有望在化疗前就开发用于预测乳腺癌化疗疗效的新生物标志物,最终实现无创预测。
王想[6]（2021）在《一、HSP90β在肺癌中的表达及机制研究 二、单细胞组学解析结直肠癌肝转移的免疫微环境变化》文中指出该博士论文由相对独立的两部分研究组成。第一部分HSP90β在肺癌中的表达及机制研究第一章肺腺癌蛋白质组学整合分析鉴定出HSP90β作为潜在预后标志物背景:肺腺癌是肺癌中最常见的组织学亚型,尽管研究已经取得了进展,但仍有大量的肺腺癌患者没有可用的靶向治疗选择。由于蛋白质是细胞的功能执行者,肺腺癌的蛋白质组和信号转导的深入表征将为全面了解该疾病的分子机制和开发新的治疗方法奠定基础。目的:通过大样本的临床数据,整合蛋白质组学及磷酸化蛋白质组学,结合临床信息,鉴定出与预后显着相关的差异蛋白,寻找肺腺癌的预后标志物。方法:本部分研究共纳入了 103例肺腺癌患者原发的肿瘤组织和配对的邻近正常肺组织,通过质谱和磷酸化质谱,鉴定出肿瘤组织相比于癌旁正常肺组织的差异蛋白和磷酸化蛋白,并通过Western Blot和酶联免疫吸附测定法在独立的样本中进行了验证。结果:我们得到103例肺腺癌患者的临床蛋白质图谱,并比较了肺腺癌患者肿瘤组织和配对的癌旁正常肺组织的蛋白质组学特征,得到一些与临床预后显着相关的差异蛋白和肺部标签蛋白,通过磷酸化蛋白质组学也得到了 一些癌症相关磷酸化蛋白,并鉴定出HSP90β在内的一些预后标志物,最后在实验中验证了 HSP90β在肺腺癌组织和患者血浆中的高表达,且与预后不良相关。结论:肺腺癌患者肿瘤组织和配对的癌旁肺组织表现出不同的蛋白质组和磷酸化蛋白质组学特征,筛选出的差异表达分子HSP90β有望成为肺腺癌的预后标志物。第二章发育相关蛋白HSP90β通过细胞周期和凋亡影响非小细胞肺癌预后背景:肿瘤的发生在许多方面都被认为与早期胚胎发育过程相似。使用正常的发育样本作为研究模型有助于我们了解肿瘤的发病机制并确定潜在的生物标志物。恒河猴可用于探索胚胎发育与肿瘤发生的模式动物,利用恒河猴肺组织的时间序列数据可以帮助筛选出非小细胞肺癌的的生物标志物。关于HSP90β在非小细胞肺癌中的作用和预后相关研究较少,也尚无肺癌中HSP90β的细胞作用机制方面的研究。目的:通过恒河猴肺组织的时间序列转录组数据,确定HSP90β在肺发育早期的表达情况,并通过肺癌细胞系探索HSP90β的作用机制。方法:本研究我们通过实验室前期恒河猴肺组织的转录组数据和人肺发育的芯片数据,筛选出肺发育早期的调控分子,然后结合非小细胞肺癌患者血浆标本进行了验证,最后在肺癌细胞系中,通过细胞表型实验和功能研究阐明了具体作用机制。结果:我们在恒河猴肺发育的数据鉴定出HSP90β参与了早期肺发育的细胞周期调控,并且在人肺发育的数据中和非小细胞肺癌血浆标本中也证实了 HSP90β的显着高表达。在肺癌细胞系中我们发现敲降HSP90β通过磷酸化关键蛋白影响肺癌细胞的周期和凋亡。结论:HSP90β在人非小细胞肺癌肿瘤组织和患者血浆中均显着高表达,通过磷酸化关键蛋白使肺癌细胞周期阻滞,增加细胞凋亡。第三章HSP90β联合CEA,CA125和CYFRA21-1建立一个肺癌预后评估模型背景:肿瘤早期缺乏症状且缺乏有效检测的生物标志物,大多数肺癌患者在诊断时已进入晚期阶段。为了改善肺癌患者的生存情况,迫切需要找到有用的生物标记物用于早期检测,预后预测和复发监测。递归分割分析可以作为一种分层工具应用于临床研究中,用来预测患者预后。CEA,CA125和CYFRA21-1均是临床常用的辅助诊断的标志物。目的:通过联合HSP90β的血浆蛋白数据和CEA,CA125及CYFRA21-1的血清数据,建立肺癌预后风险预测模型,预测肺癌患者的预后风险,并评估此预测模型是否可以作为肺癌患者独立的预后因素。方法:本研究首先整合了 1162例肺癌的血浆样本,统计了 HSP90β的表达水平,然后在组织水平通过免疫组化检测了 HSP90β在肺癌组织和癌旁组织的表达,最后通过联合HSP90β的血浆表达数据和CEA,CA125及CYFRA21-1的血清数据,运用递归决策树算法建立了风险预测决策树模型,并预测了 671例肺癌患者的预后风险。结果:我们发现肺癌患者血浆和肿瘤组织中HSP90β蛋白显着高表达,通过构建递归分割决策树预测模型可以预测肺癌患者的预后风险,且该预测模型还可以作为肺癌患者独立的预后因素。结论:HSP90β联合CEA,CA125及CYFRA21-1构建的递归分割决策树预测模型可以预测肺癌患者的预后风险,且可以作为肺癌患者独立的预后因素。第二部分单细胞组学解析结直肠癌肝转移的免疫微环境变化背景:结直肠癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,发病逐年上升。结直肠癌肝转移是结直肠癌患者最常见的死亡原因。阐明结直肠癌肝转移机制是当前研究的重要方向,对于指导临床治疗具有重大意义。单细胞测序技术是一种非常有用的工具,可以用来分析肿瘤内部和周围的多种细胞类型的特性。免疫组库可以多方面评估免疫系统的多样性,进而评估机体的抗肿瘤免疫反应。目前单细胞测序和免疫组库在肿瘤中的研究日益成熟。目的:通过结直肠癌肝转移的单细胞转录组和免疫组库测序,研究结直肠癌肝转移患者治疗过程中免疫动态变化的特征图谱,寻找影响其疗效预后的关键事件。方法:本部分研究纳入了 5例结直肠癌肝转移患者手术前,手术后七天和化疗后第一次疗效评价时的外周血,同时收集患者手术时切除的原发灶肿瘤和癌旁组织以及转移灶肿瘤和癌旁组织。患者外周血分离得到单个核细胞和多形核细胞,患者组织制备单细胞悬液,然后分选得到CD45阳性的细胞。将外周血分离的细胞和组织分选后的细胞进行单细胞转录组和TCR/BCR免疫组库测序,然后对数据进行整合分析。结果:我们得到5例结直肠癌肝转移患者随治疗变化的免疫图谱,并且发现同一患者的外周血不同时间点以及原发灶和转移灶组织之间均存在共享T细胞克隆,而不同患者之间很少共享T细胞克隆。患者在手术后外周血的T细胞免疫组库多样性显着升高,而在化疗后多样性又降低到手术前水平。外周血CD4和CD8效应T细胞亚群在手术后和化疗后比例显着增高,且效应分子表达升高,表现出活跃的细胞免疫反应。肿瘤组织中CD4效应T细胞比例高于癌旁组织,而CD8记忆T细胞在癌旁组织中的比例高于肿瘤组织。结直肠癌原发灶肿瘤组织中含有大量效应性浆细胞,而癌旁组织和转移灶组织中以B细胞和记忆B细胞为主。此外,患者化疗后外周血出现一类高表达FCGRT的中性粒细胞亚群。结论:结直肠癌肝转移患者手术后T细胞免疫组库多样性显着升高,且效应T细胞比例和效应分子均升高,显示出活跃的细胞免疫反应。结直肠癌肝转移的原发灶和转移灶以及肿瘤和癌旁组织具有不同的免疫特征,同一细胞的亚群分布也不相同。
蒋莎莎[7]（2021）在《BCAR1促进侵袭性循环肿瘤细胞生成及免疫逃避的研究》文中提出背景和目的:肺癌是目前第一大癌症杀手。手术仍是早期肺腺癌最重要的治疗手段,但术后仍有相当多的病人复发转移。循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）从原发病灶脱落并具有远处转移的能力。研究发现,发生过上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的CTCs转移、侵袭能力更强。而CTCs中程序性死亡配体1（Programmed death-ligand 1,PD-L1）,即CD274表达,能够帮助CTCs逃避T细胞的免疫杀伤,增强其在外周血中的存活能力。但CTCs发生EMT及高表达CD274的相关机制仍需要进一步探索。我们研究发现,乳腺癌抗雌激素耐药蛋白1（Breast cancer antiestrogen resistance protein 1,BCAR1）,即p130cas,在CTCs中高表达,发挥重要的生物学作用。有趣的是,BCAR1已被证实通过多条信号通路促进肺癌细胞发生EMT;此外,我们前期研究还发现,CD274的转录启动子——溴结构域蛋白4（Bromodomain-containing protein 4,BRD4）是BCAR1的互作蛋白。我们推测CTCs中BCAR1高表达促进EMT发生,生成高侵袭性CTCs;同时BCAR1通过BRD4上调CD274表达,帮助CTCs发生免疫逃避。为验证上述推测,本研究着重阐述了CTCs中BCAR1表达对早期肺腺癌患者预后的影响;以及CTCs中BCAR1表达与EMT及CD274表达的关系。以证实BCAR1促进侵袭性循环肿瘤细胞生成及免疫逃避。研究方法:1.CanpatrolTM法检测外周血CTCs及其中EMT标志物、BCAR1及CD274表达,使用Cytoplo Rare法捕获CTCs,通过免疫荧光验证其中BCAR1表达;免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）及蛋白质印迹（Western Blot,WB）检测肺癌组织中BCAR1、CD274及BRD4表达。2.构建人肺腺癌H1975、H1299细胞BCAR1-KO（Knockout,KO）稳定株及A549BCAR1-OE（Overexpression,OE）稳定株,WB及定量聚合酶链锁反应（Quantitative-Polymerase chain reaction,Q-PCR）检测BCAR1-KO及-OE后CD274表达,WB检测BCAR1-KO及-OE后细胞总蛋白及核蛋白中BRD4表达,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）分析BCAR1与BRD4及CD274蛋白质互作。3.CCK8检测BCAR1-KO及-OE后细胞增殖;细胞平板克隆形成实验分析BCAR1-KO及-OE对细胞生长的影响;构建BCAR1-KO细胞小鼠皮下成瘤动物模型。4.ESTIMATE算法计算癌症数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中肺腺癌组织免疫评分,分析BCAR1表达对免疫评分及免疫细胞浸润的影响;TIMER分析免疫细胞浸润情况。5.COX模型进行生存分析。研究结果:1.CanpatrolTM及Cytoplo Rare均证实BCAR1阳性CTCs在肺腺癌中丰度明显高于健康对照组。外周血CTCs中BCAR1高表达患者预后差。BCAR1更倾向表达在发生过EMT的CTCs中;CTCs中BCAR1及CD274表达显着相关。2.肺腺癌细胞中,BCAR1-KO后CD274 m RNA及蛋白表达降低,BCAR1-OE后CD274 m RNA表达显着增加,但未发现BCAR1和CD274之间的蛋白互作。CO-IP证实BCAR1和BRD4之间存在蛋白互作。核蛋白BRD4可分为长亚型（BRD4-L）和短亚型（BRD4-S）,BCAR1-KO后BRD4-L及BRD4-S表达分别升高或降低,BCAR1-OE后反之。核蛋白BRD4-S高表达及BRD4-L低表达的癌组织中CD274高表达。3.BCAR1-KO及-OE分别抑制或促进细胞增殖及克隆形成,BCAR1-KO后皮下成瘤显着抑制。4.癌组织中BCAR1高表达免疫评分低,BCAR1的表达与CD4+T细胞数显着正相关,而与CD8+T细胞数显着负相关,且BCAR1高表达免疫评分低的患者多处于Ⅲ&Ⅳ期,预后最差。研究结论:1.BCAR1表达促进CTCs发生EMT,使其获得间质细胞特性,更具侵袭性。2.CTCs中,BCAR1可能通过调节核蛋白BRD4亚型转换进而上调CD274表达;促进CTCs的免疫逃避,使其能够在外周血中不被免疫细胞清除。3.肺癌细胞中BCAR1发挥促增殖生长等重要作用;肺癌组织中BCAR1高表达可抑制免疫细胞浸润,参与肿瘤免疫逃避过程。4.术前检测CTCs及其中BCAR1表达,可预测早期肺癌患者高复发转移风险。
