一、豚鼠内耳前庭上皮发育过程IGF-1及ERK的表达及其意义(论文文献综述)
吴艾欣,叶瑞琴,温露,陈钢[1](2020)在《防治内耳疾病药物的研究进展》文中研究说明内耳疾病包括听力损失、耳鸣和外周前庭功能障碍,主要是由毛细胞或螺旋神经节神经元损伤引起,严重影响人体听觉与平衡功能。目前的临床药物可以缓解症状,但不能完全治愈内耳疾病,因此亟需寻找有效的防治药物。大多数在研药物的主要作用机制为毛细胞保护、毛细胞再生及螺旋神经节神经元及其突触保护等,针对不同的作用机制,药物可以与相对应的酶类、受体或者离子通道等作用,发挥不同的药理效应。本文在此基础上就相关靶点和药物进行详细梳理和分析,以期为防治内耳疾病药物的进一步研发提供参考。
周晓丹[2](2019)在《补肾通窍方对肾阴虚大鼠耳蜗组织ERK1/2表达的影响的实验研究》文中研究指明目的以MAPK信号通路中的关键因子ERK1/2作为核心指标,研究肾阴虚后及补肾方药干预后大鼠肾脏和耳蜗的功能及形态变化,探讨肾与耳的相互关系,从微观生物学角度阐释二者之间联系的部分分子机制,为祖国医学肾主耳理论的现代诠释提供实验依据,为中西医结合治疗内耳疾病提供新思路;同时丰富中医藏窍理论,为藏象学说的理论发展提供现代科学依据。方法将耳廓反射灵敏、ABR阈值正常的SD大鼠(60只),按照随机数字表法分为3组(空白组、模型组、中药组各20只),中药组及模型组采用肌肉注射醋酸氢化可的松注射液(25 mg·kg-1·d-1)连续7天的方法制造肾阴虚大鼠模型,空白组注射生理盐水(5 mL·kg-1·d-1);造模成功后,中药组给予补肾通窍方灌胃(10mL·kg-1·d-1),连续给药7天,空白组和模型组灌胃等量生理盐水。观察并记录三组大鼠一般情况。给药结束后各组大鼠以ABR方法行听功能检测,测量大鼠血浆cAMP和cGMP含量,光镜下观察大鼠肾脏、耳蜗组织形态学改变,并采用RT-PCR法检测大鼠耳蜗组织ERK1/2 mRNA的表达。结果(1)大鼠肾阴虚指标评价上,与空白组比照,模型组及中药组大鼠均出现了躁动,易惊,大便干结,进食减少,饮水增多,尿量减少,体重减轻等一系列表现,血浆cAMP/cGMP值上升(P<0.01),提示肾阴虚模型造模成功。但与模型组大鼠相比,中药组大鼠一般状态相对较好,血浆cAMP/cGMP值明显降低(P<0.01)。(2)ABR阈值比较:模型组、中药组大鼠ABR阈值较空白组显着升高(P<0.01),三组中模型组大鼠ABR阈值最高。(3)肾脏、耳蜗组织形态上,与空白组比较,模型组、中药组大鼠肾脏出现不同程度的肾小球、肾间质纤维化,肾小管扩张,脂肪变等病理性改变;耳蜗组织均出现毛细胞数量减少,排列不规则,螺旋神经节数量减少等情况。但中药组大鼠肾脏、耳蜗组织形态相对模型组整体较好。(4)耳蜗组织ERK1/2表达上:与空白组比较,模型组、中药组大鼠耳蜗组织ERK1/2mRNA的表达降低(P<0.05),而与模型组相比,中药组大鼠ERK1/2mRNA的表达相对较高(P<0.05)。结论肾阴虚后可导致肾脏和耳蜗病理性改变,引发听功能障碍,补肾通窍方对肾阴虚大鼠听功能有明显改善作用。其分子生物学机制可能是肾阴虚后通过MAPK信号通路中的关键因子ERK1/2表达的下调引起听觉信号的转导发生障碍,导致耳蜗内组织细胞的凋亡,最终引发听功能障碍甚至耳聋,ERK1/2信号通路是肾主耳的微观联系通路之一;根据中医阴虚血瘀的病理基础,创立的补肾通窍方可通过上调ERK1/2信号的表达,抑制细胞凋亡,有效发挥干预作用。
张红佳[3](2016)在《快速老化小鼠听功能、耳蜗组织中p-ERK1/2、p-ERK5增龄性变化及体外培养HUVEC-C的实验研究》文中研究说明目的:探讨听觉功能、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinases,p-ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶5(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK5)在快速老化小鼠耳蜗组织中表达的增龄性变化及在抑制剂BIX02188作用下,人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)中p-ERK5的表达情况,为阐明老年性聋的发病分子机制及为其治疗提供一些理论基础和依据。方法:选取研究对象快速老化小鼠亚系8(SAMP8),分3、5、7月龄组,各6只,运用8 kHz短纯音听性脑干反应检测其阈值,并用免疫组化染色方法检测p-ERK1/2、p-ERK5在耳蜗组织中的表达,同时分析其増龄性变化。在BIX02188(终末浓度为2、5、10、15、20μm)的作用下,体外培养人脐静脉内皮细胞24小时后,用MTT比色试验及细胞凋亡试验(Hoechst33258)分别检测细胞的存活率及凋亡率并通过免疫荧光技术检测p-ERK5蛋白的表达情况。