一、紫杉醇对小鼠巨噬细胞免疫活性的影响（论文文献综述）
杨杰[1]（2021）在《杜仲叶多糖偶联OVA脂质立方液晶对小鼠免疫活性探究》文中研究说明脂质立方液晶（Cubs）是一种新型药物载体,因其双连续通道结构使得其在难溶性大分子药物的包载与体内运输过程中有巨大优势,杜仲由于其资源稀少,又因其滋补的功效甚佳,所以自古就被视为名贵中药材,《神农本草经》记载,杜仲可补中益气,强筋骨,而植物多糖有着抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫活性的功能,尤其是在机体免疫层面,免疫细胞存在多种多糖受体,植物多糖可提高免疫细胞的活性,使其能在免疫反应过程中发挥更好的作用。目前尚未有关于杜仲叶多糖（PsEUL）配合Cubs在机体免疫活性探究的相关研究报道,为探究将PsEUL与卵清蛋白（OVA）偶联并通过Cubs作为疫苗佐剂对小鼠的免疫活性,本试验使用超声热水提取PsEUL并使用碳二胺盐酸盐（EDC）缩合法将PsEUL和OVA通过化学键偶联在一起,并使用植烷三醇作为两亲性脂质物质制备PsEUL-OVA/Cubs,并分别对PsEUL-OVA和PsEUL-OVA/Cubs进行体内外试验,探究其免疫活性以期为植物多糖修饰抗原和新型疫苗佐剂的开发提供一定的理论依据与数据支持。本次试验的主要方法与试验结果和结论如下:1.PsEUL的提取与优化。本试验采用超声热水提取PsEUL,使用傅里叶红外光谱对提取的PsEUL进行鉴定,并通过大孔树脂对提取的PsEUL进行脱色工艺优化,使用硫酸苯酚法测定PsEUL多糖含量。结果显示,PsEUL在红外光谱下具有典型的多糖吸收峰,并且PsEUL是含有吡喃糖和呋喃环的酸性多糖;通过硫酸苯酚法对超声水提的PsEUL的提取率进行计算,PsEUL的提取率为5.7%;通过两种方式对PsEUL进行脱色处理,当采用大孔树脂为脱色的材料,使用乙醇作为洗脱液时,乙醇浓度为5%时,脱色率和多糖保有率最佳。2.杜仲多糖与OVA偶联物（PsEUL-OVA）的制备与表征。将PsEUL在EDC中与OVA反应得到杜仲叶多糖与OVA的偶联产物PsEUL-OVA,在葡聚糖凝胶G-150的层析柱上通过记录洗脱液的紫外吸收值,得到纯化的PsEUL-OVA。并使用傅里叶红外光谱、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、扫描电子显微镜以及BCA试剂盒进行表征。将PsEUL和PsEUL-OVA分别进行红外光谱扫描,结果显示,PsEUL-OVA的红外光谱在1580 cm-1处出现了己二酰肼上对应的C=O伸缩振动峰,表明PsEUL已经成功通过共价键-CO-NH-的形成偶联到OVA上;通过SDS-PAGE检测OVA和PsEUL-OVA,与OVA相比,PsEUL-OVA的条带明显上移至压缩胶部分,表明分子量增大,表明PsEUL成功与OVA偶联;通过SEM观察发现PsEUL和PsEUL-OVA的形貌发生了明显变化,PsEUL-OVA的颗粒发生黏连,说明OVA与PsEUL成功的结合在一起;通过使用BCA法和硫酸苯酚法计算得到PsEUL-OVA的转化率（%）=46.25%±4.2%;多糖与蛋白的比为48.1%±6.8%。3.PsEUL-OVA体内外免疫活性的探究。为了探究PsEUL-OVA的免疫活性,本试验通过CCK-8法研究了PsEUL-OVA体外脾细胞和巨噬细胞活性,并测定PsEUL-OVA对脾细胞和巨噬细胞的细胞因子分泌水平的影响,再以FITC标记OVA,通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对FITC标记的PsEUL-OVA的吞噬效果;体内试验,90只ICR小鼠随机分为6组,空白组、PsEUL组、OVA组、PsEUL与OVA混合组、PsEUL-OVA组,弗氏佐剂（FCA）阳性对照组。各组小鼠给药后在不同时间点检测各种免疫指标的变化,通过流式细胞仪分别检测了小鼠脾脏细胞中CD4+、CD8+的表达,以及树突状细胞表面成熟标志因子CD80、CD86以及MHC-II的表达水平;同时检测了PsEUL-OVA对小鼠免疫器官指数、血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6浓度以及OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b的水平的影响。体外试验结果显示,PsEUL-OVA的浓度为200μg/m L时小鼠脾细胞活性与巨噬细胞活性显着高于其余各组（P<0.05）;PsEUL-OVA能够分别提高淋巴细胞与巨噬细胞的细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4、IL-6的分泌水平;激光共聚显微镜发现巨噬细胞对PsEUL-OVA的吞噬效果显着高于其他各组。体内试验表明,PsEUL-OVA可以显着提高小鼠免疫器官指数;小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b的水平及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6水平,提高脾淋巴细胞中CD4+T与CD8+T的分化,促进小鼠树突状细胞表面成熟标志因子CD80、CD86、MHC-II表达水平。4.PsEUL-OVA/Cubs的制备与表征。使用植烷三醇作为双亲性脂质物质加入F127水溶液,使用超声均质法制备PsEUL-OVA/Cubs,通过透射电镜观察、偏光显微镜观察、Zeta电位和粒径分析,并测定PsEUL-OVA/Cubs包封率与载药量对PsEUL-OVA/Cubs进行表征。结果显示,通过TEM对PsEUL-OVA/Cubs进行观察,可见制备的PsEUL-OVA/Cubs呈现出六面体与立方体结构,且分布比较均匀,大小也相对均一;在偏光显微镜下观察,常温下PsEUL-OVA/Cubs为暗视野,无偏光,将PsEUL-OVA/Cubs加热至60℃可以观察到视野逐渐变亮,结构也变明显。由此可以证实PsEUL-OVA/Cubs为立方相结构,光学特点为各向同性;通过测定PsEUL-OVA/Cubs的粒径和Zeta电位,PsEUL-OVA/Cubs平均粒径（AD）为（381.68±12.28）nm,多分散系数（PDI）为（0.175±0.01）,平均Zeta电位为（-10.43±0.3）m V,说明PsEUL-OVA/Cubs分散性良好,比较稳定;通过包封率和载药量的计算公式算出制备的PsEUL-OVA/Cubs包封率为78.12%±1.23%,载药量为80.75%±2.43%。5.PsEUL-OVA/Cubs体外免疫活性研究。本试验通过CCK-8法探究PsEUL-OVA/Cubs对体外培养的脾细胞和巨噬细胞活性的影响,并测定了PsEUL-OVA/Cubs对脾细胞和巨噬细胞的细胞因子分泌水平的影响,再以FITC标记OVA,通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对FITC标记的PsEUL-OVA/Cubs的吞噬效果,最后将PsEUL-OVA/Cubs与巨噬细胞共培养,并通过高通量测序分析PsEUL-OVA/Cubs对小鼠巨噬细胞的基因表达的影响。结果显示,PsEUL-OVA/Cubs的浓度为150μg/m L时小鼠脾细胞活性与巨噬细胞活性显着高于其余各组（P<0.05）;PsEUL-OVA/Cubs能够显着提高脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2,促进巨噬细胞分泌IL-4、IL-6;激光共聚显微镜观察发现巨噬细胞对PsEUL-OVA/Cubs的吞噬效果显着高于其他各组;高通量测序发现,PsEUL-OVA/Cubs处理小鼠巨噬细胞24h后,RAW264.7基因表达谱中出现差异表达相关基因3385个,其中显着上调1891个,其中差异表达相关基因免疫相关富集通路为肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路、抗原处理和递呈信号通路、吞噬体等信号通路。6.PsEUL-OVA/Cubs体内免疫活性的探究。150只ICR小鼠分为10组,空白组、PsEUL组、OVA组、PsEUL与OVA混合组、PsEUL-OVA组、PsEUL/Cubs组、OVA/Cubs、PsEUL+OVA/Cubs组、PsEUL-OVA/Cubs组,弗氏佐剂（FCA）阳性对照组。通过流式细胞仪分别检测了小鼠脾脏细胞中CD4+、CD8+的表达和树突状细胞表面成熟标志因子（CD80、CD86和MHC-II）的表型变化;此外检测了PsEUL-OVA/Cubs对小鼠免疫器官指数、血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的浓度以及OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平的影响。结果显示,PsEUL-OVA/Cubs可显着提高小鼠免疫器官指数,显着上调小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚类抗体水平,同时显着提高小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6水平;PsEUL-OVA/Cubs能够显着促进脾淋巴细胞中CD4+T与CD8+T的分化,显着提升小鼠树突状细胞CD80+、CD86+、MHC-II的表达水平。综上所述,PsEUL与OVA偶联可以显着提高PsEUL的免疫增强活性。PsEUL-OVA/Cubs在体外可显着增强巨噬细胞的吞噬能力,提高细胞因子的分泌水平。在体内PsEUL-OVA/Cubs可以显着提高小鼠血清OVA特异性IgG及其亚类的抗体水平,增强血清细胞因子水平以及增强T、B淋巴细胞的增殖能力,提高CD4+、CD8+的表达,促进树突细胞的成熟。根据高通量测序结果推测PsEUL-OVA/Cubs对机体免疫活性的影响是通过影响差异基因富集,从而表达与免疫相关蛋白来实现的。
刘雅慧[2]（2021）在《白头翁皂苷A3抑制巨噬细胞M2型极化抗三阴性乳腺癌转移的作用研究》文中研究说明目的:本研究的目的旨在研究白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化发挥抗三阴性乳腺癌转移的作用。通过体外构建巨噬细胞M2极化模型,考察白头翁皂苷A3对巨噬细胞M2型极化的影响及其作用机制;通过体外研究白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化对三阴性乳腺癌迁移能力的影响,同时体内研究白头翁皂苷A3对4T1-Luc三阴性乳腺癌肺转移小鼠的抗转移作用及其机制,为治疗三阴性乳腺癌转移提供新的研究思路与实验根据。第一部分:白头翁皂苷A3对巨噬细胞M2型极化的作用及其机制研究方法:本研究采用原代巨噬细胞BMDM来构建巨噬细胞M2型极化模型,以评价白头翁皂苷A3对巨噬细胞M2型极化的影响。采用CCK-8法考察白头翁皂苷A3对BMDM细胞存活率的影响;采用流式细胞术考察白头翁皂苷A3对M2型巨噬细胞标志性抗原CD206表达的影响;采用RT-PCR法考察白头翁皂苷A3对M2型巨噬细胞标志性基因CD206、Fizz1、Ym1、Arg-1的m RNA表达水平的影响;采用Western-blot检测白头翁皂苷A3对JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达水平的影响;采用分子对接方法预测白头翁皂苷A3抑制巨噬细胞M2型极化的作用靶标;采用si RNA转染BMDM细胞,将其STAT3基因敲低,加入白头翁皂苷A3干预后,RT-PCR法检测M2型巨噬细胞标志性基因CD206、Fizz1、Ym1、Arg-1的m RNA表达水平。