刘星[8]（2021）在《CSF-1介导肿瘤相关巨噬细胞极化在结直肠癌联合治疗中的作用及机制》文中认为目的:放射治疗作为治疗恶性肿瘤的三大手段之一,已广泛应用于结直肠癌的新辅助治疗,但仍有约30%患者放疗无效。放疗可增加肿瘤免疫原性,但放疗后肿瘤区域大量肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAM）的浸润及组织中PD-L1表达上调可能限制了其疗效。放疗联合抗肿瘤免疫治疗在结直肠癌中是否可获得协同效应及机制如何,目前尚不明晰。本课题主要研究目的如下:（1）评价巨噬细胞相关生物标志物（CD163、CD68、CSF-1和CCL2）在预测新辅助放化疗（Neoadjuvant chemoradiotherapy,NCRT）反应和局部进展期直肠癌（Locally advanced rectal cancer,LARC）预后方面的价值;（2）研究结直肠癌细胞在放疗后细胞因子分泌的变化及在肿瘤微环境中对TAM极化和PD-L1表达的影响;（3）探索肿瘤微环境中CSF-1介导的TAM极化对T淋巴细胞成熟、分化,及发挥抗肿瘤细胞毒作用的影响;（4）探讨抑制CSF-1联合放疗以及抗PD-L1治疗的作用机制,并观察联合治疗效果,为开展结直肠癌治疗新方案的临床试验和研究提供理论依据。方法:1.收集福建医科大学附属协和医院结直肠外科2011-2015年期间191例接受新辅助放化疗（NCRT）和根治性切除术的患者。收集术前结肠镜活检及术后肿瘤组织,并行免疫组化分析。2.采用CT26、MC38两种小鼠结直肠癌细胞,予不同剂量放疗,利用ELISA及流式细胞技术,在不同时间点分析放疗对其细胞因子分泌及肿瘤细胞PD-L1表达的影响。3.体外分离培养小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）,并与不同剂量放疗后的MC38细胞体外共培养,通过流式细胞术分析BMDM表面CD11b、F4/80、CD206表达情况研究其极化表型。体外分离培养小鼠脾淋巴细胞,与放疗后的MC38细胞及不同极化表型的BMDM共培养,通过流式细胞术分析淋巴细CD4、CD8、CD25、CD127、TNF-α表达,研究其对T淋巴细胞分化及功能的影响;使用CSF-1R抑制剂PLX3397,研究阻断CSF-1介导的TAM极化,对T淋巴细胞分化及功能的影响。4.构建小鼠结直肠癌MC38细胞皮下移植瘤模型,对肿瘤局部行3×4Gy放疗,第6天收集小鼠外周血、脾组织、肿瘤组织,通过流式细胞术分析不同组织中免疫细胞PD-L1、巨噬细胞CD206、T淋巴细胞CD4、CD8、CD25、CD127、TNF-α表达情况,通过RT-q PCR技术分析i NOS、IRF5、Arg1、IL-10、PD-L1等m RNA转录水平,研究放疗对肿瘤微环境中PD-L1表达、TAM极化及T淋巴细胞分化及功能的影响,探讨放疗所导致的肿瘤免疫微环境的抑制机制。5.构建小鼠荷瘤模型,随机分为5组:对照组（Ctrl组）、放疗组（RT组）、放疗+抗PD-L1组（RP组）、放疗+抗CSF-1组（RM组）、放疗+抗PD-L1+抗CSF-1R组（RPM组）,予不同方案治疗。第6天收集小鼠外周血、脾组织、肿瘤组织,行流式细胞术检测,收集肿瘤组织通过RT-q PCR技术,固定包埋肿瘤组织,行免疫组化抗体CD68、CD206、i NOS、CSF-1、PD-L1染色,分析不同治疗方案对小鼠肿瘤微环境的影响。6.构建小鼠结直肠癌MC38细胞皮下移植瘤模型,随机分5组治疗。绘制瘤体生长曲线分析,比较各治疗方案的近期抗肿瘤效果。同法分组治疗,观察测量小鼠肿瘤生长情况直至观察终点,绘制小鼠生存曲线,分析比较各治疗方案的远期抗肿瘤效果。结果:1.术后肿瘤组织中病理完全反应（p CR）组巨噬细胞相关标志物CD163、CD68、CSF-1、CCL2的表达水平较非p CR组低。NCRT前及术后较低的CD163、CD68、CSF-1、CCL2评分与DFS改善相关。Cox回归分析显示NCRT前CD163评分（HR=1.008,95%CI 1.003-1.013,P=0.003）和CSF-1评分（HR=2.187,95%CI1.343-3.564,P=0.002）是DFS的独立预测因素。2.基于Cox多因素分析,我们构建了一个具有较强预测LARC患者p CR能力的风险评分模型。并通过COX回归分析探讨风险评分在LARC患者中的作用。结果显示,肿瘤大小（HR=1.291,P=0.041）、较差的病理TNM分期（HR=1.789,P=0.005）和较高的风险评分（HR=1.084,P=0.001）与无病生存较差显着相关。基于以上结果,生成列线图和决策曲线分析。3.体外实验显示,放疗引起小鼠结直肠癌细胞CT26、MC38 PD-L1表达上调及分泌CCL2、CSF-1增加。4.共培养结果显示,放疗后的MC38细胞诱导了BMDM向M2型极化。与对照组相比,在与接受放疗后的MC38细胞共培养48h后,BMDM表现出明显增加了CD11b+/F4/80+CD206high的细胞的比例,且高表达PD-L1。CSF-1R抑制剂PLX3397,在体外抑制了M2型极化,揭示了CSF-1的介导作用。5.在与脾淋巴细胞共培养的实验中发现,放疗后的MC38细胞诱导向M2型极化的BMDM,抑制了CD8+T细胞活化和分泌TNF-α的功能。PLX3397可消除因此所导致的CD8+T细胞的功能抑制,重新激活了其抗肿瘤的作用。6.小鼠结直肠癌MC38细胞皮下移植瘤模型显示,放疗诱导了小鼠外周血、脾组织、肿瘤组织中巨噬细胞PD-L1表达上调或高表达,放疗后小鼠肿瘤组织中巨噬细胞明显向M2型极化。放疗后小鼠外周血、脾组织中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞占比及CD4+/CD8+比值与对照组相比均无明显变化,但放疗后肿瘤组织中浸润的CD8+T淋巴细胞相对减少,升高了CD4+/CD8+比值。同时发现,放疗后肿瘤组织中具有抗肿瘤免疫抑制作用的CD4+Treg细胞比例增多了。7.放疗联合抗PD-L1治疗并未明显增加小鼠MC38结直肠癌组织中CD8+T细胞的浸润,但放疗联合抗CSF-1R及抗PD-L1的三联治疗逆转了小鼠结直肠癌肿瘤微环境TAM M2型极化,降低了肿瘤组织中PD-L1的表达,减少了CD4+Treg细胞的分化,增加了肿瘤微环境中的CD8+T细胞的比例并活化分泌TNF-α。8.在小鼠结直肠癌MC38细胞皮下移植瘤模型中证实,放疗联合抗CSF-1R及抗PD-L1的三联治疗明显抑制了肿瘤的生长,延长了小鼠的生存,获得了良好的近期和远期疗效。结论:1.巨噬细胞相关生物标志物CD163、CD68、CSF-1和CCL2的表达水平与NCRT后LARC患者的放化疗耐药性和预后相关。建立了一个风险评分模型,用于预测LARC结果。2.放疗促进小鼠结直肠癌细胞PD-L1表达上调及CCL2、CSF-1的分泌增加。放疗诱导了CSF-1介导的巨噬细胞向M2型极化,且大量表达PD-L1,抑制了CD8+T细胞功能。3.放疗联合抗CSF-1R及抗PD-L1的三联治疗可逆转小鼠结直肠癌肿瘤微环境中TAM M2型极化,降低了肿瘤组织中PD-L1的表达,激活了CD8+T细胞功能,重塑了肿瘤免疫微环境。4.放疗联合抗CSF-1R及抗PD-L1的三联治疗明显抑制小鼠结直肠癌MC38细胞皮下移植瘤的生长,延长了小鼠生存,获得了良好的近、远期疗效。
赵亚楠[9]（2021）在《NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究》文中研究指明第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究研究背景:弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma,NHL）,占所有NHL的30-35%。利妥昔单抗联合化疗作为一线治疗手段显着提高了疗效,但仍有三分之一以上的患者难治或复发。90%的难治/复发病例不能通过常规挽救化疗和自体干细胞移植得到缓解。免疫疗法近年来在肿瘤治疗领域取得重要进展,例如免疫检查点阻断剂（ICB）、CAR-T疗法等,已在多种实体瘤中取得一定的疗效,但在DLBCL患者中反应欠佳。因此,探索DLBCL发病过程中调节免疫稳态的相关机制,评估高危因素,对于提高DLBCL的治疗效果十分重要。炎症反应是肿瘤发生的关键因素之一。炎症小体可介导炎性细胞因子释放,产生炎症级联反应,促进形成适合肿瘤细胞生长的炎性微环境。NLRP3炎性小体是研究最广泛的炎症小体,外来病原体入侵或体内细胞的损伤和死亡,可招募、组装并激活NLRP3炎症小体,活化caspase-1,切割IL-1β和IL-18前体,产生有活性的IL-1β和IL-18,从而介导机体的免疫应答,促进机体清除病原体和内源性损伤。此外,NLRP3炎症小体在肿瘤的发生发展中起着重要的调节作用。既往研究表明,NLRP3炎症小体在乳腺癌、纤维肉瘤和胃癌等多种恶性肿瘤中发挥促癌作用,并且NLRP3及其效应细胞因子IL-1β和IL-18可促进免疫抑制性肿瘤微环境形成,参与肿瘤的免疫逃逸。因此,NLRP3炎症小体诱导的免疫抑制可能是肿瘤发生的机制之一。本课题组前期研究发现,初诊NHL患者血清中IL-18升高,治疗缓解后降低;且淋巴瘤细胞株中的NLRP3炎症小体可被活化,伴随NLRP3炎症小体相关基因的表达升高。然而,NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用尚不清楚。肿瘤细胞可通过多种方式抑制机体的抗肿瘤免疫应答,逃逸宿主的免疫监视。免疫检查点是免疫细胞或肿瘤细胞上表达的调节免疫稳态的分子,对防止自身免疫反应过度激活起着重要作用。