结果:听功能改变:SAMP8小鼠双耳听性脑干反应阈值与月龄呈正相关,随着月龄增加显着升高(P<0.05);不同月龄SAMP8小鼠耳蜗组织中p-ERK1/2、p-ERK5的表达:p-ERK1/2在螺旋神经节细胞、内外毛细胞及血管纹中均有表达,随着月龄增加而其光密度值明显降低(P<0.05),p-ERK5在血管纹也有表达,随着月龄增加而其光密度值明显降低(P<0.05);p-ERK5在HUVEC-C的细胞核和胞浆中均有表达,随着BIX02188处理浓度的增高,其对细胞的抑制作用逐渐增强(P<0.05),细胞凋亡比例呈剂量依赖性增高(P<0.05),HUVEC-C细胞核中p-ERK5的阳性信号呈逐渐减弱趋势(P<0.05)。结论:快速老化小鼠耳蜗组织中p-ERK1/2、p-ERK5蛋白的表达水平随着听觉功能年龄相关性减退而降低,说明p-ERK1/2、p-ERK5可能参与了耳蜗的功能状态和听觉形成;BIX02188可以有效阻断ERK5的磷酸化并可抑制HUVEC-C细胞的增殖,说明p-ERK5可能与血管内皮细胞的功能状态相关,为分离出豚鼠耳蜗血管内皮细胞作为血迷路屏障模型提供了实验的基础。
郑丹丹[4](2015)在《表达三种活化型生长因子细胞系的建立及其内耳诱导分化作用的实验研究》文中研究指明背景:感音神经性耳聋是一种常见的感觉障碍性疾病,其中先天性重度感音神经性耳聋的发生率约为千分之一,严重困扰着人类的健康、生活与交流。但是,现有的治疗手段却很有限,主要是助听器和电子耳蜗植入。助听器对于中度的耳聋有一定效果,但实际上只有五分之一的人才能从中获益。对于重度感音神经性聋,主要依靠电子耳蜗植入,通过插入耳蜗鼓阶内的电极直接刺激听神经来重建聋人的听觉功能,全世界已有超过300000患者因此获益。但它是一种侵入性的手术治疗,在噪声环境下的言语识别率还有待进一步提高。助听器和电子耳蜗只能作为补偿手段改善患者听力,不能从根本上重建受损的听觉生理功能,逆转患者的听力水平。近年来生物治疗方法在内耳细胞保护、修复和再生方面展现出了巨大的潜能,主要有干细胞移植、基因治疗以及生长因子治疗等。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是骨髓中除了造血干细胞以外的另一类具有多系分化潜能、强大自我复制能力和可移植性的成体干细胞。在适宜的微环境下,MSCs可以定向诱导分化为多种组织和细胞类型,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,还可跨胚层分化为神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、肝细胞等。由于MSCs来源广泛、容易分离培养、免疫原性低等特点,被广泛应用于细胞移植及基因治疗中。生长因子是一种促进特定细胞生长的细胞因子,能和细胞膜表面的特异性受体结合从而激活细胞内信号通路发挥作用,它们对多种器官的不同类型细胞的存活、增殖、分化都有调控作用。在内耳发育成熟过程中可检测到胰岛素样生长因子1(Insulin-like Growth Factor1, IGF1)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)和成纤维细胞生长因子2(Fibroblast Growth Factor2, FGF2)三种生长因子及其受体的表达,这些生长因子可保护内耳毛细胞免受损害并促进内耳毛细胞的增殖分化。在感音神经性耳聋生物治疗中,诱导干细胞向内耳毛细胞样细胞分化的研究常采用干细胞与一些特定组织细胞共培养以及添加外源性生长因子的方法。为了将两种方法结合用于研究,本文设计了一种可同时表达三种活化型生长因子的慢病毒载体并用于构建稳定转染的细胞,试图为干细胞移植结合生长因子治疗感音神经性耳聋提供基础。1、建立表达三种活化型生长因子的细胞系活化型EGF编码序列采用RT-PCR方法从SW620人大肠癌细胞中克隆,活化型IGF1和FGF2编码序列为人工合成。用PCR的方法分别从pSecTag2A和pIRES2-EGFP质粒中克隆出引导分泌的免疫球蛋白Igκ链信号肽编码序列和引导翻译的内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site, IRES)序列。将Igκ链信号肽和三种因子的编码序列分别融合、由IRES间隔并克隆到带绿荧光蛋白报告基因的慢病毒表达质粒pLVX-IRES-ZsGreenl上并包装获得慢病毒。将慢病毒感染HEK293T细胞,通过有限稀释法筛选出稳定表达绿荧光蛋白的单细胞克隆,命名为HEK293T/3GF.用Western blot检测单细胞克隆的IGF1、EGF和FGF2的表达,并通过促进肺癌A549细胞生长实验验证分泌的生长因子的活性。2、共培养诱导骨髓间充质干细胞向内耳毛细胞样细胞分化利用构建成功的可同时表达三种活化型生长因子的HEK293T/3GF细胞与MSCs进行共培养,探索其在内耳诱导分化中的作用。采用全骨髓贴壁筛选法分离提取大鼠MSCs,体外培养纯化扩增到第四代后,与表达活化型生长因子的HEK293T/3GF细胞及未转染的HEK293T细胞进行共培养,并添加维甲酸(Retinoic Acid, RA),共培养21天后,显微镜下观察MSCs;形态变化,RT-PCR;检测毛细胞相关标记表达情况。HEK293T/3GF与MSCs共培养组与对照组相比,显微镜下可观察到细胞形态向神经细胞样改变,而且RT-PCR结果显示,HEK293T/3GF与MSCs共培养后MSCs表达毛细胞相关标记,说明HEK293T/3GF与MSCs共培养可以诱导MSCs向内耳毛细胞样细胞分化。结论:本课题成功构建了可同时表达活化型IGF1、EGF和FGF2的慢病毒载体,并获得稳定表达三种因子的HEK293T/3GF细胞,该细胞与MSCs共培养显示出诱导分化作用,为进一步的内耳细胞治疗提供了新的方法。
