一、MDV型疫苗株pp38基因同源物在家蚕细胞中的表达(论文文献综述)
党露[1](2017)在《马立克病毒感染后鸡脾脏转录组学及miR-M4-5p调控马立克病毒致病机理的研究》文中进行了进一步梳理马立克病(Marek’s Disease,MD)是由马立克病毒(Marek’s disease virus,MDV)引起的严重危害世界家禽养殖业的疾病,该病主要临床症状为被感染鸡只麻痹、眼盲、淋巴瘤形成以及免疫抑制。MDV属于疱疹病毒目、疱疹病毒科、疱疹病毒甲亚科、马立克病毒属的双链线性DNA病毒。MD是最早能够用抗病毒疫苗防治病毒诱导的肿瘤病,是研究病毒诱导肿瘤的重要模型。近年来,MDV毒力的不断增强,免疫失败的例子时常发生,而且毒力的进化很可能由疫苗本身驱动。高毒力MDV毒株引起的MD爆发可能是家禽养殖业的巨大威胁。MicroRNA是内源性的、长度约20-24碱基的非编码RNA,它们通过后转录机制调节基因表达及细胞分化、发育、增殖和凋亡等多种生物过程。MDV1基因组编码26个成熟microRNA,研究表明一些microRNA在MDV1致病过程发挥重要作用,其中miR-M4-5p是miR-155的病毒模拟物。研究发现miR-M4-5p可能直接参与MD淋巴瘤形成。因此,对miR-M4-5p调控MDV致病机理的研究有助于加深对MD分子机制,尤其是肿瘤发生机制的理解。1、MDV超强毒株GX0101感染后鸡脾脏动态转录组的研究为了解MDV感染后宿主基因的动态变化,本研究以MDV超强毒株GX0101感染后3、7、14、21、30和60天的脾脏为研究对象。提取实验组及对照组脾脏样品RNA并进行质量检测,结果显示RNA样品质量符合RNA-seq建库要求,能够用于转录组测序。RNA-seq完成后,对原始数据进行数据过滤后获得高质量数据;各个文库89%以上的clean reads能比对到参考基因组上。对基因表达量进行分析,在GX0101感染后3、7、14、21、30和60天分别获得1,567、1,342、2,503、3,517、3,810和1,351个差异表达基因,其中上调基因分别有736、812、1,507、2,250、2,390和571个;下调基因分别有831、530、996、1,267、1,420和780个。12个宿主基因qRT-PCR检测结果与RNA-seq结果一致,进一步证明RNA测序结果的真实性和可靠性。差异基因功能分析发现:先天免疫反应和炎症反应在早期溶细胞期建立,持续到淋巴瘤形成阶段;体液免疫在后期溶细胞期,且最先在肠道系统中发挥作用;在细胞增殖阶段,与转录和翻译相关的信号通路被显着富集。本研究为进一步了解马立克病发病机理提供了数据支撑;同时,分析获得的GX0101感染导致的下调基因为miR-M4-5p提供了候选基因库。2、miR-M4-5p靶向hnRNPAB促进CEF和DF-1细胞的增殖在本研究中,利用生物信息学软件对测序获得的下调基因库基因进行预测,筛选获得7个miR-M4-5p的假定靶标,分别为早期生长反应蛋白1(EGR1)、结缔组织生长因子(CTGF)、纤维连接蛋白1(FN1)、免疫球蛋白J链(IGJ)、核不均一核糖核蛋白AB(hnRNPAB)、蛋白酪氨酸磷酸酶5(PTPN5)和胶原蛋白XII型(COL12A)。利用双荧光素酶报告实验检测miR-M4-5p对各基因的抑制效果,结果发现hnRNPAB-3’UTR荧光素酶活性被抑制,且抑制效应具有靶标位点以及种子序列特异性。在过表达miR-M4-5p或GX0101感染的CEF细胞中,q RT-PCR和Western blot检测结果均发现hnRNPAB表达量被降低,证明hnRNPAB是miR-M4-5p的靶标。为研究miR-M4-5p和hnRNPAB对细胞功能的影响,过表达miR-M4-5p或特异性沉默hnRNPAB表达,结果发现CEF和DF-1细胞的细胞活性增强,细胞凋亡不受影响。本研究阐明miR-M4-5p靶向hnRNPAB调控细胞增殖是调控肿瘤的方式之一。3、鸡hnRNPAB单克隆抗体的制备及应用由于商品化hnRNPAB多克隆或单克隆抗体不能识别鸡hnRNPAB蛋白,hnRNPAB蛋白水平的研究被限制,因此,需要自制鸡hnRNPAB抗体。构建的三种重组蛋白pET28a-hnRNPAB、pET30a-hnRNPAB和pET32a-hnRNPAB均正常表达,且都引起小鼠的免疫反应。其中,pET30a-hnRNPAB蛋白以可溶状态表达,并且该蛋白的小鼠免疫效果最好。经融合、鉴定筛选获得单克隆抗体5H5-H1和5H5-G2,它们的效价为8.19×105。Western blot结果证实其均能特异性结合鸡hnRNPAB蛋白。同时,制备的单克隆抗体还能用于多种哺乳动物源hnRNPAB蛋白的免疫荧光检测实验。本研究为进一步研究鸡hnRNPAB蛋白生物学功能提供了必备材料。
苏瑞雪[2](2017)在《马立克氏病毒pp38基因对Toll样受体通路的影响》文中进行了进一步梳理马立克氏病(MD)是一种由马立克氏病病毒(Marek’s Diseas Virus,MDV)感染禽类引起的具有高度细胞结合特性的传染性肿瘤病,马立克氏病病毒(MDV)是一种致T细胞瘤的疱疹病毒,然而病毒的致肿瘤机制仍不十分清楚。所有致肿瘤的MDV均属于血清I型,而与I型MDV致肿瘤相关的3个基因:132-bPr、pp38、meq基因中,pp38基因编码的38 000磷蛋白(pp38)在肿瘤和细胞系中的表达存在差异,而I型特异性的pp38复合体是迄今为止在MDV诱发的肿瘤及非生产性肿瘤细胞系中唯一能检出的MDV特异性抗原,pp38则被证实可抑制机体的免疫应答。CVI988株属于MDVI型疫苗株,RB1B株属于MDV I型强毒株。本研究通过PCR法,从感染MDV强毒株RBIB与疫苗株CVI988的CEF细胞总RNA中扩增pp38基因序列。实验结果表明,疫苗株与强毒株均可扩增出约870bp的pp38基因片段。序列分析比对结果显示,除了在第107和109位氨基酸发生变异外,其余部分完全相同。为了进一步了解pp38在细胞感染MDV后免疫应答中的作用机理,将扩增出的基因片段用限制性内切酶HindⅢ、XhoⅠ酶切消化,然后插入经HindⅢ及XhoⅠ酶切好的真核表达载体pCMV-C-Flag中,经酶切鉴后构建成pCMV-pp38-Flag质粒。构建的表达质粒转染CEF细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)和western-blot实验验证pp38磷蛋白的表达。真核表达载体pCMV-CVI988-pp38和pCMV-RBlB-pp38的正确构建为进一步研究MDV I型强毒株与致弱株间pp38基因对宿主细胞免疫应答抑制机理的差异提供了试验材料。为研究马立克氏病病毒pp38蛋白对宿主细胞天然免疫的影响,本研究将构建的真核表达载体 pCMV-CVI988-pp38 和 pCMV-RBlB-pp38 转染至 CEF 细胞中,经 poly(I:C)刺激,分别在6,12,24小时收集细胞RNA,利用荧光定量的方法检测各个采样时间点TLR基因家族,包括TLR3、TLR7、TLR15、TLR21和TLR2、TLR4,以及TLR3信号通路相关基因的相对表达量。结果表明pp38对TLR3-TRIF通路有一定的抑制作用,并影响通路下游炎性因子的表达,且不同致病力的毒株pp38在分子水平的差异明显。同时也检测了MyD88通路下游基因IRAK4、TRAF6、IFNA、IFNB等基因以及其他一些细胞因子的相对表达水平。实验结果显示pp38对这些因子表达量的影响与MDV的毒力有关。本研究发现MDV疫苗株与强毒株pp38蛋白对TLR3-TIRF途径有抑制作用,且这种抑制作用在不同毒株之间均存在,而pp38对TLR2、7、15以及一些下游细胞因子表达量的影响与毒力有关。这些结果为研究不同MDV毒株的pp38蛋白在体内外对细胞天然免疫的反应提供了依据,也为研究pp38免疫抑制作用在不同毒力的毒株间的差异性奠定了基础,将更有利于全面了解pp38在MDV致肿瘤中的作用机制。
滕蔓[3](2017)在《Mid基因簇miRNAs在马立克病病毒致病中的潜在功能研究》文中提出马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)早期感染雏鸡引发的一种重要的免疫抑制病及肿瘤病。近年来由于MDV毒力的持续增强,MD疫情在全球范围内仍不断暴发。该病是第一个可用病毒疫苗成功预防的肿瘤病,为深入研究疱疹病毒致瘤的生物学、遗传学及免疫学提供了极好的动物模型。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA,在许多生物学过程中发挥重要的基因调控功能。MDV-1编码的26个成熟miRNA来自于14个miRNA前体,在基因组中形成3个明显的miRNA基因簇,分别命名为Meq基因簇、LAT基因簇和Mid基因簇,其中Meq基因簇和Mid基因簇的转录和表达受同一个启动子调控。多项研究发现,Meq基因簇miRNA在调控MDV-1致瘤过程中发挥关键作用,而位于其下游的Mid基因簇miRNA的潜在调控功能尚不清楚。因此,本研究利用细菌人工染色体(BAC)技术和Rec E/T同源重组技术,构建Mid基因簇中的miRNA单基因和基因簇缺失MDV-1毒株,通过动物实验分析Mid基因簇内编码的病毒miRNA与MDV-1致病性的关系,筛选并鉴定该基因簇中潜在调控MDV-1致病或致瘤表型的病毒miRNA,为进一步阐明它们的分子调控机制奠定重要基础。