然而,肿瘤中过度表达的免疫检查点可使机体免疫功能受到抑制,导致肿瘤的免疫逃逸,例如肿瘤细胞表达的程序性细胞死亡配体1（PD-L1）,与活化T细胞上表达的程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）结合并传递抑制性信号,诱导肿瘤免疫耐受。免疫抑制也是淋巴系统恶性肿瘤发生发展的重要因素之一。研究表明,恶性B淋巴细胞可通过高表达PD-L1逃避免疫监视。另外,肿瘤免疫微环境还存在髓系来源的抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）及调节性T细胞（Tregs）等抑制免疫功能的细胞。研究证实,DLBCL中MDSCs可通过IL-10、S100A12及PD-L1介导T细胞功能抑制。近期研究报道,NLRP3炎症小体/IL-1β途径可促进头颈部鳞状细胞癌的肿瘤发生,阻断该途径延缓了肿瘤生长,并伴随着效应T细胞数量的增加和免疫抑制性细胞的减少。鉴于NLRP3炎症小体在肿瘤发生和免疫抑制中的重要作用,我们推测,DLBCL中NLRP3炎症小体异常活化通过介导肿瘤免疫逃逸促进淋巴瘤发生发展。目前,DLBCL中免疫抑制的调节机制尚不明确,对于DLBCL中NLRP3炎症小体的作用及免疫调节机制的深入认识,有助于识别新的生物标志物,逆转免疫抑制状态,并改善DLBCL患者免疫治疗反应。研究目的:本课题拟研究NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用及其对肿瘤免疫应答的影响,分析其与临床特征和预后的相关性;体内验证NLRP3炎症小体对淋巴瘤小鼠发病的影响;探讨NLRP3炎症小体对T细胞表型和功能的影响及其参与淋巴瘤免疫抑制的作用及机制;探索NLRP3抑制剂对免疫检查点阻断疗法的影响。预期目标的实现,将揭示NLRP3炎症小体介导的免疫失衡在DLBCL发生发展中的作用及机制,为DLBCL提供新的预后标志物和治疗靶点。研究方法:1.收集35例初诊DLBCL肿瘤组织和35例正常淋巴组织（14例扁桃体组织,7例腋窝淋巴结,7例支气管淋巴结和7例胃周淋巴结）,制备微阵列组织芯片。（1）免疫组化染色评估DLBCL肿瘤组织和正常组织中NLRP3炎症小体效应细胞因子（IL-1β、IL-18）的水平,分析NLRP3炎症小体活化与DLBCL临床特征的关系。（2）免疫组化染色检测PD-L1的水平,分析PD-L1的表达与临床特征的关系。（3）分析IL-1β或IL-18表达与PD-L1表达的关系。2.收集初诊、缓解和难治/复发阶段的DLBCL患者外周血标本,同时收集健康对照者及其他类型NHL患者外周血标本,分离外周血单个核细胞（PBMCs）。（1）检测DLBCL患者抗肿瘤免疫应答能力:流式细胞术检测外周血中T细胞和NK细胞比例,检测T细胞和NK细胞表面免疫检查点分子（TIM-3、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD160）的表达,检测T细胞分泌细胞因子能力（IFN-γ、TNF-α）及NK细胞脱颗粒能力（颗粒酶、穿孔素、CD107a）,判断T细胞和NK细胞功能是否受损。分析外周血T细胞表达免疫检查点水平与DLBCL临床特征和预后的关系。（2）流式细胞术检测外周血中MDSCs及其亚群（PMN-MDSCs、M-MDSCs）和Tregs的比例,判断免疫抑制性细胞在DLBCL中是否扩增。（3）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测NLRP3炎症小体相关基因（IL1B、IL18、NLRP3、ASC、CASP1、NFKB1）在PBMCs中的表达,比较DLBCL患者和健康对照中的表达差异。3.体外培养DLBCL细胞株（OCI-LY3、RC和DB）,对细胞株进行不同处理:①对照组:PBS处理;②活化组:利用脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）活化NLRP3炎症小体;③抑制组:在加入LPS和ATP同时,利用NLRP3抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体活化。（1）提取不同处理组细胞的总蛋白,Western Blot方法验证各组DLBCL细胞株NLRP3炎症小体活化状态。（2）将不同处理组的OCI-LY3和RC细胞株分别与健康志愿者的PBMCs进行间接共培养,分别共培养3、7、10天后,收集共培养体系的PBMCs,进行流式细胞术检测,分析T细胞的比例和表型。4.NLRP3炎症小体介导淋巴瘤免疫失衡的体内研究:（1）A20淋巴瘤小鼠模型构建:体外培养小鼠淋巴瘤细胞株A20细胞,接种于4周龄雌性BALB/c小鼠前肢背部皮下,设置:①对照组:腹腔注射无菌PBS;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950阻断NLRP3炎症小体活化。比较两组小鼠淋巴瘤生长情况,分析阻断NLRP3炎症小体活化对小鼠淋巴瘤生长的影响。（2）ELISA检测淋巴瘤小鼠肿瘤匀浆和血浆中IL-1β和IL-18的水平,Western Blot检测小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,评估体内应用MCC950是否能抑制小鼠NLRP3炎症小体活化。（3）WesternBlot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析抑制NLRP3炎症小体对PD-L1表达及相关信号通路的影响。（4）淋巴瘤小鼠抗肿瘤免疫应答检测:分离对照组和NLRP3抑制组小鼠PBMCs、脾细胞、腋窝/腹股沟淋巴结细胞和肿瘤细胞,流式细胞术检测不同部位T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,T细胞比例及其产生IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的能力,以及免疫抑制性细胞MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断NLRP3炎症小体活化后荷瘤小鼠体内免疫应答的变化。（5）对A20淋巴瘤小鼠分别注射anti-IL-1β和anti-IL-18抗体,观察抑制IL-1β和IL-18活性对小鼠淋巴瘤生长的作用。流式检测小鼠外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤等部位T细胞比例及其表面PD-1、TIM-3的表达,以及MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断IL-1β和IL-18活性对淋巴瘤小鼠免疫应答的影响。Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析阻断IL-1 β和IL-18活性对PD-L1表达的影响。（6）对A20淋巴瘤小鼠分别注射PD-L1抗体、NLRP3抑制剂MCC950,观测对小鼠淋巴瘤生长的抑制作用,分组如下:①PD-L1抗体组:腹腔注射抗小鼠PD-L1抗体;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950;③联合组:腹腔注射MCC950和PD-L1抗体;④对照组:腹腔注射等量IgG。比较各组小鼠抗肿瘤免疫应答的差异:流式检测外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤中T细胞的比例、表型和功能,以及免疫抑制性细胞的比例变化,分析NLRP3抑制剂和PD-L1抗体之间的相互作用。5.统计分析:使用SPSS 21和GraphPad Prism 7软件对数据进行分析。数据表示为平均值±标准差或中位数±数据范围或四分位数间距。所用数据为三次独立重复实验的结果。利用Student t检验和Mann-Whitney U检验评估P值,用Pearson相关系数检验相关性,P值小于0.05表示差异具有统计学意义。研究结果:1.IL-18在DLBCL肿瘤组织中显着升高且与PD-L1表达呈正相关。（1）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织IL-18表达水平明显升高,且与生发中心型DLBCL（GCB-DLBCL）相比,非GCB型（non-GCB）DLBCL具有更高水平的IL-18。进一步亚组分析发现,IL-18和IL-1β在CD10（-）和MUM1（+）的患者中表达水平更高。（2）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织PD-L1表达水平较正常淋巴组织明显上调,且PD-L1表达与DLBCL生存不良的独立预测因子Ki-67表达成正相关。而且,肿瘤微环境中PD-L1与IL-18的表达水平成正相关。（3）RT-qPCR结果显示,与健康对照相比,DLBCL患者PBMCs中的IL1B和IL18基因表达明显上调。2.流式细胞术检测发现,DLBCL患者抗肿瘤免疫应答受到抑制。（1）流式检测T细胞和NK细胞产生细胞因子水平,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血CD3+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的水平明显减少,NK细胞（CD3-CD56+）比例显着降低,NK细胞产生穿孔素和颗粒酶的水平明显下降。（2）流式检测免疫检查点分子表达,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中T细胞表面PD-1和TIM-3的阳性率明显上升,NK细胞表面TIM-3和BTLA的表达明显升高。进一步分析患者临床资料发现,PD-1+T细胞比例与血清乳酸脱氢酶（LDH）水平呈正相关。而且,T细胞表达PD-1和TIM-3水平与淋巴瘤Ann Arbor分期和国际预后指数（IPI）有关,Ann Arbor Ⅲ/Ⅳ期的DLBCL患者较Ⅰ/Ⅱ期的患者外周血中PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,IPI≥3分的患者较IPI0-2分的患者PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,提示DLBCL患者T细胞表面PD-1和TIM-3表达的增多与不良预后相关。