邢奋丽,唐辉,邓毅,曹克利[5](2014)在《顺铂导致螺旋神经节细胞凋亡中pp38MAPK和pERK信号蛋白的作用》文中研究说明目的初步探讨丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated proteins kinase,MAPK)信号转导通路中磷酸化p38MAPK蛋白(pp38MAPK)和磷酸化ERK蛋白(pERK)在顺铂耳毒性中的作用。方法选取20只健康豚鼠随机分为两组,每组10只,实验组腹腔注射顺铂4mg·kg-1·d-1,连续4天,对照组腹腔注射等量生理盐水。最后一次给药后24小时内处死动物、取材,HE染色后光镜下观察内耳螺旋神经节细胞形态学变化;透射电镜下观察螺旋神经节细胞的凋亡情况;免疫组化染色法观察螺旋神经节细胞pp38MAPK和pERK蛋白的表达。结果实验组豚鼠螺旋神经节细胞数目减少、体积减小,排列散乱,出现凋亡改变,而对照组螺旋神经节细胞无明显凋亡改变。pp38MAPK主要分布在螺旋神经节细胞胞浆,对照组表达较弱(平均光密度值为0.12±0.04),实验组表达增强(平均光密度值为0.24±0.07),两组差异有统计学意义(t=4.581,P<0.05)。pERK在螺旋神经节细胞的胞浆有表达,对照组的平均光密度值为0.27±0.08,实验组的平均光密度值为0.25±0.08,两组差异无统计学意义(t=-0.673,P>0.05)。结论 pp38MAPK可能参与了顺铂导致豚鼠螺旋神经节细胞的凋亡。
管利娜[6](2013)在《小鼠诱导性多潜能干细胞向内耳毛细胞和螺旋神经元诱导分化的体外实验研究》文中研究说明研究背景:感音神经性耳聋是耳鼻咽喉科常见疾病,研究证实其病理变化主要是耳蜗毛细胞及与其相连的螺旋神经元的缺失。同时也有研究显示哺乳动物耳蜗毛细胞及螺旋神经元受损后再生十分困难。如果能够找到某种方法修复缺失的毛细胞或螺旋神经节细胞,就有希望治愈感音神经性耳聋。2006年,日本科学家Shinya Yamanaka等通过导入Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4四个外源基因将小鼠体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPSCs)。多项研究证实,iPSCs具有与胚胎干细胞(ESCs)类似的分化能力,却可以避免ESCs的免疫排斥及伦理道德问题,因此我们将iPSCs在体外诱导分化为耳蜗毛细胞及螺旋神经元,为感音神经性耳聋的治疗的开辟新的道路。研究内容和方法:1.iPSCs的培养与鉴定:取小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层,iPSCs接种于饲养层上胰酶消化传代,倒置显微镜下观察iPSCs生长状态,观察拟胚体(EB)形成能力,RT-PCR检测iPSCs多能性基因Oct4, Nanog, Sox2的表达情况。2. iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养及其分化细胞的鉴定:分离小鼠耳蜗Corti氏器,将iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养。对分化细胞用毛细胞的标志物(MyosinVIIA,Math1,Calretinin,Espin)进行免疫组化鉴定。3.iPSCs与耳蜗蜗轴共培养及其分化细胞的鉴定:分离小鼠耳蜗蜗轴,将iPSCs与耳蜗蜗轴共培养,对分化细胞用神经元的标志物(Nestin、Neurofilament-M、β-Ⅲ Tubulin,Vesicular glutamate transporter1(VGluT1))进行免疫组化鉴定。结果:1.成功建立稳定的iPSCs培养体系,iPSCs体外培养可形成EB。 RT-PCR显示iPSCs表达多能性基因Oct4, Nanog, Sox2。2.iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养18天后可得到表达毛细胞标志蛋白MyosinVIIA,Math1,Calretinin,Espin的细胞。3.iPSCs与耳蜗蜗轴共培养18天后可得到表达神经元标志蛋白Nestin、Neurofilament-M、β-Ⅲ Tubulin,VGluT1的细胞。结论:本实验成功建立稳定的小鼠iPSCs培养体系;共培养方法可成功将iPSCs诱导分化为耳蜗毛细胞样及螺旋神经元样细胞。