首先,利用MDV-1 GX0101-BAC质粒为亲本载体,利用Rec E/T系统进行Mid基因簇miRNAs基因同源重组敲除,构建miR-M1、miR-M11和miR-M31单基因及整个Mid基因簇缺失的候选BAC克隆,并对其进行PCR扩增鉴定、DNA测序以及限制性片段长度多态性(RFLP)分析。结果表明,经过2轮Rec E/T同源重组,成功获得了3个miRNA前体基因缺失和Mid基因簇缺失的BAC克隆质粒,分别命名为GXΔmiR-M1-BAC、GXΔmiR-M11-BAC、GXΔmiR-M31-BAC和GXΔMid-mi Rs-BAC。然后,将4个BAC重组质粒分别转染CEF细胞,进行病毒miRNA基因缺失感染性BAC克隆的拯救,并同上对拯救毒株的基因组DNA进行PCR扩增和DNA测序鉴定。同时提取各miRNA基因缺失毒株感染CEF细胞的总RNA,利用q RT-PCR分别进行相应miRNA的表达以及相关基因的表达鉴定。提取GX0101亲本毒株和各miRNA基因缺失毒株感染CEF细胞后不同时间细胞毒总DNA,利用qPCR对相应DNA的meq和gB基因进行定量检测,测定病毒增殖曲线。结果表明:成功拯救获得4个Mid基因簇miRNAs的单基因或基因簇的双等位基因缺失毒株,分别命名为GXΔmi R-M1、GXΔmiR-M11、GXΔmiR-M31和GXΔMid-mi Rs;在各miRNA基因缺失毒株中,相邻miRNA的表达并未受到影响,且相邻基因meq、RLORF6、RLORF5a和RLORF4的表达也与预期相符;各miRNA基因缺失毒株与GX0101亲本毒株具有相似的体外病毒增殖曲线。最后,用GX0101亲本毒株、GXΔmi R-M1、GXΔmi R-M11、GXΔmiR-M31和GXΔMid-mi Rs基因缺失毒株分别感染1日龄SPF鸡,以等剂量CEF正常细胞为阴性对照,对各毒株的体内复制能力(病毒血症)、感染鸡生长性能(体重)、免疫器官指数(胸腺/体重、法氏囊/体重指数)、致死率及致瘤率等进行分析。结果表明:与GX0101亲本毒株相比,各miRNA基因缺失毒株在感染鸡体内复制曲线稍有不同;从14 dpi开始,各组感染鸡体重均显着或不同程度低于CEF细胞阴性对照组,1430 dpi各组感染鸡的囊重比指数和胸腺重比指数显着低于CEF细胞阴性对照组;14 dpi以后除CEF细胞对照组鸡未发生死亡外,各攻毒组鸡群均发生不同程度的鸡只死亡,其中GXΔMid-miRs感染组至75 dpi时全部死亡,死亡率为100%,肉眼肿瘤率为21.0%;至90 dpi实验周期结束时,GXΔmi R-M1、GXΔmiR-M11和GXΔmiR-M31感染组的死亡率分别为83.3%、71.8%和69.2%,肉眼肿瘤率分别为31.7%、45.0%和31.7%;而亲本毒GX0101感染组的死亡率和肿瘤发生率分别为79.4%和40.0%。上述研究结果表明,Mid基因簇编码的miRNAs是MDV-1复制的非必须基因,与病毒感染导致的免疫抑制关系不大,但这些miRNAs的基因缺失不同程度的改变了MDV-1的致死率或致瘤率。与GX0101亲本毒株相比,整个Mid基因簇的缺失显着增强了MDV-1的致死率;miR-M1的单基因缺失增强了MDV-1的致死率,miR-M11的单基因缺失则增强了MDV-1的致瘤率,而miR-M31的基因缺失则同时降低了MDV-1的致死率和致瘤率。这些结果提示,Mid基因簇编码的miRNAs在MDV-1致病和致瘤过程中可能扮演原癌基因或抑癌基因不同角色,为今后深入研究这些病毒miRNA的分子调控机制提供了重要线索。
张丽娟[4](2014)在《马立克病PCR检测方法建立及SD2012-1株分离与毒力试验》文中认为马立克病(Marek’s Disease,MD)是由细胞结合性疱疹病毒引起的一种传染性肿瘤病,随着马立克病病毒毒力的不断增强,其对养禽甘造成了一定的威胁。本研究拟通过设计一对敏感性和特异性都较好的检测引物,从而优化马立克病的PCR检测方法,为今后马立克病的防控提供技术支撑。2012年,山东省某养鸡场暴发了严重的马立克病,本实验室从该鸡场分离到一株马立克病病毒,命名为SD2012-1,本研究对该株病毒进行序列测定和分析及毒力试验,明确了此毒株的毒力及序列信息,为掌握我国马立克病病毒株的进化规律提供线索,为今后马立克病的防控提供依据。本研究根据马立克病病毒的Meq基因序列设计特异性检测引物,与已报道的4对检测引物进行特异性和敏感性的比较研究,结果表明,5对PCR引物均具有较好的特异性,但自行设计的Meq5引物在DNA浓度为3.81×10-3μg/mL时仍能够扩增出目的条带,敏感性明显优于其他4对引物。应用该引物对组织样品进行检测,结果表明,羽髓、心脏、肝脏、脾、肾脏、腺胃及十二指肠中均能检测到马立克病病毒。从山东省某发病鸡场采集的样品中分离到的MDV SD2012-1毒株,经PCR方法扩增获得Meq基因和vIL-8基因,并克隆测序,与另外20株参考毒株相应基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行比较,结果显示,SD2012-1分离株Meq蛋白氨基酸序列与LS分离株的同源性最高,与CVI988的同源性最低。其与中国的其他强毒分离株在71、77、80、115、119、153、176以及217位点处的突变特点相同,这初步反应了我国马立克病病毒分离株的突变规律。但不同的是,SD2012-1分离株在139aa位点处并没有突变。SD2012-1分离株vIL-8基因核苷酸序列与LS、RB1B和CU-2株的同源性为99.6%,与CVI988和584A的同源性为99.4%,SD2012-1分离株的VIL-8蛋白氨基酸序列突变为位点4和31,这与甘部分中国强毒株的突变规律相同,因此,初步判断分离株SD2012-1具有马立克病病毒强毒株的特点。SD2012-1病毒株的毒力试验表明,SD2012-1分离株具有很强的毒力,能够突破HVT疫苗和HVT+SB-1双联苗的免疫保护,CVI988疫苗对免疫鸡群只能提供部分保护,再次说明了SD2012-1分离株具有马立克病强毒株的特点。临床观察结果显示,SD2012-1分离株有较长的潜伏期,攻毒后鸡早期死亡时间一般是接毒后45天,而在接种HVT疫苗的鸡群中,最早死亡出现在接毒后48天,初期症状主要表现为一些组织器官的肿胀和变性,而随着病程的变长,后期死亡的鸡会出现组织器官的肿瘤病变。
孙爱军[5](2009)在《马立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物学活性的比较研究》文中研究指明马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)是α类疱疹病毒,其基因组为174kb的双股DNA。对于未经免疫的鸡群,有很高的传染性和致肿瘤性。鸡在感染MDV后除了造成死亡外,耐过鸡可终身带毒并长期排毒。因而,在鸡场里和周围环境中该病毒长期存在。禽网状内皮增生症病毒(Reticuloendotheliosis,REV)是一类C型反转录病毒,基因组是8kb的单股正链RNA,其基因组结构类似于一个完整的转座子,这是鸡的另一种致肿瘤病毒。张志等(2004)等首次从患鸡的抗凝血中分离到整合进REV-LTR片段的天然MDV野毒株GX0101和GD0202,这表明在自然感染的条件下,REV除了能与MDV共感染同一只家禽外,还能整合到MDV的基因组中,本研究将进一步阐明MDV这种重组野毒株致病性是否发生变化,特别是这种重组作用是否会增强MDV的传染性或在体内的复制能力,外源片段的的插入对病毒的致病性,特别是其生物学特性产生了怎样的影响。在以上背景下,本研究比较了天然重组野毒株GX0101对鸡的致病性,并将其构建成感染性细菌人工染色体。在此基础上将插入片段REV-LTR敲除再进一步研究其生物学特性。同时,对MDV的两个致瘤基因1.8kb mRNA及ICP4基因进行了相关研究。不仅积累了大量的数据而且提出并验证了新的观点。1天然重组野毒株GX0101的致病性研究分别选用海蓝褐公鸡和SPF鸡进行GX0101毒株的致病性测定。1日龄免疫HVT疫苗后于5日龄分别接种野毒株GX0101及超强毒株rMd5,每天观察记录死亡并逐只剖检记录发生肿瘤情况。试验结果显示,GX0101株病毒对海蓝褐公鸡的生长抑制作用要比rMd5株弱。而且GX0101株病毒对已经有HVT疫苗免疫的海蓝褐公鸡的致死率只有44%要显着低于rMd5株的70%(P<0.01),而且它的致肿瘤率只有16%显着低于rMd5株的36%(P<0.05), GX0101株病毒对已免有HVT疫苗的SPF鸡的致死率只有28.24%要显着低于rMd5株的64.63%(P<0.01),而且它的致肿瘤率只有7.06%显着低于rMd5株的19.51%(P<0.05),该结果表明GX0101株病毒的致病性要低于强毒株rMd5株。张志(2004)和庄国庆(2006)分别在SPF鸡中做了人工感染试验,结果显示GX0101毒株的致病性要强于强毒株GA株。因此,GX0101株的致病性应是介于强毒GA与超强毒rMd5间的一株病毒。由此看来,GX0101的致病性并不是使其成为流行毒株的竞争优势。2带有REV-LTR片段的MDV野毒株GX0101的BAC感染性克隆的构建及其致病性比较2.1带有MDV基因组US2片段作为同源臂的转基因BAC载体的构建MDV的US2区两侧的同源臂用于同源重组时将BAC载体插入MDV基因组,其中2.1kb的同源臂来自质粒pDS-pHAI,4.0kb同源臂来自质粒pUS2-Partial-F,通过限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ的双酶切作用,及T4DNA Ligation连接,成功构建重组转基因载体质粒pDS-pHAI-US2。