结果:CCK-8结果发现,白头翁皂苷A3在0-100μg/ml浓度范围内对BMDM细胞的存活率无明显影响;IL-4诱导BMDM细胞后,F4/80+CD206+双阳性比例从2.92%±0.09%上升到46.4%±1.72%（P<0.01）,而同时给予低、高剂量的白头翁皂苷A3干预后,F4/80+CD206+双阳性比例从46.4%±1.72%分别下降至28.2%±0.92、17.6%±0.34（P<0.01）;IL-4诱导BMDM细胞后,M2型巨噬细胞标志性基因CD206、Fizz1、Ym1、Arg-1的m RNA表达水平显着上升（P<0.01）,同时给予白头翁皂苷A3后,BMDM细胞内CD206、Arg-1、Fizz1、Ym1的m RNA表达水平显着降低（P<0.01）;IL-4诱导BMDM细胞后,BMDM细胞内JAK2、STAT3蛋白磷酸化表达水平显着上调（P<0.01）,同时给予白头翁皂苷A3干预后,BMDM细胞内JAK2蛋白磷酸化表达水平无明显变化,但同时给予白头翁皂苷A3组干预后,BMDM细胞内STAT3蛋白磷酸化表达水平显着降低（P<0.05）;分子对接显示,白头翁皂苷A3与STAT3蛋白对接活性较好,STAT3可能为白头翁皂苷抑制巨噬细胞M2型极化的作用靶标;STAT3-si RNA转染BMDM细胞后,与IL-4-STAT3-si RNA组比较,IL-4+白头翁皂A3-STAT3-si RNA组M2型巨噬细胞标志性基因的m RNA表达显着下调（P<0.01）。第二部分:白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化对三阴性乳腺癌转移的影响方法:本研究通过体内外实验考察白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化对三阴性乳腺癌转移的作用。体外实验中收集IL-4与白头翁皂苷A3单独或共同孵育巨噬细胞的条件培养基,将其作用于4T1细胞,通过Transwell小室迁移实验与细胞划痕实验考查其迁移运动能力,同时考察白头翁皂苷A3本身对4T1细胞迁移运动能力的影响;体内实验中构建4T1-Luc三阴性乳腺癌细胞Balb/c小鼠肺转移模型,采用小动物活体成像术及HE染色法观察小鼠三阴性乳腺癌肺转移情况,以考察白头翁皂苷A3体内抗三阴性乳腺癌转移的作用。采用免疫组织化学染色法测定肺组织中的巨噬细胞M2型极化相关表面抗原CD206的表达。结果:体外Transwell小室迁移实验结果表明,IL-4诱导的条件培养基能显着增加迁移至小室底部的4T1细胞数量,从每个视野109±15增加至231±32个（P<0.01）,与IL-4诱导的条件培养基比较,同时给予高剂量的白头翁皂苷A3与IL-4孵育BMDM细胞得到的条件培养基能显着降低迁移至小室底部的4T1细胞数量,从每个视野231±32个分别下降至187±34个（P<0.05）;细胞划痕实验发现,IL-4诱导的条件培养基能显着增加4T1细胞的划痕愈合能力（P<0.01）,与IL-4诱导的条件培养基比较,同时给予高剂量的白头翁皂苷A3及IL-4孵育BMDM细胞得到的条件培养基能显着降低4T1细胞划痕愈合率（P<0.05）;而白头翁皂苷A3本身对4T1细胞的迁移能力无明显影响。三阴性乳腺癌肺转移结果显示,经过白头翁皂苷A3干预后,与4T1-Luc乳腺癌肺转移模型组小鼠比较,白头翁皂苷A3高剂量组4T1-Luc小鼠体重显着增加（P<0.01）,白头翁皂苷A3高剂量组4T1-Luc小鼠体内荧光强度显着降低（P<0.05）;HE染色结果显示,与4T1-Luc乳腺癌肺转移模型组小鼠比较,白头翁皂苷A3注射中、高剂量组能显着降低三阴性乳腺癌肺转移小鼠肺组织转移灶点数（P<0.01,P<0.05）,改善三阴性乳腺癌肺转移小鼠肺脏的肿瘤转移情况。免疫组化结果显示,白头翁皂苷A3干预后,与4T1-Luc乳腺癌肺转移模型组小鼠比较,肺组织中浸润的M2型巨噬细胞表面抗原CD206比例显着下调（P<0.05）。结论:白头翁皂苷A3在体内外均可通过抑制巨噬细胞M2型极化发挥抗三阴性乳腺癌转移的作用,其机制为白头翁皂苷A3通过靶向STAT3蛋白,负调控STAT3蛋白,抑制巨噬细胞M2型极化,从而发挥抗三阴性乳腺癌转移的作用。
张雅楠[3]（2021）在《基于硫酸软骨素和大黄酸的声动力抗肿瘤纳米粒的研究》文中研究指明目前,癌症依然是人类健康的一项重大威胁,其呈现出极高的致死率;同时其发生和发展均对患者的身、心带来巨大的创伤。当下化学疗法依旧是癌症治疗的主流手段,多种抗肿瘤药物的使用虽然可以抑制肿瘤细胞的生长,但也对患者自身的正常组织造成了一定的破坏。纳米药物递送系统作为一种能够实现长循环给药、增强药物稳定性的高安全性给药方式,能够起到持续释药、改善体内药物动力学和药效学的效果,在癌症治疗领域得到了广泛关注。而设计一种具有肿瘤靶向性、肿瘤微环境特异性释放能力、安全性强、同时具备联合治疗手段的纳米制剂仍是一项巨大挑战。以多糖为骨架的自组装纳米粒作为一种高生物相容性、低毒性和体内可降解的药物递送系统,在抗肿瘤药物的递送方面得到了广泛研究。硫酸软骨素（CS）是一种亲水性的有机材料,多作为聚合物纳米系统的骨架,具有良好的肿瘤细胞靶向的能力。大黄酸（Rh）不仅具有良好的抗肿瘤及抗转移能力,并且首次发现其可以作为一种超声敏感物质通过发挥声动力治疗（SDT）作用而起到抗肿瘤的效果。因此,本课题设计了一种以硫酸软骨素为亲水骨架,以包含大黄酸在内的多种不同的小分子物质进行疏水性修饰而构建的多种环境响应型载体。该系统不仅可以在肿瘤组织内的高浓度还原性谷胱甘肽（GSH）的存在下快速、完全的释放所载药物,起到良好的靶向及特异性抗肿瘤作用;而且可以通过超声干预实现SDT,从而以联合治疗的手段加强抑瘤效果。本课题主要从两部分内容进行研究。第一部分是通过己二酸二酰肼（ADH）构建CS氨基化物,将小分子疏水性物质Rh和α-硫辛酸（LA）逐次连接到氨基化的CS骨架上,合成了 CS-ADH-Rh-LA聚合物。LA作为交联剂,可以在特定条件下交联形成纳米粒的分子间二硫键,从而实现还原敏感的药物释放能力,同时交联后构建的纳米粒也能够增强纳米系统的稳定性。结合大黄酸自身的抗肿瘤和声动力特性,以及包载的抗肿瘤药物的功能,期望该纳米给药系统可以通过联合的化学治疗和声动力治疗实现高效的抑瘤效果,并且具备一定的抗肿瘤转移和侵袭能力。研究发现该载药纳米粒可以实现良好的化疗-声动力联合治疗抗肿瘤效果,但肿瘤微环境内缺氧的特性仍限制了该纳米递送系统的治疗效果,因而在此基础上构建了具有携氧能力的多功能纳米递送系统。本研究的第二部分是在前一部分的基础上,以胱胺（cys）将Rh和全氟辛酸（PFC）先后连接于CS骨架上,合成了另一种还原敏感两亲性携氧的CS-cys-Rh-PFC聚合物材料。更换连接臂后,不仅可以提高Rh的接枝率,提高了抑瘤效果;而且可以增加疏水性小分子的引入率,从而使获得的自组装纳米粒粒径更小、性质更稳定。PFC的加入改善了肿瘤部位的缺氧条件,同时充足的氧气分子也是提高SDT产生活性氧（ROS）产率的必要前提。基于此假设评估了纳米粒的稳定性,载药能力和携氧能力,并通过细胞实验和动物实验对该纳米粒改善体内缺氧和化疗-声动力联合治疗癌症的能力进行了综合评价。实验中数据之间的显着性差异均通过SPSS 26.0软件分析获得,且相应结果以平均值±标准差（SD）的形式加以呈现。主要研究方法和实验结果如下:（1）多烯紫杉醇（DTX）还原响应型交联硫酸软骨素-大黄酸-硫辛酸聚合物纳米粒（CS-ADH-Rh-LA）的构建及化疗-声动力联合治疗肿瘤的研究通过酰胺化反应,将Rh以ADH为连接臂连接到CS羧基端的亲水性骨架上,形成CS-ADH-Rh聚合物。再通过更改Rh和CS的投料比,获得其中Rh取代度较高的CS-ADH-Rh聚合物（取代度为3.15）进行后续实验。随后再次通过酰胺反应,将LA以与CS-ADH-Rh不同比例的投料比进行反应,接入到未被Rh占据的ADH的氨基端上。LA的取代度在5.14%-7.38%之间,而其对应的临界聚集浓度（CAC）值则在33.74-66.54 μg/mL之间的范围内变化。CS-ADH-Rh-LA聚合物在探头超声的条件下可形成自组装纳米粒,命名此为非交联纳米粒（NC-NPs）;而在适量的还原性物质的催化下,可断裂LA的分子内二硫键,同时构建了分子间二硫键,进而生成还原敏感的交联纳米粒（C-NPs）,并可提高载体的稳定性。NC-NPs在溶液中呈椭球形分布,而C-NPs则呈均匀分布的球形形态。经测定,对于不同LA投料比的NC-NPs粒径在165-185 nm范围内,Zeta电位值在-15 mV至-22 mV间。而经过交联后,C-NPs的粒径降低至138-179 nm,而电位则在-25 mV到-29 mV范围间变化。溶血率结果均小于5%,表明了 C-NPs具备良好的生物相容性。在C-NPs合成的基础上,对载药方法、药物良溶剂、超声次数和药物/载体投料比进行了筛选及优化,最终确定通过超声-透析法制备了 DTX/C-NPs（载药交联纳米粒）。在选择投料比为10:3,超声次数3次和甲醇为溶剂的条件下,优化后得到的DTX/C-NPs载药量为10.07%,包封率为35.37%。在缓冲液、高离子强度溶剂和10%胎牛血清的条件下,C-NPs均可保持良好的稳定性,并显示出了良好的抗稀释稳定性。同时,在高浓度还原剂的存在下,C-NPs发生裂解,形态明显改变,表明其具有良好的还原敏感特性。随后,用动态膜透析法对DTX/C-NPs在各种条件下的释放行为进行了研究。结果发现DTX的释放量在无二硫苏糖醇（DTT）和低浓度DTT（20μM）的溶液中释放行为几乎一致,其在72 h的孵育后,仅有小于40%的DTX可以被释放出来。而在高浓度的DTT溶液（20 mM）中,12 h时DTX即可达到约80%的累积释放,而在72 h时DTX累积释放率可达95%以上。因此,C-NPs可实现在肿瘤部位的特异性释放,同时也提高了纳米粒的稳定性,有效防止了药物泄露。通过对不同物质在去离子水（DW）中的溶液进行单线态氧含量的测定和比较,发现C-NPs较之前已被报道过的声敏剂大黄素（EMO）和二氢卟吩（Ce6）而言,其在溶液中产生单线态氧的能力更高,证明了 Rh的超声敏感性,这为之后的化疗-声动力联合治疗提供了依据。从细胞水平上来看,肿瘤细胞对于C-NPs具有良好的摄取能力,且C-NPs在进入细胞质后能够靶向高尔基体细胞器。在SDT的作用下,C-NPs可破坏细胞器结构,干扰肿瘤细胞关键性蛋白的合成过程,促进细胞凋亡;而C-NPs对溶酶体和线粒体部位的靶向作用均较高尔基体差。同时C-NPs可通过细胞间运输的作用传至深层次的肿瘤细胞,从而提高抗肿瘤作用。载药后的DTX/C-NPs可以在SDT的协同下起到理想的肿瘤杀伤作用,且细胞毒性随着纳米粒浓度和超声时间的增加而增强;C-NPs也呈现出相似的特性。与游离的DTX和Rh相比,DTX/C-NPs在低浓度时即可产生较好的细胞毒性,提高肿瘤抑制效果,这些可能归功于纳米粒的靶向作用、较高的细胞摄取能力和缓释作用。给药DTX/C-NPs的细胞经过超声处理后,其细胞凋亡的能力可以提高4.3倍。在较短的孵育时间内,超声可以诱导C-NPs和游离Rh产生数量相近的ROS分子,但延长培养时间后,C-NPs中由ADH和Rh连接形成的化学键逐步被分解,从而恢复Rh原有的结构,因此ROS的产量与C-NPs的浓度和孵育时间成正比。在游离Rh和DTX/C-NPs的作用下,SDT时间越长,对线粒体产生的破坏效果也越强,线粒体膜电位（MMP）持续降低;但C-NPs和SDT对肿瘤细胞的细胞周期无显着的影响。而微管实验的结果表明,DTX/C-NPs可以作用于微管蛋白上的特定部位以促进微管聚合,抑制肿瘤细胞的有丝分裂,而SDT则对该过程起到了一定的促进作用。C-NPs和DTX/C-NPs在SDT的作用下均有显着抑制肿瘤细胞转移和侵袭的能力,而western blot实验中MMP9蛋白表达水平的降低也与上述实验互相印证;此外,DTX/C-NPs被证实可以通过caspase-3通路以促进细胞凋亡。当荷瘤小鼠注射游离 iodide[1,1‘-dioctadecyl-3,3,3’,3‘-tetramethylindotri-carbocyanine iodide（DiR）和DiR/C-NPs后,在不同时间点对小鼠进行体内成像观察,并记录各小鼠体内DiR荧光强度及分布;此外对注射24 h后的小鼠进行解剖,观察其离体器官的荧光强度。结果显示相比于游离的DiR溶液,DiR/C-NPs可以提高其对肿瘤的靶向能力,并延长滞留时间。