一、Inducible heat shock protein 70 kD and inducible nitric oxide synthase in hemorrhage/resuscitation-induced injury（论文文献综述）
李慧敏[1]（2021）在《臂旁核在束缚-浸水应激大鼠中的作用》文中提出大鼠束缚-浸水应激（Restraint Water-immersion Stress,RWIS）模型是将大鼠四肢及头部固定于特制的硬板上,然后放入冷水环境中（水温21±1℃）浸水而产生较为严重的生理以及心理双重刺激的复合型应激模型。从而引起机体在短时间内出现恐惧、愤怒、不安等情绪变化,同时伴有胃肠活动加剧、胃黏膜血流量减少以及胃酸分泌量增多等胃肠机能的紊乱,造成机体的胃黏膜损伤。应激性胃溃疡主要是机体受到急性应激而诱发的疾病,敏感焦虑以及情绪波动较强的人容易产生该疾病,因此该模型广泛用于应激性胃黏膜损伤产生机制的研究。长期以来臂旁核（parabrachial nucleus,PBN）被认为是感觉中继,在中枢神经系统中发挥着重要的作用,维持体内平衡和促进机体生存。臂旁核与延髓迷走复合体、下丘脑、丘脑和大脑皮层存在着广泛纤维联系。臂旁核接收孤束核（Nucleus tractus solitarius,NTS）传来的内脏感觉信息,经进一步整合分析,经由丘脑传到大脑皮层皮层。同时,臂旁核可接受来自前脑的信号传入如伤害性刺激信息、内脏信息和冷热温觉信息,与下丘脑的室旁核等存在纤维投射关系,参与了水盐平衡、体温调节、睡眠觉醒和胃肠运动等机能的调控。课题组前期的研究结果表明:在束缚-浸水应激条件下,主要是大鼠的副交感神经系统（parasympathetic nerve system,PNS）参与胃机能的调节,室旁核、孤束核、迷走神经背核和视上核等参与束缚-浸水应激致胃机能紊乱过程,但是PBN是否参与RWIS过程,PBN在应激性胃黏膜损伤中的作用如何,PBN中哪类神经元在RWIS过程被激活,这些问题尚未见报道。针对以上的疑问,设计实验并得到如下结果:1.将实验大鼠随机分为三组:对照组（RWIS 0 h）、1h应激组（RWIS 1 h）、3 h应激组（RWIS 3 h）。采用免疫荧光染色技术和蛋白质免疫印迹技术检测了RWIS不同时段,内侧臂旁核（the medial parabrachial nucleus,MPB）、外侧臂旁核（the lateral parabrachial nucleus,LPB）以及KF核（Kolliker-Fuse nucleus）三个区中的神经元激活的特异性标志分子c-Fos蛋白和星形胶质细胞特异性标志物GFAP（glial fibrillary acidic portein,GFAP）的表达。实验结果发现,与对照组相比,1 h应激组（RWIS 1 h）和3 h应激组（RWIS 3 h）,单位面积内（0.01mm2）PBN的c-Fos蛋白和GFAP蛋白的表达明显增加,其中以臂旁核外侧核（LPB）的表达最多,且存在显着差异。这些结果表明PBN中的神经元和星形胶质细胞参与了RWIS过程。2.将实验大鼠随机分为三组:生理盐水组（注射生理盐水+CNO）、空载病毒组（注射AAV-Ca MKIIa-MCS-m Cherry+CNO）、h M4D病毒组（注射AAV-Ca MKIIa-h M4D（Gi）-m Cherry+CNO）。通过免疫荧光染色技术、蛋白质免疫印迹技术以及化学遗传学技术,检测臂旁核定位注射h M4D病毒抑制PBN之后,对PBN和脑干NTS内c-Fos和GFAP表达的影响,以及对大鼠的胃黏膜损伤的影响。实验结果发现,与生理盐水组相比,h M4D病毒组大鼠臂旁核内c-Fos蛋白和GFAP蛋白的表达量明显下降,大鼠胃壁中的Claudin-1、Occludin表达明显升高,胃壁中PCNA（Proliferating Cell Nuclear Antigen A,PCNA）表达明显降低,胃黏膜损伤指数呈明显降低,表明抑制臂旁核的活性,改善了束缚-浸水应激导致的胃黏膜损伤。3.将实验大鼠随机分为两组:生理盐水组（注射生理盐水）、给药组（注射抑制剂L-NAME）。通过免疫荧光染色和蛋白质印记分析技术,观察到束缚-浸水应激对PBN内MPB、LPB以及KF三个脑区中的NOS（nitric oxide synthase,NOS）表达有影响,PBN内注射NOS的抑制剂L-NAME对大鼠的胃黏膜损伤的影响。研究发现,大鼠束缚-浸水应激导致PBN内的NOS表达明显增加;和生理盐水组相比,L-NAME给药组大鼠胃黏膜损伤指数明显降低,胃黏膜损伤程度减轻;咬合蛋白Occludin以及闭合蛋白Claudin-1的表达量增多,胃壁中PCNA表达量降低,结果表明PBN内一氧化氮能神经元参与了束缚-浸水应激过程,L-NAME抑制PBN内NOS的合成改善了束缚-浸水应激导致的胃黏膜损伤,对应激性胃黏膜损伤起保护作用。
段晨阳[2]（2020）在《Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究》文中研究说明线粒体作为细胞有氧呼吸的主要场所,是缺血缺氧后较早发生损害的细胞器之一。以往针对线粒体的治疗措施主要以抗氧化应激、抗凋亡等线粒体功能障碍发生后的效应为靶点,缺乏针对线粒体质量调控过程中关键环节的防治措施,治疗效果有限。近年研究表明,线粒体质量失衡如线粒体过度分裂、融合受损、自噬和代谢紊乱等关键环节异常与缺血缺氧损伤后多器官功能障碍和机体物质能量代谢紊乱的发生密切相关。Drp1作为经典线粒体动力蛋白,主要影响了线粒体质量调节中的线粒体分裂过程。以往研究认为Drp1只有在内质网和线粒体接触（ER-Mito接触）引起线粒体预收缩后才会被招募到线粒体上参与线粒体分裂过程,但招募机制还有待深入研究。并且正常情况下转位到线粒体上参与线粒体分裂的Drp1仅占总Drp1含量的6%,还有大量Drp1存在于胞浆中。那么大量存在的细胞质Drp1具有哪些功能?在被招募到线粒体之前是否已经开始参与线粒体分裂过程?对于ER-Mito接触形成及线粒体预收缩是否有调控作用?对除了线粒体分裂的其他线粒体质量调控环节比如线粒体自噬、线粒体代谢等是否也有影响呢?此外,目前研究认为Drp1被招募到线粒体上后主要是通过其GTPase活性切割线粒体膜介导分裂的,但是Drp1介导线粒体分裂结束后下一步如何发展一直是困扰大家的问题。近年来在多种疾病模型中发现Drp1参与了线粒体和细胞功能调节,但具体调控机制尚不清楚。有研究表明,线粒体mPTP通道过度开放是线粒体膜电位改变、细胞坏死等发生的先决条件,而ROS大量堆积可能是引起上述线粒体和细胞功能障碍的重要诱因。那么缺血缺氧后线粒体Drp1除了介导线粒体分裂外,是否对线粒体外膜mPTP通道开放和ROS的产生及清除也有影响?为此,本研究利用整体失血性休克和细胞糖氧剥夺方法复制急性缺血缺氧损伤模型。首先我们了解了缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律。其次我们探究了Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及调控机制,重点研究了细胞质Drp1介导ER-Mito接触对线粒体预收缩的启动机制以及线粒体Drp 1对mPTP和ROS等线粒体功能的调控机制。最后,我们观察了使用Drp 1抑制剂Mdivi-1或者Drp 1敲除干预等措施对缺血缺氧损伤后多器官功能的保护作用,为从维持线粒体质量平衡角度调整急性缺血缺氧损伤临床救治方案提供了新思路和新靶点。[研究内容]第一部分:急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺细胞模型,观察缺血缺氧不同时相点（0.5h、1h、2h、3h、4h）血管组织、肠组织、心肌组织及其对应细胞线粒体形态和数量变化以及ATP产生、ROS含量、线粒体膜电位等线粒体功能变化,以了解急性缺血缺氧损伤多组织器官线粒体质量失衡的特征规律。第二部分:Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中作用及调控机制研究1.急性缺血缺氧损伤后线粒体动力蛋白Drp1表达、分布及修饰变化利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺血管平滑肌细胞（VSMC）模型,观察缺血缺氧不同时相点线粒体动力蛋白表达、分布情况;观察缺血损伤后血管和肠组织Drp1修饰变化。2.Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体形态和数量变化中作用及对ER-Mito接触的调控机制（1）Drp1介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的调控作用利用Drp1干扰/过表达腺病毒转染的VSMC细胞,观察干预线粒体Drp1对正常情况下和缺氧后线粒体形态和数量变化的影响,以明确Drp1介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的调控作用。（2）细胞质Drp1介导ER-Mito接触对线粒体预收缩的启动机制利用失血性休克SD大鼠和Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型、糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺血缺氧不同时相点ER-Mito接触情况;观察干预细胞质Drp1对ER-Mito接触和线粒体预收缩的影响;观察干预Drp1-Shroom4复合体对肌动蛋白束化、ER-Mito接触以及线粒体预收缩的影响,以阐明细胞质Drp1通过Shroom4束化肌动蛋白启动ER-Mito接触形成的机制。（3）细胞质Drp1加速线粒体转位的发生机制利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺血不同时相点Calnexin、Fundc1表达及分布情况;观察干预内质网蛋白Calnexin对缺氧早期Drp1和Fundc1的线粒体转位、线粒体预收缩和线粒体分裂的影响,以了解细胞质Drp1在ER-Mito接触位点Calnexin-Fundc1环的招募作用下加速线粒体转位的发生机制。（4）Drp1介导线粒体自噬对破损线粒体的清除机制利用失血性休克Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺Drp1干扰腺病毒转染的VSMC细胞模型,基因组学分析生理和缺血损伤情况下Drp1可能参与的调控通路;观察干预Drp1对缺血缺氧后线粒体自噬小体和自噬溶酶体形成的影响;观察干预Drp1对自噬相关蛋白表达及分布的影响,以阐明Drp1通过Clec16a-Parkin途径介导线粒体自噬的机制。3.Drp1在缺血缺氧损伤mPTP开放和ROS堆积等线粒体功能变化中作用及调控机制（1）Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体mPTP通道开放中的作用及调控机制利用失血性休克SD大鼠、Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺氧不同时相点mPTP开放情况;观察缺血缺氧不同时相点mPTP结构蛋白表达和分布情况;观察干预mPTP结构蛋白HK2表达活性对缺氧后mPTP开放的影响;观察干预线粒体Drp1-LRRK2结合对HK2活性、分布和mPTP开放的影响,以阐明线粒体Drp1对缺血缺氧损伤mPTP过度开放的调控机制。（2）Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体ROS堆积中的作用及调控机制利用失血性休克Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察机体能量代谢变化;代谢组学检测干预Drp1对缺血损伤后线粒体代谢的影响;观察干预Drp1介导谷胱甘肽代谢对线粒体功能的影响,以阐明Drp1通过影响线粒体代谢参与ROS生成和清除的潜在调控通路。第三部分:干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究使用Drp1抑制剂Mdivi-1以及Drp1敲除干预观察缺血缺氧损伤后（1）血管反应性、血管管径变化、血管平滑肌细胞收缩张力以及动态血压维持情况;（2）肝肾血流灌注、肝功、肾功、心输出量、心损和心肌细胞收缩力;（3）肠上皮紧密连接情况、肠道菌群组成及肠屏障功能;（4）血流动力学指标（LVSP、±dp/dt max）、血气指标（Lac、HCO3-、BE、pH等）以及72h存活情况,以阐明干预Drp1对急性缺血缺氧损伤后重要器官功能的保护作用及其临床意义。[研究结果]第一部分:急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究1.缺血缺氧损伤后血管、肠和心脏组织线粒体形态和数量均发生明显变化,但变化时间、变化程度和变化形式存在差异。血管组织变化起始于缺血缺氧后1h并逐渐加剧。肠组织在缺血缺氧后0.5h即发生明显变化,但后续并没有进一步加重。心脏组织变化不如血管和肠组织明显,缺血缺氧后2h才有稍许增加,并且不同于血管和肠组织线粒体缺血缺氧后表现为线粒体过度分裂和碎片化线粒体数量增多,缺血缺氧损伤对心肌线粒体的影响主要体现在心肌线粒体排布紊乱和内部嵴结构的破坏。2.缺血缺氧损伤后血管、肠和心脏组织线粒体功能均发生明显变化,且缺血缺氧损伤后相同组织线粒体功能变化均晚于线粒体形态和数量的变化。第二部分:Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中作用及调控机制研究1.急性缺血缺氧损伤后线粒体动力蛋白Drp1表达、分布及修饰变化（1）缺血缺氧损伤1h后Drp1发生从细胞质到线粒体转位,且其时相变化规律与线粒体碎片化程度呈正相关,提示Drp1线粒体转位在缺血缺氧早期线粒体过度分裂中发挥了重要作用。进一步发现转位到线粒体上的Drp1主要富集在线粒体预收缩位点,对于线粒体分裂的发生具有重要意义。（2）缺血损伤后Drp1的磷酸化、苏木化、亚硝基化修饰明显增高,泛素化修饰轻度减低。缺血缺氧损伤后活跃的Drp1修饰变化对于线粒体质量调控具有重要意义。2.Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体形态和数量变化中作用及对ER-Mito接触的调控机制（1）缺血缺氧后线粒体碎片化的发生是由于Drp1线粒体转位后介导线粒体过度分裂导致的。干扰Drp1后线粒体Drp1减少的同时伴随线粒体碎片数量减少。正常情况下过表达Drp1会导致线粒体过度分裂和线粒体数量的增加。上述结果明确了 Drp1线粒体转位介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的决定作用。（2）缺血缺氧损伤初期Drp1发生大量线粒体转位之前,过度磷酸化和亚硝基化的细胞质Drp1通过激活细胞骨架调节蛋白Shroom4并与之结合形成Drp1-Shroom4复合体。Drp1-Shroom4复合体如“卡扣”一样将内质网周围散乱分布的F-肌动蛋白束化,增强了内质网与线粒体之间的牵引力和有效接触面积。随后内质网在束化F-肌动蛋白锚定端INF2的牵引下,缠绕在线粒体周围,形成ER-Mito接触并进一步引起线粒体预收缩。（3）缺血缺氧损伤ER-Mito接触引起大量线粒体预收缩后,内质网Calnexin会迁移到ER-Mito接触位点并与细胞质中Fundcl结合形成功能环,加速细胞质Drp1沿内质网轨迹向ER-Mito接触位点的线粒体转位过程。（4）缺血缺氧损伤后活化Drp1可上调线粒体Clec16a表达,一方面抑制了 Parkin的线粒体募集,导致线粒体碎片形成自噬小体受阻;另一方面也加速了自噬小体向自噬溶酶体的转变,促进了缺血缺氧损伤后的自噬流过程。3.Drp1在缺血缺氧损伤mPTP开放和ROS堆积等线粒体功能变化中作用及调控机制（1）缺血缺氧晚期,线粒体收缩位点大量富集的Drp1除了介导线粒体分裂外,还会通过结合mPTP结构蛋白BAX,识别线粒体收缩位点附近的mPTP通道。然后通过招募线粒体LRRK2到线粒体收缩或分裂位点形成Drp1-LRRK2复合体引起mPTP通道结构蛋白HK2失活及其线粒体分离,破坏mPTP通道结构,导致mPTP通道过度开放,线粒体CytC释放增多,影响线粒体功能和细胞功能。（2）缺血缺氧后活化Drp1会造成ROS的过度堆积,进而破坏线粒体功能,引起细胞能量代谢异常。其潜在发生机制包括:（a）活化Drp1通过抑制辅酶Q的生物合成破坏线粒体呼吸链,导致线粒体ROS生成增加;（b）活化Drp1抑制线粒体谷氨酸-谷胱甘肽代谢,导致ROS清除减少;（c）活化Drp1通过阻断神经递质途径（包括酪氨酸-多巴胺代谢和维生素E相关通路）进一步降低ROS清除率。第三部分:干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究1.急性缺血缺氧损伤后合并使用Drp1抑制剂Mdivi-1液体复苏可以明显提高血管反应性及其收缩张力。干预Drp1可以很好地维持缺血缺氧损伤后的动态血压。2.干预Drp1可以改善缺血损伤后肝肾血流灌注和肝肾功能,对于缺血损伤后心肌细胞收缩力也有一定的影响。3.Drp1敲除干预可以通过影响肠道菌群中拟杆菌门的组成、恢复短链脂肪酸（SCFA）的产生,从而保护缺血损伤后的肠屏障功能。4.干预Drp1介导的线粒体质量失衡可以很好地改善缺血缺氧损伤后血流动力学、血气和存活情况。[结论]1.Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中发挥了重要作用。其中“Drp1的过度激活（磷酸化、苏木化、亚硝基化）”和“大量细胞质Drp1的线粒体转位”是急性缺血缺氧后线粒体形态数量和功能发生变化的重要原因。2.缺血缺氧后大量存在的细胞质Drp1在被招募到线粒体之前已经开始参与线粒体分裂过程。具体表现为过度磷酸化和亚硝基化的细胞质Drp1通过Shroom4束化肌动蛋白,增强内质网和线粒体之间牵引力,启动大量ER-Mito接触并引起大量线粒体预收缩,为后续细胞质Drp1转位到线粒体收缩位点介导线粒体过度分裂奠定了结构基础。3.缺血缺氧后细胞质Drp1加速线粒体转位是由于ER-Mito接触位点Calnexin-Fundcl功能环大量形成,促进了细胞质Drp1沿内质网向ER-Mito接触位点的大量迁移。4.缺血缺氧晚期Drp1介导线粒体分裂结束后下一步会进一步影响线粒体功能。线粒体Drp1一方面在线粒体收缩或分裂位点通过识别并破坏线粒体mPTP通道结构引起mPTP过度开放,CytC释放增加;另一方面还可通过多种线粒体代谢途径影响ROS的清除和生成,导致ROS过度堆积,最终加重了缺血缺氧后线粒体和细胞功能损伤。5.急性缺血缺氧损伤后使用Drp1抑制剂Mdivi-1液体复苏或者Drp1敲除干预可以保护血管收缩张力、改善肝肾血流灌注以及肠屏障功能,弥补了常规林格液体复苏“虽然可以快速扩容但难以长时间维持血压”的缺陷,对于延长急性缺血缺氧损伤患者的临床救治时间、提高患者救治率和存活率具有重要临床意义。