任丽丽[7](2013)在《白化荣昌猪耳聋的分子病理机制研究》文中研究表明小眼畸形相关转录因子(Mitf)是由Mitf基因编码的一个拥有碱性螺旋-环-螺旋拉链(basic helix-loop-helix zipper,bHLH-Zip)结构的转录因子[1]。Mitf调控着许多细胞的分化,如黑色素细胞,视杯来源的视网膜色素上皮细胞(RPE)以及许多类型的骨髓来源的细胞[2]。根据氨基末端的不同,Mitf包含至少5种基因亚型,每种亚型的启动子以及起始外显子都不同,并且表达在不同的组织中,而Mitf-M特异性表达在黑色素细胞和黑色素瘤细胞中[3-7]。人类的Waardenburg综合征是一种以听觉-色素异常为特点的常染色体显性遗传疾病,占先天性耳聋的2%[8]。按临床特征和遗传标准共分为四种亚型。其中Waardenburg综合征2A型及其严重类型Tietz综合征是由MITF-M基因突变引起的,表现为感音神经性耳聋、虹膜异色和白色额发[9]。尽管大量研究已经证明Mitf-M基因突变将导致神经嵴来源的黑色素细胞缺失,最终产生耳聋等症状,但是Mitf基因对听觉系统的作用及其分子病理机制至今未明[10]。因此,仔细研究此亚型Mitf基因的结构和功能对于耳聋的基因诊断和分子病理机制研究是很重要的。本研究通过建立正常荣昌猪内耳解剖、手术方式以及形态、听功能数据库,发现猪的内耳和人类及其他动物相比在功能和形态上既具有相似性又存在差异,为下一步研究白化耳聋荣昌猪奠定了基础;通过对白化耳聋荣昌猪进行家系构建和基因分析,确定精确的致病基因为Mitf-M基因,使得此耳聋动物家系遗传背景清楚,可以作为耳聋疾病的大型哺乳动物模型应用于耳科领域的研究;利用从胚胎到出生后不同发育阶段的自发突变型白化荣昌猪(Mitf-/-)和正常野生型荣昌猪(Mitf+/+)内耳形态学和听功能的比较分析,发现白化荣昌猪的耳聋是由Mitf-M基因突变导致内耳血管纹病理变化引起的,最终引发血管纹中间细胞消失,内耳钾离子浓度和耳蜗内电位的变化,导致ABR异常,听功能丧失,阐述了Mitf-M基因突变引发耳聋的病理机制。使我们进一步明确了胚胎发育过程中Mitf-M对血管纹和黑色素细胞发生作用的关键时间点和变化规律。这可能也是人类Waardenburg综合征2A型及Tietz综合征所致耳聋症状的原因。为研究人类Waardenburg综合征2A型感音神经性耳聋的早期基因干预治疗、人工听力重建、毛细胞再生等提供了重要的基础数据,为人类Waardenburg综合征2A型耳聋的研究提供了理想的大型哺乳动物模型。本研究的重要发现及其意义:1.首次报道了正常荣昌猪内耳超微结构;2.首次发现了白化荣昌猪的耳聋表型与人类Waardenburg综合征2A型Mitf-M基因突变导致的耳聋表型一致;3.首次报道了Mitf-M基因突变与白化荣昌猪内耳血管纹病理变化的关系;4.揭示了Waardenburg综合征2A型发病的分子病理机制。
舒易来[8](2012)在《腺相关及腺病毒内耳基因转染和Rb敲除结合ISL1表达诱导小鼠毛细胞与支持细胞增殖》文中指出低等脊椎动物如鸟类、鱼类的内耳毛细胞损伤后能够终生再生,而哺乳动物耳蜗毛细胞无自发性再生能力,因此毛细胞丢失所导致的感音神经性耳聋目前仍是临床治疗中的一大难题。另外一方面,上百种基因突变引起的遗传性耳聋目前没有治疗方法。因此,研究毛细胞再生以及内耳基因导入方法的发展成为重获听觉的焦点。分子生物学研究的发展为毛细胞再生带来了希望,内耳的基因治疗和外源性基因的导入,为耳聋的治疗带来了新的手段。腺病毒及腺相关病毒是内耳基因治疗常见的载体。为了验证合适的基因治疗的载体,我们使用新近发展的纳升级显微操作导入系统,大范围的在体研究了12种不同血清型的AAV作为基因载体导入的可行性,我们发现在新生鼠和成年鼠中,不同血清型的AAV可以转染不同的内耳感觉上皮细胞,包括支持细胞和毛细胞。我们还发现在新生鼠(P1/P2)给予内耳注射AAV可以持续表达较长时间,而对听力的影响很小(0-15dB)。这种方法可以用来作为早期内耳发育过程中基因功能缺失所致的遗传性耳聋的基因治疗手段。在胚胎期的内耳毛细胞及支持细胞的前体细胞中选择性敲除Rbl可产生数量远超出正常情况的前体细胞,这些细胞可进一步分化成毛细胞和支持细胞。但Rb1敲除后诱导毛细胞和支持细胞增殖是年龄相关性的,其具体引起增殖的时间截点如何?即Rbl敲除对不同年龄段内耳感觉上皮细胞重新进入细胞周期的功能如何?是否可以结合其他内耳前体细胞基因可以让更成熟甚至成年的哺乳动物毛细胞、支持细胞增殖?本研究拟行5型腺病毒经中阶路径注射转染新生和成年小鼠耳蜗毛细胞和支持细胞的评价;以Er-Cre Rb loxp/loxp系统结合腺病毒为载体携带Cre来敲除Rbl并过表达内耳前体细胞基因ISL1诱导新生及成年小鼠耳蜗毛细胞与支持细胞的增殖的研究。第一部分:5型腺病毒经中阶路径注射转染新生和成年小鼠耳蜗毛细胞和支持细胞的评价[目的]为了研究5型腺病毒携带目的基因经新生和成年小鼠中阶入路导入转染内耳细胞的可行性,为以小鼠为动物模型的内耳基因治疗提供实验基础和解剖学依据.[方法]采用纳升级显微操作系统,经中阶显微注射携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein EGFP)基因的5型重组腺病毒或人工内淋巴液于各年龄段的小鼠耳蜗(p1,p4,p7,p12,p21,1-2M),内耳注射4天后取双侧耳蜗标本做基底膜铺片,观察EGFP表达情况。[结果]p1、P4、P7组:术后第4天见耳蜗底圈、中圈支持细胞表达GFP。p12、p21、1-2M组:术后第4天可见耳蜗底圈、中圈支持细胞及部分内毛细胞表达EGFP。在人工内淋巴液和未注射耳,未见EGFP表达。