2.2 GX0101 BAC感染性克隆的构建及其拯救利用磷酸钙或脂质体转染技术,将转移载体pDSpHAI-US2与MDV GX0101感染CEF细胞的总DNA共感染鸡胚成纤维细胞。待出现细胞病变时,将其传至已加有霉酚酸-黄嘌呤-次黄嘌呤选择培养基的原代CEF上,经四轮筛选、富集重组病毒后,提取重组病毒感染CEF细胞的总DNA,电转化大肠杆菌DH10B。次日,挑取阳性克隆。经酶切及PCR鉴定后,提取BAC DNA转染CEF细胞,再次启动了病毒感染,产生了MDV特异性病毒蚀斑,拯救出了重组病毒;进一步研究表明重组病毒bac-GX0101与亲本毒GX0101在体外CEF单层上的生物学特性相似。2.3 GX0101感染性克隆的致病性比较将BAC克隆毒bac-GX0101与亲本毒GX0101接种1日龄SPF鸡,动物实验结果表明bac-GX0101毒株与亲本GX0101毒株对机体的生长性能等方面的影响没有差异,而且bac-GX0101毒株仍然保留着很好的免疫抑制功能及致肿瘤能力。该感染性克隆bac-GX0101为研究该重组野毒株中REV-LTR插入片段及其他基因的生物学功能提供了有用的技术平台。3敲除REV-LTR的感染性克隆的构建及其生物学特性比较3. 1 MDV天然重组野毒株GX0101中LTR序列的敲除MDV和REV间的自然重组的机率是很低的,在我们近几年分离到的十多个野毒株中,却有两个是重组病毒,说明这一重组过程一定有某种选择竞争性优势。为了阐明天然重组插入的REV-LTR究竟能给原始的MDV带来什么生物学特性变化,对基因组做相应的突变是必经的步骤。将GX0101构建成感染性细菌人工染色体,由于我们可以比较方便地对感染性克隆质粒GX0101-BAC基因组进行修饰,如定点敲除重组野毒株中某个基因或基因片段。这就可以用其作为研究该株MDV的特定基因或基因片段与致病性或其他生物学活性关系的一个新的技术平台。本研究利用Red/ET介导的突变技术,用卡那霉素抗性基因代替要敲除的LTR序列。设计引物,以质粒PKD13为模板,扩增卡那霉素抗性基因。这对引物3’端20个碱基来源于卡那霉素抗性基因,用来扩增该抗性基因,5’端50个碱基来源于MDV,用来同源重组,上下游引物5’端的这50个碱基来源于MDV基因组,分别位于要敲除的LTR序列的两端。卡那霉素抗性基因两端FRT位点是重组酶Flpe的识别位点。卡那霉素抗性基因取代LTR序列后,用0.1%的阿拉伯糖诱导表达Flpe重组酶,从而将卡那霉素抗性基因去除。利用脂质体转染技术,拯出重组病毒,命名为bac-GX0101△LTR。3.2整合进GX0101基因组中的REV-LTR序列的生物学特性研究在5日龄时,分别接种bac-GX0101及bac-GX0101△LTR于1日龄免疫HVT疫苗的SPF鸡,无论是bac-GX0101还是bac-GX0101△LTR,感染SPF鸡后,对生长性能和对NDV、AIV(H9-)灭活疫苗免疫后HI抗体反应均呈现出不同程度的抑制作用。相对而言,bac-GX0101△LTR对SPF鸡的致病作用低于bac-GX0101;斑点杂交检测羽毛囊中的MDV基因组DNA说明,与接种bac-GX0101毒株的同笼饲养的未攻毒鸡的MDV基因组的检出时间和接种bac-GX0101△LTR毒株的同笼饲养的未攻毒鸡的MDV基因组的检出时间相比要早一周,并且检出率也要高。接种bac-GX0101毒株和bac-GX0101△LTR毒株的鸡群在100天内的死亡率分别是28.13%和43.75%;出现肿瘤的比率是9.3%和12.5%。这充分说明REV-LTR的插入不是增强GX0101毒株的致病性和致肿瘤能力而是增强了GX0101毒株的横向传播能力,从而使GX0101毒株具有一定的竞争优势,成为流行毒株。4 MDV中1.8-kb mRNA基因的潜在阅读框A和C的敲除及其功能研究为了研究马立克氏病毒(MDV)1.8kb mRNA中潜在阅读框的功能,利用Red/ET技术将1.8kb mRNA中潜在阅读框(A+C)敲除,并成功转染出病毒bac-GX0101△(A+C),同时将bac-GX0101△(A+C)与bac-GX0101分别感染CEF后,转染包含MDV上游双向启动子的质粒pP(pp38)-CAT和pP(1.8-kb)-CAT,48h后,通过测定转染细胞裂解液中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的活性确定MDV 1.8-kb mRNA中潜在阅读框对双向启动子活性的影响。结果显示,1.8kb mRNA中潜在阅读框(A+C)的缺失可以使其上游双向启动子两个方向的活性均显着下降(P<0.01)。本研究结果证明了1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性具有增强作用。将bac-GX0101△(A+C)和bac-GX0101毒株感染SPF鸡,动物试验结果表明,GX0101毒株缺失1.8kbmRNA后,对鸡群的增重影响较轻。且对NDV和AIV灭活疫苗免疫后HI抗体滴度均高于bac-GX0101感染组, bac-GX0101△(A+C)感染的鸡只肿瘤出现时间比bac-GX0101晚22d,说明仅仅敲掉开放阅读框A和C并不能消除其致瘤性。5 MDV中ICP4基因的敲除及其致病性比较本文利用Red/ET介导的突变技术,将ICP4基因敲除,拯救出重组病毒bac-GX0101△ICP4。分别将bac-GX0101△ICP4和bac-GX0101接种SPF鸡,动物试验结果表明,GX0101毒株缺失ICP4基因后,对NDV和AIV灭活疫苗免疫后HI抗体滴度低于对照组,且与bac-GX0101的差异不显着(P>0.05),且鸡群在感染bac-GX0101△ICP4毒株后58d检测到内脏肿瘤,说明ICP4基因并不直接参与肿瘤的形成。
褚秀玲[6](2007)在《分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及其机制研究》文中研究表明人参皂苷是中药人参的主要活性成分之一。对药物分子的化学改造和修饰是研制新药与改变药效的主要途径之一。本实验以马立克氏病毒为模型,通过体内、外抗病毒实验,系统比较了分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及效果。体外实验结果显示,药物在高浓度时,表现为细胞毒性效应,抑制CEF细胞的生长;中、低浓度时促进细胞的生长。人参皂苷衍生物7具有更好的抗病毒效果,其感染阻断、增殖抑制和直接杀灭三种途径抗MDV的半数抑制浓度IC50分别是20.83μg/mL、61.98μg/mL和125.43μg/mL,选择指数SI分别是13.47、4.61和2.28。人参皂苷及其衍生物7对MDV具有直接的破坏作用,并可以减轻MDV对CEF的损伤程度,降低单位视野中的病毒粒子数。体内实验结果表明,衍生物7能够显着降低实验鸡的发病率和死亡率,减少实验鸡脏器肿瘤阳性率,与病毒对照组相比差异显着(p<0.05);并且可以改善免疫器官的形态,降低病毒抗原在组织中的表达,促进免疫器官发挥抗病毒作用。
崔红玉[7](2007)在《鸡马立克氏病病毒细菌人工染色体的构建》文中研究说明鸡马立克氏病(Marek’s disease,MD)是危害养鸡业的主要传染病之一。该病以T淋巴细胞增生性肿瘤、高度接触性传染以及造成鸡的严重免疫抑制为特征,其病原为鸡马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV),该病毒属疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科双链DNA病毒,基因组大约180kb。根据抗原性不同,马立克氏病病毒(MDV)可分为3种血清型,血清1型包括所有致瘤的马立克氏病病毒,含强毒及其致弱的变异毒株;而血清2型包括所有不致瘤的马立克氏病病毒;血清3型包括所有的火鸡疱疹病毒(Herpesvirus ofturkey,HVT)及其变异毒株。由于MDV是严格的细胞结合病毒,对MDV基因组进行基因操作和研究十分困难。近几年细菌人工染色体技术的出现解决了这一难题。首先构建MDV细菌人工染色体(BAC),然后利用分子克隆化病毒BAC质粒转染哺乳动物细胞,启动病毒感染,产生纯系重组病毒。BAC分子克隆化病毒服从大肠杆菌基因操作技术,在大肠杆菌中可以对其进行方便的基因操作和研究。尤其是利用近几年来发展起来的现代DNA克隆技术——RED/ET技术,它可以在细菌中对病毒基因组实施快速有效的各种修饰(删除、插入和点突变),甚至对病毒基因组的必需基因进行有效的突变。本研究的目的是构建鸡马立克氏病病毒814株全基因组感染性分子克隆化病毒—细菌人工染色体,建立鸡马立克氏病病毒的反向遗传操作技术平台。首先利用自主构建的表达Eco-gpt的哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记(1.3kb)和带有细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosomes,BAC)基本基因功能序列(pBeloBACll,7.5kb)成功构建了鸡马立克氏病病毒重组病毒转移载体pUAB-gpt-BACll,使用脂质体转染技术,将转移载体与马立克氏病病毒感染CEF细胞的总DNA共转染鸡胚成纤维细胞,启动病毒感染后,在选择培养基的遗传选择加压条件下,经八轮筛选、富集并完全纯化了重组病毒;适时提取环化重组病毒感染CEF细胞的总DNA,电转化大肠杆菌DHl0B,挑取阳性克隆经酶切图谱、凝胶电泳和PCR鉴定BAC分子克隆化病毒,经鉴定获得了38个BAC分子克隆化病毒,并且用编号为MDV-BAC2的克隆提取纯化的BAC-DNA转染次代CEF细胞,再次启动了病毒感染,产生了MDV特异性病毒蚀斑,拯救出了重组病毒;进一步研究表明重组病毒rv-MDV814、野生病毒wt-MDV814与拯救的重组病毒BAC-redrived MDV814三种病毒在体外鸡胚成纤维细胞上的生物学特性相似;进一步的动物试验研究表明rv-MDV 814、BAC2-derived MDV 814、PBS-BAC2-DNA、LiD-BAC2-DNA、Ca-BAC2-DNA、活菌-BAC2免疫鸡部分能够抵抗J-1株强毒的攻击,表明BAC-based疫苗具有作为预防鸡马立克氏病新型疫苗进行开发的潜力。本研究为进一步研究鸡马立克氏病病毒的致瘤机制、潜伏机制和基因功能提供了很好遗传操作技术平台,添补了国内空白,同时也为以马立克氏病病毒毒细菌人工染色体为基础的新型基因工程疫苗的开发和应用提供了强大的技术平台。