体内抗肿瘤实验表明,化疗-声动力联合应用的方法较传统的单一化疗可以显着提高对模型小鼠的治疗效果。实验结束后,DTX/C-NPs和DTX/C-NPs+SDT的相对肿瘤体积分别降低为1.62和0.74,而生理盐水（NS）处理组则为4.40;同时对肿瘤组织进行q-PCR检测,结果表明,相较于NS组,DTX/C-NPs+SDT处理后COX-2和uPA的表达显着降低,证明了 DTX/C-NPs+SDT这种联合治疗的方式可以起到最优的抗肿瘤效果。结合各治疗组小鼠模型的主要器官切片的H&E染色结果和小鼠血清中存在的谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、肌酐（CREA）和血清尿素氮（BUN）的含量变化来看,各制剂均具有良好的安全性。同时,运用TUNEL染色证实了该制剂的促肿瘤细胞凋亡的作用。此外,通过对小鼠远端瘤的肿瘤体积变化的测定和小鼠血清中巨噬细胞标志性成分IL-12、IL-10的测定和多种肿瘤切片的观察表明,DTX/C-NPs+SDT可以显着抑制远端瘤的生长,起到全身免疫的作用,这可能与SDT抑制小鼠体内M2型巨噬细胞有关。DTX/C-NPs+SDT不仅可以剧烈杀伤肿瘤细胞,而且具有良好的体内安全性。由于所用细胞来源的限制,该部分课题只能对裸鼠进行研究,而裸鼠的免疫缺陷特性使得我们无法对其体内淋巴细胞的变化情况进行考察;同时,在研究中发现了 ADH和Rh间的化学键会对Rh生成ROS的能力有一定的限制性,故而在此基础上进行了进一步地研究。（2）多烯紫杉醇还原响应型携氧硫酸软骨素-大黄素-全氟辛酸聚合物纳米粒（CS-cys-Rh-PFC）的构建及体内外研究在上一部分化疗-光动力治疗联合作用的抗肿瘤的研究基础上,为进一步提高SDT的效果,提高声敏剂Rh的含量,将上一章中出现的连接臂ADH换成接枝率更高的cys,并且更换了 Rh的连接方法;同时为了提高ROS的转化效率,缓解肿瘤细胞周围的缺氧环境,在聚合物结构中引入了具有良好的生物相容性的携氧物质全氟辛酸（PFC）,以获得更加理想的抗肿瘤效果。首先将Rh通过cys键连接到CS骨架上,构建具有两亲性的CS-cys-Rh聚合物,通过紫外分光光度法（UV-vis）测定了聚合物中Rh的含量在0.46%到11.54%之间。在此基础上,考察了 CS-cys-Rh经过不同的方法制备的结果,并优化了所用方法中的乙醇浓度及沉淀时间。随后,将PFC以不同比例通过酰胺反应连接于 CS-cys-上,构建了 CS-cys-Rh-PFC 聚合物,其 CAC 值在 27.52-33.83 μg/mL之间,纳米粒在131.1-149.6 nm之间呈分散均匀的球形,Zeta电位在-32 mV至-36 mV之间,Rh在各聚合物中的含量在10.7%-11.7%之间。同样通过超声-透析法制备载DTX的纳米粒后,可在10:3投料比时获得最大的载药量至16.8%,而粒径略有增加。CS-cys-Rh-PFC经探头超声后形成的纳米粒CRP-NPs具有良好的还原敏感性,通过模拟肿瘤中还原性环境制备高浓度的DTT（20 mM）溶液,发现CRP-NPs可以通过断裂分子内的二硫键使自身结构被破坏并呈碎片状态,从而迅速释放出其中包载的DTX和通过二硫键相连的Rh。且该过程相比于低浓度的DTT溶液和空白溶液来说,Rh和DTX的累计释放速度和释放量在20 mM DTT中显着提升,在孵育72 h后分别可达为61.1%和96.9%的累计释放,由此证明CRP-NPs良好的还原响应性和稳定性。通过测定聚合物水溶液中溶解氧的含量,发现相对于纯水而言（氧含量为11 mg/L）,CRP-NPs具备良好的携氧能力17.68 mg/L,且该能力随CRP浓度的升高而增大。同时,CRP-NPs在氧气含量充足的条件下单线态氧的生成能力也显着升高,这初步表明了 PFC的引入对CRP-NPs的整体结构和功能是有利的。在细胞实验中,B16F10黑色素瘤细胞对CRP-NPs具有良好的摄取能力,该摄取同样依赖于CD44受体介导的主动靶向;并且相较于游离药物,纳米粒具备良好的高尔基体靶向能力。载药纳米粒DTX/CRP-NPs可在化疗-声动力联合治疗时展现出良好的细胞毒性,且该毒性随着超声时间的延长而增大。在较短时间内,CS-cys-Rh和CRP-NPs在SDT的辅助下均可以刺激ROS的生成,且CRP-NPs生成ROS的含量更高,因此证明PFC的引入可以显着提高ROS产量,从而提高抗肿瘤效果。通过对细胞周期的研究发现,CRP-NPs和DTX/CRP-NPs均可以提高肿瘤细胞在G2/M期的数量,且该过程中DTX占主导地位,因此纳米粒具备良好的抑制肿瘤细胞有丝分裂的能力。同时,观察药物干预后微管结构的变化,发现DTX/CRP-NPs可以显着促进微管蛋白的聚集,而其和SDT的协同治疗作用则表现出制剂对肿瘤细胞极高的杀伤效果,加强细胞凋亡程度,因此其微管结构不明显。CRP-NPs和DTX/CRP-NPs均可在SDT的作用下导致钙网蛋白（CRT）由胞内外翻至肿瘤细胞膜外,预示着产生了免疫原性细胞死亡（ICD）的作用。DTX/CRP-NPs 可显着增加凋亡相关蛋白 cleaved caspase-3,cleaved caspase-9 的表达,增加BAX/Bcl-2的表达,同时抑制MMP9的表达。在施加SDT后,肿瘤细胞凋亡率有所提高,而DTX/CRP-NPs与SDT联合作用后凋亡率可达到57.37%。通过将荧光物质DiR包载入CRP-NPs后,注射到B16F10荷瘤小鼠体内,在不同时间点进行活体成像的观察;随后在第24 h时解剖小鼠,分离各主要器官并对DiR荧光强度进行定量。结果与第一部分类似,相较于游离的DiR,DiR/CRP-NPs具备更长的体内循环时间,且对肿瘤具有良好的靶向能力。此外,在SD大鼠中进行了 DTX/CRP-NPs的药代动力学研究。结果表明,相比于市售药物Taxotere（?）,DTX/CRP-NPs可显着增加DTX在血液中的分布时间,降低药物清除速度;同时半衰期由2.1 h增加至9.5 h。在构建的荷瘤小鼠模型体内,相比于空白对照组而言,CRP-NPs+SDT可以显着提高肿瘤组织中ROS的产量,同时纳米粒内部携带的氧气分子也可有效缓解肿瘤组织中的缺氧环境,抑制其转移。载药后,DTX/CRP-NPs在体内抗肿瘤实验中表现良好,相比于CS-Rh+SDT组44%的抑瘤率来说,DTX/CRP-NPs、DTX/CRP-NPs+SDT和Taxotere（?）组中小鼠的肿瘤抑制率分别可达66.9%、75.6%和47.6%。随后各器官的H&E染色结果均表明各制剂具有良好的体内安全性,而对肿瘤组织的 H&E染色结果和 TUNEL染色也相互印证了DTX/CRP-NPs+SDT在促进肿瘤细胞凋亡方面的优越性。此外通过对小鼠血清中分泌细胞因子的测定发现,DTX/CRP-NPs+SDT可以显着提高全身IL-6,TNF-α和IFN-γ的表达,而IL-2则无显着变化。解剖小鼠后,对小鼠引流淋巴结（TDLN）染色,发现联合治疗组能提高淋巴结中成熟的树突状细胞（DCs）的比例。随后,将肿瘤组织研磨后,检测其中CD3+CD4+T细胞连同CD3+CD8+T细胞的表达能力,发现相较于空白组,DTX/CRP-NPs+SDT可显着提高两种相关T细胞的表达;而对各治疗组肿瘤切片进行的T细胞的免疫荧光染色实验也得到了相同的结果。这证明了 DTX/CRP-NPs可以在超声的辅助下增强与肿瘤抑制能力相关的T细胞含量,从而可能激活全身免疫应答,有效抑制肿瘤的生长。
江敏[4]（2021）在《兰坪虫草多糖缓解博来霉素引起的小鼠肺纤维化》文中研究说明肺纤维化是持续性肺损伤和肺组织结构异常后重塑的结果,其主要特征为炎症弥漫性肺泡损伤,成纤维细胞分化导致的胶原蛋白沉积。尽管对肺纤维化发病机理的探究已有二十年之久,但是目前临床上仍以糖皮质激素和免疫抑制剂治疗为主,毒副作用大且不能从根本上逆转肺纤维化。因此,迫切需要找到治疗肺纤维化的新方法和新策略。兰坪虫草（Ophiocordyceps lanpingensis）是近些年发现的线虫草属新种,主要分布在云南省兰坪县。当地的少数民族长期将兰坪虫草用于保健和治疗疾病,尤其对呼吸系统疾病疗效显着,但药理机制仍不明晰。我们的前期研究表明,兰坪虫草多糖可能是兰坪虫草的主要活性成分,本研究以兰坪虫草多糖为实验药物,探究其对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的缓解效果及其作用机制,为兰坪虫草资源的开发和利用提供理论支撑,也为临床上肺纤维化的治疗提供借鉴依据。本论文的研究内容主要包括以下两个方面:1.兰坪虫草多糖对小鼠肺纤维化的药效研究50只C57BL/6雄性小鼠,分为对照组、模型组、兰坪虫草多糖低/中/高剂量组,每组10只,共5组。通过单次气管内滴注6 mg/kg博来霉素建立小鼠肺纤维化模型。兰坪虫草多糖低、中、高剂量组每天灌胃相应剂量（0.3 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg）的多糖溶液,对照组给予等量生理盐水,给药21天后,观察肺组织形态结构变化,检测肺组织中羟脯氨酸（HYP）含量和氧化应激指标,同时取肺组织进行HE、Masson染色,观察其病理变化。结果表明:兰坪虫草多糖显着改善纤维化小鼠的疾病状态,缓解小鼠肺组织水肿和降低了肺系数。病理切片结果显示兰坪虫草多糖可以有效减轻肺泡炎,抑制胶原纤维沉积。此外,兰坪虫草多糖减少了肺组织内HYP含量以缓解胶原沉积,同时增加了超氧化物歧化酶、谷胱甘肽含量,增强肺组织抗氧化防御机制,减少了丙二醛的产生。以上研究明确了兰坪虫草多糖能够有效缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化进程。2.兰坪虫草多糖缓解小鼠肺纤维化的机制研究采用实时荧光定量PCR检测单核细胞趋化因子MCP-1和巨噬细胞标志物基因NOS2、CXCL10/IP10、MARCO、ST2的m RNA表达水平,并进一步检测巨噬细胞分泌的炎性相关细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13和关键致纤维化因子TGF-β1以及调节炎性因子表达的多效应细胞因子OSM的基因表达量;采用免疫组织化学染色、免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测巨噬细胞标记物CD68+,促炎因子IL-6和成纤维细胞标志基因α-SMA的蛋白表达水平。结果表明,兰坪虫草多糖显着下调了MCP-1、NOS2、CXCL10/IP10、MARCO和ST2的表达,有效抑制了TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、OSM、TGF-β1的表达,同时,使CD68+、IL-6和α-SMA的蛋白表达水平下降,以上结果说明兰坪虫草多糖通过减少巨噬细胞在肺部的募集以及抑制细胞因子的分泌来缓解肺纤维化进程。采用荧光定量PCR检测自噬相关基因Beclin1、ATG7、p62和自噬负调控通路PI3K/AKT/m TOR各基因表达量,利用蛋白质免疫印记法检测该信号通路的磷酸化水平;此外,检测了与基质金属蛋白酶相关的MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1、E-cadherin、Collagen-I、Collagen-III的表达,明确其对ECM沉积的影响。结果表明兰坪虫草多糖可以抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路表达,促进Beclin1、ATG7表达,降低p62表达,进而促进肺部细胞自噬;同时,兰坪虫草多糖可升高E-cadherin表达量,降低Collagen-I、Collagen-III表达水平,维持MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1平衡。以上结果表明,兰坪虫草多糖抗肺纤维化的作用机制可能与促进细胞自噬和维持基质金属蛋白酶系统的平衡有关,最终达到减轻ECM异常沉积的目的,缓解了肺纤维化进程。综合上述研究成果,表明兰坪虫草多糖可以有效缓解BLM诱导的小鼠肺纤维化,其药理机制包括兰坪虫草多糖可以抑制肺组织的氧化应激状态和炎症反应,减少巨噬细胞在肺组织中的募集,进而降低细胞因子的释放和影响;同时,兰坪虫草多糖还可以促进细胞自噬,维持基质金属蛋白酶系统的平衡,减轻ECM异常沉积。以上多层面的共同作用,最终实现缓解BLM诱导的肺纤维化进程。