（3）流式检测免疫抑制性细胞比例,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中MDSCs和Tregs细胞的比例明显增高,而治疗后缓解的DLBCL患者Tregs比例较初诊患者明显下降,难治/复发DLBCL患者Tregs比例较缓解患者明显升高。3.体外实验证实,DLBCL细胞株的NLRP3炎症小体可被活化并影响PD-L1表达。（1）WesternBlot结果显示:与对照组相比,LPS和ATP处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1蛋白水平明显升高;MCC950处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1表达明显下调。（2）体外活化或抑制RC或OCI-LY3细胞的NLRP3炎症小体,并与PBMCs共培养,流式结果显示:共培养7天后,RC细胞和OCI-LY3细胞的共培养体系中,NLRP3炎症小体活化组的CD8+T细胞比例均较对照组显着降低,而NLRP3炎症小体抑制组的CD8+T细胞比例较活化组显着升高。4.体内实验证实,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可抑制淋巴瘤生长,降低PD-L1表达。（1）我们通过向BALB/c小鼠皮下注射同系A20淋巴瘤细胞株建立了小鼠淋巴瘤模型,接种后7天左右,小鼠右侧斜肋部皮下出现肉眼可见的肿瘤,接种后14天左右,小鼠肿瘤负荷明显增加。至观察终点处死小鼠,ELISA结果显示,肿瘤组织匀浆中IL-1β和IL-18水平明显升高。（2）Western Blot结果证实:腹腔注射MCC950使小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体效应产物IL-1β和IL-18水平显着降低,并且显着下调淋巴瘤小鼠模型肿瘤中的PD-L1和磷酸化STAT3（pSTAT3）的蛋白水平。（3）分析NLRP3炎症小体与小鼠淋巴瘤生长的关系,发现观察终点时,NLRP3抑制组淋巴瘤小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量明显低于对照组。5.流式结果显示,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可提高淋巴瘤小鼠的T细胞比例及其产生TNF-α的水平,减少PD-1+或TIM-3+T细胞比例,降低免疫抑制性细胞的水平。（1）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠肿瘤浸润CD8+T细胞明显增多,脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例明显升高,脾脏CD3+T细胞产生TNF-α的水平明显增加,而分泌IFN-γ的水平下降。（2）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠脾脏和淋巴结中CD3+T细胞表达PD-1和TIM-3的比例显着降低。（3）与对照组相比,NLRP3抑制组MDSCs和TAMs比例在小鼠肿瘤、外周血、脾脏中显着降低,Tregs细胞比例在肿瘤和脾脏中显着降低。6.体内中和IL-18可抑制淋巴瘤生长,降低免疫抑制性细胞比例。（1）将淋巴瘤小鼠分别注射IL-1β或IL-18中和抗体,发现观察终点时,anti-IL-1β组和anti-IL-18组小鼠淋巴瘤大小均显着低于对照组。（2）流式结果显示:与对照组相比,anti-IL-18组小鼠肿瘤、外周血和淋巴结中CD8+T细胞比例均显着增加;anti-IL-1β组小鼠淋巴结中CD8+T细胞比例增加,而外周血中CD8+T细胞比例降低。（3）流式检测T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,结果显示:anti-IL-18组小鼠外周血和淋巴结中CD8+T细胞表达PD-1降低,肿瘤、外周血和脾脏中CD4+T细胞表达PD-1的比例降低,且肿瘤浸润T细胞表达TIM-3降低;而anti-IL-1β组小鼠T细胞表达PD-1百分比无明显变化,肿瘤T细胞表面TIM-3表达升高。（4）流式检测免疫抑制性细胞的比例,发现:anti-IL-18小鼠外周血MDSCs和TAMs比例均明显低于对照组,且anti-IL-18组小鼠肿瘤和脾脏的Tregs比例较对照鼠显着降低;anti-IL-1 β组小鼠外周血MDSCs和TAMs也明显低于对照组,而Tregs比例无明显改变。（5）Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,发现anti-IL-18和anti-IL-1β组小鼠肿瘤组织中PD-L1和pSTAT3蛋白表达水平均较对照显着降低。7.NLRP3炎症小体抑制剂和PD-L1抗体对于抑制淋巴瘤生长具有拮抗作用。（1）在本研究中,我们分别用MCC950、anti-PD-L1抗体单一处理或MCC950联合anti-PD-L1抗体处理淋巴瘤小鼠模型,观察对小鼠淋巴瘤生长的影响,结果显示,单用MCC950或anti-PD-L1抗体均能减小淋巴瘤小鼠的肿瘤负荷,而联用MCC950和anti-PD-L 1抗体降低了肿瘤抑制效果。（2）流式分析发现,与对照相比,anti-PD-L1抗体能显着提高肿瘤浸润性CD8+T细胞和总T细胞的比例,并增加脾脏CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α产生;而联合MCC950后,肿瘤CD8+T细胞比例及脾脏CD8+T细胞产生IFN-γ和TNF-α的水平明显低于单用anti-PD-L1组。以上结果说明,NLRP3抑制剂会破坏由PD-L1抗体提高的CD8+T细胞比例和产生细胞因子能力。（3）流式分析发现,anti-PD-L1组小鼠脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞比例明显高于对照组和MCC950组,而联合组小鼠的脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞的百分比也明显高于单用MCC950组。此外,与MCC950组相比,anti-PD-L1组肿瘤浸润的MDSCs和TAMs的百分比均显着提高,而且联合用药组小鼠肿瘤中的MDSCs和TAMs比例也明显高于单用MCC950组。可见,PD-L1抗体在一定程度上破坏了由NLRP3抑制剂降低的免疫抑制因素。结论:1.DLBCL患者中NLRP3炎症小体异常活化,肿瘤组织中效应细胞因子IL-18表达上调,且与共抑制配体PD-L1表达成正相关。2.DLBCL患者体内抗肿瘤免疫应答受到抑制,肿瘤微环境中PD-L1表达增加,外周免疫抑制性细胞群体MDSCs、TAMs和Tregs明显扩增,T细胞表达PD-1和TIM-3增加,与DLBCL不良预后相关。3.阻断NLRP3炎症小体活化可显着抑制小鼠淋巴瘤进展,增强抗肿瘤免疫应答,降低免疫抑制性细胞数量。而且,NLRP3炎症小体主要通过效应因子IL-18介导淋巴瘤中免疫应答的调节。4.A20淋巴瘤小鼠模型体内阻断NLRP3炎症小体活化可拮抗PD-L1抗体对肿瘤的抑制作用。第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究研究背景胃粘膜相关淋巴组织（Mucosa-associated lymphoid tissue,MALT）淋巴瘤的发生发展与幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori,HP）感染导致的胃粘膜区域免疫稳态失衡密切相关。胃MALT淋巴瘤是慢性炎症转化为肿瘤的典型疾病类型。胃粘膜局部微环境中大量免疫细胞浸润、细胞因子产生等导致的免疫稳态失衡,在胃MALT淋巴瘤的发生发展中起重要作用,因此探究其潜在的免疫调节机制对于明确炎症-肿瘤转化的机制意义重大。髓系来源的抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）由处于早期分化阶段的髓系细胞组成。生理状态下MDSCs处于静息状态,缺乏免疫抑制活性。在各种病理状态下,MDSCs被募集到淋巴器官或肿瘤组织中,通过细胞间接触或可溶性细胞因子的作用,产生广泛的免疫抑制作用。MDSCs主要通过抑制T细胞、NK细胞功能介导肿瘤免疫耐受。研究发现,MDSCs中高活性的精氨酸酶1（Arginase 1,Arg-1）消耗TCR合成的原料L-精氨酸,并抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D3、CDK4的表达,导致T细胞增殖阻滞。MDSCs通过诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）产生一氧化氮,诱导T细胞凋亡。除此之外,MDSCs还能通过促进调节性T细胞（Tregs）聚集发挥免疫抑制作用。由此可见,MDSCs在肿瘤免疫耐受中扮演重要角色。胃粘膜免疫是机体整个免疫网络的重要组成部分,具有独特的结构和功能,其中γδT细胞的富集是胃粘膜区域免疫的重要特性。γδT细胞在胃肠道粘膜中含量丰富,对于维持胃粘膜微环境稳态、抵御外来微生物入侵及调节获得性免疫应答起重要作用。yδT细胞可分泌多种细胞因子,按功能不同可划分为分泌IFN-y的γδT1和分泌IL-17的γδT17,其中的T17的作用日益受到重视。γδT17在纤维肉瘤、皮肤癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的微环境中大量浸润,通过促进血管生成、肿瘤侵袭以及诱导免疫耐受等发挥促癌作用。研究表明,HP感染相关的慢性胃炎可引起γδT细胞大量活化18,而且在胃MALT淋巴瘤微环境中存在IL-17的高表达19,20。然而,关于γδT17在胃MALT淋巴瘤中的作用尚不清楚,有待于进一步研究。近年研究显示,γδT17可通过募集和激活MDSCs来介导结直肠癌和肝细胞癌肿瘤微环境中的免疫耐受。在结肠癌微环境中,IL-23诱导γδT17细胞极化,分泌IL-17、IL-8、TNF-α和GM-CSF等细胞因子,招募并激活MDSCs。在肝癌微环境中,活化的γδT17产生大量IL-17,可促使肿瘤细胞分泌CXCL5,进而招募MDSCs;同时,MDSCs通过分泌IL-23和IL-1β促进γδT17极化,形成正反馈环路,进一步介导肿瘤免疫耐受。由此我们推测,HP感染引起胃粘膜局部慢性炎症,微环境免疫稳态失衡,γδT17被激活,通过分泌IL-17等细胞因子,募集MDSCs,介导肿瘤细胞免疫逃逸,参与胃MALT淋巴瘤发生发展。