周祥[8](2007)在《广西马立克氏病病毒野毒株的分离与鉴定及其与其它病毒共感染的研究》文中进行了进一步梳理马立克氏病(Marek’s disease,MD)是由鸡马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)引起的一种鸡的高度接触性恶性淋巴肿瘤性疾病,在内脏器官、皮肤等处诱发肿瘤。近年来,由于MD毒株毒力不断增强,疫苗免疫效果明显降低,即使在一些已用CVI988/Rispens株疫苗免疫的鸡群,在其生长后期仍有肿瘤的发生,给目前的养禽业带来巨大的损失。为了研究广西近年来MDV毒株的流行、分布、毒力变化及其分子衍化规律,本文采用细胞培养、间接荧光抗体试验和PCR扩增的方法,从曾免疫过CVI988/Rispens疫苗株的患MD肿瘤的三黄鸡的外周血淋巴细胞(PBLs)和羽囊液中分离到三株MDV野毒株(分别命名为GXY1、GXY2、GXYL1)。三株MDV野毒株的细胞培养中,GXYL1感染的细胞还能与抗网状内皮组织增殖病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)的单抗11B118反应,也可以用PCR扩增出REV LTR的特异性片段,说明这株MDV感染的细胞中含有传染性的REV,此病例为MDV和REV共感染;GXY1感染的细胞不能与单抗11B118反应,说明样品中不含有游离的REV,但能扩增出REV的LTR和env基因片段,同时也能扩增出禽痘病毒(Fowl poxvirus,FPV)的核蛋白4b基因片段,将细胞培养物上清再接种到DEF单层,然后再用单抗11B118进行IFA,结果为阴性,说明分离的毒株中不含有游离的REV,而再进行LTR、env和4b基因片段的PCR扩增,结果均为阳性,说明样品中的LTR和env基因片段是来源于细胞培养物上清中游离的FPV,也就是说在野毒GXY1的细胞培养中含有整合了REV基因组片段的FPV野毒;GXY2感染的细胞不与单抗11B118反应,但是能扩增出REV的LTR片段,而作为阴性对照的正常细胞却不能扩增出REV的LTR片段,说明该株MDV的基因组中已整合了REV的LTR片段。MDV-1 meq基因具有fos/jun群类转录激活因子的特征,被认为是一种转录激活因子,是MDV主要的致瘤基因。通过对三株广西分离的MDV野毒株的meq基因序列与参考株GA和RB1B株及之前我们先前研究的广西分离株的meq基因序列进行比较分析。结果表明,MDV毒株的meq基因序列相对比较保守,三株分离株的meq基因在第77、80、115、139、176、217位氨基酸分别存在一致的突变,且氨基酸第80、115、217位所有的广西分离株都因为同一个碱基的改变而分别突变为Y、A、A,与两个参考株及疫苗株不同,表现出一定的规律性。同时第139位氨基酸突变为A,国外发表的仅只有一株野毒株的meq基因序列在此位点存在突变,我们国内分离株基本上都发生了突变,这个位置的突变国外还未见报道,可能与MDV的毒力有关;而位于脯氨酸重复区的与毒力相关的第176位氨基酸突变为R,与国外发表的MDV的meq基因序列在此位置的变化(A/H)不同,是我们国内分离株所特有的。这些变化对于我们研究国内的MDV-1毒株很有意义。本研究结果表明,广西目前流行的MDV野毒株中,存在着其它病毒的共感染,不同科属病毒间存在遗传重组,并且存在整合进了REV基因组片段的天然重组MDV病毒;对MDV的致瘤基因meq基因的序列分析发现,中国内分离株中存在一个特有氨基酸的突变,国内外还未见报道。这些研究结果对于我们进一步了解和掌握MDV的毒力进化的机制以及病毒的生物学特性提供了有用的资料。
郑梅竹[9](2007)在《L-meq对MDCC-MSB1细胞端粒酶活性影响的研究》文中进行了进一步梳理本研究利用现代分子生物学的研究手段和方法研究了L-meq基因在体外培养MDCC-MSB1细胞中的表达及其对端粒酶活性的影响。研究以MDV基因组为模板通过PCR方法扩增了L-meq基因,将其亚克隆构建原核表达质粒pET-28a-L-meq和真核表达质粒pcDNA3.1(+)-L-meq。将重组质粒pET-28a-L-meq转化表达受体菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达的融合蛋白带大约位于55kDa处,表达蛋白占菌体蛋白的18.88%。用纯化后的L-MEQ蛋白对獭兔进行常规免疫,得到较高效价的多克隆抗体(1:12800)。继而构建了L-meq基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-L-meq并将其转染鸡淋巴瘤细胞系MDCC-MSB1细胞。应用RT-PCR方法和Western-blot方法检测到L-meq基因在MDCC-MSB细胞中能够稳定表达,并抑制了端粒酶活性。利用实时荧光定量RT-PCR方法检测了转染前后chTERT的表达量,结果显示L-MEQ的稳定表达下调了chTERT mRNA的表达水平。总之,本研究成功克隆了L-meq基因,应用其纯化蛋白制备了多克隆抗体,并研究了L-meq基因对鸡淋巴瘤细胞系MDCC-MSB1端粒酶活性的影响,推测L-MEQ蛋白可能通过抑制MEQ蛋白的功能而起到抑制表达meq基因的vvMDVⅠ的复制,进而抑制细胞的端粒酶的活性。这些研究结果都为进一步探讨L-meq的一些生物学特性和L-MEQ在抑制肿瘤发生过程中的重要作用奠定了基础,并且为相关肿瘤的研究提供了更多的理论参考。
潘风光[10](2007)在《MDV致瘤的分子机理》文中提出马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是能用实验方法证明的有致瘤性的第一个疱疹病毒,也是第一个能用疫苗来预防的肿瘤病,因此是研究肿瘤发病机理的理想模型。由于MDV-I具有快速致瘤的特性,因此我们完全有理由推测病毒本身具有致瘤基因。目前认为,与致瘤相关的基因有132重复序列(132-bpr)、pp38和meq,在目前已得到鉴定的46个MDV基因组中特异的基因中,仅有meq与132-bpr 2个基因是MDV-I所特有的,但132-bpr与病毒致弱程度或细胞上传代的次数有关,因此人们将马立克氏病毒致瘤的更多的焦点集中到meq上。meq编码一个含339个氨基酸的蛋白质,N-端为碱性区含有亮氨酸拉链结构,C-端为富含脯氨酸重复的区域,具有与肿瘤蛋白fos/jun家族相似的结构。因此,人们把它当作一种细胞核内的致瘤基因,但目前尚未阐明其与MDV致瘤作用的关系。本研究旨在通过潜伏感染期检测到的MDV基因组中的meq、L-meq基因为切入点,比较两者核苷酸的差别序列和氨基酸的差异序列,并探索meq、L-meq基因对肿瘤抑制基因p53、端粒酶催化亚基chTERT和端粒酶的模板chTR表达的影响,并用2-DE技术分析meq、L-meq基因及其差异序列转染CEF前后的差异蛋白质,为鸡马立克氏肿瘤病的研究和肿瘤的发生机制提供理论依据。
二、MDV型疫苗株pp38基因同源物在家蚕细胞中的表达(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、MDV型疫苗株pp38基因同源物在家蚕细胞中的表达(论文提纲范文)
(1)马立克病毒感染后鸡脾脏转录组学及miR-M4-5p调控马立克病毒致病机理的研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 文献综述 |
1.1 马立克病毒的研究进展 |
1.1.1 MDV的分类 |
1.1.2 MDV基因组结构 |
1.1.3 MDV致瘤相关基因 |
1.1.4 MDV的感染阶段 |
1.1.5 影响MDV感染的因素 |
1.1.6 马立克病疫苗 |
1.2 MDV感染后宿主基因表达谱研究进展 |
1.2.1 利用芯片技术研究MDV感染后宿主基因表达谱 |
1.2.2 qRT-PCR技术研究MDV感染后宿主基因表达谱 |
1.2.3 RNA-seq技术及应用 |
1.3 病毒编码microRNA的研究进展 |
1.3.1 mcroiRNA的出现 |
1.3.2 病毒miRNA及其生物起源 |
1.3.3 疱疹病毒miRNA及其功能 |
1.3.4 MDV编码的miRNA |
1.4 本研究的目的与意义 |
第二章 MDV感染鸡脾脏组织转录组研究 |
2.1 前言 |
2.2 材料 |
2.2.1 构建测序文库及qRT-PCR验证的组织材料 |
2.2.2 主要试剂 |
2.2.3 主要仪器设备 |
2.3 方法 |
2.3.1 RNA提取及浓度测定 |