耿志华[3]（2020）在《姜黄素对脊髓损伤小鼠的抗抑郁和神经保护作用的机制研究》文中研究指明目的研究小鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后,姜黄素（curcumin,CCM）治疗的抗抑郁作用和神经保护作用,并探究其抗抑郁作用是否与细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）蛋白以及脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）的表达有关。方法使用改良的动脉瘤夹装置模型模拟脊髓损伤1的发生。将小鼠随机分为三组,SCI治疗组（SCI+CCM组,SCI 30 min后给予姜黄素（200 mg/kg）灌胃干预治疗,每天一次,持续7天）,SCI对照组（SCI+Veh组,SCI 30 min后给予200mg/kg生理盐水灌胃干预治疗,每天一次,持续7天）和假手术组（Sham组,单纯摘除椎板而无脊髓损伤,术后30 min时候给予200 mg/kg生理盐水灌胃干预治疗,每天一次,持续7天）。我们通过BMS（basso mouse scale）评分、斜板实验、PI（propidium iodide staining）染色、FJB（fluoro-jade b）染色、脊髓水含量测定、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）测定、丙二醛（malondlaldehyde,MDA）测定来评估姜黄素的神经保护作用,我们通过悬尾实验、糖水偏好实验来评估姜黄素抗抑郁作用,并通过BDNF和ERK蛋白表达探究其作用机制。结果1.姜黄素长期治疗显着改善脊髓损伤小鼠抑郁行为与SCI+Veh组小鼠相比,SCI+CCM组显着降低了小鼠不动时间（p<0.05）并显着增加了小鼠的蔗糖偏嗜度百分比（p<0.05）。2.姜黄素长期治疗增加了小鼠杏仁核中ERK蛋白和BDNF蛋白的表达与SCI+Veh组小鼠相比,SCI+CCM组显着增加SCI小鼠ERK蛋白和BDNF蛋白的表达（p<0.05）。3.姜黄素治疗对脊髓损伤小鼠具有抗炎作用与SCI+Veh组小鼠相比,SCI+CCM组小鼠SOD水平显着升高（p<0.05）,MDA水平显着降低（p<0.05）,脊髓水含量显着降低（p<0.05）。4.姜黄素治疗脊髓损伤减少了细胞坏死、凋亡与SCI+Veh组小鼠相比,PI染色显示,SCI+CCM组小鼠脊髓损伤周围区域坏死细胞显着减少（p<0.05）;FJB染色显示阳性细胞代表神经元变性坏死,与SCI+Veh组小鼠相比,SCI+CCM组小鼠染色阳性细胞数显着降低（p<0.05）。5.姜黄素治疗脊髓损伤改善了小鼠后肢的运动功能与SCI+Veh组小鼠相比,SCI+CCM组显着增加了小鼠BMS评分和斜面倾斜度（p<0.05）。结论1.脊髓损伤后小鼠会出现抑郁行为;2.姜黄素治疗可以有效预防脊髓损伤后小鼠的抑郁行为;3.姜黄素预防脊髓损伤后抑郁小鼠的抗抑郁作用可能部分由BDNF蛋白来介导;4.姜黄素治疗对脊髓损伤小鼠具有神经保护作用。
林小龙[4]（2020）在《2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究》文中认为第一部分2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用目的:既往研究表明2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）在多种病理生理过程中参与抗氧化、抗炎症、抗凋亡。但是2-BFI在脊髓损伤模型中的作用尚不清楚。因此本实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinalcord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型探讨2-BFI在脊髓损伤大鼠模型中潜在作用。方法:实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。参照既往文献,建立了脊髓损伤大鼠实验模型。将大鼠麻醉后俯卧位固定置于专用手术台上。取后正中切口,从T10椎板到T12椎板行椎板切除术,充分暴露脊髓。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。对照组及实验组大鼠利用70g闭合力Yasargil动脉瘤夹钳夹脊髓60秒,损伤成功的指标包括局部脊髓出现红肿、压迫后双后肢立即抽动、大鼠清醒时双侧后肢麻痹。药物注射（2-BFI腹腔注射3 mg/kg或0.9%生理盐水,每日2次,共3日）由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。所有大鼠在造模后第1、2、3、7、14、21天进行神经功能评估。神经功能评估采用BBB（Basso、Beattie and Bresnahan）神经功能评分量表,评分范围从0分到21分。结果:SCI大鼠运动神经功能采用BBB运动能力评定量表进行评定。假手术组术后即刻、术后1-3天、7天、14天、21天得分均为21分。在SCI发生后第1天,对照组和实验组的BBB运动能力评分均迅速下降,分别为0.17±0.41及0.17±0.41,相对于假手术组,两组的BBB评分呈显着性下降（p<0.05）,但两组之间并无统计学差异（P>0.05）。虽然在SCI发生后第3天,实验组的BBB评分高于对照组,分别为2.00±1.09及1.33±0.82,但两组之间仍无统计学差异（P>0.05）。但在SCI发生后第7天,实验组的BBB评分则高于对照组,且两者差异存在统计学意义（分别为4.33±0.52及3.33±0.52,p<0.05）。同样的结果也出现在SCI发生后第14天,实验组的BBB评分明显高于对照组（6.17±0.98及4.67±0.822,p<0.05）。将观察期延迟到SCI发生后的第21天,实验组的BBB评分明显大于对照组,且两组之间的差距更加明显（8.00±1.10及 6.17±0.98,p<0.01）。结论:通过2-BFI处理后SCI大鼠的BBB评分明显高于对照组,说明腹腔注射2-BFI（3mg/kg）后可显着改善SCI后BBB神经功能评分,在脊髓损伤大鼠模型中具有神经保护作用。第二部分 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用机制目的:本部分实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型证实 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）对脊髓损伤大鼠的神经保护作用,并探讨2-BFI神经保护作用机制。方法:根据第一部分实验结论的进一步延续,采用动脉瘤夹钳夹脊髓的方法造模。实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。SCI+vehicle组大鼠腹腔注射0.9%生理盐水,每日2次,共3日;SCI+2-BFI组大鼠腹腔注射2-BFI溶液,剂量为3 mg/kg,每日2次,共3日。药物注射由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。在脊髓损伤后第3天,所有大鼠均行腹腔注射戊巴比妥钠（100mg/kg）深度麻醉并处死。损伤部位周围脊髓组织立即取出并置于冰面上用200m14℃0.9%生理盐水灌洗。Western blot检测Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白。使用ELISA试剂盒,对脊髓组织样本中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性进行检测。FJB染色和TUNEL染色检测损伤部位周围脊髓组织的细胞坏死和凋亡。结果:与假手术组相比,对照组SOD和GPx活性均明显降低（P<0.01）。同时,SOD和GPx活性在使用2-BFI后明显升高（P<0.05）。脊髓损伤大鼠脊髓组织中Bax蛋白及cleaved caspase-3蛋白水平（p 19和p 17）明显升高,Bcl-2蛋白水平明显降低（P<0.01和P<0.05）。而2-BFI的应用显着提高了 SCI后Bcl-2蛋白水平（P<0.01）,Bax蛋白和cleaved caspase-3蛋白水平（p19和p17）都被下调。与此同时,对照组与假手术组相比,Bcl-2/Bax比值在SCI后明显降低,而在使用2-BFI后,实验组较对照组Bcl-2/Bax比值明显升高（P<0.01）。假手术组脊髓切片未见FJB阳性或TUNEL阳性细胞,然而在对照组中可见大量FJB阳性细胞和TUNEL阳性细胞,使用2-BFI治疗后FJB阳性细胞和TUNEL 阳性细胞数量显着降低（P<0.05和P<0.01）。结论:2-BFI的应用上调SOD和GPx的活性,上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白和cleaved caspase3（p17和p19）蛋白的表达,进一步证实其神经保护作用。此外,FJB染色和TUNEL染色显示细胞坏死和凋亡水平降低也佐证了 2-BFI的神经保护作用。综上所述,这些结果提示2-BFI可能通过抑制氧化应激反应和细胞凋亡坏死来减轻脊髓损伤,从而提高脊髓损伤后的功能恢复。第三部分 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中神经保护作用的调节机制目的:本部分实验采用钳夹法建立脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）大鼠模型并利用该模型证实 2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline,2-BFI）是否通过激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶（Nrf2/HO-1）信号通路,引起下游抗氧化、抗凋亡相应蛋白变化从而保护神经细胞。方法:根据第二部分实验结果的进一步延续,采用动脉瘤夹钳夹脊髓的方法造模。实验用成年雄性SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）;（2）对照组（SCI+vehicle组）;（3）实验组（SCI+2-BFI组）。对照组大鼠腹腔注射0.9%生理盐水,每日2次,共3日;实验组大鼠腹腔注射2-BFI溶液,剂量为3mg/kg,每日2次,共3日。药物注射由一名对实验分组不熟悉的研究人员进行。假手术组仅仅行T10-T12椎板切除术,暴露脊髓而不引起脊髓损伤为标准。在脊髓损伤后第3天,所有大鼠均行腹腔注射戊巴比妥钠（100mg/kg）深度麻醉并处死。损伤部位周围脊髓组织立即取出并置于冰面上用200ml4℃0.9%生理盐水灌洗。Westernblot检测Nrf2、HO-1和NQO1蛋白。利用免疫荧光染色技术定位Nrf2蛋白,观察损伤部位周围脊髓组织神经元细胞和星形胶质细胞中的Nrf2表达量变化。结果:与假手术组相比,对照组和实验组脊髓组织中无论Nrf2蛋白还是HO-1蛋白都有明显升高（P<0.01）,而与假手术组相比,对照组NQO1蛋白表达降低（P<0.01）。此外,与对照组相比,实验组Nrf2和HO-1进一步显着升高（P<0.01）。但对照组与实验组NQO1表达差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光染色显示,Nrf2蛋白无论在神经元细胞还是星形胶质细胞中的表达,对照组及实验组均显着高于假手术组（P<0.01）。此外,实验组神经元细胞内、星形胶质细胞内Nrf2水平明显高于对照组（P<0.01）。结论:脊髓损伤后2-BFI处理增加了 Nrf2蛋白和HO-1蛋白的表达,表明2-BFI可激活Nrf2/HO-1信号保护脊髓损伤后的神经细胞。总之,这些结果为2-BFI通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻脊髓损伤,提高脊髓损伤后的功能恢复提供了有力证据。
文玲[5]（2020）在《安胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠NF-κBp65、INOS、COX-2、TNF-α、IL-1β表达影响的实验研究》文中认为目的:探究安胰颗粒对左旋精氨酸诱导的重症急性胰腺炎大鼠核转录因子-κBp65（nuclear factor-κBp65,NF-κBp65）、诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、环氧合酶-2（cyclo-oxygenase,COX-2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）、白细胞介素1-β（interleukin 1-β,IL-1β）表达水平的影响,阐明安胰颗粒有效治疗重症急性胰腺炎的主要机制,丰富临床治疗重症急性胰腺炎的方法,改善重症急性胰腺炎的预后。方法:取鼠龄为42～49天的清洁级雄性成年SD（Sprague-Dawley,SD）大鼠120只,体重约200～250g,适应性喂养7天后,用电脑随机数字表随机分为4组。分别为正常组、模型组、中药组及西药组,每组30只大鼠。各组进一步分为3小时、6小时、12小时三小组,每组10只大鼠。中药组造模前连续三天以8g/kg的安胰颗粒水溶后灌胃,一天1次;正常组不做处理,自由饮水饮食;西药组造模前1小时予以人重组白介素10（Recombinant human interleukin-10,rh IL-10）10000U行腹腔注射;经以上预处理后,取模型组、中药组、西药组大鼠,造模前禁食不禁水12小时,以6%左旋精氨酸（L-arginine）溶液按150mg/100g剂量腹腔注射3次,每次间隔1小时,诱导SAP模型。用最后一次注射结束时间开始,按3小时、6小时、12小时时间点将四组大鼠分批麻醉后取腹主动脉血并处死大鼠进行解剖,观察胰腺大体形态,迅速摘取胰腺组织。采用酶联免疫吸附测定法测血清TNF-α、IL-1β水平;取胰腺组织,进行病理切片制作、用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测NF-κBp65mRNA含量、用免疫组化法测定NF-κBp65、iNOS、COX-2表达。采集所有数据进行统计学分析。结果:（1）胰腺病理切片结果:正常组电镜下胰腺小叶结构清晰,腺泡细胞、腺管、胰岛形态结构正常,腺泡细胞内见深蓝色点状细胞核。模型组随时间延长,小叶结构模糊,细胞排列紊乱,可见成片破裂细胞堆积,视野模糊,腺泡细胞大面积空泡性坏死,细胞核游出或破碎,间隙增宽,炎性细胞浸润,间质小血管破裂坏死,红细胞溢出。中药组胰腺小叶结构尚可见,炎性细胞浸润、血管破裂、细胞坏死情况与模型组对比明显改善,细胞肿胀明显,尚可见清晰细胞轮廓及在位的细胞核。西药组胰腺电镜下改变与中药组大体相似。（2）血清TNF-α、IL-1β:除正常组外,其余各组造模后各时间点血清TNF-α、IL-1β均随时间延长而显着升高,12小时间点为本实验观察时间中的峰值,同时间点与正常组两两对比差异有统计学意义（其中TNF-α水平p<0.01,IL-1β水平p<0.05）;与模型组同时间点两两对比,中药组和西药组血清TNF-α、IL-1β显着下降,差异有统计学意义（p<0.01）。中药组和西药组对比差异无统计学意义（p>0.05）。（3）胰腺组织NF-κBp65mRNA:除正常组外,其余各组造模后各时间点胰腺组织NF-κBp65mRNA均随时间延长而显着升高,12小时间点为本实验观察时间中的峰值,同时间点与与正常组两两对比差异有统计学意义（p<0.01）;与模型组同时间点两两对比,中药组和西药组胰腺组织NF-κBp65mRNA显着下降,差异有统计学意义（p<0.01）。中药组和西药组对比差异无统计学意义（p>0.05）。（4）胰腺组织NF-κBp65、iNOS、COX-2:除正常组外,其余各组造模后各时间点胰腺组织NF-κBp65、iNOS、COX-2均随时间延长显着升高,12小时间点为本实验观察时间中的峰值,同时间点与正常组两两对比差异有统计学意义（p<0.01）;与模型组同时间点两两对比,中药组和西药组胰腺组织NF-κBp65、iNOS、COX-2显着下降,差异有统计学意义（p<0.01）。中药组和西药组对比差异无统计学意义（p>0.05）。（5）SAP大鼠胰腺组织NF-κBp65的表达量与TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2表达量分别呈高度正相关（p<0.05）,而各TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2间亦存在不同程度的正相关关系（p<0.05）。结论:1、左旋精氨酸诱导的大鼠SAP模型血清TNF-α、IL-1β以及胰腺组织NF-κBp65mRNA、NF-κBp65、iNOS、COX-2水平在3小时时间点开始显着升高,于本组实验的12小时达到峰值,NF-κBp65与各因子的表达量间呈高度正相关,而各因子间亦存在不同程度的正相关关系,说明NF-κBp65mRNA基因转录诱导了NF-κBp65蛋白表达,蛋白过表达又导致下游靶基因转录或激活靶基因转录,炎症放大与微循环障碍同时发生在SAP早期,且炎症因子与微循环之间相互影响。2、安胰颗粒能够有效改善SAP大鼠胰腺组织病理损伤,说明安胰颗粒对胰腺组织具有保护作用,是有效治疗SAP的病理生理基础。3、安胰颗粒胃灌注后不仅显着降低SAP大鼠血清TNF-α、IL-1β含量,还显着降低胰腺组织NF-κBp65mRNA表达及NF-κBp65、iNOS、COX-2表达,提示安胰颗粒通过核因子-炎症因子通路,防治SAP系统性炎症反应综合征,通过核因子-微循环因子通路改善微循环,有效减轻SAP发病过程中的炎性损伤及微循环障碍,达到有效治疗SAP的目的。