王栋[5]（2021）在《肺癌免疫化疗及LCN2干预治疗的探究》文中研究表明癌症是影响人类生命健康的四大疾病之一。其中,肺癌的发病率在众多癌症中高居首位,肺癌的发生和许多基因的变化密切相关。25%的肺癌患者中都会发生KRAS的突变,但是目前针对这种突变的肺癌病人并没有太好的治疗方法。IL-12作为一种强效的免疫活化性的细胞因子应用于许多肿瘤疾病的临床前研究,但是IL-12对于肺癌的治疗效果以及机制还并不很清楚。另一方面,约40%的肺癌晚期病人会进展为恶液质,表现为显着的体重降低,肌肉组织和脂肪组织等多种器官的萎缩。目前主要认为,恶液质病人体内是一种高度炎性的环境,但是调节炎性反应的免疫细胞在恶液质中扮演的具体的角色仍鲜有报道。肺癌恶液质的关键驱动因子目前知之甚少,且临床上针对肿瘤引起的恶液质的治疗方案十分有限。本文主要从探究早期和中期的肺癌的免疫治疗和晚期肺癌导致的恶液质的关键驱动因子及治疗方案两方面进行研究,取得了以下的结果。Ⅰ、曲美替尼联合IL-12有效治疗KRAS驱动的肺癌1.曲美替尼上调肺癌肿瘤细胞的免疫原性体外对多种肺癌细胞系进行药物处理,使用免疫荧光及流式细胞术检测CRT和HMGB1分子的表达,鉴定出曲美替尼能够上调肺癌肿瘤细胞的免疫原性。2.曲美替尼联合IL-12有效抑制小鼠皮下瘤的生长,并能在体内上调肿瘤细胞的免疫原性对LLC皮下瘤小鼠进行药物处理,流式检测瘤内DC细胞的表型。结果表明,曲美替尼可以促进瘤内DC细胞的活化。构建LLC细胞皮下瘤及Kras自发肺癌组织来源的皮下瘤小鼠模型,对小鼠进行曲美替尼和IL-12的联合治疗,我们发现,联合治疗能够后,肿瘤的进展明显被抑制,小鼠的存活时间也明显得到延长。对肿瘤组织切片进行CRT、HMGB1和HSP70分子的免疫荧光染色,结果显示曲美替尼单独使用或者联合治疗都可以在体内上调肿瘤细胞的免疫原性。3.曲美替尼联合IL-12明显抑制Kras突变驱动的自发肺癌的生长,并能在体内上调肿瘤细胞的免疫原性利用Cre慢病毒滴鼻处理Kras突变小鼠,诱导小鼠自发肺癌,分别从早期和中期对自发肺癌小鼠进行曲美替尼和IL-12的联合治疗。结果表明,联合治疗后,早期和中期的肺癌进展受到抑制。对肺癌组织切片进行CRT、HMGB1和HSP70分子的免疫荧光染色,结果显示曲美替尼单独使用或者联合治疗都可以在体内上调肿瘤细胞的免疫原性。4.曲美替尼联合IL-12明显促进肺癌原位NK细胞和T细胞的活化构建LLC细胞肺转移模型、Kras自发肺癌组织来源的皮下瘤以及Kras突变自发肺癌小鼠模型,对荷瘤小鼠进行治疗。流式结果表明,曲美替尼联合IL-12明显增加瘤内T细胞的数量,并且上调NKG2D+NK细胞及CD62L-CD44+T细胞的比例,还能够明显降低MDSC和Treg这些免疫抑制性细胞的比例。5.曲美替尼联合IL-12明显上调肺癌原位NK细胞和T细胞的抗肿瘤功能构建LLC细胞肺转移模型以及Kras突变自发肺癌小鼠模型,对荷瘤小鼠进行治疗。流式检测结果表明,曲美替尼联合IL-12明显促进瘤内NK细胞和CD8+T细胞表达抗肿瘤功能分子TNFα及granzyme B。构建LLC细胞皮下瘤模型以及Kras突变自发肺癌小鼠模型,对荷瘤小鼠进行治疗。纯化瘤内NK细胞进行体外杀伤,流式及ELISA结果表明,曲美替尼联合IL-12治疗有效上调肿瘤内NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力及IFNγ分泌能力。使用抗体清除小鼠体内的NK细胞或CD8+T细胞,再进行联合治疗,荷瘤小鼠的生存期相较于未清除细胞组明显缩短,表明联合治疗的抗肿瘤能力依赖于NK细胞和CD8+T细胞。综上所述,本研究鉴定出Kras下游的抑制剂曲美替尼具有提高肿瘤细胞免疫原性的作用。将其与IL-12联合对多种肺癌小鼠模型治疗,都得到良好的治疗效果。这种联合治疗在体内不仅可以提高T细胞的数量,活化NK细胞和T细胞,还能够提高二者的抗肿瘤功能。本研究为KRAS突变的肺癌病人提供了新的治疗方案。Ⅱ LCN2驱动肿瘤恶液质引发的全身性组织萎缩1.恶液质病人及恶液质小鼠体内均高表达LCN2对恶液质病人、普通肺癌病人及健康人的外周血进行蛋白芯片检测,分析芯片数据,结果表明,恶液质病人体内高表达LCN2。扩大样本进行血清ELISA,验证了芯片的结果。接着构建并鉴定了LLC皮下瘤诱导的小鼠模型,对恶液质小鼠及健康小鼠血清进行蛋白芯片检测,芯片结果表明,恶液质小鼠体内也高表达LCN2。随后利用qPCR和ELISA在LLC皮下瘤模型及肺癌PDX模型中都验证了恶液质小鼠确实高表达LCN2。2.LCN2促进小鼠恶液质的发生制备LCN2过表达的慢病毒并以尾静脉的途径注射给小鼠。我们发现,LCN2过表达的小鼠表现出类似恶液质的体重减轻,脂肪和肌肉组织萎缩的现象。3.恶液质的LCN2主要由中性粒细胞产生流式结果表明,恶液质小鼠体内多种器官的髓系细胞大量增加。进而我们通过qPCR,western blot和流式鉴定出LCN2主要来自于中性粒细胞。对人的外周血进行流式检测,也发现中性粒细胞数量明显增加且主要产生LCN2。4.清除中性粒细胞明显缓解恶液质造成的萎缩对恶液质小鼠使用抗体清除中性粒细胞,我们发现,清除中性粒细胞后可以明显抑制肿瘤的生长,缓解恶液质造成的体重减轻,脂肪萎缩的症状。5.抗体清除LCN2明显缓解恶液质造成的萎缩对恶液质小鼠使用抗体清除LCN2,我们发现,清除LCN2后可以明显抑制肿瘤的生长,缓解恶液质造成的体重减轻,脂肪萎缩的症状。6.恶液质脂肪细胞铁死亡途径上调对恶液质小鼠的脂肪组织进行转录组测序,分析结果,我们发现,恶液质小鼠的脂肪组织中铁死亡通路明显富集上调。利用qPCR、流式细胞术、ELISA检测多种指标,验证了恶液质的脂肪细胞确实铁死亡程度增加。7.铁死亡抑制剂DFO治疗明显缓解恶液质造成的萎缩对恶液质小鼠使用铁死亡抑制剂DFO治疗,我们发现,DFO治疗明显抑制肿瘤的生长,并且缓解恶液质造成的体重减轻,脂肪萎缩的症状。综上所述,本研究鉴定了LCN2是肿瘤恶液质的关键驱动因素,并且LCN2主要来自于中性粒细胞。LCN2的上调促进铁的转运进而造成脂肪细胞的铁死亡。清除中性粒细胞或LCN2,或者抑制铁死亡,都能够有效缓解恶液质的症状。本研究为肿瘤恶液质的诊断和治疗提供了新思路。
南黎[6]（2021）在《纳米甘草酸增强家兔波氏杆菌OMV免疫效果的研究》文中研究指明兔波氏杆菌病是由兔支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）引起的一种慢性呼吸道传染病。该病传播广泛,病程较长,较难治愈,给养兔业带来严重的经济损失。目前,预防该病的全菌灭活疫苗的保护力较低,并且传统兽用疫苗佐剂无论在其安全性方面还是诱导能力等方面均存在着缺陷,因此现阶段亟需开展新型疫苗的研究。鉴于脑膜炎奈瑟菌外膜囊泡（Outer Membrane Vesicle,OMV）疫苗的成功研制,本研究对波氏杆菌OMV的制备方法进行探索,将纳米化的甘草酸（Nano-Glycyrrhizic acid,GAN）作为免疫佐剂,结合波氏杆菌OMV,构建了GAN-OMV体系,并对其体内、体外免疫效果进行研究,为兔波氏杆菌新型亚单位疫苗的研发提供科学依据,同时也为新型兽用疫苗的研发提供新的思路。1.兔波氏杆菌外膜囊泡的制备及其蛋白质成分分析本研究确立了波氏杆菌OMV的最佳制备工艺,并对其蛋白成分进行解析。波氏杆菌OMV产量较低,为了提高OMV产量,本研究以兔波氏杆菌毒力较强菌株FX-1为研究对象,筛选出制备OMV的最优方法,并对培养时间、抗生素添加量及过滤方法进行逐一优化。采用透射电镜、扫描电镜和DLS等方法检测OMV的理化性质;Bradford蛋白定量分析法、SDS-PAGE及LC-MS/MS检测OMV的蛋白含量及组分。试验结果显示,超滤浓缩法是制备兔波氏杆菌OMV的较适方法;最佳培养时间、头孢氨苄浓度和过滤方法分别为18 h、64μg/m L和0.45μm滤膜过滤一次。制得的OMV呈纳米球形囊泡状,平均直径为75.66±11.84 nm。对其蛋白分析结果表明,OMV包含多种与波氏杆菌毒力和感染有关的蛋白质。该制备工艺能够显着提高兔波氏杆菌OMV的产量,为工业化生产提供可能。对其结构和蛋白成分的分析,为研发新型亚单位疫苗提供科学依据。2.纳米甘草酸结合波氏杆菌OMV对小鼠巨噬细胞活性的影响将甘草酸纳米化后,通过机械挤出法制备GAN-OMV,并对制得的GAN-OMV亚单位疫苗的理化性质进行综合评估,包括形态、粒径、Zeta电位等检测。结果显示GAN与OMV成功结合,呈现明显的核-壳结构。体外试验结果显示GAN-OMV对巨噬细胞增殖、细胞因子分泌和细胞吞噬功能等免疫功能的影响。结果表明:GAN-OMV有效促进巨噬细胞增殖,促进巨噬细胞分泌IL-6、IL-10、IL-1β及TNF-α。胞饮和网格蛋白介导的内吞途径是GAN-OMV进入巨噬细胞并发挥作用的主要途径,用共聚焦进一步观察发现OMV主要富集在巨噬细胞内的溶酶体上。3.纳米甘草酸结合波氏杆菌OMV对小鼠免疫应答的影响本研究设立GAN-OMV、Alum-OMV、OMV及空白对照四个组,用实验鼠进行免疫和攻毒试验。试验结果表明GAN-OMV的结合,不仅是一种稳定的赋形作用,而且还使其具有更好的免疫学性能。血常规检测表明GAN-OMV有效刺激淋巴细胞水平升高;间接ELISA结果表明,GAN-OMV能够刺激小鼠血清特异性Ig G抗体水平升高,并且有效刺激特异性抗体Ig G1和Ig G2a的水平升高;GAN-OMV能有效刺激脾脏淋巴细胞的增殖,提高了脾淋巴细胞中B细胞的水平和T细胞CD4+/CD8+比率,并促进了Th1型（IFN-γ）、Th2型（IL-4）和Th17（TNF-α和IL-6）细胞因子的分泌。以上结果均表明GAN-OMV能够有效诱导免疫小鼠的体液免疫与细胞免疫。此外,血清杀菌试验和肺部含菌量检测显示GAN-OMV更有效提升杀菌抗体水平,并显着减少攻毒后肺部含菌量,表明GAN-OMV能有效预防波氏杆菌的感染。
韩博[7]（2020）在《榄香烯对三阴性乳腺癌小鼠的治疗效果与作用机制研究》文中进行了进一步梳理乳腺癌的发病率和死亡率位居女性癌症患者首位。临床上通常根据其分型进行针对性治疗,主要包括化疗、激素治疗、靶向治疗和免疫治疗。其中,三阴性乳腺癌由于雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）和表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor-2,Her-2）表达均为阴性,无法从激素治疗和靶向治疗中获益。此外,三阴性乳腺癌比受体阳性的乳腺癌更易发生转移。当前主要依靠紫杉类、蒽环类、环磷酰胺和铂类药物的组合治疗,患者生存率较为低下。与此同时,由于这些传统的化疗方法缺少靶向性,通常会产生严重的毒副作用,一些年老体弱以及患有其他疾病的肿瘤患者难以耐受,因而出现无药可用的困境。中药作为肿瘤治疗的补充药物正得到越来越多的关注。莪术是传统中药中常用的活血化瘀类药材,早期的临床试验和相关基础研究发现其挥发油提取物榄香烯具有一定的抗肿瘤活性。既往的临床应用发现,榄香烯乳液在癌性胸腹水及消化道肿瘤的治疗方面具有一定疗效,且毒副作用相对较低,老年体弱的患者可耐受。然而,已有的研究报道主要集中于榄香烯的细胞毒机制,关于榄香烯的药理还有很多不明了之处,对临床应用的指导价值不足。本研究根据莪术的临床药理特点,从榄香烯对肿瘤微环境作用的角度出发,在分子、细胞、组织和动物整体水平上系统研究榄香烯对三阴性乳腺癌的治疗作用与机制,以期为临床应用提供理论和实验依据。本文使用CCK8（Cell Counting Kit-8）法检测了榄香烯对小鼠乳腺癌细胞株4T1、小鼠巨噬细胞株RAW264.7、人脐静脉内皮细胞株HUVEC、小鼠成纤维细胞株NIH3T3、大鼠心肌细胞株H9C2活性的影响,使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测了榄香烯对4T1细胞凋亡的影响。