2.3.2 甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量 |
2.3.3 测序文库的构建及测序 |
2.3.4 转录组测序数据质控和比对分析 |
2.3.5 qRT-PCR验证差异基因 |
2.4 结果与分析 |
2.4.1 RNA样品检测结果 |
2.4.2 Raw data的质量评估结果 |
2.4.3 Clean reads与参考基因组的比对结果 |
2.4.4 基因表达量分析结果 |
2.4.5 DEGs的筛选结果 |
2.4.6 qRT-PCR验证结果 |
2.4.7 DEGs的K-means分析结果 |
2.4.8 DEGs的GO、KEGG分析结果 |
2.4.9 蛋白互作网络 |
2.5 讨论 |
2.6 小结 |
第三章 miR-M4-5p靶向hnRNPAB促进CEF和DF-1 细胞的增殖 |
3.1 前言 |
3.2 材料 |
3.2.1 病毒和细胞材料 |
3.2.2 载体 |
3.2.3 合成的引物或核酸序列 |
3.2.4 主要试剂 |
3.2.5 主要仪器设备 |
3.3 方法 |
3.3.1 生物信息学方法预测 |
3.3.2 psi CHECK2- 和pcDNA6.2- 系列载体构建 |
3.3.3 双荧光素酶报告实验 |
3.3.4 miR-M4-5p过表达和GX0101感染细胞样品的制备 |
3.3.5 荧光定量PCR |
3.3.6 Western blot |
3.3.7 细胞增殖和凋亡检测 |
3.4 结果与分析 |
3.4.1 生物信息学预测miR-M4-5p靶标 |
3.4.2 候选靶基因的载体构建结果 |
3.4.3 双荧光素酶报告基因检测结果 |
3.4.4 miR-M4-5p下调hnRNPAB mRNA水平的表达 |
3.4.5 miR-M4-5p抑制hnRNPAB蛋白水平的表达 |
3.4.6 miR-M4-5p靶向hnRNPAB促进CEF和DF-1 细胞的增殖 |
3.5 讨论 |
3.5.1 miR-M4-5p在MDV感染中的作用 |
3.5.2 HnRNPs家族成员在肿瘤中的作用及hnRNPAB的作用 |
3.6 小结 |
第四章 鸡hnRNPAB蛋白单克隆抗体的制备 |
4.1 前言 |
4.2 材料 |
4.2.1 动物、细胞材料、载体和菌株 |
4.2.2 主要试剂 |
4.2.3 主要设备 |
4.3 方法 |
4.3.1 重组蛋白制备 |
4.3.2 小鼠免疫及检测 |
4.3.3 杂交瘤细胞制备及筛选 |
4.3.4 单克隆抗体制备 |
4.3.5 单克隆抗体的鉴定 |
4.4 结果与分析 |
4.4.1 HnRNPAB载体构建结果 |
4.4.2 HnRNPAB蛋白表达及纯化结果 |
4.4.3 HnRNPAB抗体的筛选及鉴定结果 |
4.4.4 HnRNPAB抗体的检测 |
4.5 讨论 |
4.6 小结 |
全文总结与创新点 |
全文总结 |
创新点 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简介 |
(2)马立克氏病毒pp38基因对Toll样受体通路的影响(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
文献综述 |
1 马立克氏病的研究进展 |
2 马立克氏病病毒基因组 |
2.1 病毒分类 |
2.2 MDV的形态学特征 |
2.3 MDV的分子特征 |
3 流行病学 |
4 临床症状 |
5 发病机制 |
5.1 早期溶细胞期 |
5.2 潜伏期 |
5.3 晚期溶细胞和免疫抑制期 |
5.4 增殖期 |
6 免疫应答机制 |
6.1 非特异性防御机制 |
6.2 适应性免疫应答 |
6.3 抗体的作用 |
6.4 细胞介导的免疫应答作用 |
7 抗马立克氏病疫苗 |
8 生物安全 |
9 马立克氏病病毒致肿瘤基因pp38的研究 |
10 Toll样受体在免疫应答中的作用 |
10.1 TLRs的简介 |
10.2 TLRs信号通路及相关细胞因子 |
11 研究的目的和意义 |
研究内容一 马立克氏病pp38蛋白真核表达载体的构建 |
1 材料 |
1.1 毒株、菌种与细胞 |
1.2 载体与主要试剂 |
1.3 培养基与试剂 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 CVI988株与RB1B株基因组总DNA的提取 |
2.2 引物设计 |
2.3 PCR扩增CV1988株与RB1B株pp38基因 |
2.4 PCR产物的回收纯化 |
2.5 酶切 |
2.6 酶切回收纯化 |
2.7 连接 |
2.8 E.coli DH5α感受态的制备 |
2.9 转化 |
2.10 阳性克隆筛选鉴定 |
2.11 阳性重组质粒转染CEF细胞 |
2.12 间接免疫荧光试验 |
2.13 Western blot鉴定重组质粒的表达 |
3 结果 |
3.1 MDV pp38基因的PCR扩增结果 |
3.2 pp38重组质粒的筛选和酶切鉴定 |
3.3 重组质粒pCMV-pp38-Flag中pp38基因测序结果 |
3.4 转染细胞中pp38表达的检测 |
3.5 Western blot中重组质粒的表达 |
4 讨论 |
研究内容二 疫苗株与强毒株pp38蛋白对Toll样受体信号通路的影响 |
1 材料 |
1.1 主要试剂 |
1.2 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 重组质粒中量提取 |
2.2 重组质粒转染CEF细胞 |
2.3 poly(I:C)刺激 |
2.4 RNA提取 |
2.5 反转录 |
2.6 Real-time PCR |
2.7 统计分析 |
3 结果 |
3.1 MyD88非依赖途径相关基因表达情况 |
3.1.1 pp38对TLR3表达的抑制作用 |
3.1.2 TRIF途径的相对表达量 |
3.1.3 IRIF3的相对表达量 |
3.1.4 IKKα NF-κB的相对表达量 |
3.2 MyD88依赖途径相关因子的表达情况 |
3.3 其他Toll样受体的表达情况 |
3.3.1 TLR2的相对表达量 |
3.3.2 TLR7的相对表达量 |
3.3.3 TLR15的相对表达量 |
3.3.4 TLR4、TLR21的相对表达量 |
3.4 其他细胞因子及免疫活性因子的检测 |
3.4.1 IL-6、IL-12及TNF-α的表达情况 |
3.4.2 MDA5通路相关因子 |
3.4.3 PKR的表达情况 |
4 讨论 |
4.1 pp38对MyD88非依赖途径的抑制作用 |
4.2 pp38对MyD88依赖途径的影响 |
4.3 病毒致病力对TLRs表达量的影响 |
4.4 pp38对其他一些细胞因子的影响 |
全文小结 |
参考文献 |
致谢 |
(3)Mid基因簇miRNAs在马立克病病毒致病中的潜在功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
Summary |
缩略词中英文对照表 |
引言 |
第一章 文献综述 |
1.1 马立克病(MD) |
1.2 马立克病病毒(MDV) |
1.2.1 MDV的分类 |
1.2.2 MDV的生物学特性 |
1.2.3 MDV的致病机制 |
1.2.4 MDV的基因组结构 |
1.2.5 MDV的基因与功能 |
1.3 微小RNA(MicroRNA,miRNA) |
1.3.1 miRNA的发现 |
1.3.2 miRNA的生物合成和作用机理 |
1.3.3 miRNA的调控功能 |
1.4 病毒编码的miRNA |
1.4.1 病毒miRNA的发现和鉴定 |
1.4.2 病毒miRNA的功能 |
1.4.3 疱疹病毒编码的miRNA |
1.5 MDV编码的miRNA |
1.5.1 MDV miRNA的发现与鉴定 |
1.5.2 MDV miRNA的表达 |
1.5.3 MDV miRNA的功能 |
1.6 本研究的目的和意义 |
第二章 研究内容 |
2.1 前言 |
2.2 材料 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.2 仪器和设备 |
2.2.3 主要试剂的配方 |
2.3 方法 |
2.3.1 Mid基因簇miRNA基因缺失BAC克隆的构建 |
2.3.2 Mid基因簇miRNA基因缺失BAC克隆的鉴定 |
2.3.3 Mid基因簇miRNA基因缺失感染性BAC克隆的拯救 |
2.3.4 Mid基因簇miRNA基因缺失毒株的鉴定 |
2.3.5 Mid基因簇miRNA基因缺失毒株的致病性分析 |
2.4 结果 |
2.4.1 GXΔmiR基因缺失BAC克隆的构建及筛选结果 |
2.4.2 GXΔmiR基因缺失BAC质粒的鉴定结果 |
2.4.3 GXΔmiR基因缺失毒株的拯救与鉴定结果 |
2.4.4 GXΔmiR基因缺失毒株的致病性分析结果 |
2.5 讨论 |
2.5.1 BAC和RecE/T是研究miRNA基因缺失的高效工具/手段 |
2.5.2 Mid基因簇miRNA的基因缺失未影响邻近miRNA及蛋白编码基因的表达 |
2.5.3 Mid基因簇miRNAs是MDV-1 复制的非必须基因,且与MD的免疫抑制无关 |
2.5.4 Mid基因簇miRNAs在MDV致瘤过程中可能扮演致癌或抑癌基因的不同角色 |
2.5.5 MDV编码的病毒miRNAs在致病/致瘤过程中的平衡调控 |
2.6 结论 |
致谢 |
基金 |
参考文献 |
作者简介 |
导师简介 |