[结论]采用经中阶入路显微注射5型腺病毒携带目的基因导入新生鼠及成年鼠能够将目的基因成功转染至耳蜗组织并表达。第二部分:12种腺相关病毒经中阶路径注射转染新生和成年小鼠耳蜗毛细胞和支持细胞的比较[目的]为了比较12种腺相关病毒携带目的基因经新生和成年小鼠中阶入路导入内耳的可行性,寻找新的更安全的载体,为以小鼠为动物模型的内耳基因治疗提供实验基础和解剖学依据。[方法]采用经中阶显微注射12种腺相关病毒((AAV1、2、5、6、6.2、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43))携带目的基因导入,将携带EGFP的腺相关病毒或人工内淋巴液导入小鼠耳蜗。其中新生鼠为p1/p2CD1小鼠,成年鼠为CBA/CAJ。新生鼠在内耳注射后1周、2周、3月,成年鼠在1周及3月后分别取双侧耳蜗标本做基底膜铺片及冰冻切片,观察EGFP表达情况。部分新生鼠组在术后3周行ABR检测。[结果]新生鼠组:术后第1周、2周、3月可见支持细胞、毛细胞、螺旋韧带、螺旋神经节、前庭感觉细胞表达EGFP,GFP在术后1周表达较弱。术后ABR示听力约有0-15dB下降。其中AAV1和AAV2对支持细胞和毛细胞的感染效率相对较高。成年鼠组:术后1周、3月可见支持细胞、毛细胞、螺旋韧带、螺旋神经节、前庭感觉细胞表达EGFP。其中AAV1、AAV8和AAV9对支持细胞和毛细胞的感染效率相对较高。[结论]采用经中阶显微注射腺相关病毒携带目的基因导入新生鼠及成年鼠能够将目的基因成功转染至耳蜗组织并表达,其中新生鼠组只有轻微的听力下降。新生鼠组可选择AAV1和AAV2作为载体,成年鼠组可选择AAV1、AAV8和AAV9。第三部分:敲除Rbl并过表达ISLl诱导小鼠耳蜗毛细胞与支持细胞增殖的体内研究[目的]在体敲除Rbl并过表达ISL1诱导小鼠耳蜗毛细胞与支持细胞增殖的研究。[方法]采用Er-Cre Rb loxp/loxp转基因鼠,体内模型中敲除Rbl基因,研究其对耳蜗毛细胞及支持细胞增殖的促进作用。以Er-Cre Rb loxp/loxp转基因鼠与ISL1转基因鼠杂交,获得Er-Cre Rb loxp/loxp ISL1或Rb loxp/loxp ISL1转基因鼠,在体敲除Rbl并过表达ISL-1,研究其对P1、P4、P5、P7、P12及P21耳蜗毛细胞及支持细胞增殖的促进作用。[结果]在出生后的耳蜗毛细胞中特异性敲除Rbl基因,可见毛细胞和支持细胞在P4前能重新进入细胞周期,P5、P7、P12及P21未见毛细胞和支持细胞增殖。ISL1过表达在新生鼠和成年鼠中均未见毛细胞和支持细胞增殖,Rb1敲除联合ISL1过表达,也未见P4之后的毛细胞和支持细胞增殖。[结论]Rb1基因敲除诱导耳蜗毛细胞和支持细胞增殖呈年龄相关性,Rb1敲除联合ISL1过表达也未能使得P4之后的毛细胞和支持细胞增殖。
王乐[9](2012)在《hESC和hiPSC体外定向诱导分化的实验研究》文中研究说明目的研究体外诱导人胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)和人工诱导的人多能干细胞(Inducible pluripotent stem cells,iPSC)分化为内耳毛细胞及神经细胞祖细胞的方案,并探讨体外诱导分化各个阶段相关基因的表达情况及其意义。材料和方法应用含有抑制剂(DKK1, A8301,DMH)和细胞因子(胰岛素样生长因-1,碱性成纤维细胞生长因子)的培养基,使胚胎干细胞和人工诱导的人多能干细胞先悬浮培养后贴壁培养,并对各个时间点的基因表达量进行实时定量PCR检测,培养第13天进行免疫荧光检测。结果悬浮培养人胚胎干细胞和诱导的多能干细胞第三天可形成类胚体,随着悬浮培养类胚体变得圆润饱满;贴壁培养并更换培养基,类胚体开始分化形成神经花环。多能性基因nanog和oct4表达量随时间的增长而降低;神经元祖细胞特异性基因pax6和nestin表达量分别在第8天和第10天达到最高后开始减低;毛细胞祖细胞特异性基因otx2,pax2和pax8分别在第4天,第10天和第10天达到最高后开始减低。实验组胚胎干细胞分化的祖细胞特异性基因otx2,nestin,pax6,pax2和pax8表达量与对照组相比有显着性差异(p<0.05);实验组人工诱导的多能干细胞分化的祖细胞特异性基因otx2,nestin,pax6,pax2和pax8表达量与对照组相比有显着性差异(p<0.05);胚胎干细胞和诱导的多能干细胞来源的祖细胞可特异性表达抗体PAX6,PAX2和NESTIN。结论1通过本实验确立了诱导人胚胎干细胞和诱导的多能干细胞有效分化为毛细胞和神经细胞的祖细胞的实验方案。2体外培养时WNT信号抑制剂DKK1,BMPH信号抑制剂DMH1,TGF-β信号抑制剂A8301和细胞因子IGF可以有效的促进人胚胎干细胞和诱导的人多能干细胞分化为毛细胞及神经细胞的祖细胞。3在体外诱导人胚胎干细胞和诱导的人多能干细胞分化为毛细胞及神经细胞的祖细胞的过程中特异性基因是相继表达的。