研究目的本项目拟以胃MALT淋巴瘤区域免疫微环境为切入点,研究γδT17、MDSCs及相关细胞因子在胃MALT淋巴瘤免疫失衡中的关键作用,探索胃MALT淋巴瘤从炎症向肿瘤转化过程中的免疫调节机制。研究方法1.利用H.felis给BALB/c小鼠灌胃,构建小鼠胃MALT淋巴瘤模型,利用快速尿素酶实验和PCR方法检测细菌定植情况,利用H&E染色和免疫组化鉴定小鼠胃粘膜病理特征,动态监测小鼠胃组织成瘤情况。2.H.felis感染后不同时间点（8、11、14、19月）分离小鼠的外周血、脾脏及胃组织,流式细胞术检测MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠中的比例。制备小鼠胃组织的石蜡切片,利用免疫荧光和免疫组化检测胃局部MDSCs（Gr-1+CD 11 b+）的数量及其产生Arg-1和iNOS的水平。3.在胃MALT淋巴瘤小鼠模型发病过程中,利用ELISA和RT-qPCR检测胃组织IL-17蛋白水平和Il17a基因表达的变化,通过流式细胞术分析产生IL-17的三种主要细胞γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例变化,比较γδT17细胞水平在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠之间的差异,以及随H.felis感染时间延长的变化趋势。4.比较胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠胃局部细胞因子和趋化因子的差异:RT-qPCR检测Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）、细胞因子及趋化因子的表达,ELISA检测IL-1β、IL-23等细胞因子的表达和水平,Western Blot检测NLRP3炎症小体是否在H.felis感染鼠胃组织活化,分析差异表达的细胞因子或趋化因子在胃MALT淋巴瘤小鼠发病中的作用。5.收集胃MALT淋巴瘤初诊患者和健康对照者的外周血标本,并制备胃MALT淋巴瘤组织和正常胃组织的石蜡组织切片。流式细胞术检测外周血中MDSCs（CD45+Lin-CD33+HLA-DR-CD11b+）、Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）、γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例,比较胃MALT淋巴瘤患者和健康志愿者之间的差异。免疫荧光检测MD S C s（CD33+CD11b+）和γδT17（TCRγδ+IL-17+）在胃MALT淋巴瘤肿瘤组织中的浸润,免疫组化检测Arg-1、iNOS、IL-1β和IL-23的表达。6.统计分析:本研究数据以平均数±标准差或中位数±四分位数间距表示,用Student t检验或Mann-Whitney检验评估,使用 SPSS 21 和GraphPad Prism 7对数据进行分析。P值小于0.05差异具有统计学意义。结果1.胃MALT淋巴瘤小鼠模型鉴定:H&E染色结果显示,从灌胃后8个月开始,H.felis感染鼠胃黏膜出现以淋巴细胞聚集为主的淋巴滤泡,且随感染时间延长,H.felis感染鼠胃黏膜的病理损害逐渐加剧;感染后14个月,淋巴细胞明显破坏粘膜肌层,甚至粘膜全层,形成淋巴上皮损害（LEL）,这是胃MALT淋巴瘤的典型特征。免疫组化证实,H.felis感染鼠胃黏膜聚集的淋巴组织主要由CD20+的B淋巴细胞组成。以上结果证实,长期的H.felis感染会导致BALB/c小鼠胃黏膜病理损害,先后出现炎症、淋巴组织增生、淋巴滤泡形成和LEL,此病程演变与人的胃MALT淋巴瘤的形成过程高度一致。2.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中MDSCs浸润增多。流式结果显示,H.felis感染早期胃部病变较轻时,感染鼠外周血中MDSCs的比例较对照鼠无明显变化;H.felis感染中后期,胃MALT淋巴瘤小鼠模型的外周血中MDSCs的比例较对照鼠明显升高。免疫荧光和免疫组化证实,与对照鼠相比,Gr-1+CD11b+的MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织浸润显着增多,而且胃组织局部的Arg-1分泌明显增多。3.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中γδT17大量聚集。RT-qRCR和ELISA结果显示,H.felis感染鼠胃组织IL-17在mRNA和蛋白水平均显着高于对照鼠。同时,免疫组化也证实了 IL-17在胃MALT淋巴瘤小鼠模型淋巴滤泡形成部位的高表达。流式数据显示:与对照鼠相比,H.felis感染后8个月小鼠脾脏γδT细胞的比例明显升高,而CD4+T和CD8+T细胞比例无明显差异;而且,胃MALT淋巴瘤小鼠的脾脏中γδT17在产生IL-17的T淋巴细胞中的比例显着升高,而Th17和Tc17比例在两组小鼠之间无明显变化,提示γδT17是胃MALT淋巴瘤发展过程中调节免疫稳态的主要细胞群体。进一步研究发现,γδT17的比例随着H.felis感染时间的延长逐渐升高,提示的T17与疾病进展的相关性。4.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜病变部位参与γδT17极化和募集的细胞因子和趋化因子表达增加。RT-qPCR结果显示,与对照鼠相比,Tlr2、Tlr7和Tlr9基因在H.felis感染后的小鼠胃组织中表达明显升高。Western Blot结果显示,NLRP3炎症小体的活化产物cleaved caspase-1的蛋白水平在H.felis感染后的小鼠胃组织明显增加。ELISA评估小鼠胃组织匀浆中细胞因子的水平,发现与对照鼠相比,IL-1β和IL-23在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织中显着升高。同时RT-qPCR检测发现,Ccr6和Ccl20在胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃组织的表达显着高于对照鼠。5.胃MALT淋巴瘤临床标本检测结果:流式检测发现,与健康志愿者相比,胃MALT淋巴瘤患者外周血中MDSCs和Tregs的比例显着升高。免疫荧光和免疫组化证明,胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中MDSCs和γδT17细胞水平较正常胃组织显着升高,且Arg-1和iNOS在肿瘤微环境中的表达显着上调,同时细胞因子IL-1β和IL-23的表达明显上调。结论1.持续性的H.felis感染可导致小鼠胃组织从胃炎进展到胃MALT淋巴瘤,病理发病过程与人胃MALT淋巴瘤的发生发展高度相似。2.MDSCs在H.felis感染小鼠胃部病变组织和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中大量浸润,参与炎症向淋巴瘤的转化。3.胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃部病变和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中,IL-17分泌增多,γδT17大量聚集,IL-1β、IL-23的激活和CCL20-CCR6的趋化作用可能参与γδT17在病变部位的浸润。γδT17随感染时间延长逐渐增多,可能通过募集MDSCs参与胃MALT淋巴瘤的进展。总之,胃局部免疫稳态失衡是胃MALT淋巴瘤发生发展的重要因素。
杨莹[10]（2021）在《肿瘤相关成纤维细胞在结直肠癌转移过程中的作用及相关机制研究》文中指出研究背景结直肠癌是世界上常见的恶性肿瘤之一。远处转移是结直肠癌患者最为主要的死亡原因。抑制转移及减少远处转移灶的大小和数量,降低肿瘤负荷,可以显着延长患者的生存时间。但是肿瘤细胞的转移并不完全由肿瘤细胞决定。肿瘤微环境中的其他细胞对于肿瘤细胞的转移及在远处脏器的定植也有重要作用。其中肿瘤相关性成纤维细胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）是肿瘤原发灶和转移灶微环境的重要组成部分。已经有研究报道肿瘤细胞（种子）可以携带CAFs共转移,共转移的CAFs可以帮助肿瘤细胞在远处器官定植并形成转移灶。在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等肿瘤患者的外周血中均发现了 CAFs的存在,而且循环CAFs的数量和患者预后显着相关,抑制CAFs转移有希望减少结直肠癌转移的发生。所以我们计划研究结直肠癌中CAFs转移的机制,期望为晚期结直肠癌患者的治疗提供新的策略。研究方法1我们首先与结直肠癌细胞系共培养脂肪来源的间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）将之诱导分化为CAFs,应用Western blot、流式细胞分析、成骨及成脂分化能力等验证CAFs的特征;粘附实验、迁移和侵袭实验、裸鼠结直肠癌皮下移植模型等验证CAFs本身迁移和侵袭能力上调及探索CAFs对结直肠癌转移的促进作用从而明确CAFs的功能。2探索调控CAFs迁移和侵袭的机制。应用Western Blot、RT-PCR分析MSCs和CAFs之间HIF-1 α、miR210、VMP1等基因表达的差异;基因干扰及过表达实验分析上述基因之间的调控作用;CHIP实验验证HIF-1 α对miR210的转录调控作用;双荧光素报告酶等验证miR210对VMP1的调控作用;并在裸鼠结直肠癌皮下移植模型中验证干扰miR210对CAFs转移及结直肠癌肺转移灶形成的影响。3在裸鼠构建结直肠癌皮下移植模型,检测CAFs对转移的结直肠癌细胞定植并形成转移灶的影响。（实验流程图见下）。研究结果1 MSCs与结直肠癌细胞系共培养后可以被诱导分化为CAFs,其特征性蛋白α-SMA和FAPA表达显着上调,成骨及成脂分化能力消失。CAFs与MSCs相比,粘附能力下降,迁移和侵袭能力显着增强。在裸鼠结直肠癌皮下移植模型中,与结直肠癌细胞系HCT116共移植的MSCs能够在皮下肿瘤组织中分化为CAFs。MSCs和HCT116共移植组的裸鼠有更多的远处转移灶。裸鼠活体荧光成像和肺组织多重免疫荧光染色发现人源的CAFs可以从裸鼠原发灶中转移到远处器官,其定植的部位和转移的结直肠癌细胞相邻。2 MSCs分化为CAFs后,HIF-1α表达显着上调,抑制HIF-1α具有抑制CAFs迁移和侵袭的作用。HIF-1α可以通过与miR210的启动子区结合,调控miR210的转录。根据生物信息学分析及双荧光素报告酶的结果发现miR210可以直接作用于VMP1的3‘UTR区,调控VMP1的表达。miR210过表达或者VMP1干扰能够增强CAFs的迁移和侵袭,反之则结果相反。HIF-1α/miR210/VMP1信号通路可能具有调控CAFs迁移侵袭的功能。干扰miR210后,CAFs转移减少,同时结直肠癌转移灶的数量也显着下降,从而证实miR210通过调控CAFs转移影响结直肠癌转移。3将已经形成皮下肿瘤灶裸鼠分成4组,2组对侧肢体分别注射Matrigel胶或者CAFs混合Matrigel胶。5周后在CAFs混合Matrigel胶组注射处发现结直肠癌转移灶形成。另2组尾静脉分别注射PBS溶液或者CAFs。5周取出裸鼠肺组织检测,发现CAFs组的肺转移灶的数量显着增多,表明CAFs有促进转移的结直肠癌细胞定植并形成转移灶的作用。研究结论1结直肠癌裸鼠模型中,转移灶部分CAFs来源于原发灶2在结直肠癌中,HIF-1α/miR210/VMP1信号通路调控CAFs迁移侵袭。通过抑制miR-210表达能够抑制CAFs转移,减少结直肠癌的转移。3在裸鼠结直肠癌模型中,CAFs可能具有促进转移的结直肠癌细胞定植并形成转移灶的能力。