辛美萤[6]（2020）在《基于AMPK/mTOR/ULK1通路探讨自噬在缺血性脑损伤中的作用及丹酚酸B的神经保护机制》文中研究表明背景:自噬是机体抵抗应激、提高生存能力的重要过程。脑缺血发生后,胞内衰老和受损的成分可经自噬降解产生代谢底物被循环利用,帮助细胞维持能量稳态并提高生存率。作为中枢神经系统中主要的细胞类型,脑缺血后星形胶质细胞可通过激活自噬改变其存活及功能状态,从而对改善卒中后脑损伤及神经功能发挥重要作用。unc-51样激酶1（Unc-51 like kinase 1,ULK1）是启动自噬的关键蛋白,雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,m TOR）可通过磷酸化ULK1的丝氨酸757位点抑制其活化。既往研究表明,应激条件下激活的AMP依赖的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）可以解除m TOR对ULK1的抑制作用,从而促进自噬发生。然而,目前关于缺血后星形胶质细胞中AMPK/m TOR/ULK1通路对自噬调控的相关研究尚少。此外,选择性自噬是细胞对胞内特定成分的选择性清除,目前有许多研究涉及丝氨酸757位点磷酸化的ULK1（p S757-ULK1）对自噬的调控,却很少有研究探索自噬对p S757-ULK1的反向调控。因此,我们试图通过观察缺血后星形胶质细胞中AMPK/m TOR/ULK1通路的变化、p S757-ULK1的自噬降解及它们对自噬的调控,探索其对缺血性脑损伤的神经保护作用,并为缺血性脑卒中的治疗提供新靶点。丹酚酸B（Salvianolic acid B,Sal B）是中药丹参中的主要活性成分。已有研究报道Sal B在心肌细胞、肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞中对自噬有促进作用。但Sal B对脑缺血后星形胶质细胞的自噬调控作用及机制尚不明确,需要我们进一步探究。目的:明确自噬对缺血性脑损伤的神经保护作用,验证缺血性脑损伤后星形胶质细胞AMPK/m TOR/ULK1通路对自噬的调控作用,同时探索Sal B的神经保护作用及机制。方法:体内实验中,选用体重为20-23g的成年雄性C57BL/6小鼠,建立左侧大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型。实验分为假手术组、MCAO组、Sal B干预组、自噬抑制剂巴弗洛霉素（Bafilomycin A1,Baf A1）干预组、Sal B+Baf A1干预组。通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑（Triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色评价各组小鼠脑梗死体积情况;通过Longa评分评估各组小鼠神经行为学评分情况。体外实验中,培养新生C57BL/6小鼠皮层星型胶质细胞,以糖氧剥夺（Oxygen glucose deprivation,OGD）模型为基础,实验分为对照组、OGD组、Sal B干预组、Baf A1干预组、Sal B+Baf A1干预组、AMPK抑制剂多索吗啡（Dorsomorphin）干预组和Sal B+Dorsomorphin干预组。应用噻唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测各组细胞存活率;应用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;应用流式微珠阵列（Cytometric bead array,CBA）法检测各组细胞炎性细胞因子的释放情况;应用免疫印迹法检测各组细胞中自噬标志物Beclin 1和LC3B蛋白以及AMPK/m TOR/ULK1通路相关蛋白的表达情况,检测应用si RNA技术分别敲低选择性自噬受体NDP52、OPTN、NBR1和p62的基因后细胞中p S757-ULK1的表达变化;应用免疫共沉淀技术分别评价p S757-ULK1与NDP52和OPTN之间的连接情况;应用免疫荧光染色分别观察p S757-ULK1与NDP52和OPTN的共定位情况。结果:1.组织形态学及神经行为学评分:与MCAO组相比,Sal B干预组的脑梗死体积显着减小（p<0.0001）,Longa评分有减小趋势,但无统计学差异;与Sal B干预组相比,Sal B+Baf A1干预组的脑梗死体积明显增加（p<0.001）,Longa评分有增加趋势,但无统计学差异。2.细胞存活及功能状态:与对照组相比,OGD组的细胞存活率降低（p<0.001）,凋亡比率增加（p<0.001）,促炎因子IFN-γ、IL-2和IL-6的水平增高（p<0.01）,抗炎因子IL-4和IL-10的水平减低（p<0.05）;Sal B干预剂可明显提高细胞存活率（p<0.01）,降低细胞凋亡比率（p<0.001）,减少细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6（p<0.01）并增加IL-4和IL-10的释放（p<0.05）,明显改善细胞的存活及功能状态;而给予自噬抑制剂Baf A1可逆转Sal B对细胞存活及功能方面的保护作用。3.自噬相关蛋白及调控分子的改变:与对照组相比,OGD组细胞内自噬标志物Beclin 1表达、LC3B II/LC3B I比值（p<0.001）和p T172-AMPK的表达明显增加（p<0.01）,p S2448-m TOR、p S757-ULK1的表达明显降低（p<0.05）;对于OGD组,给予Sal B处理可进一步增加Beclin 1（p<0.05）和p T172-AMPK的表达（p<0.01）,增大LC3B II/LCB I比值（p<0.05）,并减少p S2448-m TOR和p S757-ULK1的表达（p<0.01）,表明Sal B激活AMPK/m TOR/ULK1通路并增强自噬活性;此外,给予Sal B干预组AMPK抑制剂Dorsomorphin处理可逆转上述蛋白改变。4.自噬介导p S757-ULK1降解:给予OGD组和Sal B干预组自噬抑制剂Baf A1处理后,胞内p S757-ULK1出现蓄积（p<0.05）,且Sal B干预组中p S757-ULK1蓄积更明显,表明Sal B可促进p S757-ULK1的自噬降解;选择性自噬受体NDP52和OPTN敲低后,p S757-ULK1蓄积明显（p<0.01）,表明p S757-ULK1的选择性自噬降解可能由自噬受体NDP52和OPTN介导;此外,免疫共沉淀结果显示Sal B处理可以使p S757-ULK1与星形胶质细胞中内源性的NDP52和OPTN之间的连接增加。免疫荧光结果显示Sal B处理可以使p S757-ULK1与He La细胞中外源性的NDP52和OPTN之间的共定位增加。结论:1.脑缺血损伤后星形胶质细胞中自噬活性的增强可促进其存活,减少其促炎因子并增加其抗炎因子的释放。2.脑缺血损伤后星形胶质细胞中AMPK/m TOR/ULK1信号通路的激活可增强其自噬活性,同时自噬促进由NDP52和OPTN介导的p S757-ULK1的选择性自噬降解,形成正反馈型保护环路。3.Sal B通过激活星形胶质细胞AMPK/m TOR/ULK1信号通路及促进p S757-ULK1的自噬降解,增强星形胶质细胞的自噬活性,进而在脑缺血损伤中发挥神经保护作用。
郑文亚[7]（2019）在《运输应激对山羊主要器官的应激损伤及热休克蛋白表达的影响》文中提出畜禽运输是畜牧业生产过程中必不可少的一个重要环节,运输过程中的拥挤、颠簸、震动、噪音、温度变化和禁食禁水等复合应激源均可造成动物机体生理紊乱、发病甚至死亡,同时降低肉品质量和动物福利,给畜牧业带来巨大的经济损失。热休克蛋白参与各种生命活动,主要发挥分子伴侣作用,具有组装、折叠和转运等功能,同时参与抗应激和抗凋亡等生理活动,在运输应激中可能发挥一定的作用。本实验选用12只体重相近（13.89±2.96 Kg）且健康的赣西公山羊为实验动物并将其随机分为3组,即对照组（不运输）、2 h运输处理组和6 h运输处理组,运输处理组在温度为28℃32℃、车速为3545 km/h条件下进行公路运输,运用HE染色、透射电镜技术、实时定量PCR、免疫组织化学和Western blot方法,系统分析了不同运输时间山羊心脏、肝脏、肾脏、肺脏、气管、支气管、脾脏、淋巴结和小肠的显微和超微病理变化,并探讨运输前后HSP27、HSP70和HSP90在山羊主要器官的分布和表达情况,为探讨山羊运输应激发病机制及其解决方案的研究提供基础资料。本研究主要取得了以下结果:（1）山羊心脏实验结果表明运输后心肌纤维发生颗粒变性,线粒体肿胀、破裂,间质水肿、充血出血、炎性细胞浸润,6 h运输处理组病变更严重。3种蛋白主要在心肌细胞胞质中表达,HSP27和HSP90在胞核中也表达。与对照组相比,2 h和6 h运输处理组HSP27、HSP70和HSP90的mRNA水平均升高,并且2 h运输处理组HSP27、HSP70和HSP90的蛋白表达量也有所升高,6 h运输处理组仅HSP70和HSP90的蛋白表达量有所升高。（2）山羊肝脏实验结果表明处理组肝脏发生不同程度的损伤,中央静脉扩张充血,窦间隙变小,肝细胞出现明显的颗粒和水泡变性,少量肝细胞核染色质聚集,线粒体肿大变形、嵴断裂消失,胞质中出现空泡和脂滴,6 h运输处理组更为严重。HSP27在中央静脉和门管区附近的肝细胞、血管内皮细胞及胆小管上皮细胞的胞质中都有分布;HSP70与HSP90主要定位于中央静脉和门管区附近的肝细胞胞质中,HSP90在胞核也有表达。与对照组相比,2 h运输处理组仅HSP27和HSP90的mRNA表达量上调,而6 h运输处理组仅HSP70的mRNA表达量上调,同时两个处理组仅HSP27与HSP70的蛋白表达量高于对照组。（3）山羊肾脏实验结果表明部分肾小管和集合小管结构紊乱,管腔界限不清,管腔可见脱落的上皮细胞和黏液,肾小球充血、肿胀,肾小囊腔变窄,线粒体肿胀且嵴断裂并减少,运输6 h后充血、出血更明显,管腔和肾小球细胞损伤更严重。对照组3种蛋白主要在肾小管和集合小管表达,运输后表达更强,处理组肾小体也可见阳性反应。与对照组相比,2 h运输处理组HSP27与HSP90的mRNA和蛋白表达量均有上调,而HSP70的mRNA的表达量下调,其蛋白表达量上调,6 h运输处理组仅HSP27的mRNA表达上调,而3个分子的蛋白表达均上调。（4）山羊肺脏、气管和支气管实验结果表明运输后气管和支气管黏膜水肿、充血,炎性细胞浸润,纤毛倒伏、断裂和脱落,少量黏膜上皮细胞变性、坏死,纤毛和杯状细胞超微病变明显,线粒体肿胀、嵴溶解减少,血管内皮细胞膜起泡、破损。肺泡腔塌陷或融合,肺泡隔增宽、充血,炎性细胞浸润,部分肺泡上皮细胞变性,肺泡腔可见脱落的细胞和碎片,肺泡II型上皮细胞超微病变明显,肺泡I型上皮细胞膜不平整、胞质空泡化,运输6 h后损伤更严重。HSP27和HSP70在气管和支气管上皮、腺上皮和血管内皮表达,处理组阳性表达的炎性细胞数量增多,在肺泡细胞和细支气管上皮普遍表达,HSP90表达强度较弱,仅在气管和支气管上皮、腺上皮及肺泡II型上皮细胞、细支气管上皮表达。气管HSP70蛋白表达量在2 h和6 h运输处理组与对照组相比明显上调,2 h运输处理组肺脏HSP70的mRNA和蛋白表达量与对照组相比均明显上调。（5）山羊淋巴结和脾脏实验结果表明运输后淋巴结和脾脏均出现急性病理变化,淋巴小结和脾小结增生明显,6 h运输处理组淋巴细胞和网状内皮细胞可见核破碎,细胞超微病变明显,发生凋亡或坏死。运输前后3种蛋白在淋巴结和脾脏中的定位存在差异,HSP27主要分布在弥散淋巴组织,HSP70和HSP90主要分布在淋巴小结和脾小结。与对照组相比,2 h运输处理组HSP27、HSP70和HSP90的mRNA水平在淋巴结和脾脏中均上调,而6 h运输处理组仅淋巴结中HSP70的mRNA水平和脾脏中HSP90的mRNA水平有所上调;两个处理组的淋巴结与脾脏HSP90蛋白表达量均有所上调,并且运输2 h后HSP27的蛋白在脾脏、HSP70的蛋白在淋巴结的表达量上调,运输6 h后HSP70在脾脏中的表达量与对照组相比下调。（6）山羊十二指肠、空肠和回肠实验结果表明运输后肠绒毛黏膜上皮和固有层有炎性细胞浸润、充血和出血,少量上皮细胞变性,微绒毛倒伏,核固缩,线粒体肿胀、增生。3种蛋白主要在肠绒毛上皮表达,HSP27和HSP70主要在胞质表达,HSP90在胞质和胞核均有表达。与对照组相比,十二指肠中HSP27和HSP70的mRNA水平在6 h运输处理组中均上调,2 h运输处理组仅HSP27的mRNA水平上调,而在蛋白水平上,仅HSP90的蛋白表达量在运输6 h后上调;空肠HSP27、HSP70和HSP90的mRNA水平在2 h运输处理组均上调,6 h运输处理组中仅HSP70的mRNA水平上调;回肠中仅HSP70的mRNA水平在2 h运输处理组上调,而HSP27的mRNA水平在两个处理组中均下调,HSP27蛋白表达量在两个处理组均明显降低,在运输2 h后HSP70蛋白表达量与对照组和6 h运输处理组相比均有所升高。总之,运输应激对山羊主要实质器官和空腔器官均造成了一定程度的病理性损伤,随着运输时间的延长损伤加重。运输后,HSP27、HSP70和HSP90的定位情况在不同器官中均出现了不同的变化,其mRNA和蛋白的表达量也有一定的变化,提示这些分子与运输应激对山羊脏器的损伤之间存在一定的联系。