向6-8周龄雌性Balb/c小鼠乳腺脂肪垫内注射4T1细胞,建立三阴性乳腺癌原位移植瘤小鼠模型;给予每日一次腹腔注射榄香烯（1mg/kg,5mg/kg,10mg/kg和20mg/kg）治疗,设置不治疗对照组和每周腹腔注射一次紫杉醇（paclitaxel,PTX;20mg/kg）组。治疗3周后处死小鼠,摘取脏器进行组织病理研究。通过H&E染色观察肿瘤细胞在肝脏和肺脏的转移情况;通过免疫组化染色检测组织内HIF-1α、CD31、NLRP3、caspase1和IL-1β的表达;使用二氢乙啶（Dihydroethidium,DHE）作为荧光探针观察肿瘤组织内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。研究结果表明,当浓度低于20μg/mL及以下时,榄香烯对肿瘤细胞和正常细胞均未表现出明显的细胞毒性,当浓度为30μg/mL时,榄香烯具有显着的细胞毒作用,并诱导肿瘤细胞凋亡。根据细胞实验结果,在动物实验中使用了低中剂量进行治疗。生存实验的结果表明,榄香烯治疗组（1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg）与低剂量紫杉醇组（20mg/kg）乳腺癌小鼠的生存时间相近,均显着长于对照组乳腺癌小鼠。组织病理学研究表明,连续治疗3周后,低中剂量榄香烯乳（1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg）虽然对小鼠原位肿瘤的尺寸没有显着影响,但能够显着抑制肿瘤细胞向肺和肝脏的转移,同时对荷瘤小鼠脾脏肿大的现象有缓解作用。在机理研究方面,我们发现榄香烯通过下调乳腺癌小鼠肿瘤组织中HIF-1α及其下游蛋白CD31的表达而抑制肿瘤组织内血管新生,从而减少了肿瘤细胞的转移。与此同时,榄香烯能够抑制乳腺癌小鼠肿瘤组织中炎症小体NLRP3的表达,从而通过抑制Caspase-1活化而抑制IL-1β的表达,表明其具有抑制炎性反应的作用。电子自旋共振谱的检测结果表明,榄香烯具有清除活性氧（reactive oxygen species,ROS）的功能,包括DPPH、超氧阴离子和羟自由基。细胞实验结果显示,榄香烯显着降低脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）引起的小鼠巨噬细胞RAW264.7胞内ROS的升高和炎性因子Il-1β和Tnf-α转录水平的升高,证实榄香烯可通过清除ROS发挥其抑炎作用。在组织水平上,通过二氢乙啶染色观察到榄香烯治疗组小鼠肿瘤组织内的ROS水平显着下调,说明榄香烯可通过清除ROS来抑制HIF-1α和NLRP3的表达。综上,本研究通过细胞、组织和动物整体层次的系统实验,阐明榄香烯乳在低中剂量下细胞毒性较低且具有清除ROS的功能,通过减少乳腺肿瘤组织中的ROS而改善肿瘤组织的缺氧和炎性微环境,抑制了肿瘤新生血管的形成,降低了肿瘤细胞向肺和肝脏的转移,也缓解了荷瘤小鼠脾脏肿大的现象,延长了小鼠生存期。本研究的创新性在于揭示了榄香烯在主要通过对肿瘤组织微环境的改善调理而实现其抗肿瘤效应,而不是基于对肿瘤细胞的杀伤作用,但在高浓度下榄香烯对血管内皮和成纤维细胞具有较明显的细胞毒性。建议在临床应用中将榄香烯作为改善肿瘤微环境的治疗药物,而不宜将其作为细胞毒化疗药物。
李田宽[8]（2020）在《协同功能微泡构建及其在非小细胞肺癌治疗中的应用》文中研究表明研究背景:在世界范围内,肺癌的发病率和死亡率均是排在第一位,肺癌的主要类型是非小细胞肺癌（NSCLC）。以PD1/PD-L1等免疫检查点抑制剂（ICIs）目前已成为肺癌治疗领域最热门的抗肿瘤药物,ICIs通过降低肿瘤细胞免疫逃逸能力而治疗肿瘤。大量的临床试验结果显示免疫疗法已经成为与化疗、放疗等同样有效的治疗晚期非小细胞肺癌的手段,ICIs已被NCCN指南推荐为晚期肺癌的一线治疗方法。临床证据表明,化疗药物联合PD1/PD-L1检查点抑制剂的治疗效果优于单一药物治疗。然而,除了PD1/PD-L1检查点抑制剂的心脏毒性外,联合用药还会加重血液学毒性、肝毒性和神经毒性。因此,需要适当的给药系统来减少这两种药物的不良影响。本课题中,我们首先合成了在DTX的磷脂微泡,并在微泡表面连接anti PD-L1抗体,主动和被动靶向作用下,化疗药物在肿瘤细胞内内大量富集,促进肿瘤细胞凋亡并抑制跨越肿瘤细胞周期;在皮下瘤模型的基础上,我们建立了小鼠肺内肿瘤模型,验证了在低频超声的作用下,新型多功能微泡对小鼠肺部原位肿瘤的治疗效果。我们构建了肺癌不完全消融皮下瘤模型,将微泡用于微波不完全消融后的残余病灶的治疗,验证了此协同功能超声微泡对于微波不完全消融后残余病灶的控制效果和作用机制。第一部分协同功能微泡构建及其对肺癌细胞的作用目的:构建负载多西他赛（DTX）和anti-PD-L1 mAb的协同功能磷脂微泡（PDMs）并研究该微泡对肺癌细胞的杀伤作用。方法:通过薄膜水化法制备了负载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的磷协同功能磷脂微泡。通过电镜和激光共聚焦显微镜对微泡的形态进行观察,通过马尔文激光粒度分析仪检测粒径和Zeta电位,通过高效液相色谱方法检测微泡中的多西他赛包封率及载药率。我们同时检测了多西他赛的释放曲线,并对微泡的在体外和体内的成像能力进行了检测。通过微泡溶血实验和小鼠生化指标评估了微泡的生物安全性。通过激光共聚焦显微镜观察并流式细胞仪检测了,负载anti-PD-L1 mAb微泡对肺癌细胞的摄取药物的影响。通过流式细胞术检测了鼠源的LLC细胞、人源的NCI-H460、NCI-1299和A549细胞表面的PD-L1的表达情况,通过CCK-8方法检测了微泡对几种细胞肺癌细胞的杀伤作用与PD-L1表达的关系。通过流式细胞术检测了微泡促进LLC肿瘤细胞凋亡的能力和细胞周期抑制能力。结果:负载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的协同功能磷脂微泡具有较好的形态,粒径666.4±35.9 nm,包封率为57.34±2.61%,载药率为4.45±0.91%。超声作用下,微泡内的多西他赛释放速度明显提高,在微泡外连接anti-PD-L1 mAb对多西他赛的药物释放没有影响。激光共聚焦显微镜下显示荧光标记抗体的结合在微泡表面。超声成像下微泡有较好的增强效果,增强效果不受搭载药物和抗体的影响。体外实验证明微泡不会产生溶血效应,微泡对小鼠的生化指标无明显影响,对重要器官无明显损害。激光共聚焦显微镜和流式细胞术显示载有anti-PD-L1抗体的微泡能促进肺癌细胞对药物的吸收,低频超声击破微泡可以进一步增加肺癌细胞对药物的吸收。CCK-8实验显示负载了anti-PD-L1 mAb的微泡对肿瘤细胞增殖的抑制能力与肿瘤细胞表面PD-L1表达呈正相关,而低频超声辐照则增强了对肿瘤细胞的抑制作用。流式检测了微泡对肿瘤细胞凋亡的影响,结果显示超声辐照联合anti-PD-L1 mAb使肺癌细胞总凋亡比例最高,同时,anti-PD-L1 mAb的靶向作用和低频超声辐照可以增强多西他赛对肿瘤细胞周期的抑制作用。结论:通过薄膜水化法合成的负载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的协同功能磷脂微泡具有较好的成像能力,在低频超声作用下可以迅速释放药物,具有较好的生物安全性。该微泡可以促进肺癌细胞对药物的吸收,负载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的磷脂微泡对肿瘤细胞增殖有更强的抑制作用,在低频超声作用下能促进肺癌细胞的凋亡并能更好的抑制细胞周期。第二部分协同功能微泡（PDMs）对肺癌模型的治疗效果评价目的:建立小鼠肺癌皮下瘤模型及原位瘤模型,评估协同功能微泡对两种肺癌模型的治疗治疗效果。方法:建立小鼠肺癌皮下瘤模型,在微泡上搭载亲脂荧光探针DiR,分别标记多西他赛微泡（DMs）,载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的协同功能微泡（PDMs）,对比不同方法下（游离的DiR、DiR-DMs或DiR-PDMs经尾静脉注射,DiR-PDMs联合低频超声）在肿瘤部位的富集情况,评估了协同功能磷脂微泡超声击破后在药物肿瘤部位的富集能力,并通过活体成像对富集DiR的重要器官的进行成像观察组织分布。采用对照组（注射PBS）、Free DTX（注射游离DTX溶液）、Free combo（注射游离DTX和anti-PD-L1 mAb）、DMs、PDMs,协同治疗组（PDMs+US）不同治疗方法对小鼠皮下瘤模型进行治疗,观察了小鼠的体重、肿瘤大小、生存期差异,对肿瘤标本进行TUNEL和免疫组化染色（CD31、Ki67）、检测了肿瘤样本中CD4+、CD8+T淋巴细胞的改变,通过western blot方法对肿瘤组织中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 8、Cleaved-caspase 9,通过ELISA方法对TNF-α,TGF-βand VEGF进行了检测。在DSA引导下经过肺穿刺建立了小鼠肺肺内肿瘤模型,采用上述不同方案进行治疗,通过CT进行随访,观察肿瘤体积、小鼠体重、生存期的变化。结果:与游离DiR和DiR-DMs相比,DiR-PDMs在体内和体外的肿瘤组织中均表现出增强的信号,而在低频超声下这种信号强度进一步增强。DiR-PDMs联合低频超声在第1小时即可是肿瘤内达到最大药物浓度,单纯DiR-PDMs注射药物浓度在第6小时达到最大值,游离DiR和DiR-DMs在肿瘤内的富集程度始终较低。在皮下瘤模型中,PDMs联合US照射组的存活率最高,且对肿瘤生长抑制效果最好,单独使用PDMs的治疗效果优于自由药物组合,排在第二位。协同治疗比化疗有更明显的疗效,DMs对肿瘤体积抑制和生存率的治疗效果略有改善,组间体重差异不明显。在肿瘤组织免疫组化染色中,联合治疗组中TUNEL凋亡率最高,CD31、Ki67最低。PDMs联合US照射组肿瘤样本中浸润的CD4+、CD8+T细胞比例和数量最多,凋亡通道蛋白cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 8、cleaved-caspase 9表达也最高。同时,PDMs联合US照射组有最高的TNF-α和最低的TGF-β、VEGF。通过CT评估,结果显示联合治疗组有最低的肿瘤生长速度,最长的生存期和最好的生存状态。结论:皮下瘤模型显示,协同功能磷脂微泡联合超声可以促进药物更快地在肿瘤富集并获得最高的药物浓度,产生最好的治疗效果。该治疗方案在,肺内肿瘤模型中也能起到同样的治疗效果。第三部分协同功能微泡（PDBMs）对肺癌不完全消融模型的治疗效果评价目的:建立小鼠肺癌不完全消融模型,评估协同功能微泡对肺癌不完全消融模型的治疗效果。方法:通过薄膜水化法制备了负载多西他赛、Bindarit和anti-PD-L1 mAb的磷协同功能磷脂微泡（PDBMs）。通过电镜、紫外光谱仪检测了微泡的形态、光谱等指标,采用高效液相色谱方法测试了微泡中的多西他赛、Bindarit的包封率和载药率。通过动物生化指标和重要脏器的HE染色切片评估了微泡的生物安全性。采用45°C 15min为不完全微波消融组（iMWA）,65°C 15min为完全消融组,通过流式细胞术检测了微波消融+PDBMs对肺癌细胞凋亡的影响。通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测了微波消融+PDBMs对肺癌表达单核细胞趋化蛋白-1（CCL2、MCP-1）、钙网蛋白（CRT）、PD-L1的影响。将微波消融+PDBMs治疗后的肺癌细胞与DC细胞在Transwell小室内孵育,通过流式细胞术检测微波消融+PDBMs治疗后的肺癌细胞对小鼠骨髓来源DC细胞（BMDCs）活化的影响。将微波消融+PDBMs治疗后的肺癌细胞、BMDCs、T淋巴细胞共同孵育,通过流式细胞术检测Ki67和Granzyme B评价T淋巴细胞的增殖能力和杀伤能力。通过标本、活体肿瘤探索了构建不完全消融的微波参数。