二、乳腺癌患者外周血RNA提取方法的探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乳腺癌患者外周血RNA提取方法的探讨（论文提纲范文）
（2）PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 非小细胞肺癌的诊断 |
| 1.1.3 非小细胞肺癌的治疗 |
| 1.2 肿瘤-睾丸抗原(CTA)的研究进展 |
| 1.2.1 CTA分类及特征 |
| 1.2.2 CTA表达调控 |
| 1.2.3 CTA作用和功能 |
| 1.2.4 配子发生与恶性生殖 |
| 1.2.5 CTA在恶性肿瘤中的诊断价值 |
| 1.2.6 肿瘤疫苗和免疫治疗 |
| 1.3 人鱼精蛋白1(PRM1) |
| 1.3.1 PRM1 的作用 |
| 1.3.2 PRM1 与恶性肿瘤 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备和试剂 |
| 2.1.1 实验设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验细胞和动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集 |
| 2.2.2 RT-PCTR法检测样本mRNA水平 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.5 细胞株复苏与培养 |
| 2.2.6 非小细胞肺癌细胞株活力检测 |
| 2.2.7 非小细胞肺癌细胞在不同血清浓度下孵育 |
| 2.2.8 质粒转染和RNA干扰 |
| 2.2.9 人源重组PRM1 蛋白孵育实验 |
| 2.2.10 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.2.11 EdU法检测细胞增殖实验 |
| 2.2.12 动物实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 PRM1 在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达 |
| 3.1.1 非小细胞肺癌肿瘤组织与配对正常组织PRM1-mRNA水平的差异 |
| 3.1.2 非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1 蛋白水平及临床相关性 |
| 3.1.3 非小细胞肺癌患者外周血中PRM1 蛋白水平及与临床特征的相关性 |
| 3.2 PRM1 诊断价值的评估 |
| 3.2.1 外周血PRM1 蛋白水平对非小细胞肺癌的诊断价值 |
| 3.2.2 PRM1 在肺腺癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.3 PRM1 在肺鳞癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.4 PRM1 在组合标志物中诊断价值的评估 |
| 3.2.5 PRM1 对不同分期的非小细胞肺癌的诊断价值评估 |
| 3.2.6 PRM1 在Ⅰ-Ⅱ期肺鳞癌和肺腺癌中的诊断价值 |
| 3.3 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用的研究-细胞学实验 |
| 3.3.1 PRM1 在非小细胞肺癌细胞株中的表达 |
| 3.3.2 PRM1 基因过表达和敲低对非小细胞肺癌细胞株增殖的影响 |
| 3.3.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 细胞营养状态对PRM1 表达水平的影响 |
| 3.3.5 PRM1对A549、NCI-H460 细胞的细胞周期和凋亡的影响 |
| 3.4 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用研究-动物学实验 |
| 3.4.1 构建A549 细胞裸鼠转移瘤模型 |
| 3.4.2 非小细胞肺癌细胞A549 转移瘤裸鼠血清中PRM1 表达水平 |
| 3.4.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤生长曲线的影响 |
| 3.4.4 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤体积和重量的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 调节性B细胞概述 |
| 1.2 调节性B细胞与肿瘤 |
| 1.3 肿瘤微环境中调节性B细胞的来源 |
| 1.4 乳酸对肿瘤微环境免疫反应的影响 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 调节性B细胞生物学特性 |
| 2.1.1 调节性B细胞分类及分子标志 |
| 2.1.2 调节性B细胞抑制功能机制 |
| 2.1.3 调节性B细胞的起源及分化 |
| 2.2 调节性B细胞在自身免疫性疾病、感染和肿瘤中的作用 |
| 2.2.1 Breg细胞在自身免疫性疾病中的作用 |
| 2.2.2 Breg细胞在感染性疾病中的作用 |
| 2.2.3 Breg细胞在肿瘤中的作用 |
| 2.3 ROS在B细胞中作为信号分子的作用 |
| 2.3.1 ROS在B细胞中的产生和降解 |
| 2.3.2 ROS调节B细胞的成熟、活化和增殖 |
| 2.3.3 ROS影响B细胞功能 |
| 2.4 乳酸促进肿瘤发生发展机制 |
| 2.4.1 乳酸的来源与代谢 |
| 2.4.2 乳酸在肿瘤发生发展中的作用 |
| 2.4.3 乳酸/GPR81 信号通路对肿瘤的影响 |
| 2.4.4 乳酸作为肿瘤治疗靶点 |
| 第3章 乳酸诱导小鼠B细胞分化为Breg样细胞的分子机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 磁珠分选B6 小鼠B220~+B细胞 |
| 3.3.2 磁珠分选CD8~+T细胞 |
| 3.3.3 磁珠分选CD4~+T细胞 |
| 3.3.4 磁珠分选B6 小鼠na(?)ve CD4~+T细胞 |
| 3.3.5 CFSE染色 |
| 3.3.6 乳酸培养小鼠B220 细胞抑制功能实验 |
| 3.3.7 CFSE法检测细胞增殖 |
| 3.3.8 慢病毒CRISPR/Cas9 技术构建LDHA基因敲除D121 细胞混合克隆稳定株 |
| 3.3.9 小鼠肺腺癌模型的构建 |
| 3.3.10 小鼠肿瘤组织消化 |
| 3.3.11 肿瘤组织B淋巴细胞分选 |
| 3.3.12 组织染色 |
| 3.3.13 流式分析 |
| 3.3.14 qRT-PCR检测 |
| 3.3.15 Western blot |
| 3.3.16 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 乳酸诱导B细胞具有CD25~+CD81~+Breg样细胞的表型 |
| 3.4.2 乳酸诱导的Breg样细胞具有免疫抑制功能 |
| 3.4.3 乳酸诱导的Breg样细胞不能诱导Treg细胞分化及CD4~+T细胞凋亡 |
| 3.4.4 乳酸诱导的Breg样细胞抑制T细胞增殖机制研究 |
| 3.4.5 乳酸激活B细胞表面GPR81 受体诱导ROS表达 |
| 3.4.6 乳酸激活B细胞内PPARα诱导ROS表达 |
| 3.4.7 乳酸通过结合GPR81 受体激活PPARα诱导ROS产生 |
| 3.4.8 降低肿瘤内乳酸浓度对B细胞及其他免疫细胞比例及功能的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和仪器 |
| 4.2.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 |
| 4.3.2 磁珠分选人外周血CD3~+T/CD19~+B细胞 |
| 4.3.3 乳酸培养人CD19~+B细胞抑制功能试验 |
| 4.3.4 流式检测 |
| 4.3.5 qRT-PCR检测 |
| 4.3.6 人肺腺癌组织及癌旁组织免疫荧光染色 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 肺腺癌患者外周血乳酸含量及Breg细胞比率 |
| 4.4.2 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.4.3 人肺腺癌组织及癌旁组织内乳酸对 B 细胞 ROS 表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）LncRNA-HISLA调控乳腺癌细胞耐药及进展的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7-ADR构建及转录组测序 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1. 主要材料与试剂 |