龙宗泓[8]（2019）在《LOC339524和UQCRC1介导心/脑保护的作用和机制研究》文中研究说明目的:基础疾病、手术创伤和术中体位改变等会对患者生理功能造成不同程度的影响,病人围术期极易发生心脑脆弱器官的缺血/再灌注损伤,并且术中呼吸和循环系统的稳定直接影响病人术后恢复,因此如何保证患者围术期安全,预防围术期不良事件的发生是麻醉医生面临的重大挑战。LOC339524是课题组于2012年在研究人心脏早期停跳灌流液的蛋白质组学时通过高效液相色谱-芯片/质谱（High performance liquid chromatography-chip/mass spectrometry,HPLC-Chip/MS）技术分离、鉴定的新蛋白,随后制备了单克隆抗体5-D3。前期研究发现LOC339524可能参与了胚胎期大鼠心脏的发育,并且能调控H9C2心肌细胞的分裂增殖。除此之外,课题组前期研究还证实LOC339524参与大脑炎症的调控,其高表达可以明显减轻脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）导致的小胶质细胞炎症反应。这些均提示LOC339524具有重要的功能,可能参与器官保护。但LOC339524在心肌缺血/再灌注损伤中的作用和机制尚不清楚,并且其减轻BV-2小胶质细胞炎症反应的可能信号通路也尚未明确。因此本研究旨在通过建立LOC33524过表达的AC16和BV-2稳转细胞株,并给予相应损伤的情况下,探究LOC33524过表达在心肌氧糖剥夺/复氧损伤中的保护作用和机制,及其减轻炎症反应的可能通路,为开发特异性的心脑保护药物提供新的靶点。此外,细胞色素c还原酶核心蛋白1（Ubiquinol-cytochrome-c reductase complex core protein 1,UQCRC1）也是课题组筛选到的可能具有心肌保护作用的蛋白。前期研究提示,UQCRC1表达变化会直接影响线粒体功能,表现为线粒体功能障碍常常伴有UQCRC1下调,而过表达UQCRC1会明显增加复合体Ⅲ呼吸率,表明UQCRC1对线粒体功能的维持十分重要。多项研究表明线粒体是包括预处理在内的多种心肌保护方式的共同作用靶点,但参与预处理介导心肌内源性保护效应的线粒体蛋白尚不明确。本研究旨在通过长期注射二氮嗪（Diazoxide,DZ）构建大鼠的心肌保护模型,分离心肌线粒体内膜（Mitochondrial inner membrane,MIM）蛋白后,筛选出MIM中可能产生保护作用的靶蛋白,并从细胞水平加以证实。为进一步寻找预处理时心肌细胞主动产生内源性保护分子的机制、开发围术期心肌保护药物提供理论依据。第一部分LOC339524对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制研究第一部分方法:1.探讨LOC339524表达蛋白的可能性。1.1探讨LOC339524外源性表达蛋白。将构建C端融合有FLAG标签的LOC339524表达质粒,以lipofectamine TM 3000为载体,转染至293T细胞,48h后提取蛋白,FLAG抗体检测蛋白的表达情况。1.2探讨LOC339524内源性表达蛋白。在荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）再次证实大鼠可以表达LOC339524的前提下,提取了成年SD大鼠心,脑,脾,肾等主要组织蛋白,Western Blot分析了LOC339524蛋白在上述组织器官的内源性表达。2.探讨缺氧对LOC339524表达的影响。2.1在细胞水平明确缺氧对LOC339524表达量及位置的影响。人心肌AC16细胞置于缺氧（1%O2）环境24h或者用200μmol/L Co Cl2作用10h,提取RNA和蛋白,RT-q PCR和Western Blot分别检测了缺氧对LOC339524基因和蛋白表达的影响。同时分别提取常氧和缺氧环境中AC16细胞胞浆蛋白和胞核蛋白,Western Blot分析了LOC339524蛋白在缺氧条件下的表达位置变化。2.1在动物水平明确缺氧对大鼠心肌和血清外泌体LOC339524表达的影响。将成年SD大鼠置于模拟海拔5000m高原环境的人工实验舱072h,处死大鼠,收集血清外泌体及心肌组织。RT-q PCR检测心肌LOC339524 m RNA的表达;Western Blot评估心肌和血清外泌体LOC339524蛋白的表达。3.探讨无义介导的m RNA降解（Nonsense-Mediated m RNA Decay,NMD）途径对LOC339524调控的可能性。3.1激活或抑制NMD途径后,探讨LOC339524基因和蛋白水平的变化。构建NMD途径中关键因子上游移码蛋白1（up-frameshift protein 1,UPF1/RENT1）的高表达慢病毒（LV-TOPO-UPF1/RENT1）,将其转染至AC16、H9C2、HMO6和LO2四种细胞中,构建上述细胞的UPF1/RENT1高表达稳转细胞株;或者采用si RNA沉默上述四种细胞中UPF1/RENT1的表达后,RT-PCR和Western Blot分别检测了LOC339524基因和蛋白水平的表达变化。3.2探讨LOC339524逃逸NMD调控的可能机制。构建LOC339524高表达慢病毒（LV-TOPO-LOC339524）,将其转染至AC16细胞中,建立AC16高表达LOC339524的稳转细胞株。提取蛋白,Western Blot分析了磷酸化真核生物翻译起始因子2α（Phospho-eukaryotic translation initiation factor 2α,p-e IF2α）的表达变化。4.采取下述方法探讨LOC339524介导心肌氧糖剥夺/复氧（Oxygen and glucose deprivation/Reoxygenation,OGD/R）的保护作用及其可能机制。4.1筛选OGD/R最佳时间点。将AC16和AC16-LOC339524+/+细胞分别氧糖剥夺0/3/6/9/12/24/48/72h,复氧12h,收集细胞并对其进行Annexin V-FITC/PI或JC-1染色,采用流式细胞术评估氧糖剥夺不同时间/复氧12h的细胞凋亡变化,后续研究采用上述两种方法均检测到凋亡变化最显着的OGD/R时间点。对于筛选到的时间点,再通过Western blot检测细胞凋亡相关蛋白——活化的caspase3、聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP1）和bcl-2的表达来加以验证。4.2转录组测序（RNA-seq）分析了LOC339524过表达后的差异基因以及差异信号通路（着重分析了PI3K通路和MAPK通路）,并初步探讨了差异基因间的相互作用网络,为后续信号通路的筛选提供参考。RNA-seq结果的可靠性由RT-q PCR和Western Blot加以鉴定。4.3探讨LOC339524对PDGFR/PI3K/Akt通路蛋白的影响。在RNA-seq的提示下,对细胞进行OGD/R损伤,提取蛋白,Western Blot分析PDGFR/PI3K/Akt通路中PDGFRα（Tyr754）,PDGFRβ（Tyr751）、PIK3C2B（Y228）、Akt（Thr308）,Akt（Ser473）和GSK3β（Ser9）总蛋白及其磷酸化水平的变化,初步探究高表达LOC339524对PDGFR/PI3K/Akt通路蛋白的影响。4.4使用PDGFR和PI3K抑制剂,反向证实LOC339524产生心肌保护作用的可能机制。在细胞进行OGD/R损伤前,使用PDGFR抑制剂Crenolanib（1umol/L）和PI3K特异性抑制剂LY294002（10umol/L）或Wortmannin（100nmol/L）抑制相应蛋白的激活,采用流式细胞术评估使用上述抑制剂对细胞凋亡的影响;Western Blot检测PDGFRα（Tyr754）,PDGFRβ（Tyr751）、PIK3C2B（Y228）、Akt（Thr308）,Akt（Ser473）和GSK3β（Ser9）磷酸化水平的变化,以及cleaved caspase3、PARP1-83kd和bcl-2的改变,明确LOC339524产生心肌保护作用的可能机制。第一部分结果:1.LOC339524基因可以编码蛋白。正常情况下,采用抗体5-D3在大鼠的主要组织中均能检测到LOC339524蛋白的内源性表达,并以肝脏、心肌和子宫中表达最多。此外,FLAG抗体在29k Da处检测到蛋白条带,说明LOC339524基因可以外源性的编码蛋白。2.缺氧能诱导LOC339524表达并出现胞核到胞浆的转移。在体外,无论是物理性缺氧（1%O2）还是通过Co Cl2模拟的化学性缺氧均可诱导AC16细胞高表达LOC339524,并且可从胞核转移至胞浆;在体内,大鼠心肌组织中LOC339524的表达随着缺氧时间延长而增加,当缺氧达到72h,血清外泌体中LOC339524表达显着上升。3.LOC33924可能通过调控p-e IF2α表达逃逸NMD调控。无论是通过慢病毒高表达UPF1/RENT1或采用si RNA沉默UPF1/RENT1,LOC33924基因和蛋白水平均不符合NMD调控理论上的下降或增高;而高表达LOC339524后,p-e IF2α表达显着高于对照组。4.当氧糖剥夺24h/复氧12h时,LOC339524通过调控PDGFR/PI3K/Akt通路,明显减轻AC16细胞遭受的OGD/R损伤。4.1氧糖剥夺24h/复氧12h是LOC339524保护AC16心肌细胞的最佳作用时间点。在氧糖剥夺09h/复氧12h时,Annexin V-FITC/PI和JC-1检测到的细胞凋亡率均随着氧糖剥夺时间的延长而略微增加,此时LOC339524过表达组的凋亡率略少于对照组（无统计学意义）;当氧糖剥夺1224h/复氧12h时,细胞凋亡率明显增加,此时LOC339524过表达组凋亡率较对照组大大降低（具有统计学意义）,且在氧糖剥夺24h/复氧12h组最为明显;当氧糖剥夺达4872h/复氧12h时,尽管LOC339524过表达组仍表现出明显的保护作用,考虑到此时细胞整体的凋亡率极高,故最终将氧糖剥夺24h/复氧12h作为后续血细胞损伤的时间点。在此时间点上,Western Blot的检测LOC339524高表达组活化的caspase3及其下游蛋白PARP1-83kd的表达显着少于对照组,保护性蛋白bcl-2明显增加。4.2 LOC339524可能通过PDGFR/PI3K/Akt通路保护心肌细胞。4.2.1 RNA-seq结果提示,LOC339524过表达后PI3K通路的16个基因以及MAPK通路的15个基因明显高表达。4.2.2 Western Blot证实LOC339524过表达会明显增加PI3K通路中PDGFRα（Tyr754）,PDGFRβ（Tyr751）、PIK3C2B（Y228）、Akt（Thr308）,Akt（Ser473）和GSK3β（Ser9）磷酸化水平,进而使OGD/R损伤后Annexin V-FITC/PI染色阳性的细胞比例以及线粒体膜电位JC-1下降的细胞比例均显着少与对照组。4.2.3在OGD/R前,使用Crenolanib预处理1h,抑制PDGFRα和PDGFRβ激活,尽管此时整体凋亡增加,但相较于Control+Crenolanib组,p-PDGFRα（Tyr754）仍然明显增加,活化的Caspase3和PARP1-83kd的表达显着降低,bcl-2蛋白明显增高,线粒体膜电位下降的细胞比例也较对照组明显减少,即LOC339524过表达组仍然具有减轻凋亡的作用。4.2.4在OGD/R前,使用LY294002或Wortmannin抑制Akt激活,尽管p-Akt（Thr308）、p-Akt（Ser473）和p-GSK3β（Ser9）表达均显着下降,但LOC339524过表达组仍明显高于对照组,活化的caspase3和PARP1-83kd的表达少于对照组,bcl-2表达高与对照组,Annexin V-FITC/PI染色阳性细胞比例也显着低于对照组。第二部分LOC339524抑制脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应的机制研究第二部分方法:5.以生物信息学分析和转录组学为基础,在细胞水平探讨LOC339524减轻BV-2小胶质细胞炎症的机制。5.1明确LOC339524对LPS诱导炎症介质的影响。在BV-2细胞高表达LOC339524或通过si RNA沉默LOC339524后,100ng/m L LPS作用12h,免疫荧光检测炎症介质环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,i NOS）的变化。5.2探讨NF-κB与LOC339524启动子结合情况,以及对LOC339524表达的影响。构建LOC339524启动子1509-1520、2000-2009、2758-2769和2971-2981区域的野生型及其相应突变型载体,给予25ng/m L肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα）TNF-α刺激24h或者刺激前使用IκBα特异性抑制剂PDTC（0.5μmol/L）预处理1h,通过双荧光素酶实验,检测各组荧光OD值。5.3在细胞水平探讨LOC339524减轻LPS诱导的炎症反应的可能机制。5.3.1明确LOC339524对NF-κB/p65核移位的影响。BV-2细胞改变LOC339524表达后,100ng/m L LPS作用3h,免疫荧光检测核因子-κB/p65（Nuclear factor-κB/p65,NF-κB/p65）的变化;同时分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白,Western Blot分析NF-κB/p65在胞质和胞核的表达。5.3.2明确LOC339524对Src/NF-κB和p38MAPK通路的影响。BV-2细胞改变LOC339524表达后,100ng/m L LPS作用30min,提取蛋白,Western Blot检测了Src和NF-κB通路中的核因子-κB抑制物激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,Ikk）、核因子-κB抑制因子α（NF-kappa-B inhibitorα）以及NF-κB/p65的磷酸化。或在LPS刺激前,使用IκBα特异性抑制剂PDTC（0.5μmol/L）或p38MAPK特异性抑制剂SB203580（20μmol/L）预处理1h,Western Blot分析了IκBα、NF-κB/p65和p38MAPK的磷酸化。第二部分结果5.LOC339524可能通过Src/NF-κB和p38MAPK通路减轻LPS诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应。5.1 LOC339524减少炎症介质的表达。过表达的LOC339524可显着减少LPS诱导的BV-2细胞COX-2和i NOS表达以及NF-κB/p65的核移位,LOC339524沉默则结果相反。5.2 NF-κB与LOC339524启动子1509-1520区域结合并激活该基因的表达。TNF-α刺激后,LOC339524-1520启动子载体荧光OD值明显高于非刺激组和突变组（LOC-MUT-1520组）,而其他启动子区域载体的荧光OD值则没有明显变化。5.3 Src/NF-κB和p38MAPK通路是LOC339524减轻炎症反应的可能机制。5.3.1 LOC339524抑制Src的活性。LOC339524高表达后,LPS刺激引起的Src（Tyr527）（磷酸化后抑制Src）的磷酸化明显增多,而对Src（Tyr 416）（磷酸化后激活Src）位点磷酸化无影响;LOC339524沉默后,则Src（Tyr 527）磷酸化减少,Src（Tyr 416）位点磷酸化仍无变化。5.3.2 LOC339524显着降低LPS诱导的NF-κB和p38MAPK通路的激活。与con+LPS组相比,Ikkα/β、IκBα和NF-κB/p65磷酸化均显着减少;当LOC339524沉默后,则Ikkα/β、IκBα和NF-κB/p65磷酸化明显高于NC+LPS组。而在LPS刺激前,使用PDTC特异性抑制IκB的激活后,可以显着减少LOC339524沉默对IκB和NF-κB/p65的磷酸化;而在LPS刺激前,使用SB203580特异性抑制p38MAPK的激活,则能够明显减少LOC339524沉默对p38MAPK的磷酸化。第三部分UQCRC1在药物预处理大鼠心肌保护中的作用研究第三部分方法6.通过以下方法筛选和初步证实线粒体内膜中可能参与预处理介导心肌保护的靶蛋白。6.1建立大鼠心肌保护模型。首先采用腹腔单次注射50 mg·kg-1异丙肾上腺素素（isoproterenol hydrochloride,ISO）来建立大鼠心肌损伤模型;或在构建大鼠心肌损伤模型前,腹腔连续注射20mg·kg-1·d-1二氮嗪（diazoxide,DZ）不同时间（3d8W）;或在给与DZ的同时联合使用80 mg·kg-1·d-1 5-羟基癸酸（5-hydroxydecanoic acid,5-HD）,具体分组如下:1)第1组为control组。2)第2组为ISO组:仅皮下注射ISO（50 mg·kg-1溶于生理盐水中）。3)第3组为DZ+ISO组:在注射ISO之前,大鼠连续3天每天腹腔注射20mg·kg-1·d-1的DZ。4)第4,5,6,7和8组大鼠在注射ISO之前,分别接受腹腔注射1,2,4,6和8周的DZ（20 mg·kg-1·d-1,每天注射一次）。在给药期间,所有其他组给予等体积的生理盐水。5)第9组中,大鼠在注射ISO之前,5-HD与DZ一起给予8周。6.2在ISO注射后4h,断颈处死大鼠,收集心脏,筛选MIM中的靶蛋白。1)部分组织进行石蜡包埋,TUNEL染色观察上述分组中心肌组织的凋亡情况;2)部分心肌用于提取MIM蛋白,通过二维荧光差异凝胶电泳（two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis,2D-DIGE）结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS）分析了DZ 0w,4w和6w心肌MIM中的差异蛋白;3)Western Blot检测了DZ处理0w,4w和6w后筛选到的UQCRC1表达变化。6.3在细胞水平进一步探讨UQCRC1的心肌保护作用。使用100μmol/L DZ作用H9C2细胞24h,或100μmol/L DZ和100μmol/L 5-HD共同作用H9C2 24h,Western Blot评估上述分组中UQCRC1表达的改变;随后将细胞进行OGD/R损伤,Hoechst33342染色检测细胞的凋亡情况;H9C2细胞进行OGD/R损伤前,采用si RNA沉默UQCRC1表达,Hoechst33342染色进一步评估细胞的凋亡变化。第三部分结果:6.UQCRC1可能是二氮嗪预处理时心肌细胞主动产生内源性保护的靶蛋白。6.1成功建立大鼠心肌保护模型。ISO组中大鼠心肌TUNEL阳性细胞比例明显高于对照组;当DZ作用时间较短（<4w）,此时DZ表现出明显的保护效应:TUNEL阳性细胞比例较ISO组显着减少;当DZ作用时间>4w后,DZ的保护效应不仅消失,反而表现为损伤作用:TUNEL阳性细胞比例明显上升;在使用DZ的同时联合5-HD,可以部分逆转因DZ长时间作用引起的保护丧失。6.2 DZ长时间处理后心肌MIM的差异蛋白中,UQCRC1的表达变化与DZ处理后心肌保护变化一致。当DZ作用时间较短（<4w）时,心肌MIM蛋白中UQCRC1表达显着增加;而当时间>4w时,UQCRC1表达明显减少。6.3 UQCRC1明显减轻H9C2细胞遭受OGD/R损伤。相较于Control组,DZ 24h组可明显增加UQCRC1的表达,而在联合使用5-HD后,DZ 24h组高表达UQCRC1的作用消失;与之对应的是,在OGD/R损伤后,DZ 24h组Hoechst33342染色为强蓝色的细胞比例明显低于Control组,联合使用5-HD则Hoechst33342染色为强蓝色的细胞比例显着增加。通过si RNA明显减少UQCRC1的表达,再对细胞进行OGD/R损伤,si UQCRC1组Hoechst33342染色为强蓝色的细胞比例明显多于NC组。结论:1.首次证实一个被注释为Lnc RNA的LOC339524可以编码蛋白,且该蛋白在主要的组织器官中均有表达,具有重要的功能。2.缺氧可以诱导LOC339524在大鼠心肌和AC16细胞中高表达。而LOC339524可以通过激活AC16细胞PDGFR/PI3K/Akt通路,减轻OGD/R损伤,增加存活率。3.LOC339524减轻LPS诱导培养的BV-2小胶质细胞炎症反应,是通过抑制Src活性,进而抑制下游的两条信号通路。一条是NF-κB通路,另一条是p38MAPK通路,从而减少炎症介质i NOS和COX-2的表达来实现。4.在大鼠心肌线粒体内膜蛋白中筛选到的差异蛋白——UQCRC1可能是预处理时心肌细胞主动产生内源性保护的靶蛋白。