构建小鼠肺癌不完全消融模型并随机分为五组:对照组（Control）,不完全消融组（iMWA）,iMWA+DTX组,iMWA+Bindarit组,iMWA+PDBMs,随访肿瘤体积、计算生存时间并检测肺转移灶的数量。将组织标本通过TUNEL染色评价治疗不同方法对肿瘤凋亡的影响,通过Ki67染色评价肿瘤组织内的增殖能力。通过流式细胞术评价肿瘤组织内CD4+和CD8+T细胞比例,以及Treg细胞的比例。检测肿瘤组织内TGF-β、VEGF、IL-10细胞因子的水平。结果:我们成功合成了负载多西他赛、Bindarit和anti-PD-L1 mAb的磷协同功能微泡。电镜下微泡呈现规则的圆形,紫外光谱显示PDBMs的波形,HPLC检测结果显示PDBMs中DTX的包封率为35.56±5.86%,载药率为4.25±0.67%,Bindarit的包封率为37.85±6.75%,载药率为4.67±0.53%。经尾静脉注射PDBMs每七天一次,总共五次,生化指标随访均在正常范围内,心、肝、脾、肺、肾HE染色未见异常。完全消融组（c MWA）促进肺癌细胞凋亡的作用最强,iMWA、iMWA+DTX组、iMWA+Bindarit组和iMWA+PDBMs引起肺癌细胞总凋亡比例在40%50%之间。将干预后的各组通过共聚焦显微镜和流式细胞术检测CCL2表达,结果显示,c MWA组最弱,iMWA组较对照组CCL2表达上升,iMWA+DTX组与对照组无明显统计学差异,在Bindarit的作用下iMWA+Bindarit组和iMWA+PDBMs的CCL2表达下降。通过共聚焦和流式细胞术对治疗后肺癌细胞检测发现不完全消融后肺癌CRT表达上升,DTX、Bindarit和anti-PD-L1 mAb对CRT表达无明显影响,不完全消融、DTX、Bindarit对肺癌细胞表达PD-L1无明显影响。在对DC活化检测方面,iMWA+PDBMs组DC激活比例增加,同时DC的IL-12p70分泌也相应增加;在T淋巴细胞活化方面,iMWA+PDBMs相较其他组可以增强CD8+T细胞的增殖能力和Granzyme B的表达量。我们建立了不完全消融模型,五组治疗方案中,iMWA+PDBMs可以明显降低消融后肿瘤生长速度,延长生存期,减少转移结节数目。消融后肿瘤组织TUNEL染色和Ki67免疫组化结果显示,iMWA+PDBMs组肿瘤内比例最高,增殖能力最弱。对肿瘤组织进行流式细胞术检测结果显示,iMWA+PDBMs组CD4+和CD8+T细胞比例上升,其中CD8+T细胞上升更明显,Treg比例下降。对肿瘤内细胞因子检测显示,微波消融后TGF-β、VEGF上升,协同微泡治疗后肿瘤内TGF-β、VEGF、IL-10下降。结论:协同功能微泡PDBMs具有很好的生物安全性,协同功能微泡可以抑制肺癌细胞CCL2的表达,提高DC细胞和T淋巴细胞的活化比例,降低肺癌不完全消融灶的生长速率和肺转移灶数量并延长小鼠的生存期。协同功能微泡PDBMs对肺癌消融后的治疗具有很高的潜在应用价值。
薛宁[9]（2020）在《灸治乳腺癌：从减轻化疗毒副作用到抑制瘤体生长的探索》文中研究表明目的:艾灸治疗肿瘤,是当代针灸临床的新课题。如何运用艾灸治疗肿瘤,以往实践多关注于肿瘤放化疗后的毒副作用,对于肿瘤瘤体影响鲜少关注。本研究将以乳腺癌为例,以临床观察艾灸对乳腺癌患者化疗后骨髓抑制、胃肠道等毒副作用为起点,通过设计实验研究艾灸对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤瘤体生长抑制的影响,并从肿瘤微环境和免疫调节角度探讨艾灸抑制瘤体生长的免疫调节机制,旨在进一步探索“灸治肿瘤”理论与实践提供新的思路和解决方法。方法:临床研究:将符合入组条件的乳腺癌化疗患者随机分为对照组和观察组,每组30例。两组化疗患者均采用化疗周方案,对照组每次化疗前30 min使用注射用盐酸格拉司琼（3 mg+0.9%氯化钠注射液）,静脉滴注;治疗组在对照组基础上化疗当日即配合使用麦粒灸,每次取6 mg艾绒搓为麦粒大小艾柱在患者双侧足三里、及气海、关元穴施灸,每穴9壮,每日1次,连续7天。观察化疗第1、3、7天,两组患者胃肠道反应程度（恶心、呕吐）及骨髓抑制情况（白细胞、血小板和血红蛋白含量）。动物实验研究:将30只BALB/c小鼠按1:4随机分为正常组（6只）和模型组（24只）。将24只雌性BALB/C小鼠接种4T1乳腺癌细胞建立荷瘤模型;造模成功后,模型组随机分为模型对照组、紫杉醇干预组、艾灸干预组和紫杉醇+艾灸干预组,每组6只。模型对照组:自肿瘤细胞接种次日起,不予任何治疗及干预;紫杉醇干预组:当肿瘤长至100-200 mm3后,尾静脉注射cy7紫杉醇0.1 mL（1 mg/mL）;艾灸干预组:将艾绒搓成麦粒大小（约6mg）置于穴位上小鼠双侧足三里穴位处,线香点燃待艾绒烧尽后将直接按灭于施灸处,每穴3壮,每日1次,连续2周;紫杉醇+艾灸干预组:当肿瘤长至100-200 mm3后,尾静脉注射cy7紫杉醇0.1mL（1 mg/mL）后,同时进行艾灸干预。观察2周内小鼠体质量与瘤体体积变化及2周时各组瘤体质量,计算抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数,并进行瘤体组织病理形态学观察。血液分析仪测定全血白细胞计数及其分类的分布,ELISA法检测血清中IL-2、IFN-γ、IL-10和TGF-β1的表达,采用免疫组化、Western blot和qPCR检测肿瘤组织中CD-34、HIF-1α、VEGFA、PD-1和PD-L1的表达。结果:1、临床研究中,化疗第3、7天,治疗组患者恶心和呕吐症状与化疗后第1天相比得到明显改善（P<0.05）;与化疗前1天相比,化疗后第1天两组患者的白细胞含量显着性下降（P<0.05）,表明化疗药物会导致患者白细胞数目的下降;治疗组中化疗第3、7天白细胞含量明显高于同期对照组（P<0.05）。两组患者血红蛋白和血小板比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2、动物实验研究中,与紫杉醇组相比,艾灸+紫杉醇组小鼠的体重下降趋势明显减缓（P<0.05）;第14天艾灸组出现肿瘤细胞坏死、瘤体生长变缓;与肿瘤模型组小鼠相比,艾灸干预组组小鼠外周血中脏器指数和白细胞总数显着提高（P<0.05）;与紫杉醇组相比,艾灸+紫杉醇组小鼠外周血中脏器指数和白细胞总数显着提高（P<0.05）;与普通对照组相比,肿瘤模型组中IL-2、IFN-γ水平显着降低（P<0.05）,IL-10、TGF-β1水平显着升高（P<0.05）;与模型对照组相比,艾灸干预组中IL-2、IFN-γ水平升高（P<0.05）,IL-10、TGF-β1水平降低（P<0.05）。与模型对照组相比,艾灸组肿瘤组织中CD34、HIF-1α、VEGFA和PD-1、PD-L1蛋白及mRNA的表达降低（P<0.05）。结论:1.临床和动物实验表明,艾灸能够不同程度减轻乳腺癌化疗的毒副作用;且艾灸具有系统性调整的特点。2.动物实验表明,14天艾灸治疗可以出现肿瘤细胞坏死、瘤体生长变缓,呈现抑制瘤体生长的现象。3.艾灸通过增强小鼠免疫功能和调节细胞因子的表达,从而抑制肿瘤细胞生长。4.艾灸抑制肿瘤细胞生长,还可能与抑制肿瘤细胞免疫逃逸有关。
胡媛[10]（2020）在《胆固醇-磷酸酪氨酸偶联物的酶促自组装用于卵巢癌联合治疗的研究》文中指出卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤,恶性程度极高,晚期患者的5年生存率不足30%。手术联合化疗是其一线治疗方案,从铂类等传统化疗药物到分子靶向药物、免疫疗法,卵巢癌的治疗不断优化,但仍未在患者身上获得期待的疗效,我们亟需开发新模式下的抗肿瘤药物。酶促自组装（enzymeinstructed self-assembly,EISA）是一种新兴的抗肿瘤疗法,不同于传统药物依赖受体-配体通过干扰某一特定的细胞功能发挥抗癌作用,EISA的抗肿瘤作用往往是多步骤多方面的,具有选择性、高效性、不易耐药及生物安全性高的特点。此外,肿瘤的发展离不开它的“巢穴”—肿瘤微环境,肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是肿瘤微环境中数量最多的免疫细胞,其功能特点趋向于M2型巨噬细胞,利用巨噬细胞高可塑性的特点,使巨噬细胞由M2向M1的方向重塑,可以增强抗肿瘤作用。前期我们制备了一个胆固醇与磷酸酪氨酸偶联的小分子化合物（phosphotyrosine cholesterol,PTC）,在碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的作用下,酶解磷酸基团发生EISA。在本课题中我们结合体外和体内实验,研究了PTC的EISA对卵巢癌细胞的抑制作用、对巨噬细胞极性的调控以及在卵巢癌中的联合抗肿瘤作用。本课题分为以下三部分:（1）PTC的EISA对卵巢癌细胞的抑制作用及机制;（2）PTC的EISA对巨噬细胞极性的调控及机制;（3）PTC的EISA在卵巢癌中的联合抗肿瘤作用。研究目的:1.研究PTC的EISA对卵巢癌细胞的抑制作用及机制;2.研究PTC的EISA对巨噬细胞极性的调控及机制;3.研究PTC的EISA在卵巢癌中的联合抗肿瘤作用。研究方法:1.制备PTC,透射电镜检测PTC发生EISA前后的形态和粒径。运用TCGA数据库检索ALP在卵巢癌中的表达情况,运用ALP检测试剂盒检测卵巢癌细胞系及正常卵巢上皮细胞ALP的活性。运用CCK8试剂盒检测PTC对卵巢癌细胞的抑制作用,并比较PTC和顺铂对卵巢癌细胞的抑制效果。运用流式细胞术检测PTC对卵巢癌细胞凋亡的影响,运用Western blot检测PTC对卵巢癌细胞效应凋亡蛋白酶caspase-3、类固醇受体激活因子SRC及其下游AKT信号通路的影响。2.PMA诱导人单核细胞THP-1为巨噬细胞,IL-4、IL-13诱导巨噬细胞为M2型巨噬细胞,IL-4诱导鼠巨噬细胞RAW264.7为M2型巨噬细胞,q RT-PCR检测CD206、IL-10的表达变化。ALP检测试剂盒检测两种M2型巨噬细胞ALP的活性。运用CCK8试剂盒检测PTC对两种M2型巨噬细胞活力的影响。q RT-PCR检测PTC作用48h后,两种M2型巨噬细胞中CD206、IL-10、TNF-α、i NOS表达的变化。ELISA检测细胞上清液中IL-10、TNF-α分泌水平的变化。提取6例卵巢癌患者的腹水巨噬细胞,PTC作用48h后,流式细胞术检测腹水巨噬细胞CD206、CD86的变化。运用活性氧检测试剂盒,通过荧光显微镜、流式细胞术、酶标仪分别检测PTC对THP-1、RAW264.7来源的M2型巨噬细胞活性氧水平的影响。运用鬼笔环肽标记细胞骨架,通过免疫荧光、延长度检测PTC对THP-1、RAW264.7来源的M2型巨噬细胞细胞骨架的影响。3.运用transwell装置构建体外人源和鼠源卵巢癌细胞与M2型巨噬细胞的共培养体系,流式细胞术检测PTC对共培养体系中卵巢癌细胞凋亡的影响,以及对巨噬细胞CD206、CD86表达的影响。ELISA检测共培养体系上清液中IL-10、TNF-α分泌水平的变化。构建C57BL/6免疫健全小鼠的卵巢癌皮下瘤模型,观察PTC对皮下移植瘤生长情况的影响。运用免疫组化检测小鼠肿瘤组织中cleaved caspase-3的表达变化。制备小鼠肿瘤组织的单细胞悬液,运用流式细胞术检测小鼠肿瘤相关巨噬细胞中CD206、CD86表达的变化。免疫荧光检测小鼠肿瘤组织CD206、CD86、CD8及Foxp3表达的变化。通过小鼠体重的变化及小鼠心、肝、脾、肺、肾的HE染色进一步评估PTC在体内的生物安全性。研究结果:1.PTC在电镜下分布均匀,大小均一,加入ALP发生EISA后的形态呈圆形或椭圆形,分散性好,大小均一。PTC的粒径为7.4±1.2nm,加入ALP发生EISA后的粒径为17.3±2.4nm,粒径大小成正态分布。由TCGA数据库检索可知,ALP在卵巢癌中高表达。卵巢癌细胞系的ALP活性高于正常卵巢上皮细胞。PTC对卵巢癌细胞SKOV3、ID8的IC50分别是:5.48±0.082μg/ml,2.15±0.075μg/ml,PTC的EISA呈剂量依赖的方式有效抑制卵巢癌细胞的生长。顺铂对卵巢癌细胞SKOV3、ID8的IC50分别是:4.34±0.066μg/ml,3.41±0.066μg/ml,PTC的抑癌效率等同于或优于顺铂。