朱纲华[10](2007)在《FGF、BMP、WNT信号通道对乳鼠耳蜗神经发育及谷氨酸钠耳毒性作用的影响初步研究》文中研究说明第一章乳鼠耳蜗信号通道基因表达目的不同的信号通道(FGF、BMP、WNT等)和神经系统的功能有密切的关系。同时,FGF、BMP、WNT等对神经元的发育及存活及对神经元损伤后的修复起重要作用。目前对于信号通道在中枢神经功能方面的研究已取得重大进展,提示内耳可能存在类似机制。本部分先检测FGF、BMP、WNT相关基因在耳蜗的表达,为进一步研究提供支持。方法以出生一天(P1)的BALB/C乳鼠为研究对象,无菌条件下取出耳蜗,于低血清DMEM/F-12培养基体外培养(每组20个)。设计引物,运用Trizol一步法抽提组织总RNA,逆转录PCR检测,并以测序证实。结果本研究结果发现,在各实验组Nudt6、Bmp4、Wnt7a、six1、six4、fas、bcl-2、β-actin均在耳蜗有明显表达,其中Nudt6是首次发现在内耳有表达。结论本实验成功证实在乳鼠(P1)耳蜗部分信号通道及凋亡基因有表达,bFGF的反义调控基因-Nudt6在内耳表达,提示它们在内耳发育调控中具有一定意义。第二章信号通道与内耳神经发育初步研究目的在中枢神经系统,不同信号通道对于神经元的发育、分化起着重要作用。但是对内耳神经系统的作用还存在争议。我们在体外阻断耳蜗的BMP,WNT信号途径,观察其对耳蜗神经发育相关基因的影响及形态变化,为进一步理解这些基因的功能和下一步研究提供基础。方法在离体耳蜗(每组20个),以Noggin阻断BMP,以Wif-1阻断WNT信号通道,同时在培养基中添加bFGF蛋白。离体耳蜗经短程培养后,抽提RNA,并行定量逆转录PCR检测。耳蜗组织行TUNEL检测神经元凋亡情况。结果在试验组耳蜗出现Six1(3.3061±0.1454),Six4(6.6179±0.5069),bcl-2(3.8766±0.3112)基因表达增高,Nudt6(0.4672±0.0430)表达下调,但耳蜗螺旋神经节细胞凋亡无显着改变。结论阻断BMP、WNT途径并以bFGF处理后,在耳蜗诱导Six1,Six4,bcl-2产生,Nudt6表达水平下降,fas表达无明显改变,提示信号通道被改变后凋亡被抑制,表现出促进耳蜗螺旋神经元发育的趋势。第三章信号通道对谷氨酸钠耳毒性作用的影响初步研究目的谷氨酸钠是神经系统一种重要的调节因子,过量谷氨酸钠对内耳神经元有明显毒性作用,但是在这个过程中各个信号通道是否发挥作用,如何发挥作用有待研究。本研究将谷氨酸钠在体外作用于耳蜗,再阻断信号通道,以定量逆转录PCR、组织化学方法检测神经发育相关指标。方法以谷氨酸钠(200 uM)处理培养离体耳蜗组织,分别加入Noggin(5ug/ml),Wif-1(2ug/ml)及bFGF(10ng/ml)。抽提RNA并行定量PCR检测,耳蜗组织行TUNEL检测神经元凋亡。结果谷氨酸钠处理后fas表达(76.0933±7.2652)明显高于bcl-2(9.6117±1.5023),耳蜗螺旋神经节细胞凋亡增加,Nudt6(7.3138±0.3302)、six(six4 17.4846±0.6854,six1 6.8887±0.3675)基因表达增加。BMP、WNT阻断组与单纯谷氨酸钠处理后的结果类似。bFGF组耳蜗螺旋神经节细胞凋亡减少。结论谷氨酸钠在低浓度对耳蜗螺旋神经元有明显的耳毒性。阻断BMP、WNT途径加重这种损伤,bFGF可以保护耳蜗螺旋神经元,促进神经元发育。进一步从信号通道的角度证明谷氨酸钠在耳对神经元的毒性作用。
二、豚鼠内耳前庭上皮发育过程IGF-1及ERK的表达及其意义(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、豚鼠内耳前庭上皮发育过程IGF-1及ERK的表达及其意义(论文提纲范文)
(1)防治内耳疾病药物的研究进展(论文提纲范文)
1 内耳疾病发病机制 |
2 内耳疾病治疗靶点与药物 |
2.1 毛细胞保护 |
2.1.1谷氨酸受体 |
2.1.2离子电压门控通道 |
2.1.3丝裂原活化蛋白激酶 |
2.1.4 Src蛋白酪氨酸激酶 |
2.1.5组蛋白脱乙酰酶 |
2.1.6钙蛋白酶 |
2.1.7半胱天冬酶 |
2.1.8钙调神经磷酸酶 |
2.1.9 p53 |
2.1.10 NADPH氧化酶 |
2.1.11环氧合酶 |
2.1.12糖皮质激素受体 |
2.1.13多巴胺受体 |
2.1.14γ-氨基丁酸受体 |
2.1.15 5-羟色胺受体 |
2.1.16 NF-κB |
2.1.17 JAK-STAT6信号通路 |
2.1.18氧化应激 |
2.2 毛细胞再生 |
2.2.1 Notch信号通路 |
2.2.2 Wnt信号通路 |
2.3 螺旋神经节神经元及其突触的保护 |
3 结语与展望 |
(2)补肾通窍方对肾阴虚大鼠耳蜗组织ERK1/2表达的影响的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
主要符号表 |
前言 |
1 实验材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 主要实验试剂及设备 |
2 实验方法 |
2.1 实验分组 |
2.2 动物给药 |
2.3 指标采集 |
2.4 统计学分析 |
3 观察指标及意义 |
3.1 大鼠一般情况 |
3.2 ABR阈值测定 |
3.3 cAMP、cGMP测定 |
3.4 大鼠肾脏、耳蜗组织形态学观察 |