潘燕[9]（2019）在《一氧化碳释放分子-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化的抑制作用及其机制的研究》文中进行了进一步梳理背景和目的牙周炎是由牙周致病菌引起的牙周组织慢性感染性疾病,是口腔常见病、多发病,发病率高达80%以上。牙周炎会导致牙周组织结构破坏,牙周附着丧失,继而形成牙周袋甚至牙齿松动、脱落,是导致成年人失牙的主要原因[1]。临床上牙周炎的治疗方法包括牙周基础治疗,同时配合全身或局部应用抗生素治疗,以及手术、修复治疗和支持治疗[2]。成骨细胞导致的骨形成和破骨细胞引起的骨吸收之间维持着相互耦联的动态平衡,骨的形态因之能保持稳定。当各种骨吸收刺激因子诱导大量的破骨细胞活化,导致牙槽骨发生显着破坏吸收时,仅仅依靠简单的物理和化学治疗很难逆转牙槽骨出现的破坏趋势。因此,如果能够在牙周炎症的初期抑制破骨细胞分化成熟、减少牙槽骨的吸收,这对治疗牙周炎、维持患牙功能甚至保留患牙尤为重要。本课题以小鼠RAW264.7细胞为体外研究模型,研究CORM-3对RAW264.7这一小鼠源性破骨前体细胞向破骨细胞分化的抑制作用,并探讨其作用机制;并以C57小鼠为体内实验模型,检测CORM-3对实验性牙周炎小鼠牙槽骨吸收的抑制作用,以期为牙周炎的临床治疗提供新的思路。RAW264.7细胞是小鼠源性破骨前体细胞,该细胞株最初来源于Abelson小鼠白血病病毒所致的肿瘤。通过RANKL诱导RAW264.7细胞获得成熟破骨细胞是一种较好的获取破骨细胞的方法。曾有多种破骨前体细胞系（如FDCP、HL-60细胞、C7细胞和FLG29.1等）用于破骨细胞的研究[5],但目前公认的唯一成系的破骨细胞前体细胞是RAW264.7[6],该细胞可表达破骨细胞表型标志基因,与破骨细胞的基因表达谱极其相似,且能形成骨吸收陷窝[7]。RANKL刺激RAW264.7细胞后,与骨吸收有关的基因如ca-thepsin K等表达显着上调,进一步表明RAW264.7细胞是一种较好的破骨前体细胞模型。在破骨细胞前体细胞至成熟破骨细胞的分化过程中有一系列标志性基因产生,可作为破骨细胞及其分化阶段的标识。RANKL/RANK/OPG是调节破骨细胞分化成熟和骨吸收功能的关键系统[8],当多种刺激骨吸收因子作用于成骨/基质细胞后,成骨/基质细胞在其表面表达RANKL特异性的识别破骨细胞前体,并与其膜上的功能性受体RANK结合,刺激破骨细胞前体发育成成熟的破骨细胞。同时RANKL还能通过RANK途径,使成熟的破骨细胞内迅速形成肌动蛋白环,激活成熟的破骨细胞发挥骨吸收功能。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）是在破骨细胞中高度表达的关键酶,并参与破骨细胞介导的骨转换过程。组织蛋白酶K（Cathepsin K）是表达于破骨细胞上并以溶胶原形式存在的半胱氨酸蛋白酶。Cts-K与TRAP均为鉴定破骨细胞的重要基因[9]。基质金属蛋白酶（MMP）属于锌结合肽链内切酶家族。为包括骨组织在内的多种组织细胞外基质降解所必须。MMP,尤其是MMP-9在破骨细胞中高表达,是降解细胞外基质、参与骨重建的重要蛋白酶,在破骨细胞活性增强的骨吸收中起重要作用[10]。CORM是近年来新合成的一种CO复合物,经适当溶剂溶解后能够在生理环境下可控制地释放CO,可作为外源性CO供源。已有研究证实,CORM能抑制关节炎小鼠病变区内多种炎症分子的表达,有效改善其临床表征[11]CORM通过其抗氧化、抗炎及抗细胞凋亡作用,可以减轻脂多糖诱导下的大鼠多器官功能损伤[12]。本课题组在前期研究中已发现CORM作为外源性CO供源,能够抑制炎症因子诱导的人牙龈成纤维细胞黏附分子的表达,降低免疫活性细胞的浸润和黏附[13];同时还发现CORM能有效抑制实验性牙周炎大鼠血清中TNF-α和IL-1β的升高,抑制牙槽骨的吸收及病变区域炎症细胞的浸润,证实CORM能有效抑制大鼠实验性牙周炎的病理进程。血红素氧合酶-1（HO-1）是血红素降解的限速酶。HO系统是广泛存在于人和哺乳动物体内的微粒体酶系统。在正常状态下,HO-1呈低水平表达,易受多种因素诱导表达,如血红素、细胞因子、CO[14]等。已有研究表明HO-1在骨改建过程中可起到直接的调节作用[15,16]。本课题通过培养小鼠RAW264.7细胞并对该细胞进行破骨分化诱导,建立体外破骨细胞分化体系,然后在该体系中加入CORM-3,证实CORM-3通过HO-1途径在一定程度上抑制破骨细胞的分化与成熟。同时通过建立实验性牙周炎小鼠模型,经腹腔注射CORM-3,发现CORM-3能够抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞的形成和牙槽骨的吸收。以往对牙周炎治疗的研究多数针对控制牙周炎症方面或聚焦研究成骨方面,本实验以抑制骨吸收为目标,从延缓牙周炎牙槽骨吸收进程入手,为牙周炎的临床治疗提供了新的思路以及实验基础和理论依据。方法1.小鼠RAW264.7细胞破骨分化模型的建立将小鼠RAW264.7细胞以5×104的密度接种于6孔板,细胞分为两组:对照组和破骨诱导组（100μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF）,每组设3个复孔。培养5天后,用TRAP染色法检测不同组细胞破骨分化的情况。2.不同浓度CORM-3对小鼠RAW264.7细胞活性的影响RAW264.7细胞于0、100、200、400及800μM的CORM-3培养液分别培养24h和48h后,以CCK-8法检测不同浓度CORM-3对RAW264.7细胞活性的影响。3.CORM-3抑制RAW264.7细胞破骨分化将小鼠RAW264.7细胞以5×104的密度接种于6孔板,细胞分为三组:对照组、破骨诱导组（100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF）和CORM-3组（200 μM CORM-3+100μg/LRANKL+50μg/LM-CSF）,每组设3个复孔。培养5天后,用TRAP染色法检测不同组细胞破骨分化的情况。4.CORM-3抑制小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子（RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K）mRNA和蛋白表达将小鼠RAW264.7细胞以5×104细胞密度接种于6孔板,细胞分为四组:对照组、破骨诱导组（100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF）、失活 CORM-3 组（200μM失活 CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF）和 CORM-3 组（200 μM CORM-3+100 μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF）,每组设 3 个复孔。细胞培养 5、7、9天后,用RT-PCR和Western Blot方法分别检测细胞中RANK,TRAP,MMP-9和Cts-K四种破骨相关因子的mRNA及蛋白表达。上述实验均重复至少三次。5.HO-1基因沉默慢病毒转染实验将小鼠RAW264.7细胞以5×105细胞密度接种于12孔板,细胞分为五组:空白组、NC对照组、SH-1病毒组、SH-2病毒组和SH-3病毒组,每组均分为三个MOI值（MOI=40、50、60）,感染5天后在荧光显微镜下观察选出最佳感染MOI值;用最佳MOI值组别的细胞进行PT-PCR和Westen Blot方法检测,筛选出感染效率最高的慢病毒进行后续正式感染实验。6.HO-1基因沉默后CORM-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子（RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K）mRNA和蛋白表达的影响HO-1基因沉默后的小鼠RAW264.7细胞以5×104细胞密度接种于6孔板。细胞分为4组:对照组、破骨诱导组（100 μg/LRANKL+50 μg/LM-CSF）、失活 CORM-3 组（200 μM 失活 CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF）和CORM-3 组（200 μM CORM-3+100 μg/L RANKL+50 μg/L M-CSF）,每组设三个复孔。细胞培养5、7、9天后,分别用实时荧光定量PCR及Western Blot方法检测细胞中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表达。上述实验均重复至少三次。7.CORM-3抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞分化成熟及牙槽骨吸收选择雄性8周龄C57小鼠36只（23g-25g）。将C57小鼠随机分为三组（每组12只）,即正常组、慢性牙周炎组（CP组）及CORM-3干预牙周炎组（CORM-3组）。其中,CP组和CORM-3组采用丝线结扎上颌第二磨牙同时局部注射内毒素法建立牙周炎模型。CORM-3组和CP组自结扎当天起分别腹腔注射一氧化碳释放分子-3溶液（CORM-3,10 mg/kg/d）和等体积无菌生理盐水。分别于牙周结扎的第7天和第14天,各组分别处死6只小鼠,并制作双侧上颂骨标本。一侧上颌骨标本去除附着的牙周软组织用甲苯胺蓝染色后,在体视显微镜下观察每组牙槽骨吸收情况;另一侧上颌骨标本经固定、脱钙、透明、包埋后制作常规石蜡切片,TRAP染色后显微镜下观察每组牙槽骨内破骨细胞分化成熟的情况。结果1.小鼠RAW264.7细胞破骨分化模型的建立RAW264.7细胞加入破骨诱导液诱导5天后,TRAP染色显示有明显破骨细胞形成,且破骨细胞数量显着高于对照组（P<0.05）。2.不同浓度CORM-3对小鼠RAW264.7细胞活性的影响24h和48hCCK-8检测结果均显示:1 00μM和200μM的CORM-3均不影响RAW264.7细胞的活性,且200μM的CORM-3对RAW264.7细胞增殖有显着的促进作用,而800μM的CORM-3显着抑制了RAW264.7细胞的增殖,（P<0.05）。因此选择浓度为200μM的CORM-3作为后续实验操作浓度。3.CORM-3抑制RAW264.7细胞破骨分化RAW264.7细胞破骨诱导的同时加入CORM-3,5天后TRAP染色显示CORM-3干预组仅有少量破骨细胞形成,且破骨细胞数量显着低于破骨诱导组（P<0.05）。4.CORM-3抑制小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子（RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K）mRNA和蛋白表达RAW264.7细胞进行破骨诱导后,用实时荧光定量PCR技术检测第5、7、9天4种破骨相关基因RANK,TRAP,MMP-9,Cathepsin K的mRNA表达,结果显示,第5、7、9天破骨诱导组中细胞四种因子mRNA的表达均显着高于对照组（P<0.05）。CORM-3组中四种因子mRNA的表达较之破骨诱导组有显着降低（P<0.05）。失活 CORM-3 组中,RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的 mRNA表达比CORM-3组有显着增强（P<0.05）,但与破骨诱导组相比无显着差异（P＞0.05）。Western Blot检测结果显示第5、7、9天破骨诱导组中细胞RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的蛋白表达均显着高于对照组（P<0.05）。而CORM-3组中四种因子的蛋白表达较之破骨诱导组有显着降低（P<0.05）。失活CORM-3组中,RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的蛋白表达显着高于 CORM-3 组（P<0.05）,但与破骨诱导组相比无显着差异（P>0.05）。5.HO-1基因沉默慢病毒转染实验实验结果显示:SH-3病毒在MOI值为60时对小鼠RAW264.7细胞HO-1基因的沉默效率最高。6.HO-1基因沉默后CORM-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化四种破骨相关因子（RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K）mRNA和蛋白表达的影响小鼠RAW264.7细胞中的HO-1基因沉默后,再进行破骨诱导,用荧光实时定量 PCR 技术检测第 5、7、9 天 RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K 的 mRNA 表达。结果显示,破骨诱导组、失活CORM-3组及CORM-3组四种因子的mRNA表达均比对照组有显着增强（P<0.05）。三组间比较,四种因子的mRNA表达无显着性差别（P＞0.05）。Western Blot检测结果显示第5、7、9天破骨诱导组、失活CORM-3组及CORM-3组中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的蛋白表达较对照组显着增加（P<0.05）,而CORM-3组与破骨诱导组相比,四种因子的表达无显着性差异（P<0.05）。7.CORM-3抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞分化成熟及牙槽骨吸收实验性牙周炎小鼠经腹腔注射CORM-3 7天、14天后,小鼠上颌骨甲苯胺蓝染色结果显示,CP组牙槽骨高度显着低于CORM-3组（P<0.05）。上颌骨TRAP染色结果显示,CORM-3组牙槽骨内成熟破骨细胞数量较CP组显着减少（P<0.05）。结论1.CORM-3能够抑制RANKL+M-CSF诱导的小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化。2.CORM-3能够显着降低破骨相关因子RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表达。这一抑制作用是通过CORM-3释放的CO实现的。3.将RAW264.7细胞中HO-1基因沉默后,CORM-3对破骨诱导过程中RANK,TRAP,MMP-9,Cts-K的mRNA及蛋白表达的调控作用丧失,表明CORM-3对RAW264.7细胞破骨分化的抑制作用是通过HO-1通路进行的。4.CORM-3能够抑制实验性牙周炎小鼠牙槽骨内破骨细胞的分化成熟,抑制牙周炎小鼠牙槽骨的吸收。