(4)马立克病PCR检测方法建立及SD2012-1株分离与毒力试验(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略语表 |
第一章 马立克病研究进展 |
1 .相关基因及蛋白研究 |
1.1 病原分类 |
1.2 病毒形态 |
1.2.1 物理特性及结构组成 |
1.3 病毒基因和蛋白 |
1.3.1 致肿瘤相关基因 |
1.3.2 糖蛋白基因 |
1.3.3 其他基因 |
2 病毒感染研究 |
2.1 自然和实验宿主 |
2.2 宿主间传播 |
2.3 潜伏期 |
2.4 发病率和死亡率 |
3 .症状及病理变化 |
3.1 临床症状 |
3.2 甘体病变 |
3.3 组织病理甘 |
4 .发病机理研究 |
4.1 早期产毒性限制性感染期 |
4.2 感染潜伏期 |
4.3 第二次溶细胞感染期 |
4.4 淋巴组织增生期 |
5 诊断技术研究 |
5.1 诊断技术分类 |
5.1.1 病毒分离 |
5.1.2 病毒抗原检测 |
5.1.3 聚合酶链式反应(PCR) |
5.1.4 DNA探针 |
5.1.5 抗体检测 |
5.2 与其他肿瘤病的鉴别诊断 |
6 . 预防措施 |
6.1 免疫接种 |
6.1.1 疫苗的类型 |
6.1.2 疫苗接种 |
6.1.3 影响免疫效力的因素 |
6.2 提高遗传抵抗力 |
6.3 管理措施 |
第二章 马立克病PCR检测方法的建立 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 引物 |
1.1.2 病毒 |
1.1.3 组织样品 |
1.1.4 试剂 |
1.1.5 仪器 |
1.2 方法 |
1.2.1 特异性试验 |
1.2.2 敏感性试验 |
1.2.3 不同器官中MDV的检测比较 |
2 结果 |
2.1 特异性试验结果 |
2.2 敏感性试验结果 |
2.3 不同脏器 MDV 检测结果 |
3 .讨论 |
第三章 马立克病SD2012-1 株的分离和分析 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 样品采集 |
1.1.2 主要药品与试剂 |
1.1.3 主要仪器设备 |
1.1.4 引物 |
1.2 方法 |
1.2.1 马立克病病毒PCR鉴定 |
1.2.2 病毒的分离培养 |
1.2.3 MDV基因组总DNA的提取 |
1.2.4 主要致瘤基因的PCR扩增 |
1.2.5 PCR产物的纯化与回收 |
1.2.6 胶回收产物的连接与转化 |
1.2.7 质粒提取 |
1.2.8 Meq及vIL-8 基因的测序与分析 |
2 结果 |
2.1 马立克病病毒PCR鉴定结果 |
2.2 MDV的分离培养及基因组的提取 |
2.3 Meq基因和VIL-8 基因的序列测定 |
2.4 序列分析 |
2.4.1 Meq基因序列比较分析 |
2.4.2 vIL-8 基因序列分析 |
3 讨论 |
第四章 马立克病SD2012-1 株毒力试验 |
1 . 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
1.2.1 SD2012-1 分离株毒力试验 |
1.2.2 统计分析 |
2 . 结果 |
2.1 SD2012-1 分离株毒力试验结果 |
2.2 大体病变 |
3 . 讨论 |
全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
导师简介 |
(5)马立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物学活性的比较研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
1 文献综述 |
1.1 马立克氏病病毒(MDV)研究进展 |
1.1.1 病原学 |
1.1.2 流行病学 |
1.1.3 发病机理及病理变化 |
1.1.4 诊断技术 |
1.1.5 疾病防制策略 |
1.2 马立克氏病病毒的致病型 |
1.3 马立克氏病病毒的基因组结构 |
1.4 禽反转录病毒与DNA病毒间的基因重组 |
1.4.1 病毒的变异方式 |
1.4.2 MDV 与REV 间的基因重组 |
1.4.3 MDV 与ALV 间的基因重组 |
1.4.4 禽反转录病毒与DNA病毒间的基因重组的发生机制 |
1.5 不同病毒间遗传重组的流行病学意义 |
1.6 DNA 片段克隆的载体系统 |
1.6.1 质粒 |
1.6.2 粘粒 |
1.6.3 BAC 的优势及其发展 |
1.7 操纵MDV 基因:依靠细菌人工染色体新技术 |
1.7.1 RecA 蛋白介导的同源重组 |
1.7.2 RecE/T 蛋白介导的同源重组 |
1.8 本研究的意义 |
2 一株整合有 REV 长末端重复序列的 MDV 的致病性研究 |
2.1 材料和方法 |
2.1.1 材料 |
2.1.1.1 蛋鸡、SPF 鸡和SPF 动物设施 |
2.1.1.2 病毒与鸡胚 |
2.1.1.3 疫苗 |
2.1.1.4 主要仪器 |
2.1.2 方法 |
2.1.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 |
2.1.2.2 病毒的增殖与定量 |
2.1.2.3 MDV 人工攻毒 |
2.1.2.4 NDV 和AIV 油乳灭活苗的免疫和免疫反应的测定 |
2.1.2.5 MDV 感染对体重的影响 |
2.1.2.6 接种 MDV 的海蓝褐公鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
2.1.2.7 MDV 感染影响免疫器官发育的比较方法 |
2.1.2.8 病理学检测 |
2.1.2.9 统计学分析 |
2.2 结果 |
2.2.1 GX0101 毒株感染对鸡生长性能的影响 |
2.2.1.1 对海蓝褐公鸡的影响 |
2.2.1.2 对SPF 鸡的影响 |
2.2.2 GX0101 毒株感染对NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
2.2.2.1 对海蓝褐公鸡的影响 |
2.2.2.2 对SPF 鸡的影响 |
2.2.3 GX0101 毒株感染对 AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
2.2.3.1 对海蓝褐公鸡的影响 |
2.2.3.2 对SPF 鸡的影响 |
2.2.4 GX0101 毒株感染对 AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
2.2.4.1 对海蓝褐公鸡的影响 |
2.2.4.2 对SPF 鸡的影响 |
2.2.5 GX0101 毒株感染后对中枢免疫器官的影响 |
2.2.6 接种 MDV 的鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
2.2.6.1 对海蓝褐公鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
2.2.6.2 对SPF 鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
2.3 讨论 |
3 带有 REV-LTR 片段的 MDV 野毒株 GX0101 的BAC 克隆的构建及拯救病毒的致病性分析 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 材料 |
3.1.1.1 病毒 |
3.1.1.2 相关试剂 |
3.1.1.3 动物及疫苗 |
3.1.2 方法 |
3.1.2.1 构建感染性 BAC 分子克隆化病毒的技术路线 |
3.1.2.2 重组转基因载体质粒 pDS-pHAI-US2 的构建 |
3.1.2.3 GX0101-BAC 克隆的构建及鉴定 |
3.1.2.4 重组病毒的拯救及间接免疫荧光试验 |
3.1.2.5 BAC 克隆毒bac-GX0101 与亲本毒GX0101 致病性比较 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 质粒 pDS-pHAI-US2 |
3.2.2 GX0101-BAC 克隆的鉴定 |
3.2.3 拯救的重组病毒的鉴定 |
3.2.4 IFA 检测重组病毒bac-GX0101 |
3.2.5 对增重的影响 |
3.2.6 对 NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
3.2.7 对AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
3.2.8 对AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
3.2.9 致肿瘤性以及死亡率 |
3.2.10 GX0101、bac-GX0101 株感染对 SPF 鸡的病理组织学检测 |
3.3 讨论 |
4 马立克氏病病毒野毒株 GX0101 的 LTR 序列敲除及其生物学特性比较 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 材料 |
4.1.1.1 细胞与病毒 |
4.1.1.2 相关试剂 |
4.1.1.3 动物及疫苗 |
4.1.2 方法 |
4.1.2.1 卡那霉素抗性基因的扩增 |
4.1.2.2 REV-LTR 序列的敲除 |