3.5 RT-PCR 方法检测大鼠耳蜗 ERK1/2 mRNA 含量 |
4 实验结果 |
4.1 大鼠的一般状态 |
4.2 大鼠体重 |
4.3 血浆cAMP、cGMP含量 |
4.4 大鼠 ABR 阈值 |
4.5 大鼠耳蜗、肾脏形态学特征 |
4.6 大鼠耳蜗 ERK1/2 mRNA 含量 |
5 讨论 |
5.1 肾与耳关系的中西医研究概况 |
5.2 肾阴虚造模方法的选择 |
5.3 阴虚血瘀的病机探讨 |
5.4 ERK信号通路与耳蜗细胞凋亡的关系研究 |
5.5 补肾通窍方立方探究 |
6 结论 |
问题与展望 |
参考文献 |
附录 |
综述 肾与耳关系的现代医学研究综述 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
(3)快速老化小鼠听功能、耳蜗组织中p-ERK1/2、p-ERK5增龄性变化及体外培养HUVEC-C的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
英汉缩略词表 |
前言 |
1 材料与方法(组织) |
1.1 实验材料与仪器 |
1.2 实验试剂 |
1.3 实验方法 |
2 材料与方法(细胞) |
2.1 实验材料与仪器 |
2.2 主要试剂的配制 |
2.3 药物配制 |
2.4 实验方法 |
3 结果 |
3.1 各组SAMP8 小鼠听性脑干反应(ABR)阈值 |
3.2 p-ERK1/2、p-ERK5 在各月龄小鼠耳蜗组织中的表达 |
3.2.1 各月龄小鼠耳蜗螺旋神经节细胞中p-ERK1/2 的表达 |
3.2.2 各月龄小鼠耳蜗毛细胞中p-ERK1/2 的表达 |
3.2.3 各月龄小鼠耳蜗血管纹中p-ERK1/2 的表达 |
3.2.4 各月龄小鼠耳蜗血管纹中p-ERK5 的表达 |
3.3 p-ERK5在HUVEC-C中的表达 |
3.3.1 BIX02188对HUVEC-C细胞增殖的影响(MTT实验) |
3.3.2 BIX02188对HUVEC-C细胞凋亡的影响(Hoechst33258 染色).. |
3.3.3 不同处理因素下HUVEC-C中 p-ERK5 的分布情况(免疫荧光技术) |
4 讨论 |
5 结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
攻读学位期间发表的学术论文目录 |
致谢 |
(4)表达三种活化型生长因子细胞系的建立及其内耳诱导分化作用的实验研究(论文提纲范文)
致谢 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
英文缩写词表 |
目录 |
1、前言 |
2、第一部分建立表达三种活化型生长因子的细胞系 |
2.1 材料和方法 |
2.2 结果 |
2.3 讨论 |
2.4 结论 |
3、第二部分共培养诱导骨髓间充质干细胞向内耳毛细胞样细胞分化 |
3.1 材料和方法 |
3.2 结果 |
3.3 讨论 |
3.4 结论 |
全文创新点 |
参考文献 |
文献综述 |
参考文献 |
作者简历 |
硕士在读期同发表的论文 |
(5)顺铂导致螺旋神经节细胞凋亡中pp38MAPK和pERK信号蛋白的作用(论文提纲范文)
1 材料与方法 |
1.1 实验动物和分组 |
1.2 耳蜗石蜡切片制作及HE染色 |
1.3 电镜标本制备 |
1.4 免疫组化染色 |
1.5 统计学方法 |
2 结果 |
2.1 HE染色观察结果 |
2.2 透射电镜观察结果 |
2.3 pp38MAPK表达结果 |
2.4 pERK表达结果 |
3 讨论 |
(6)小鼠诱导性多潜能干细胞向内耳毛细胞和螺旋神经元诱导分化的体外实验研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
目录 |
第1章 引言 |
第2章 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验动物及细胞系 |
2.1.2 实验试剂 |
2.1.3 实验主要培养基和试剂的配制 |
2.1.4 实验主要仪器与耗材 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 器材的准备 |
2.2.2 原代 MEF 的分离培养与冻存 |
2.2.3 MEF 的复苏、传代及饲养层细胞的制备 |
2.2.4 小鼠 iPSCs 的复苏、传代培养及冻存 |
2.2.5 小鼠 iPSCs 的鉴定 |
2.2.6 小鼠 iPSCs 向内耳毛细胞及螺旋神经元诱导分化 |
2.3 统计分析 |
第3章 结果 |
3.1 MEF 的形态学特点 |
3.2 小鼠 iPSCs 的生长特点 |
3.3 拟胚体的生长特点 |
3.4 细胞经共培养诱导后的形态学特点 |
3.5 诱导后细胞相关标志物的表达 |
3.5.1 内耳毛细胞诱导分化组毛细胞相关标志物的免疫学鉴定结果 |
3.5.2 螺旋神经元诱导分化组神经元相关标志物的免疫学鉴定结果 |
3.6 统计学分析结果 |
3.6.1 毛细胞诱导分化组细胞阳性率及其统计学分析 |
3.6.2 螺旋神经元诱导分化组细胞阳性率及其统计学分析 |
第4章 讨论 |
第5章 结论 |
致谢 |
参考文献 |