| 2. 主要设备 |
| 3. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. CCK8检测乳腺癌细胞MCF-7及耐药株MCF-7/ADR耐药能力检测 |
| 2. 乳腺癌细胞MCF-7及耐药株MCF-7/ADR转录组测序结果 |
| 结论 |
| 第二章 HIF-1A稳定长非编码RNA(HISLA)调控乳腺癌细胞耐药、增殖及侵袭 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1. 主要材料与试剂 |
| 2. 主要设备 |
| 3. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. siRNA高效干扰HISLA表达 |
| 2. 干扰HISLA表达抑制MCF-7/ADR细胞耐药能力 |
| 3. 干扰HISLA表达抑制MCF-7/ADR细胞侵袭能力 |
| 结论 |
| 第三章 外周血中循环HISLA作为乳腺癌诊断和预后的潜在生物标志物评估 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要设备 |
| 3. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. HISLA的上调与乳腺癌患者的分期有关 |
| 2. 乳腺癌患者血清HISLA表达上调且与乳腺癌组织中的HISLA表达呈正相关 |
| 3. 血清HISLA表达水平在乳腺癌患者诊断和预后中作用 |
| 4. 术前和术后乳腺癌患者血清HISLA表达水平的比较 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 附录 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（5）基于血浆游离DNA（cfDNA）分布特征的分类方法及其在乳腺癌良恶性区分、分子分型、淋巴结转移及新辅助治疗疗效预测中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 cfDNA分布特征与基因表达相关关系的机制研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与主要方法 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.2.3 细胞获取及培养 |
| 1.2.4 MDA-MB-231细胞系的α鹅膏覃碱处理 |
| 1.2.5 细胞上清液及细胞沉淀的分离 |
| 1.2.6 细胞上清液和血浆cfDNA的文库构建 |
| 1.2.7 样本收集及血浆分离 |
| 1.2.8 细胞上清液和血浆cfDNA的提取 |
| 1.2.9 细胞沉淀的核小体DNA提取(MNase处理) |
| 1.2.10 细胞沉淀的核小体DNA文库构建 |
| 1.2.11 细胞沉淀的总RNA提取 |
| 1.2.12 总RNA中mRNA的分离 |
| 1.2.13 mRNA文库构建 |
| 1.2.14 模板制备与富集 |
| 1.2.15 测序 |
| 1.2.16 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 细胞上清液cfDNA文库、细胞核小体DNA文库、乳腺癌患者血浆cfDNA文库和健康人群血浆cfDNA文库长度分布情况 |
| 1.3.2 细胞上清液cfDNA测序、细胞核小体DNA测序及细胞mRNA测序的相关关系 |
| 1.3.3 mRNA合成抑制剂对细胞上清液cfDNA的TSSs谱影响 |
| 1.3.4 细胞与cfDNA的三种平台的相关性分析 |
| 1.3.5 乳腺癌基因的特异性分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 cfDNA分布特征在乳腺癌诊断、分型及淋巴结转移预测的临床应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 样本收集 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 不同批次校正结果分析 |
| 2.3.2 cfDNA测序的稳定性评估 |
| 2.3.3 乳腺癌患者的cfDNA中核小体改变 |
| 2.3.4 良性乳腺肿瘤与恶性乳腺癌区分 |
| 2.3.5 乳腺癌的分子分型 |
| 2.3.6 淋巴结转移预测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 cfDNA分布特征与乳腺癌新辅助化疗疗效关系的探讨 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 样本收集 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.2.5 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 应答者和非应答者对新辅助化疗反应的基因是不同的 |
| 3.3.2 应答者和非应答者在新辅助化疗前具有差异的cfDNA TSSs基因 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）一、HSP90β在肺癌中的表达及机制研究 二、单细胞组学解析结直肠癌肝转移的免疫微环境变化（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 HSP90β在肺癌中的表达及机制研究 |
| 引言 |
| 第一章 肺腺癌蛋白质组学整合分析鉴定出HSP90β作为潜在预后标志物 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 用于质谱的肺腺癌组织标本的收集 |
| 1.2 用于独立验证的肺腺癌标本的收集 |
| 1.3 主要的试剂与试剂盒 |
| 1.4 主要仪器与耗材 |
| 1.5 生物信息学分析软件及网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 肺腺癌组织标本的处理 |
| 2.2 肺腺癌组织标本的病理学评估 |
| 2.3 肺腺癌患者和正常人外周血血浆的处理 |
| 2.4 质谱和磷酸化质谱(该部分由中科院上海药物所完成) |
| 2.4.1 蛋白提取和胰蛋白酶消化 |
| 2.4.2 通过高pH高效液相色谱(HPLC)进行肽的预分离 |
| 2.4.3 磷酸化肽段的富集 |
| 2.4.4 纳升液相色谱-质谱(Nano-LC-MS/MS) |
| 2.4.5 质谱数据库搜索 |
| 2.5 液相色谱—质谱(LC-MS/MS)数据的质控和评估 |
| 2.6 差异蛋白分析 |
| 2.7 通路富集分析 |
| 2.8 磷酸化蛋白质组学数据分析 |
| 2.9 生存分析 |
| 2.10 肺腺癌预后生物标志物的筛选 |
| 2.11 酶联免疫吸附测定法(ELISA) |
| 2.12 蛋白免疫印迹法(Western Blot) |
| 2.12.1 肺组织蛋白的提取 |
| 2.12.2 蛋白浓度测定(BCA法) |
| 2.12.3 SDS-PAGE胶的配制 |
| 2.12.4 上样,电泳 |
| 2.12.5 转膜 |
| 2.12.6 封闭 |
| 2.12.7 孵育一抗 |
| 2.12.8 孵育二抗 |
| 2.12.9 曝光 |
| 2.12.10 膜洗脱再生,孵育新的抗体 |
| 结果 |
| 1. 103例肺腺癌患者的临床信息和组学数据 |
| 2. 肺腺癌患者肿瘤组织和配对的邻近正常肺组织(NAT)的蛋白质组学特征 |
| 3. 肺腺癌患者磷酸化蛋白质组学的特征 |
| 4. 肺腺癌潜在预后标志物HSP90β的筛选 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 发育相关蛋白HSP90β通过细胞周期和凋亡影响非小细胞肺癌预后 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 用于ELISA的非小细胞肺癌血浆标本 |
| 1.2 恒河猴肺组织的转录组数据 |
| 1.3 人肺发育的芯片表达谱数据 |
| 1.4 肺癌细胞系 |
| 1.5 质粒 |
| 1.6 BALB/c裸鼠 |
| 1.7 主要的试剂与试剂盒 |
| 1.8 主要仪器与耗材 |
| 1.9 生物信息学分析软件及网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 恒河猴肺组织的转录组数据处理 |
| 2.2 人肺发育的芯片表达谱数据处理 |
| 2.3 RNA的提取 |
| 2.3.1 细胞系RNA的提取前处理 |
| 2.3.2 组织RNA的提取前处理 |
| 2.3.3 细胞系或组织RNA的后续操作 |
| 2.4 RNA反转录为cDNA |
| 2.5 实时定量PCR |
| 2.6 蛋白免疫印迹法(Western Blot) |
| 2.7 非小细胞肺癌患者血浆中HSP90β的酶联免疫吸附测定法(ELISA) |
| 2.8 肺癌细胞系的培养 |
| 2.8.1 肺癌细胞系的复苏 |
| 2.8.2 肺癌细胞系的传代 |
| 2.8.3 肺癌细胞系的冻存 |
| 2.9 敲降质粒的转化及扩大培养 |
| 2.10 扩大培养后中量质粒的提取 |
| 2.11 质粒转染肺癌细胞系 |
| 2.11.1 肺癌细胞系中质粒的转染 |
| 2.11.2 稳定敲降肺癌细胞系的筛选 |
| 2.12 细胞生物学表型试验 |
| 2.12.1 CCK8细胞增殖实验 |
| 2.12.2 细胞集落形成实验 |
| 2.12.3 细胞凋亡实验(Annexin-V FITC+PI双染) |
| 2.12.4 细胞周期实验 |
| 2.13 裸鼠移植瘤模型 |
| 2.14 磷酸化蛋白抗体芯片 |
| 结果 |
| 1. 恒河猴肺发育数据鉴定出HSP90β参与早期肺发育的细胞周期调控 |
| 2. HSP90β在人的肺肿瘤组织和血浆中显着高表达 |
| 3. 敲降HSP90β影响肺癌细胞的增殖、周期及凋亡 |
| 4. HSP90β通过磷酸化关键蛋白影响肺癌细胞周期和凋亡 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 HSP90β联合CEA,CA125和CYFRA21-1建立一个肺癌预后评估模型 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 用于ELISA的肺癌血浆标本 |