周游[10]（2019）在《邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应的防治反作应用反及应其机制研究》文中指出背景:大气细颗粒物（PM2.5）已被证实可通过引起机体促炎/抗炎反应失衡而诱导肺损伤的发生,同时研究表明,PM2.5中的主要成份可被Toll样受体4（TLR4）识别,并触发信号转导,近年来,TLR4/NF-κB信号通路被公认为与肺损伤的发病及其炎症反应密切相关,同时也已证实该信号通路在PM2.5诱导的炎症反应中起重要作用。国医大师邓铁涛认为,雾霾属邪毒,其性轻扬易袭肺脏,其性湿浊易酿痰瘀,其可致虚,入体易从热化,并将雾霾性肺损伤的病机归为毒、热、痰、瘀四大病理产物相互搏结于肺而发病,因此确立治法为清热解毒,活血祛瘀,并在其百岁之际献方邓氏清霾汤。该方在前期临床研究中已证实可减轻痰热郁肺型急性肺损伤患者的炎症反应。本研究在广东省中医药管理局基金项目（No.20193005）和广州中医药大学邓铁涛基金项目（No.2016030101）资助下,在国医大师邓铁涛治疗雾霾性肺损伤学术理论思想的指导及前期邓氏清霾汤治疗痰热郁肺型急性肺损伤临床研究基础上,我们提出假设:具有清热解毒、活血祛瘀功效的邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应具有防治作用,其作用机制是通过调控TLR4/NF-κB信号通路及其下游的炎症介质释放所实现。为验证假设,我们在对文献进行系统回顾后开展体内、体外实验研究,对邓氏清霾汤防治PM2.5诱导肺损伤炎症反应的疗效及其可能的作用机制进行了探讨,为其在临床中的推广应用奠定研究基础。目的:明确邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应的防治作用及探讨其作用机制。方法:1.PM2.5诱导肺损伤大鼠模型的优化建立选用72只SPF级4～6月龄SD大鼠（体质量200～240g）随机分为4组,即对照组（Control）、PM2.5低浓度组（0.25mg/m L）、PM2.5中浓度组（0.5mg/m L）、PM2.5高浓度组（1mg/m L）。采用单侧鼻腔滴注法进行动物模型建立,分别于第1天、第7天、第14天、第21天、第28天各滴鼻1次（体积100μL/只）,并且于第3次、第4次、第5次滴鼻之后24h,每组随机选取6只大鼠,采用麻醉后腹主动脉放血处死。每次取材后,记录大鼠的行为活动、体重变化等一般情况;取肺组织切片,HE染色观察肺组织病理变化;取左侧完整肺组织,进行肺组织W/D比值计算;取肺泡灌洗液（BALF）,采用Brandford法测定肺通透指数;采用血氧分析仪测定腹主动脉血氧合指数,评价模型建立是否成功。2.邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应的防治作用将邓氏清霾汤熬制成低（0.72g/m L）、中（1.45g/m L）、高（2.90g/m L）三种不同浓度剂量的药液。将72只SPF级4～6月龄SD大鼠（体质量200～240g）随机分为6组,即对照组（Control）、模型组（Model）、地塞米松组（DXM）、邓氏清霾汤低（Low dose）、中（Medium dose）、高（High dose）剂量组,每组12只。除对照组外,其余各组均采用浓度为0.5mg/m L的PM2.5混悬液进行单侧鼻腔滴注法建立肺损伤大鼠模型,于造模当天算起,分别于第1天、第7天、第14天、第21天、第28天各滴鼻1次（体积100μL/只）,同时从造模当日起,各中药组大鼠进行中药灌胃（体积3m L/只）,每日1次,地塞米松组大鼠每日灌胃相同体积的地塞米松溶液（浓度0.02mg/m L）,对照组大鼠每日灌胃相同体积的生理盐水,各组大鼠均连续灌胃4周。在第5次滴鼻（即造模第28天）之后24h,对各组大鼠进行麻醉后腹主动脉放血处死。记录大鼠的行为活动、体重变化等一般情况;取肺组织切片,HE染色观察肺组织病理变化;取左侧完整肺组织,进行肺组织W/D比值计算;取肺泡灌洗液（BALF）,采用Brandford法测定肺通透指数;取BALF进行吉姆萨染色（Giemsa）,进行细胞分类及计数;采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测BALF中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α炎性因子表达水平;采用血氧分析仪测定腹主动脉血氧合指数。3.邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应的作用机制含药血清制备:选用24只SPF级4～6月龄SD大鼠（体质量200～240g）随即分为2组,即给药组（12只）、空白组（12只）。给药组采用邓氏清霾汤中剂量（1.45g/m L）灌胃（体积3m L/只）,每日1次,连续1周。空白组采用相同方式给予等量的生理盐水灌胃。末次给药后2h,用2%戊巴比妥钠（2m L/kg）腹腔注射麻醉后进行腹主动脉取血,血液经离心、过滤、灭活补体后保存备用。细胞实验:选用大鼠肺泡巨噬细胞（NR8383细胞）进行离体实验,细胞复苏后进行常规培养与传代,选取对数生长期的细胞进行实验。将细胞分为6组,即空白组（Blank）、对照组（Control）、模型组（Model）、中药组（Drug）、抑制剂组（PDTC）。模型组、中药组、抑制剂组用浓度为0.5mg/m L的PM2.5混悬液刺激细胞,空白组、对照组不做PM2.5染毒处理。空白组、模型组、抑制剂组采用20%空白组大鼠血清培养细胞,对照组、中药组采用20%大鼠含药血清培养细胞,各组干预细胞24h后,收集细胞及上清液进行检测。采用MTT法检测各组细胞存活率;采用免疫印迹（Western blotting）法检测TLR4/NF-κB信号通路中相关蛋白TLR4、My D88、IKKα/β、IκB-α、NF-κB p65（胞浆及胞核）的表达水平;采用荧光免疫染色（IFS）法检测细胞中NF-κB移位变化及入核情况;采用凝胶迁移实验（EMSA）检测入核后NF-κB与DNA启动子结合情况;采用双荧光素酶报告基因（Luciferase）检测NF-κB激活i NOS和COX-2基因启动子转录表达情况;采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Westernblotting法检测转录后i NOS和COX-2 m RNA的表达水平,以及生成i NOS和COX-2蛋白的表达水平;采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测NF-κB诱导释放的炎症介质NO、PGE2的表达水平及炎性因子IL-10、IL-1β、TNF-α和IL-6的表达情况。结果:1.动物模型优化建立成功（1）大鼠一般情况:对照组、低浓度组、中浓度组大鼠未见死亡,高浓度大鼠于第1次滴鼻后死亡4只,于第3次滴鼻前死亡3只,第4次滴鼻前因麻醉死亡1只,滴鼻后随即死亡4只。对照组:实验全过程中所有大鼠精神反应灵敏,活泼好动,毛色白有光泽,进食及排便未见异常,体重均速增长,未问及异常呼吸音。低浓度组:实验全过程中所有大鼠精神状态良好,毛发有光泽,进食正常,后期部分大鼠体重稍有下降;多数大鼠于第4次滴鼻后出现喉间痰鸣音。中浓度组:多数大鼠于第4次滴鼻后出现精神萎靡,皮毛渐黄无光泽,进食量逐渐减少,体重增加缓慢,偶出现轻度气喘症状,重者可闻及喉间痰鸣音。高浓度组:部分大鼠于第2次滴鼻前出现精神萎靡,呼吸急促,反应迟钝,爪甲、口唇发绀;多数大鼠于第3次滴鼻后出现喘息急促、口唇青紫、无进食现象,死亡率高。（2）肺组织病理学观察及病理评分:肺组织病理学观察显示:对照组:肺组织进行3次取材结果观察,无明显差异:视野内极少出现炎症细胞及血液渗出;肺泡结构完整,肺泡腔无塌陷,极少数肺泡腔略微增大;肺泡壁无断裂、融合,仅有少部分水肿;肺间质内少量血性渗出及炎症浸润;支气管管壁无增厚及充血。低浓度组:3次取材肺组织病理结果差异较小:视野范围内见肺组织少量炎症细胞及渗出;肺泡壁少量断裂,轻度水肿;肺泡腔少许增宽;肺间质出现少量炎症细胞;支气管管壁无明显增厚及充血。中浓度组:第2次取材（22d）发现较第1次取材（15d）肺组织病理损害略有增加,具体观察为:视野内肺组织损害轻微,多数肺泡结构完整,肺泡腔无塌陷,但部分肺泡腔略增大,肺泡壁部分断裂及水肿;支气管管壁无明显增厚。第3次取材（29d）发现肺组织病理损害程度严重,表现为:满肺野充血水肿,多数肺泡结构不可见;肺间质及支气管管壁增厚,且支气管管壁周围出现大量炎症细胞浸润。高浓度组:第1次取材观察肺组织病理损害明显,表现为肺泡结构绝大多数被破坏,肺间质可见充血、大量炎症细胞及红细胞渗出;第2次取材观察结果,肺组织结构不可见,被大量炎症细胞及红细胞包裹。肺组织病理学评分:第1次取材后,高浓度组较对照组比较,评分明显高于对照组;低浓度组与中浓度组较对照组,评分无明显差异。第2次取材后,高浓度组较对照组比较,评分明显高于对照组;低浓度组与中浓度组较对照组,评分无明显差异。第3次取材后,中浓度组较对照组比较,评分明显高于对照组;低浓度组较对照组,评分无明显差异。（3）实验室指标:第1次取材后:低浓度组、中浓度组与对照组相比,肺通透指数、肺组织W/D比值和氧合指数等方面均无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）;高浓度组与对照组相比,肺通透指数、肺组织W/D比值显着升高,氧合指数显着下降,差异有统计学意义（P<0.01）。第2次取材后:低浓度组与对照组相比,肺通透指数、肺组织W/D比值方面无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）;中浓度组较对照组相比,氧合指数明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）;高浓度组较对照组相比,肺通透指数、肺组织W/D比值升高,氧合指数显着下降,差异有统计学意义（P<0.05）。第3次取材后:低浓度组与对照组相比,肺通透指数、肺组织W/D比值、氧合指数均无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）;中浓度组与对照组相比,肺通透指数、肺组织W/D比值显着升高,氧合指数显着下降,差异有统计学意义（P<0.01）;高浓度组大鼠在第3次取材前均死亡,影响本次检测。2.邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应具有防治作用（1）大鼠一般情况:各组大鼠均未见死亡。取材前观察各组大鼠情况如下:对照组:所有大鼠反应敏捷,精神可,活泼喜动,毛发色白有光泽,进食及大便未见异常,未闻及异常呼吸音及喉间痰鸣音。模型组:绝大多数大鼠活动迟缓,喜静恶动,精神萎靡,皮毛发黄,进食量减少,出现气喘症状,重者可闻及喉间痰鸣音。地塞米松组:大多数大鼠喜静恶动,精神疲惫,行动迟缓,毛色黄白相间,多数大鼠进食量明显减少,少部分大鼠出现气促症状,部分可闻及喉间痰鸣音。各中药治疗组:绝大多数大鼠活泼好动,精神可,反应灵活,食量适中,毛发有光泽,均未闻及喉间痰鸣音;其中低剂量组多数大鼠表现咳嗽、气促等症状;中、高剂量组少数大鼠出现咳嗽、气促且症状较轻。大鼠体重情况:第1d体重:各组间大鼠体重比较均无明显差异。第7d体重:模型组、地塞米松组和低剂量组与对照组比较,大鼠体重值有明显减少,差异有统计学意义（P<0.01）;中、高剂量组与对照组比较,大鼠体重值无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。第14d体重:地塞米松组、低剂量组与模型组比较,大鼠体重值无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）;中、高剂量组与对照组比较,大鼠体重值无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。第21d体重:模型组与对照组相比,大鼠体重值明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）;中、高剂量组与模型组相比,大鼠体重值明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）;地塞米松组与模型组相比,大鼠体重值无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）;中、高剂量组与地塞米松组相比,大鼠体重值明显增加（P<0.01）;中、高剂量组与对照组比较,大鼠体重值无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。第28d体重:模型组、地塞米松组与对照组相比,大鼠体重值明显减少,差异有统计学意义（P<0.01）;低、中、高剂量组与模型组相比,大鼠体重值明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）;低、中、高剂量组与地塞米松组相比,大鼠体重值明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）;低、中、高剂量组与对照组相比,大鼠体重值无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。（2）肺组织形态及病理学:肺组织形态学观察:对照组:肺组织表面光滑,肺体呈均匀淡粉色,未见肿胀、充血、渗出以及明显梗死灶。模型组:双侧肺组织呈肿胀伴有凹凸细砂粒状,色暗红,肺包膜下出现较多处出血灶,甚则连成片状。地塞米松组:肺组织表面较光滑,肺整体呈淡粉色,中间夹杂点状出血点及少量渗出液。低剂量组:双肺体积明显增大,肺组织中央呈暗红色充血状,周边呈淡粉色。中、高剂量组:双肺体积无明显增大,整体呈淡粉色,未见明显充血点及渗出液。肺组织病理学观察:对照组:肺泡结构正常,分布均匀,肺泡腔饱满光滑无异常增大,肺泡壁无充血水肿、融合及断裂,肺泡间隔无增厚、增宽;肺间质内出现极少量渗血及炎症细胞;支气管管壁无充血、狭窄;模型组:整个肺组织损害严重,视野内可见大量炎症细胞渗出、充血和水肿,无完整肺泡结构;支气管管壁充血、增厚;地塞米松组:视野内肺组织少量炎症细胞及出血、水肿;可见较完整肺泡结构,少部分肺泡腔塌陷,少量肺泡出现融合、断裂;部分肺间质充血及炎性渗出;支气管管壁轻度增厚;低剂量组:视野内肺组织较多炎症渗出和充血;多数肺泡结构不完整,肺泡腔塌陷,肺泡间隔融合、增厚;肺间质充血伴炎症细胞增多;支气管管壁增厚、充血;中、高剂量组:视野内肺组织结构相对完整,极少量肺泡腔塌陷或增大,肺泡壁少许水肿、断裂和增厚;肺间质少量炎症细胞浸润;支气管管壁未见明显充血、狭窄。（3）实验室指标:动物模型建立成功后,模型组与对照组相比,BALF中炎性因子IL-1β、IL-10、TNF-α、IL-6的表达、肺组织W/D比值、肺通透指数及炎症细胞数量均明显升高,氧合指数明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）;低剂量组与模型组相比,BALF中炎性因子IL-1β、IL-10、TNF-α、IL-6的表达,肺组织W/D比值,肺通透指数及炎症细胞数量有一定程度下降,氧合指数有一定程度上升;中、高剂量组与模型组相比,BALF中炎性因子IL-1β、IL-10、TNF-α、IL-6的表达,肺组织W/D比值,肺通透指数及炎症细胞数量均有下降,氧合指数均有上升,差异有统计学意义（P<0.05）;中、高剂量组与地塞米松组相比,治疗效果在减少肺组织病理损害方面无明显差异（P>0.05）,但在减轻肺损伤产生的症状方面中药效果明显优于地塞米松,地塞米松在控制炎性因子释放与提高氧合指数方面效果优于中药。3.邓氏清霾汤可通过调控TLR4/NF-κB信号通路转导及其下游炎症介质释放,以减轻PM2.5诱导肺损伤的炎症反应（1）不同浓度PM2.5对NR8383细胞存活率的影响:与PM2.50.5mg/m L组相比,PM2.52mg/m L组细胞存活率在12h、24h、48h、72h显着下降;与PM2.50.5mg/m L组相比,PM2.54mg/m L组细胞存活率在12h、24h、48h、72h显着下降;与PM2.50.5mg/m L组24h相比,72h细胞存活率显着下降,差异有统计学意义（P<0.01）。（2）各组对TLR4/NF-κB信号通路中相关蛋白的影响:对照组与空白组比较,TLR4、My D88、IKKα/β、IκB-α、核内NF-κB p65、胞内NF-κB p65蛋白表达水平无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）;模型组与空白组比较,TLR4、My D88、IKKα/β、核内NF-κB p65蛋白表达增多,IκB-α、胞内NF-κB p65蛋白表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）;中药组与模型组比较,TLR4、My D88、IKKα/β、核内NF-κB p65蛋白表达少,IκB-α、胞内NF-κB p65蛋白表达多,差异有统计学意义（P<0.05）;中药组与PDTC组比较,TLR4、My D88、IKKα/β、IκB-α、核内NF-κB p65、胞内NF-κB p65蛋白表达均无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）。（3）各组对NF-κB移位及入核的影响:对照组与空白组比较,两者视野内可见少量高强度红色荧光,胞核内红色荧光极少,NF-κB p65蛋白与胞核共定位区域荧光强度值无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）;模型组与空白组比较,整体视野内荧光强度增加,红色荧光主要聚集于胞核内,NF-κB p65蛋白与胞核共定位区域荧光强度值明显增强,差异有统计学意义（P<0.01）;中药组与模型组比较,视野内整体荧光强度降低,胞核内红色荧光聚集明显偏少,NF-κB p65蛋白与胞核共定位区域荧光强度值明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）;中药组与PDTC组比较,NF-κB p65蛋白与胞核共定位区域荧光强度值无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）。