PTC可上调卵巢癌细胞cleaved caspase-3的表达,细胞凋亡的比例显着升高。PTC可下调类固醇受体激活因子SRC的磷酸化水平,同时抑制其下游AKT通路的活化。2.ALP在THP-1和RAW264.7来源的M2型巨噬细胞中有活性,PTC对THP-1、RAW264.7来源的M2型巨噬细胞的IC50分别是:60.95±0.296μg/ml、76.79±0.502μg/ml。PTC的EISA可下调THP-1、RAW264.7来源的两种M2型巨噬细胞中CD206、IL-10的表达,上调TNF-α、i NOS的表达,减少巨噬细胞中IL-10的分泌,增加TNF-α的分泌。PTC的EISA可下调卵巢癌患者腹水巨噬细胞中CD68+CD206+的比例,降低CD206的平均荧光强度,CD68+CD86+的变化虽无统计学差异,但CD86的平均荧光强度升高。PTC作用于THP-1和RAW264.7来源的M2型巨噬细胞48h后,活性氧试剂盒检测细胞的活性氧水平,荧光显微镜显示细胞的荧光强度显着增加,流式细胞术显示阳性细胞数及平均荧光强度均增加,酶标仪显示细胞的OD值显着增加。鬼笔环肽标记细胞骨架actin,免疫荧光显微镜显示PTC作用后,THP-1和RAW264.7来源的M2型巨噬细胞的细胞形态由细长趋向圆形,延长度显着降低。3.在人源共培养体系（SKOV3与THP-1来源的M2型巨噬细胞）中,PTC作用下的SKOV3细胞凋亡比例升高,THP-1来源的M2型巨噬细胞中CD68+CD206+的比例降低,CD68+CD86+的比例升高,IL-10的分泌减少,TNF-α的分泌增加。在鼠源共培养体系（ID8与RAW264.7来源的M2型巨噬细胞）中,PTC作用下的ID8细胞凋亡比例升高,RAW264.7来源的M2型巨噬细胞中F4/80+CD206+的比例降低,F4/80+CD86+的比例升高,IL-10的分泌减少,TNF-α的分泌增加。体内实验中,PTC处理组小鼠的卵巢癌皮下瘤生长减慢,肿瘤大小小于对照组。免疫组化显示PTC处理组的肿瘤组织中cleaved caspase-3的表达显着高于对照组。流式细胞术显示PTC处理组的肿瘤组织中F4/80+CD206+的比例降低,CD206的平均荧光强度降低,F4/80+CD86+的比例升高。免疫荧光显示PTC处理组的肿瘤组织中CD206表达降低,CD86表达升高,CD8表达升高,Foxp3表达降低。PTC处理组的小鼠在用药期间的体重无明显减轻,变化趋势与对照组相似。PTC处理组的小鼠心、肝、脾、肺、肾的HE染色切片未见明显的病理改变。结论:1.PTC粒径适宜,分散均匀。PTC的EISA呈剂量依赖的方式有效抑制卵巢癌细胞的生长,其抑癌效率等同于或优于顺铂。PTC的EISA通过多途径发挥抑癌作用:既可激活caspase通路的级联活化,促进卵巢癌细胞的凋亡,又可抑制类固醇受体激活因子SRC及其下游AKT通路的活化,从而对卵巢癌细胞的生长起到抑制作用。2.PTC的EISA可调控THP-1、RAW264.7来源的M2型巨噬细胞及卵巢癌患者腹水巨噬细胞的极性,使其由M2向M1的方向重塑。机制研究表明PTC的EISA一方面可通过提高巨噬细胞中活性氧的水平,另一方面可通过改变细胞骨架来实现对巨噬细胞极性的调控。3.PTC的EISA既可抑制卵巢癌细胞的生长,又可重塑巨噬细胞的极性,PTC在细胞和动物水平上可发挥“一石二鸟”的联合抗肿瘤作用,同时PTC的EISA减弱了卵巢肿瘤微环境的免疫抑制状态。
二、紫杉醇对小鼠巨噬细胞免疫活性的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、紫杉醇对小鼠巨噬细胞免疫活性的影响（论文提纲范文）
（1）杜仲叶多糖偶联OVA脂质立方液晶对小鼠免疫活性探究（论文提纲范文）
| 本课题得到以下项目支持 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 植物多糖的研究概况 |
| 1.2 天然高分子化合物的偶联研究概况 |
| 1.2.1 天然高分子化合物的介绍及应用 |
| 1.2.2 天然高分子化合物的偶联方法 |
| 1.2.3 天然高分子化合物偶联物在生物医学的研究与应用 |
| 1.3 脂质立方液晶的研究 |
| 1.3.1 脂质立方液晶 |
| 1.3.2 脂质立方液晶作为载药体的优势 |
| 1.4 小结与展望 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 PsEUL的提取与优化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 主要药品及试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 杜仲叶多糖的提取 |
| 3.2.2 杜仲叶多糖红外光谱(IR)分析 |
| 3.2.3 硫酸苯酚法测定杜仲叶多糖的含量 |
| 3.2.4 杜仲叶多糖脱色方法 |
| 3.2.5 统计方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 杜仲叶多糖红外光谱分析 |
| 3.3.2 杜仲叶多糖含量测定结果 |
| 3.3.3 杜仲叶多糖脱色效果 |
| 3.4 分析讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 PsEUL-OVA的制备与表征 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 主要药品及试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 多糖与蛋白的偶联 |
| 4.2.2 PsEUL-OVA结构表征 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 PsEUL-OVA分离纯化 |
| 4.3.2 红外光谱分析 |
| 4.3.3 SDS-PAGE结果 |
| 4.3.4 扫描电镜结果 |
| 4.3.5 多糖与蛋白的结合程度 |
| 4.4 分析讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 PsEUL-OVA体内外免疫活性的探究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 试验细胞株 |
| 5.1.3 主要药品及试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 小鼠脾细胞培养 |
| 5.2.2 巨噬细胞培养 |
| 5.2.3 PsEUL-OVA对小鼠脾细胞毒性(细胞活性)试验 |
| 5.2.4 PsEUL-OVA对小鼠RAW264.7 巨噬细胞毒性(细胞活性)试验 |
| 5.2.5 PsEUL-OVA对小鼠脾细胞/巨噬细胞细胞因子分泌水平的影响 |
| 5.2.6 巨噬细胞吞噬试验 |
| 5.2.7 小鼠体内免疫分组及血清和免疫器官处理 |
| 5.2.8 流式细胞术分析 |
| 5.2.9 血清抗体水平测定 |
| 5.2.10 血清细胞因子分析 |
| 5.2.11 统计方法 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 体外试验结果 |
| 5.3.2 体内试验 |
| 5.4 分析讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 PsEUL-OVA脂质立方液晶(PsEUL-OVA/Cubs)的制备与表征 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 主要药品及试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 PsEUL-OVA/Cubs制备 |
| 6.2.2 PsEUL-OVA/Cubs结构表征 |
| 6.2.3 PsEUL-OVA/Cubs包封率与载药量测定 |
| 6.3 试验结果 |
| 6.3.1 透射电镜结果 |
| 6.3.2 偏光显微镜观察结果 |
| 6.3.3 Zeta电位和粒径分析结果 |
| 6.3.4 PsEUL-OVA/Cubs包封率与载药量测定结果 |
| 6.4 分析讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 第7章 PsEUL-OVA/Cubs体外免疫活性的探究 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 试验细胞株 |
| 7.1.2 主要药品及试剂 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 小鼠脾淋巴细胞培养 |
| 7.2.2 巨噬细胞培养 |
| 7.2.3 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠脾细胞毒性(细胞活性)试验 |
| 7.2.4 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠RAW264.7 巨噬细胞毒性(细胞活性)试验 |
| 7.2.5 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠脾细胞/巨噬细胞细胞因子分泌水平的影响 |
| 7.2.6 巨噬细胞吞噬试验 |
| 7.2.7 PsEUL-OVA/Cubs对RAW264.7 巨噬细胞免疫相关基因表达的影响 |
| 7.2.8 统计方法 |
| 7.3 试验结果 |
| 7.3.1 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠脾细胞毒性(细胞活性)试验结果 |
| 7.3.2 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠巨噬细胞活性试验结果 |
| 7.3.3 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠脾细胞/巨噬细胞细胞因子分泌水平的影响 |
| 7.3.4 巨噬细胞对PsEUL-OVA/Cubs吞噬试验 |
| 7.3.5 PsEUL-OVA/Cubs对RAW264.7巨噬细胞相关基因 |
| 7.4 分析讨论 |
| 7.5 本章小结 |
| 第8章 PsEUL-OVA/Cubs体内免疫活性的探究 |
| 8.1 试验材料 |
| 8.1.1 试验动物 |
| 8.1.2 主要药品及试剂 |
| 8.1.3 主要仪器 |
| 8.2 试验方法 |
| 8.2.1 小鼠体内免疫分组及血清和免疫器官处理 |
| 8.2.2 流式细胞术分析 |
| 8.2.3 血清抗体水平测定 |
| 8.2.4 血清细胞因子分析 |
| 8.2.5 统计方法 |
| 8.3 试验结果 |
| 8.3.1 小鼠免疫器官指数 |
| 8.3.2 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠血清中OVA特异性IgG的影响结果 |
| 8.3.3 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠血清细胞因子的影响结果 |
| 8.3.4 流式细胞术分析结果 |
| 8.4 分析讨论 |
| 8.5 本章小结 |
| 第9章 全文总结 |
| 9.1 结论 |
| 9.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）白头翁皂苷A3抑制巨噬细胞M2型极化抗三阴性乳腺癌转移的作用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 文献综述 三阴性乳腺癌的药物治疗研究进展 |
| 1. 三阴性乳腺癌的中医辨证 |