| 1.2 用于免疫组化(IHC)的肺癌组织标本 |
| 1.3 主要的试剂与试剂盒 |
| 1.4 主要仪器与耗材 |
| 1.5 生物信息学分析软件及网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 肺癌患者血浆中HSP90β的酶联免疫吸附测定法(ELISA) |
| 2.2 肺癌患者肿瘤和癌旁组织的免疫组化(IHC) |
| 2.2.1 免疫组化实验 |
| 2.2.2 免疫组化结果的评分 |
| 2.3 肺癌患者血清中CEA,CA125,CYFRA21-1蛋白水平的测定 |
| 2.4 肺癌预后风险预测模型的建立 |
| 结果 |
| 1. 肺癌患者血浆和组织HSP90β蛋白显着高表达 |
| 2. 递归分割决策树预测模型可以预测肺癌预后风险 |
| 3. 递归分割决策树预测模型可以作为肺癌患者独立的预后因素 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 单细胞组学解析结直肠癌肝转移的免疫微环境变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 结直肠癌肝转移患者标本的收集 |
| 1.2 主要的试剂与试剂盒 |
| 1.3 主要仪器与耗材 |
| 1.4 生物信息学分析软件及网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌肝转移患者外周血标本的处理 |
| 2.1.1 外周血单个核细胞(PBMC)的分离 |
| 2.1.2 多形核细胞(PMN/粒细胞)的分离 |
| 2.2 结直肠癌肝转移患者组织标本的处理 |
| 2.3 组织单细胞悬液的制备 |
| 2.3.1 组织解离消化液的配制(美天旎肿瘤解离试剂盒:MACS~(TM) TumorDissociation Kit, Order no.130-095-929) |
| 2.3.2 组织解离步骤 |
| 2.4 组织中CD45阳性免疫细胞的磁珠分选:(美天旎分选磁珠:MACS~(TM)CD45 MicroBeads human, Order no.130-045-801) |
| 2.4.1 磁珠分选工作液Buffer的配制(1×PBS+0.5%BSA+2mM EDTA) |
| 2.4.2 磁珠分选操作步骤: (示意图如右图) |
| 2.5 10×Genomics单细胞测序 |
| 2.5.1 单细胞样本检测 |
| 2.5.2 单细胞文库的构建和测序(本部分由北京博奥晶典公司完成) |
| 2.6 单细胞测序后数据的分析 |
| 2.6.1 上游数据的处理(Linux系统上进行,服务器内存最低需64GB) |
| 2.6.2 下游数据的处理 |
| 结果 |
| 1. 结直肠癌肝转移患者的单细胞免疫图谱 |
| 2. 结直肠癌肝转移患者随治疗的外周血和组织的T细胞免疫组库变化 |
| 3. 外周血效应T细胞亚群在手术和化疗后激活 |
| 4. 组织T细胞亚群在原发灶和转移灶差异显着 |
| 5. B细胞亚群在外周血和组织中的不同特征 |
| 6. 外周血多形核细胞PMN中随治疗出现特殊细胞亚群 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 已发表与学位论文相关的英文论文 |
| 研究生期间其他学术成果 |
| 文献综述 单细胞测序在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献(文献综述部分) |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）BCAR1促进侵袭性循环肿瘤细胞生成及免疫逃避的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 临床病例及组织 |
| 2.2 细胞系及实验动物 |
| 2.3 仪器与试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 CTCs中 BCAR1 与上皮间质转化发生及CD274 表达密切相关 |
| 3.2 术前BCAR1(++)CTCs丰度高的患者预后差 |
| 3.3 术后BCAR1 阳性CTCs增加与疾病进展相关 |
| 3.4 肺腺癌组织中BCAR1、 CD274高表达患者预后差;BCAR1 与BRD4/CD274 的表达正相关。 |
| 3.5 癌组织中BCAR1 抑制免疫细胞浸润 |
| 3.6 肺腺癌细胞中BCAR1 通过BRD4 的亚型转化上调CD274 表达 |
| 3.7 BCAR1-KO及-OE分别抑制或促进肺癌细胞增殖 |
| 3.8 BCAR1-KO及-OE分别抑制或促进肺癌细胞克隆形成 |
| 3.9 H1975 细胞BCAR1-KO后皮下成瘤显着抑制 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 循环肿瘤细胞及特异性标志物在癌症精准诊疗中的价值 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（8）CSF-1介导肿瘤相关巨噬细胞极化在结直肠癌联合治疗中的作用及机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分:肿瘤相关巨噬细胞标记物预测局部进展期直肠癌新辅助放化疗疗效 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3.结果与分析 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二部分:放疗后结直肠癌细胞诱导骨髓源性巨噬细胞极化对T 细胞功能影响的体外研究 |
| 引言 |
| 1. 材料 |
| 2.方法 |
| 3. 结果 |
| 4 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三部分:放疗对小鼠结直肠癌组织 PD-L1 表达及肿瘤免疫微环境的影响 |
| 引言 |
| 1. 材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第四部分:抑制 CSF-1 介导 TAM 极化联合放疗及抗PD-L1 治疗对小鼠结直肠癌免疫微环境的影响及疗效观察 |
| 引言 |
| 1. 材料 |
| 2.方法 |
| 3 结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 放疗联合抗 CSF-1 及抗 PD-1/PD-L1 治疗在肿瘤治疗中的新进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间已发表论文 |
| 致谢 |
（9）NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 文献综述 炎症、肿瘤和免疫: 微环境中的密切交流 |
| 一、肿瘤中炎症的类型 |
| 二、炎症与肿瘤的发生发展 |
| 三、炎症反应的关键信号通路与肿瘤 |
| 四、炎症和肿瘤免疫 |
| 五、靶向炎症反应和肿瘤治疗 |
| 六、总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论着 |
（10）肿瘤相关成纤维细胞在结直肠癌转移过程中的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MSCs来源的CAFs具有促进结直肠癌细胞转移的作用 |
| 3.2 MSCs分化为CAFs后迁移侵袭能力增强 |
| 3.3 HIF-1α调控CAFs的迁移和侵袭 |
| 3.4 HIF-1α通过上调miR210的表达调控CAFs的迁移和侵袭 |
| 3.5 miR210通过调控VMP1调控CAFs迁移和侵袭 |
| 3.6 体内实验中干扰miR210表达后CAFs远处转移能力及其促肿瘤细胞转移能力减弱 |
| 3.7 CAFs在裸鼠体内诱导结直肠癌细胞定植 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 创新性与不足 |
| 参考文献 |
| 综述 循环肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤转移过程中的作用 |
| 参考文献 |
| 主要缩略词表 |
| 致谢 |
四、乳腺癌患者外周血RNA提取方法的探讨（论文参考文献）
- [1]乳腺癌患者外周血中hMAM、SBEM和CEACAM19 mRNA联合检测及其临床意义[J]. 于秀艳,李铤,丛占杰,王文龙,张晓伟,吴雪峰. 吉林大学学报(医学版), 2022(01)
- [2]PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究[D]. 李小丰. 吉林大学, 2021(01)
- [3]肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制[D]. 林杉. 吉林大学, 2021(01)
- [4]LncRNA-HISLA调控乳腺癌细胞耐药及进展的研究[D]. 胡泓. 南方医科大学, 2021(02)
- [5]基于血浆游离DNA（cfDNA）分布特征的分类方法及其在乳腺癌良恶性区分、分子分型、淋巴结转移及新辅助治疗疗效预测中的应用[D]. 杨旭. 南方医科大学, 2021
- [6]一、HSP90β在肺癌中的表达及机制研究 二、单细胞组学解析结直肠癌肝转移的免疫微环境变化[D]. 王想. 北京协和医学院, 2021
- [7]BCAR1促进侵袭性循环肿瘤细胞生成及免疫逃避的研究[D]. 蒋莎莎. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [8]CSF-1介导肿瘤相关巨噬细胞极化在结直肠癌联合治疗中的作用及机制[D]. 刘星. 福建医科大学, 2021(02)
- [9]NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究[D]. 赵亚楠. 山东大学, 2021(11)
- [10]肿瘤相关成纤维细胞在结直肠癌转移过程中的作用及相关机制研究[D]. 杨莹. 北京协和医学院, 2021(02)
标签：乳腺癌论文; 淋巴瘤论文; 弥漫大b细胞淋巴瘤论文; 肿瘤免疫论文; 细胞免疫论文;