4.1.2.3 GX0101△LT R-BAC DNA 的鉴定 |
4.1.2.4 PCR产物序列的比较与分析 |
4.1.2.5 GX0101△LT R-BAC DNA 的提取 |
4.1.2.6 重组病毒的拯救 |
4.1.2.7 间接免疫荧光法(IFA)检测拯救的重组病毒bac-GX0101△LTR |
4.1.2.8 MDV 毒人工感染方法 |
4.1.2.9 MDV 感染对体重的影响 |
4.1.2.10 对 NDV 和 AIV 油乳灭活苗的免疫后的免疫抑制性的比较 |
4.1.2.11 斑点杂交检测 bac-GX0101 毒株与 bac-GX0101△LTR 毒株的横向传播能力 |
4.1.2.12 病毒血症的检测 |
4.2 结果 |
4.2.1 卡那霉素的特异性扩增 |
4.2.2 敲除GX0101 株中整合的REV-LTR 序列 |
4.2.3 PCR 产物的序列测定与分析 |
4.2.4 拯救病毒 bac-GX0101△LTR |
4.2.5 对增重的影响 |
4.2.6 对 NDV 疫苗免疫抗体反应的抑制作用 |
4.2.7 对 AIV-H9 疫苗免疫抗体反应的抑制作用 |
4.2.8 间接免疫荧光法(IFA)检测 MDV 病毒血症水平 |
4.2.9 MDV-pp38 核酸探针灵敏度及特异性检测 |
4.2.10 斑点分子杂交检测感染鸡的羽毛囊中的 MDV |
4.2.11 bac-GX0101 毒株与bac-GX0101△LTR 毒株横向传播能力的比较 |
4.2.12 两株 MDV 诱发鸡的死亡率和肿瘤发生率比较 |
4.3 讨论 |
5 马立克氏病病毒 ICP4 基因功能的研究 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 材料 |
5.1.1.1 细胞与病毒 |
5.1.1.2 相关试剂 |
5.1.1.3 动物及疫苗 |
5.1.2 方法 |
5.1.2.1 卡那霉素抗性基因的扩增 |
5.1.2.2 ICP4 基因的敲除 |
5.1.2.3 GX0101 △ICP4 -BAC DNA 的鉴定 |
5.1.2.4 PCR 产物序列的比较与分析 |
5.1.2.5 GX0101△ICP4 -BAC DNA 的提取 |
5.1.2.6 重组病毒的拯救 |
5.1.2.7 间接免疫荧光法(IFA)检测拯救的重组病毒bac-GX0101△ICP4 |
5.1.2.8 bac-GX0101 △ICP4 与bac-GX0101 致病性比较 |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 敲除MDV 毒株中的ICP4 基因 |
5.2.2 PCR 产物的序列测定与分析 |
5.2.3 拯救bac-GX0101△ICP4 |
5.2.4 IFA |
5.2.5 对增重的影响 |
5.2.6 对 NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
5.2.7 对 AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
5.2.8 对 AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
5.2.9 致死率与致肿瘤性 |
5.3 讨论 |
6 马立克氏病毒1.8-kb mRNA 基因的潜在阅读框A和C的敲除及其功能研究 |
6.1 材料与方法 |
6.1.1 材料 |
6.1.1.1 病毒 |
6.1.1.2 相关试剂 |
6.1.1.3 动物及疫苗 |
6.1.2 方法 |
6.1.2.1 GX0101△(A+C) -BAC的构建 |
6.1.2.2 GX0101△(A+C) -BAC DNA 的鉴定 |
6.1.2.3 GX0101 △(A+C) -BAC DNA 拯救病毒生长特性的测定 |
6.1.2.4 ORF(A+C)对双向启动子活性的影响 |
6.1.2.5 bac-GX0101△(A+C) 与bac-GX0101 致病性比较 |
6.2 结果 |
6.2.1 1.8kb-m RNA 中ORF(A+C)缺失株的构建 |
6.2.3 1.8kb-mRNA 中 ORF(A+C)对双向启动子活性的影响 |
6.2.4 对增重的影响 |
6.2.5 对 NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
6.2.6 对 AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
6.2.7 对 AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
6.2.8 致肿瘤性 |
6.3 讨论 |
结论 |
创新之处 |
参考文献 |
致谢 |
读博士学位期间发表、录用(或起草)论文 |
(6)分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及其机制研究(论文提纲范文)
提要 |
英文缩略词表 |
文缩略词表(续) |
前言 |
第一篇 文献综述 |
第一章 中药抗病毒研究进展 |
1 病毒的致病机理和机体的抗病毒免疫 |
2 中药抗病毒的作用机理和途径 |
3 中药抗病毒的研究方法和思路 |
4 中药抗病毒的临床应用与研究 |
5 小结 |
第二章 皂苷与人参皂苷的研究进展 |
1 皂苷 |
2 人参皂苷 |
3 小结 |
第三章 马立克氏病毒研究进展 |
1 MDV 生物学研究进展 |
2 MDV 分子生物学研究进展 |
3 小结 |
第二篇 实验研究 |
第一章 人参皂苷及其衍生物体外抗马立克病毒鸡胚成纤维细胞模型的建立 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第二章 人参皂苷及其衍生物对鸡胚成纤维细胞最大安全浓度的测定 |
1 材料和方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第三章 人参皂苷及其衍生物体外抗马立克氏病毒的药效学研究 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第四章 通过透射电镜观察人参皂苷及其衍生物体外抗马立克氏病毒作用 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第五章 人参皂苷及其衍生物体内抗马立克氏病毒的疗效观察 |
1 材料和方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
第六章 人参皂苷及其衍生物体内抗马立克氏病毒的作用机制研究 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
结论 |
参考文献 |
攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
详细摘要 |
导师简历 |
作者简历 |
致谢 |
(7)鸡马立克氏病病毒细菌人工染色体的构建(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 绪论 |
1.1 MDV研究简述 |
1.1.1 MD和MDV |
1.1.2 MDV的分类 |
1.1.3 MDV的病原学特征 |
1.1.4 MDV的基因利蛋白 |
1.1.5 MDV的增殖与感染 |
1.1.6 MDV的疫苗防控策略 |
1.2 细菌人工染色体技术研究进展 |
1.2.1 BAC载体系统简述 |
1.2.2 BAC分子克隆化病毒 |
1.2.3 细菌人工染色体的修饰技术 |
1.3 本研究的目的和意义 |
第二章 细菌人工染色体重组病毒转移载体的构建 |
2.1 材料 |
2.1.1 质粒、菌种、病毒与试剂 |
2.1.2 主要仪器 |
2.2 方法 |
2.2.1 细菌人工染色体重组病毒转移载体的设计及技术路线 |
2.2.2 BAC载体基本功能基因序列制备 |
2.2.3 表达Eco-gpt的正选择标记基因的构建 |
2.2.4 转移载体pUAB-gpt-BAC11的构建 |
2.3 结果 |
2.3.1 BAC载体基本功能基因序列制备 |
2.3.2 表达Eco-gpt的正选择标记基因的鉴定 |
2.3.3 BAC-rv-MDV814重组病毒转移载体pUAB-gpt-BAC11的鉴定 |
2.4 讨论 |
2.4.1 制备BAC载体基本功能基因序列 |
2.4.2 表达Eco-gpt的正选择标记基因 |
2.4.3 细菌人工染色体重组病毒转移载体的核心序列 |
第三章 细菌人工染色体重组马立克氏病病毒的构建 |
3.1 材料 |
3.1.1 菌种、细胞、病毒与试剂 |
3.1.2 主要仪器 |
3.2 方法 |
3.2.1 电转化转移载体质粒pUAB-gpt-BAC11到宿主菌DH10B |
3.2.2 转移载体质粒的提取和纯化 |
3.2.3 转染用MDV感染细胞总DNA的制备 |
3.2.4 转移载体质粒与Total-DNA的共转染 |
3.2.5 重组病毒rv-MDV814的初步筛选和富集 |
3.2.6 重组病毒rv-MDV814的纯化 |
3.2.7 重组病毒rv-MDV814的鉴定 |
3.3 结果 |
3.3.1 转移载体质粒的电转化、保种、纯化及纯度测定 |
3.3.2 转移载体质粒与Total-DNA的共转染启动病毒感染 |
3.3.3 重组病毒rv-MDV814的筛选和纯化 |