（4）各组对NF-κB与DNA结合活性影响:对照组与空白组比较,NF-κB与探针的结合情况无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）;模型组与空白组比较,NF-κB与探针的结合能力增强,其灰度值明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）;中药组与模型组比较,NF-κB与探针的结合能力较弱,其灰度值明显减少,差异有统计学意义（P<0.01）;中药组与PDTC组比较,NF-κB与探针的结合情况无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）。（5）PM2.5对NF-κB转录活性的影响:共转染组（D组）较其余三组（A组、B组、C组）,细胞中相对荧光强度值显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）。（6）各组对NF-κB转录后激活炎症介质的影响:对照组与空白组比较,i NOS和COX-2 m RNA及其蛋白相对表达量与NO、PGE2蛋白表达水平无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）;模型组与空白组比较,i NOS和COX-2 m RNA及其蛋白相对表达量与NO、PGE2蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）;中药组与模型组比较,i NOS和COX-2 m RNA及其蛋白相对表达量与NO、PGE2蛋白表达水平均有减少,差异有统计学意义（P<0.05）;中药组与PDTC组比较,NO和PGE2蛋白表达水平无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）。（7）各组对NF-κB转录后促进炎性因子释放的影响:对照组与空白组比较,IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α含量无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）;模型组与空白组比较,IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α含量明显增多,差异有统计学意义（P<0.01）;中药组与模型组比较,IL-1β、IL-10和TNF-α含量明显减少,差异有统计学意义（P<0.01）;中药组与PDTC组比较,IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α含量明显增多,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:1.用浓度为0.5mg/m L,体积为100μL的PM2.5混悬液通过鼻腔滴注法在滴鼻5次（即造模28天）后可成功优化建立PM2.5诱导肺损伤大鼠模型,该动物模型符合肺损伤的主要特征,且合乎人类肺损伤的发生机制。2.PM2.5染毒肺组织后,可造成大鼠出现肺损伤症状,发生肺组织病理损害,引发炎症反应。邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应的防治作用表现在缓解肺损伤症状,降低肺组织病理损害程度,减轻炎症反应等方面,且存在量-效关系。3.PM2.5刺激细胞后,可通过干预TLR4/NF-κB信号通路中相关蛋白表达,活化NF-κB使其移位、入核,促进与靶DNA结合,并引发转录,促使大量炎症介质生成及炎性因子释放,发生炎症反应;邓氏清霾汤可通过调控TLR4/NF-κB信号通路中相关蛋白表达,减少活化的NF-κB移位、入核,降低与靶DNA结合活性,减少炎症介质生成及炎性因子释放,进而减轻炎症反应。
二、Inducible heat shock protein 70 kD and inducible nitric oxide synthase in hemorrhage/resuscitation-induced injury（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Inducible heat shock protein 70 kD and inducible nitric oxide synthase in hemorrhage/resuscitation-induced injury（论文提纲范文）
（1）臂旁核在束缚-浸水应激大鼠中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 应激与胃黏膜损伤 |
| 1.1 应激 |
| 1.2 应激性胃黏膜损伤与束缚-浸水应激模型 |
| 1.3 c-Fos蛋白与应激 |
| 1.4 应激诱导GFAP的表达 |
| 1.5 胃黏膜损伤与一氧化氮 |
| 2 臂旁核的形态与功能 |
| 2.1 臂旁核的结构组成 |
| 2.2 臂旁核的纤维联系 |
| 2.3 臂旁核的功能 |
| 2.3.1 调控心血管系统 |
| 2.3.2 味觉与摄食的调节 |
| 2.3.3 体温调节 |
| 2.3.4 痛觉调节 |
| 2.3.5 睡眠与觉醒调节 |
| 2.3.6 参与呼吸活动调节 |
| 3 药理遗传学 |
| 实验研究一:束缚-浸水应激对大鼠臂旁核内c-Fos蛋白和GFAP蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器以及分析软件 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要溶剂及试剂配方 |
| 1.4 实验动物及分组 |
| 1.5 RWIS实验模型 |
| 2 免疫荧光染色实验方法 |
| 2.1 脑组织的准备 |
| 2.2 脑组织冰冻切片 |
| 2.3 免疫荧光染色实验 |
| 3 Western blot实验方法 |
| 3.1 组织蛋白准备 |
| 3.2 蛋白提取 |
| 3.3 蛋白含量测定 |
| 3.4 SDS-PAGE凝胶配制 |
| 3.5 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 3.6 转膜 |
| 3.7 免疫反应 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 RWIS不同时段PBN中 c-Fos蛋白的表达 |
| 4.2 RWIS不同时段PBN中 GFAP的表达 |
| 4.3 RWIS不同时段胃肌间神经丛中c-Fos蛋白的表达 |
| 4.4 RWIS不同时段胃肌间神经丛中GFAP的表达 |
| 5 讨论 |
| 实验研究二:抑制臂旁核对束缚-浸水应激大鼠胃黏膜损伤的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物应激模型制备 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 病毒核团注射 |
| 2.1 PBN微量注射病毒 |
| 2.2 造模与取材 |
| 3 免疫荧光染色实验方法 |
| 4 EI评估 |
| 5 Western blot实验方法 |
| 6 实验结果 |
| 6.1 PBN注射hM4D病毒后对胃黏膜损伤的影响 |
| 6.2 PBN注射hM4D病毒后对胃壁中Occludin表达的影响 |
| 6.3 PBN注射hM4D病毒后对胃壁中Claudin表达的影响 |
| 6.4 PBN注射hM4D病毒后对胃壁中PCNA表达的影响 |
| 6.5 PBN注射hM4D病毒后PBN、NTS内 c-Fos蛋白的表达 |
| 6.6 PBN注射hM4D病毒后PBN、NTS内 GFAP的表达 |
| 7 讨论 |
| 实验研究三:臂旁核注射L-NAME对束缚-浸水应激大鼠胃黏膜损伤的影响 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 核团套管 |
| 1.5 动物应激模型制备 |
| 1.6 主要试剂配制 |
| 2 核团抑制剂注射 |
| 2.1 PBN核团埋管 |
| 2.2 PBN核团注射 |
| 2.3 PBN位点鉴定 |
| 2.4 造模与取材 |
| 3 免疫荧光染色实验方法 |
| 4 EI评估 |
| 5 Western bolt实验 |
| 6 实验结果 |
| 6.1 RWIS不同时段PBN中 NOS阳性神经元数量的变化 |
| 6.2 RWIS不同时段对胃壁中NOS表达的影响 |
| 6.3 PBN注射L-NAME后对PBN内 NOS表达的影响 |
| 6.4 PBN注射L-NAME后对胃黏膜损伤的影响 |
| 6.5 PBN注射L-NAME后对胃壁中NOS表达的影响 |
| 6.6 PBN注射L-NAME后对胃壁中Occludin、Claudin、PCNA表达的影响 |
| 7 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（2）Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及调控机制研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 Drp1在缺血缺氧损伤中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 创伤休克血管低反应性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）姜黄素对脊髓损伤小鼠的抗抑郁和神经保护作用的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 SCI脊髓损伤模型的建立 |
| 2.3 悬尾实验(tail suspension test,TST) |
| 2.4 糖水偏好实验(sucrose preference test,SPT) |
| 2.5 Western blot检测蛋白浓度 |
| 2.6 BMS(basso mouse scale,BMS)评分 |
| 2.7 斜板实验 |
| 2.8 PI染色 |
| 2.9 FJB(fluoro-jade b)染色 |
| 2.10 细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondlaldehyde,MDA)含量的测定 |
| 2.11 脊髓水含量的测定 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 致死率 |
| 3.2 姜黄素在悬尾实验中的作用 |
| 3.3 姜黄素在糖水偏好实验中的作用 |
| 3.4 姜黄素增加杏仁核中ERK蛋白和BDNF蛋白水平 |
| 3.5 姜黄素治疗改善脊髓损伤小鼠后肢运动功能 |
| 3.6 姜黄素治疗对SCI后SOD和MDA表达以及脊髓含水量的影响 |
| 3.7 姜黄素治疗SCI减少细胞坏死和神经元变性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 姜黄素治疗药物浓度的选择 |
| 4.2 实验动物的选择 |
| 4.3 脊髓损伤模型的选择 |
| 4.4 姜黄素的抗抑郁作用 |
| 4.5 姜黄素抗抑郁作用的分子机制 |
| 4.6 姜黄素的神经保护作用 |
| 4.7 本实验的不足和展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 姜黄素对脊髓损伤神经保护作用的研究现状和进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 咪唑啉受体(IR)的研究进展 |
| 1.2.1 咪唑啉受体(IR)的简介 |
| 1.2.2 咪唑啉受体(I_2R)的简介 |
| 1.2.3 咪唑啉I_2受体与神经保护功能的关系 |
| 1.3 Nrf2参与中枢神经系统保护作用 |
| 1.4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 钳夹法脊髓损伤大鼠模型成功建立 |
| 2.3.2 2-BFI的应用有助于脊髓损伤大鼠神经功能恢复 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中的作用机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验所使用的试剂及生产厂家 |
| 3.2.3 实验所使用的主要仪器和生产厂家 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 2-BFI增加脊髓损伤局部组织抗氧化酶活性 |
| 3.3.2 2-BFI增加脊髓损伤组织抗凋亡水平,抑制细胞坏死 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉在脊髓损伤大鼠模型中神经保护作用的调节机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验所使用的试剂及生产厂家 |
| 4.2.3 实验所使用的主要仪器和生产厂家 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 2-BFI通过激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶(Nr2/HO-1)信号通路保护神经 |
| 4.3.2 2-BFI在神经元细胞及星形胶质细胞内激活核转录因子-E2相关因子/血红素加氧酶(Nrf2/HO-1)信号通路保护神经 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 研究的不足之处 |
| 5.3 展望 |
| 综述（一） 脊髄损伤动物模型 |
| 参考文献 |
| 综述（二） 咪唑啉受体（IR）的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述（三） Nrf2通路研究概况 |
| 参考文献 |
| 英汉主要缩略词表 |
| 在读期间撰写论文及科研情况 |
| 致谢 |
（5）安胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠NF-κBp65、INOS、COX-2、TNF-α、IL-1β表达影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学文献研究 |
| 1.1 SAP概述 |
| 1.2 SAP病因 |
| 1.3 SAP发病机制 |
| 1.4 SAP诊断 |
| 1.5 SAP非手术治疗进展 |
| 2 传统医学文献研究 |
| 2.1 中医对AP的大体认识 |
| 2.2 SAP中医辨证论治 |
| 2.3 中医对SAP的治疗 |
| 第二部分 动物实验 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 造模前处理 |
| 2.3 造模 |
| 2.4 标本采集 |
| 2.5 HE染色及病理切片制作 |
| 2.6 指标检测 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 实验大鼠胰腺大体观察结果 |
| 3.2 胰腺组织病理结果 |
| 3.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β检测结果 |
| 3.4 各组大鼠胰腺组织NF-κBp65mRNA检测结果 |
| 3.5 各组大鼠胰腺组织NF-κBp65、iNOS、COX-2表达结果 |
| 3.6 相关性分析 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 白介素10与SAP |
| 2 NF-κB/TNF-α-IL-1β信号通路与SAP |
| 2.1 NF-κB与SAP |
| 2.2 TNF-α、IL-1β与SAP |
| 2.3 NF-κB、TNF-α、IL-1β与SAP |
| 3 NF-κB/iNOS-COX-2信号通路与SAP |
| 4 SAP炎症通路与微循环通路的关系 |
| 4.1 TNF-α、IL-1β均可诱导iNOS的表达 |
| 4.2 TNF-α、IL-1β均可诱导C0X-2 的表达 |
| 4.3 NF-κB、TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2与SAP |
| 4.4 实验小结 |
| 第四部分 结语 |
| 1 结论 |