附录 实验图片 |
攻读学位期间的研究成果 |
综述 |
参考文献 |
(7)白化荣昌猪耳聋的分子病理机制研究(论文提纲范文)
英文缩略词表 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
参考文献 |
第一部分 正常荣昌猪的听功能及内耳形态学数据库的建立 |
材料 |
实验方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第二部分 白化荣昌猪耳聋家系的构建和基因定位 |
材料 |
实验方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第三部分 白化荣昌猪耳聋的病理机制研究 |
材料 |
实验方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
研究结论与展望 |
综述 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
(8)腺相关及腺病毒内耳基因转染和Rb敲除结合ISL1表达诱导小鼠毛细胞与支持细胞增殖(论文提纲范文)
缩略语表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一部分 5型腺病毒经中阶路径注射转染新生和成年小鼠耳蜗毛细胞和支持细胞 |
引言 |
实验材料 |
实验方法 |
实验结果 |
附图表 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 12种腺相关病毒经中阶路径注射转染新生和成年小鼠耳蜗毛细胞和支持细胞的比较 |
引言 |
实验材料 |
实验方法 |
实验结果 |
附图表 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分 敲除Rb1并过表达ISL1诱导小鼠耳蜗毛细胞与支持细胞增殖的体内研究 |
引言 |
实验材料 |
实验方法 |
实验结果 |
附图表 |
讨论 |
参考文献 |
全文小结 |
本文创新性 |
综述 |
参考文献 |
参与科研项目 |
参与学术交流 |
博士期间发表文章 |
致谢 |
(9)hESC和hiPSC体外定向诱导分化的实验研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
引言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
综述 内耳毛细胞及神经细胞再生 |
参考文献 |
个人简历 |
在学期间发表的学术论文与研究成果 |
致谢 |
(10)FGF、BMP、WNT信号通道对乳鼠耳蜗神经发育及谷氨酸钠耳毒性作用的影响初步研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
目录 |
英文略缩语 |
第一章 乳鼠耳蜗信号通道基因表达 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第二章 信号通道与内耳神经发育的初步研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第三章 信号通道对谷氨酸钠耳毒性作用的影响初步研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
结论 |
附图 |
综述一 信号通道FGF基础与临床研究 |
综述二 TGF-β、Wnt信号通道及其与神经系统及耳蜗发育的关系 |
在读期间论文发表情况 |
致谢 |
四、豚鼠内耳前庭上皮发育过程IGF-1及ERK的表达及其意义(论文参考文献)
- [1]防治内耳疾病药物的研究进展[J]. 吴艾欣,叶瑞琴,温露,陈钢. 中国新药杂志, 2020(20)
- [2]补肾通窍方对肾阴虚大鼠耳蜗组织ERK1/2表达的影响的实验研究[D]. 周晓丹. 山西中医药大学, 2019(01)
- [3]快速老化小鼠听功能、耳蜗组织中p-ERK1/2、p-ERK5增龄性变化及体外培养HUVEC-C的实验研究[D]. 张红佳. 桂林医学院, 2016(05)
- [4]表达三种活化型生长因子细胞系的建立及其内耳诱导分化作用的实验研究[D]. 郑丹丹. 浙江大学, 2015(09)
- [5]顺铂导致螺旋神经节细胞凋亡中pp38MAPK和pERK信号蛋白的作用[J]. 邢奋丽,唐辉,邓毅,曹克利. 听力学及言语疾病杂志, 2014(04)
- [6]小鼠诱导性多潜能干细胞向内耳毛细胞和螺旋神经元诱导分化的体外实验研究[D]. 管利娜. 南昌大学, 2013(04)
- [7]白化荣昌猪耳聋的分子病理机制研究[D]. 任丽丽. 中国人民解放军医学院, 2013(08)
- [8]腺相关及腺病毒内耳基因转染和Rb敲除结合ISL1表达诱导小鼠毛细胞与支持细胞增殖[D]. 舒易来. 复旦大学, 2012(03)
- [9]hESC和hiPSC体外定向诱导分化的实验研究[D]. 王乐. 郑州大学, 2012(09)
- [10]FGF、BMP、WNT信号通道对乳鼠耳蜗神经发育及谷氨酸钠耳毒性作用的影响初步研究[D]. 朱纲华. 中南大学, 2007(01)