3.3.4 重组病毒rv-MDV814的鉴定结果 |
3.4 讨论 |
第四章 感染性BAC分子克隆化病毒的筛选 |
4.1 材料 |
4.1.1 菌种、细胞、病毒与试剂 |
4.1.2 主要仪器 |
4.2 方法 |
4.2.1 构建感染性BAC分子克隆化病毒的技术路线 |
4.2.2 电转化分子克隆化病毒感受态细菌DH10B的制备 |
4.2.3 环化重组病毒细胞总DNA的提取 |
4.2.4 电转化筛选BAC转化子 |
4.2.5 BAC转化子的初步鉴定 |
4.2.6 BAC分子克隆化病毒克隆质粒的提取和纯化 |
4.2.7 BAC-DNA的限制性内切酶酶切图谱分析 |
4.2.8 BAC分子克隆化病毒的外源目的插入片段的PCR鉴定 |
4.2.9 BAC分子克隆化病毒中病毒基因组的PCR鉴定 |
4.2.10 转染用BAC-DNA的提取和纯化 |
4.2.11 CEF载体总DNA的制备 |
4.2.12 BAC-DNA转染CEF |
4.2.13 救重组病毒BAC-derived MDV814 |
4.2.14 拯救重组病毒BAC-derived MDV814的鉴定 |
4.2.15 重组病毒、野生病毒与拯救的重组病毒在体外生长特性的比较 |
4.3 结果 |
4.3.1 电转化筛选BAC转化子 |
4.3.2 BAC-DNA的限制性内切酶酶切图谱分析结果 |
4.3.3 BAC分子克隆化病毒的外源目的插入片段的PCR鉴定结果 |
4.3.4 BAC分子克隆化病毒的病毒基因组的PCR鉴定结果 |
4.3.5 BAC-DNA的浓度和纯度 |
4.3.6 拯救的重组病毒BAC-derivedMDV814 |
4.3.7 重组病毒rv-MDV814、野生病毒wt-MDV814与拯救的重组病毒BAC-redrived MDV814的病毒蚀斑的形态比较 |
4.3.8 重组病毒rv-MDV814、野生病毒wt-MDV814与拯救的重组病毒BAC-derived MDV814的病毒生长曲线的比较 |
4.4 讨论 |
第五章 BAC-based vaccine免疫效力初步试验 |
5.1 材料 |
5.1.1 病毒、菌种与试剂 |
5.1.2 主要仪器 |
5.2.方法 |
5.2.1 动物试验设计 |
5.2.2 MDV京-1强毒株的复壮 |
5.2.3 各种BAC-based免疫制剂的制备 |
5.3 结果 |
5.3.1 各试验组鸡只存活率及攻毒死亡变化曲线 |
5.3.2 各试验组鸡只MD发病情况 |
5.4 讨论 |
第六章 全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历 |
(8)广西马立克氏病病毒野毒株的分离与鉴定及其与其它病毒共感染的研究(论文提纲范文)
摘要 |
英文摘要 |
目录 |
前言 |
文献综述 |
实验研究之一 马立克氏病病毒广西野毒株的分离与鉴定 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 MDV野毒株的分离 |
2.2 间接免疫荧光抗体试验(IFA)的检测 |
2.3 PCR的扩增结果 |
3 小结与讨论 |
实验研究之二 广西MDV野毒株中REV共感染的初步研究 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 病毒在DEF上的增殖 |
2.2 MDV和REV的IFA的检测 |
2.3 132bpr和LTR序列的二重PCR扩增结果 |
2.4 MDV meq基因、REV env基因和FPV 4b基因的PCR扩增结果 |
2.5 REV env基因和FPV 4b基因的序列测定 |
3 小结与讨论 |
实验研究之三 整合进REV基因组片段的MDV重组野毒株的分离与鉴定 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 MDV分离毒株的获得 |
2.2 毒株细胞培养物IFA的检测结果 |
2.3 132bpr序列和REV LTR序列的二重PCR扩增结果 |
2.4 MDV分离株的蚀斑克隆纯化 |
2.5 MDV meq基因和REV env基因的PCR扩增结果 |
3 小结与讨论 |
实验研究之四 MDV野毒株meq基因的克隆及序列分析 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 meq基因的PCR扩增结果 |
2.2 重组质粒的双酶切鉴定结果 |
2.3 meq基因核苷酸序列的比较分析 |
2.4 meq基因氨基酸序列的比较分析 |
2.5 MDV毒株meq基因进化树的绘制 |
3 小结与讨论 |
结论 |
致谢 |
个人简历 |
攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
攻读硕士学位期间参与的科研课题 |
(9)L-meq对MDCC-MSB1细胞端粒酶活性影响的研究(论文提纲范文)
内容提要 |
引言 |
第一篇 文献综述 |
第一章 MDV致病机理的研究进展 |
1 MD概述 |
2 MDV基因组结构的特点 |
3 MDV致瘤相关基因 |
4 马立克氏病肿瘤发生过程中病毒与宿主的关系 |
第二章 端粒、端粒酶与肿瘤关系的研究进展 |
1 端粒、端粒酶的发现 |
2 端粒的结构与功能 |
3 端粒酶的结构与功能 |
4 端粒、端粒酶与肿瘤 |
第二篇 研究内容 |
第一章 L-meq基因的原核表达及多克隆抗体的制备 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第二章 L-meq对端粒酶活性影响的研究 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
结论 |
参考文献 |
中文摘要 |
英文摘要 |
致谢 |
导师简介 |
作者简介 |
CURRICULUM VITAE |
(10)MDV致瘤的分子机理(论文提纲范文)
提要 |
前言 |
第一篇 文献综述 |
第一章 鸡马立克氏病与马立克氏病毒的研究进展 |
1 MD 的研究进展 |
2 MDV 的分子生物学研究现况 |
第二章 端粒和端粒酶的研究进展 |
1 端粒和端粒酶的研究进展 |
2 端粒酶活性的调控 |
3 端粒酶活性检测的研究进展 |
4 端粒、端粒酶与肿瘤 |
第三章 P53 与细胞周期调控研究进展 |
1 细胞周期 |
2 细胞周期限制点的调控 |
3 鸡细胞周期因子的研究进展 |
4 端粒酶与细胞周期和细胞周期调控因子的关系 |
第四章 蛋白质组学研究内容及技术概况 |
1 蛋白质组学概念及研究内容 |
2 蛋白质组学研究技术 |
3 比较蛋白质组学及其主要进展 |
4 蛋白质组研究策略 |
5 双向凝胶电泳技术研究及其在蛋白质组学中的应用 |
第二篇 研究内容 |
第一章 MD 京-1 株感染鸡后不同时期meq 基因的动态监测 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第二章 meq 基因在CEF 中的表达及对p53、chTERT、chTR 表达的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第三章 L-meq 基因在CEF 中的表达及对p53、chTERT、chTR 表达的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第四章 meq 和L-meq 及L-meq-180 序列在CEF 中的表达及对p53、 chTERT、chTR 表达的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第五章 双向凝胶电泳(2-DE)比较转染 CEF 前后蛋白质组差异的研究 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
结论 |
参考文献 |
攻读博士期间发表的主要论文 |
中文摘要 |
英文摘要 |
致谢 |
导师简介 |
个人简介 |
四、MDV型疫苗株pp38基因同源物在家蚕细胞中的表达(论文参考文献)
- [1]马立克病毒感染后鸡脾脏转录组学及miR-M4-5p调控马立克病毒致病机理的研究[D]. 党露. 西北农林科技大学, 2017(02)
- [2]马立克氏病毒pp38基因对Toll样受体通路的影响[D]. 苏瑞雪. 扬州大学, 2017(01)
- [3]Mid基因簇miRNAs在马立克病病毒致病中的潜在功能研究[D]. 滕蔓. 甘肃农业大学, 2017(09)
- [4]马立克病PCR检测方法建立及SD2012-1株分离与毒力试验[D]. 张丽娟. 甘肃农业大学, 2014(05)
- [5]马立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物学活性的比较研究[D]. 孙爱军. 山东农业大学, 2009(03)
- [6]分子修饰前后的人参皂苷抗马立克氏病毒的作用及其机制研究[D]. 褚秀玲. 吉林大学, 2007(03)
- [7]鸡马立克氏病病毒细菌人工染色体的构建[D]. 崔红玉. 中国农业科学院, 2007(05)
- [8]广西马立克氏病病毒野毒株的分离与鉴定及其与其它病毒共感染的研究[D]. 周祥. 广西大学, 2007(05)
- [9]L-meq对MDCC-MSB1细胞端粒酶活性影响的研究[D]. 郑梅竹. 吉林大学, 2007(04)
- [10]MDV致瘤的分子机理[D]. 潘风光. 吉林大学, 2007(03)