| 2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 重症急性胰腺炎微循环障碍中西医发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（6）基于AMPK/mTOR/ULK1通路探讨自噬在缺血性脑损伤中的作用及丹酚酸B的神经保护机制（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 缺血性脑卒中概述 |
| 1.2 自噬概述 |
| 1.2.1 自噬的生理功能 |
| 1.2.2 自噬的分子机制 |
| 1.2.3 选择性自噬 |
| 1.3 自噬在缺血性脑卒中中的作用 |
| 1.3.1 神经元自噬与缺血性脑卒中 |
| 1.3.2 神经胶质细胞自噬与缺血性脑卒中 |
| 1.3.3 脑内皮细胞自噬与缺血性脑卒中 |
| 1.4 丹酚酸B对自噬的促进作用 |
| 1.5 丹酚酸B在缺血性脑损伤中的作用 |
| 1.6 展望 |
| 第2章 脑缺血损伤体内、体外模型的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠大脑皮层星形胶质细胞培养体系的建立 |
| 2.3.2 小鼠大脑皮层星形胶质细胞纯度鉴定 |
| 2.3.3 小鼠大脑皮层星形胶质细胞OGD模型的建立 |
| 2.3.4 小鼠星形胶质细胞OGD模型中SalB工作浓度的选择 |
| 2.3.5 小鼠MCAO模型的建立及MCAO模型中SalB给药浓度的选择 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 自噬在小鼠缺血性脑损伤模型中的神经保护作用及SalB对其促进作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 OGD后星形胶质细胞中自噬标志物水平的上调及SalB对其促进作用 |
| 3.3.2 OGD后星形胶质细胞自噬流的增强及SalB对其促进作用 |
| 3.3.3 自噬提高OGD后星形胶质细胞的存活率及SalB对其促进作用 |
| 3.3.4 自噬降低OGD后星形胶质细胞的凋亡比率及SalB对其促进作用 |
| 3.3.5 自噬调节OGD后星形胶质细胞炎性细胞因子的释放及SalB对其调控作用 |
| 3.3.6 自噬对MCAO小鼠脑梗死体积的影响及SalB的神经保护作用 |
| 3.3.7 自噬对MCAO小鼠神经功能学评分的影响及SalB的神经保护作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 AMPK/mTOR/ULK1通路对OGD后小鼠星形胶质细胞中自噬的调控及SalB对其促进作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 OGD后星形胶质细胞自噬的增强与AMPK/mTOR/ULK信号通路的激活有关 |
| 4.3.2 SalB通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强OGD后星形胶质细胞自噬 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 小鼠星形胶质细胞糖氧剥夺后pS757-ULK1的降解机制及SalB对pS757-ULK1的调控作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 OGD后星形胶质细胞中pS757-ULK1通过自噬降解及SalB对其降解的促进作用 |
| 5.3.2 OGD后星形胶质细胞中pS757-ULK1降解与选择性自噬的关系及SalB对其调控作用 |
| 5.3.3 免疫共沉淀法探究SalB对OGD后小鼠星形胶质细胞中pS757-ULK1与选择性自噬受体连接的影响 |
| 5.3.4 免疫荧光法探究SalB对OGD后HeLa细胞中pS757-ULK1与选择性自噬受体连接的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）运输应激对山羊主要器官的应激损伤及热休克蛋白表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 综述 |
| 1 应激对动物机体的影响 |
| 1.1 应激与心脏 |
| 1.2 应激与肝脏 |
| 1.3 应激与肾脏 |
| 1.4 应激与呼吸系统 |
| 1.5 应激与免疫器官 |
| 1.6 应激与肠道 |
| 1.7 运输应激对动物生理、内分泌指标及肉质的影响 |
| 2 热休克蛋白与动物器官保护 |
| 2.1 热休克蛋白与心脏 |
| 2.2 热休克蛋白与肝脏 |
| 2.3 热休克蛋白与肾脏 |
| 2.4 热休克蛋白与肺脏 |
| 2.5 热休克蛋白与免疫器官 |
| 2.6 热休克蛋白与肠道 |
| 第二章 运输应激对山羊心脏的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要化学试剂 |
| 1.3 实验方案与设计 |
| 1.4 石蜡包埋及HE染色 |
| 1.5 透射电镜技术 |
| 1.6 实时定量PCR |
| 1.7 免疫组织化学 |
| 1.8 Western blot |
| 1.9 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊心脏的显微病理学观察 |
| 2.2 山羊心脏的超微病理学观察 |
| 2.3 山羊心脏三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.4 山羊心脏三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 第三章 运输应激对山羊肝脏的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊肝脏的显微病理学观察 |
| 2.2 山羊肝脏的超微病理学观察 |
| 2.3 山羊肝脏三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.4 山羊肝脏三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 第四章 运输应激对山羊肾脏的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊肾脏的病理学观察 |
| 2.2 山羊肾脏三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.3 山羊肾脏三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 第五章 运输应激对山羊肺脏、气管和支气管的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊气管的病理学观察 |
| 2.2 山羊支气管的病理学观察 |
| 2.3 山羊肺脏的病理学观察 |
| 2.4 山羊气管和支气管三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.5 山羊肺脏三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.6 山羊气管、支气管和肺脏三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 第六章 运输应激对山羊免疫器官的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊淋巴结和脾脏的病理学观察 |
| 2.2 山羊淋巴结和脾脏三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.3 山羊淋巴结和脾脏三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 第七章 运输应激对山羊小肠的病理损伤及HSP27、HSP70和HSP90 表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 山羊小肠的显微病理学观察 |
| 2.2 山羊小肠的超微病理学观察 |
| 2.3 山羊小肠三种热休克蛋白的分布与表达情况 |
| 2.4 山羊小肠三种热休克蛋白的定量表达情况 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（8）LOC339524和UQCRC1介导心/脑保护的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 LOC339524对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 LOC339524抑制脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应的机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 UQCRC1在药物预处理大鼠心肌保护中的作用研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞色素C还原酶核心蛋白1(Ubiquinol-cytochrome-creductasecomplexcore protein1,Uqcrc1)的功能及其参与疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间撰写论文情况 |
| 致谢 |
（9）一氧化碳释放分子-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化的抑制作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 一氧化碳释放分子-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化的抑制作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 一氧化碳释放分子-3抑制小鼠RAW264.7细胞破骨分化作用机制的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 一氧化碳释放分子-3对实验性牙周炎小鼠牙槽骨破骨细胞分化成熟及牙槽骨吸收的抑制作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 伦理声明 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（10）邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应的防治反作应用反及应其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献回顾 |
| 第一节 PM2.5与雾霾 |
| 一、PM2.5 |
| 1 PM2.5定义 |
| 2 PM2.5来源和组成 |
| 3 PM2.5时空分布特征 |
| 4 PM2.5对人体健康的影响 |
| 5 PM2.5对呼吸系统的影响 |
| 二、雾霾 |
| 1 古籍对雾霾的记载 |
| 2 古籍对雾霾致病的认识 |
| 3 雾霾的发病及致病特征 |
| 4 雾霾病的辨证论治 |
| 5 雾霾与肺脏疾病 |
| 第二节 PM2.5诱导肺损伤 |
| 一、PM2.5诱导肺损伤的现代医学研究 |
| 1 病理机制 |
| 2 治疗进展 |
| 3 展望 |
| 二、中医药防治雾霾性肺损伤的研究概况 |
| 1 诊断依据 |
| 2 病因病机 |
| 3 治疗进展 |
| 4 展望 |
| 第三节 NF-κB信号通路 |
| 1 NF-κB的概述 |
| 2 NF-κB上游信号转导途径 |
| 3 TLR4/NF-κB信号通路 |
| 4 NF-κB与肺损伤 |
| 5 以NF-κB为靶点的药物治疗 |
| 第四节 邓铁涛教授治疗雾霾性肺损伤经验总结 |
| 1 邓老对雾霾致病特点的探究 |
| 2 邓老对雾霾性肺损伤的诊疗 |
| 3 总结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一节 PM2.5诱导肺损伤大鼠模型的优化建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 PM2.5混悬液制备 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 动物处理方式及模型制备 |
| 2.3 标本取材与检测指标 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般情况 |
| 3.2 肺组织病理学观察及病理评分 |
| 3.3 肺组织干湿重比值 |
| 3.4 肺通透指数 |
| 3.5 氧合指数 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二节 邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应的防治作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 PM2.5混悬液制备 |
| 1.6 药物制备 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 动物处理方式 |
| 2.3 动物模型制备 |
| 2.4 标本取材与检测指标 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般情况 |
| 3.2 肺组织形态、病理学观察 |
| 3.3 肺泡灌洗液中炎症细胞种类及数量 |
| 3.4 肺组织炎症标志物的表达 |
| 3.5 氧合指数 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三节 邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应的作用机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 1.6 含药血清制备 |
| 1.7 中药药液和PM2.5混悬液制备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 实验分组及处理 |
| 2.3 标本取材与检测指标 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同浓度PM2.5对NR8383细胞存活率的影响 |
| 3.2 各组对TLR4/NF-κB信号通路中相关蛋白表达的影响 |
| 3.3 各组对NF-κB入核、与DNA结合的影响 |
| 3.4 PM2.5对NF-κB转录活性的影响 |
| 3.5 各组对NF-κB转录后激活炎症介质的影响 |
| 3.6 各组对NF-κB转录后促进炎性因子释放的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
四、Inducible heat shock protein 70 kD and inducible nitric oxide synthase in hemorrhage/resuscitation-induced injury（论文参考文献）
- [1]臂旁核在束缚-浸水应激大鼠中的作用[D]. 李慧敏. 山东师范大学, 2021(12)
- [2]Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究[D]. 段晨阳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [3]姜黄素对脊髓损伤小鼠的抗抑郁和神经保护作用的机制研究[D]. 耿志华. 郑州大学, 2020(02)
- [4]2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉在急性脊髓损伤大鼠模型中的神经保护作用及其机制研究[D]. 林小龙. 苏州大学, 2020(06)
- [5]安胰颗粒对重症急性胰腺炎大鼠NF-κBp65、INOS、COX-2、TNF-α、IL-1β表达影响的实验研究[D]. 文玲. 广西中医药大学, 2020(02)
- [6]基于AMPK/mTOR/ULK1通路探讨自噬在缺血性脑损伤中的作用及丹酚酸B的神经保护机制[D]. 辛美萤. 吉林大学, 2020(08)
- [7]运输应激对山羊主要器官的应激损伤及热休克蛋白表达的影响[D]. 郑文亚. 甘肃农业大学, 2019
- [8]LOC339524和UQCRC1介导心/脑保护的作用和机制研究[D]. 龙宗泓. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019
- [9]一氧化碳释放分子-3对小鼠RAW264.7细胞破骨分化的抑制作用及其机制的研究[D]. 潘燕. 山东大学, 2019(02)
- [10]邓氏清霾汤对PM2.5诱导肺损伤炎症反应的防治反作应用反及应其机制研究[D]. 周游. 广州中医药大学, 2019