| 2. 三阴性乳腺癌的治疗药物 |
| 3. 小结 |
| 第一部分 白头翁皂苷A3 对巨噬细胞M2 型极化的作用及其机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 受试细胞 |
| 1.2 受试动物 |
| 1.3 受试药物及配备 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 小鼠骨髓来源巨噬细胞的分离及诱导培养 |
| 2.3 流式细胞术检测原代巨噬细胞BMDM的纯度 |
| 2.4 CCK-8 法检测白头翁皂苷A3对BMDM细胞存活率的影响 |
| 2.5 流式细胞术检测白头翁皂苷A3对M2型巨噬细胞表面标志性抗原CD206表达的影响 |
| 2.6 RT-qPCR法检测白头翁皂苷A3对M2 型巨噬细胞标志性基因mRNA表达的影响 |
| 2.7 Western-blotting检测白头翁皂苷A3对JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白表达水平的影响 |
| 2.8 分子对接方法预测白头翁皂苷A3 的作用靶标 |
| 2.9 RT-qPCR法检测si-RNA敲低STAT3 后白头翁皂苷A3对M2 型巨噬细胞标志性基因m RNA表达水平的影响 |
| 2.10 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 巨噬细胞纯度鉴定 |
| 3.2 白头翁皂苷A3 对BMDM细胞存活率的影响 |
| 3.3 白头翁皂苷A3 对巨噬细胞M2 型极化表面抗原CD206 表达的影响 |
| 3.4 白头翁皂苷A3对M2 型巨噬细胞标志性基因的mRNA表达水平的影响 |
| 3.5 白头翁皂苷A3对JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白表达水平的影响 |
| 3.6 白头翁皂苷A3 作用靶标的预测 |
| 3.7 siRNA敲低STAT3 后白头翁皂苷A3对M2 型巨噬细胞标志性基因m RNA表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化对三阴性乳腺癌转移的作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 受试细胞 |
| 1.2 受试药物及配备 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 4T1 细胞培养 |
| 2.2 条件培养基的制备 |
| 2.3 Transwell小室迁移实验检测白头翁皂苷A3 通过抑制巨噬细胞M2 型极化对4T1 细胞迁移能力的影响 |
| 2.4 细胞划痕实验检测白头翁皂苷A3 通过抑制巨噬细胞M2 型极化对4T1 细胞迁移能力的影响 |
| 2.5 CCK8 法检测白头翁皂苷A3 对M2 型巨噬细胞诱导的4T1 细胞增殖的影响 |
| 2.6 Transwell小室迁移实验检测白头翁皂苷A3 本身对4T1 细胞迁移能力的影响 |
| 2.7 细胞划痕实验检测白头翁皂苷A3 对M2 型巨噬细胞诱导的4T1 细胞迁移能力的影响 |
| 2.8 4T1 细胞体内转移模型 |
| 2.8.1 小鼠三阴乳腺癌4T1-Luc尾静脉接种肺转移模型建立 |
| 2.8.2 分组及给药 |
| 2.8.3 白头翁皂苷A3对4T1-Luc三阴性乳腺癌小鼠体重的影响 |
| 2.8.4 小动物活体成像检测白头翁皂苷A3对4T1-Luc三阴性乳腺癌小鼠体内荧光强度变化的影响 |
| 2.8.5 HE染色法检测白头翁皂苷A3对4T1-Luc尾静脉接种模型小鼠肺转移的影响 |
| 2.8.6 免疫组化法检测白头翁皂苷A3对4T1-Luc尾静脉接种模型小鼠肺组织CD206 表达的影响 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 白头翁皂苷A3 通过抑制巨噬细胞M2 型极化对4T1 细胞迁移能力的影响 |
| 3.2 白头翁皂苷A3 通过抑制巨噬细胞M2 型极化对4T1 细胞迁移能力的影响 |
| 3.3 白头翁皂苷A3 对M2 型巨噬细胞诱导的4T1 细胞增殖的影响 |
| 3.4 白头翁皂苷A3 本身对4T1 细胞迁移运动能力的影响 |
| 3.5 白头翁皂苷A3 本身对4T1 细胞迁移运动能力的影响 |
| 3.6 白头翁皂苷A3对4T1-Luc尾静脉接种肺转移小鼠肿瘤肺转移的影响 |
| 3.6.1 白头翁皂苷A3对4T1-Luc尾静脉接种肺转移小鼠体重的影响 |
| 3.6.2 白头翁皂苷A3对4T1-Luc尾静脉接种肺转移小鼠体内肿瘤荧光强度的影响 |
| 3.6.3 白头翁皂苷A3对4T1-Luc尾静脉接种肺转移小鼠肺组织肿瘤转移情况的影响 |
| 3.6.4 白头翁皂苷A3对4T1-Luc尾静脉接种模型小鼠肺组织CD206 蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 不足之处及后期计划 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 个人简介 |
（3）基于硫酸软骨素和大黄酸的声动力抗肿瘤纳米粒的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1.多糖骨架作为聚合物纳米载体的研究 |
| 2.以硫酸软骨素为亲水骨架的自组装纳米粒 |
| 3.环境响应型纳米载体 |
| 4.声动力治疗概述 |
| 5.大黄酸作为声敏剂的概述 |
| 6.全氟辛酸的概述 |
| 7.还原响应型的交联纳米粒概述 |
| 8.肿瘤缺氧 |
| 9.多烯紫杉醇概述 |
| 10.本研究的思路 |
| 第一章 还原敏感的硫酸软骨素-大黄酸-硫辛酸聚合物纳米粒的构建及理化性质考察 |
| 一、材料和仪器 |
| 1.材料 |
| 2.仪器 |
| 二、方法和结果 |
| 1.硫酸软骨素-大黄酸-硫辛酸(CS-ADH-Rh-LA)材料的构建 |
| 2.聚合物的结构表征 |
| 2.1 NMR图谱 |
| 2.2 FTIR图谱 |
| 2.3 取代度测定 |
| 2.3.1 Rh取代度的测定 |
| 2.3.1.1 Rh测定方法的确定 |
| 2.3.1.2 Rh的标准曲线 |
| 2.3.1.3 Rh的取代度测定结果 |
| 2.3.2 LA取代度的测定 |
| 2.3.2.1 LA测定方法的确定 |
| 2.3.2.2 LA的标准曲线 |
| 3.空白非交联以及交联纳米粒的构建 |
| 4.空白纳米粒理化性质考察 |
| 4.1 粒径和电位 |
| 4.2 透射电镜(TEM)观察 |
| 4.3 临界聚集浓度(CAC)的测定 |
| 5.DTX含量测定方法的建立 |
| 5.1 DTX储备液的制备 |
| 5.2 DTX检测波长的确定 |
| 5.3 HPLC条件 |
| 5.4 专属性考察 |
| 5.5 标准曲线的建立 |
| 5.6 精密度实验 |
| 5.7 DTX回收率实验 |
| 6.纳米粒中DTX的含量测定 |
| 7.载药量和包封率的计算 |
| 8.纳米粒载药能力的评价 |
| 8.1 载药非交联纳米粒的制备 |
| 8.1.1 载药方法的筛选 |
| 8.1.2 载药方法的优化 |
| 8.1.2.1 超声次数的考察 |
| 8.1.2.2 药物良溶剂的选择 |
| 8.1.2.3 药质比的筛选 |
| 8.2 载药交联/非交联纳米粒的制备及考察 |
| 9.纳米粒的稳定性考察 |
| 10.C-NPs还原敏感特性的研究 |
| 10.1 TEM及粒径分布考察 |
| 10.2 单态氧的测定 |
| 10.3 DTX的还原触发释放考察 |
| 11.溶血性实验 |
| 三、本章小结 |
| 第二章 载DTX的CS-ADH-Rh-LA纳米粒的体外评价 |
| 一、材料和仪器 |
| 1.材料 |
| 2.仪器 |
| 二、方法和结果 |
| 1. 细胞培养 |
| 1.1 细胞复苏 |
| 1.2 细胞传代 |
| 2.载香豆素6(C6)纳米粒制备 |
| 2.1 C6的含量测定 |
| 2.1.1 C6储备液的制备 |
| 2.1.2 C6标准曲线方程的建立 |
| 2.1.3 含量测定方法 |
| 3.细胞摄取能力的评价 |
| 4.C6/C-NPs通过细胞间转运方式传递 |
| 5.联合治疗增强细胞毒性 |
| 6.促进肿瘤细胞凋亡 |
| 7.活/死细胞实验 |
| 8.细胞中活性氧含量测定 |
| 9.对线粒体膜电位的逆转 |
| 10.细胞周期检测 |
| 11.微管形态聚集的观察 |
| 12.纳米粒的亚细胞共定位试验 |
| 13.对高尔基体结构的影响 |
| 14.TransweⅡ试验考察肿瘤侵袭能力 |
| 15.划痕实验评估肿瘤细胞转移 |
| 16.Western Blot检测蛋白的表达 |
| 16.1 细胞培养及总蛋白提取 |
| 16.2 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 三、本章小结 |
| 第三章 对以CS-ADH-Rh-LA聚合物构建的DTX/C-NPs的体内评价 |
| 一、材料和仪器 |
| 1.材料 |
| 2.仪器 |
| 3.实验用动物 |
| 二、方法与结果 |
| 1.DiR的含量测定 |
| 1.1 DiR储备液的制备 |
| 1.2 DiR标准曲线方程的建立 |
| 1.3 含量测定方法 |
| 2.构建肺癌A549荷瘤Balb/c的裸鼠模型 |
| 3.C-NPs在小鼠体内分布研究 |
| 4.肿瘤组织体外渗透实验 |
| 5.体内抗肿瘤实验 |
| 6.血清成分的测定 |
| 6.1 血清白介素因子的ELISA测定 |
| 6.2 小鼠肝和肾功能的指标测定 |
| 6.2.1 血清AST和ALT的测定 |
| 6.2.2 血清CREA和BUN的测定 |
| 7.肿瘤中转移相关蛋白的测定 |
| 8.免疫荧光染色观察血管及M2型巨噬细胞 |
| 9.组织安全性考察 |
| 10.肿瘤组织细胞凋亡的检测 |
| 三、本章小结 |
| 第四章 携氧还原敏感型硫酸软骨素-大黄酸-全氟辛酸纳米粒的构建及理化性质考察 |
| 一、材料和仪器 |
| 1.材料 |
| 2.仪器 |
| 二、方法和结果 |
| 1.硫酸软骨素-胱胺-大黄酸-全氟辛酸聚合物(CS-cys-Rh-PFC)的合成 |
| 1.1 CS-cys-Rh的合成 |
| 1.1.1 Rh检测方法的确立 |
| 1.1.1.1 Rh的专属性考察 |
| 1.1.1.2 Rh测定的精密度实验 |
| 1.1.1.3 Rh测定的回收率实验 |
| 1.1.2 合成方法的考察 |
| 1.1.3 Rh与CS-cys投料比的考察 |
| 1.1.4 乙醇浓度的考察 |
| 1.1.5 沉淀时间的考察 |
| 1.2 CS-cys-Rh-PFC的合成 |
| 2.聚合物的结构表征 |
| 2.1 NMR图谱 |
| 2.2 FTIR图谱 |
| 3.空白纳米粒的构建 |
| 4.空白纳米粒理化性质考察 |
| 4.1 粒径和电位 |
| 4.2 TEM结果 |
| 4.3 CAC的测定 |
| 5.溶解氧含量的测定 |
| 6.DTX含量测定方法的建立 |
| 6.1 DTX储备液的制备 |
| 6.2 DTX检测波长的确定 |
| 6.3 HPLC条件 |
| 6.4 专属性考察 |
| 6.5 标准曲线方程的建立 |
| 6.6 精密度实验 |
| 6.7 DTX回收率实验 |
| 7.载药量和包封率测定 |
| 8.药质比的筛选 |
| 9.稳定性考察 |
| 10.还原稳定性 |
| 10.1 通过TEM及DLS方法观察 |
| 10.2 DTX和Rh的还原敏感性释放测定 |
| 11.单态氧的测定 |
| 12.溶血率考察 |
| 三、本章小结 |
| 第五章 DTX/CRP-NPs的体外生物学评价 |
| 一、材料和仪器 |
| 1.材料 |
| 2.仪器 |
| 二、方法和结果 |
| 1.细胞培养 |
| 2.载C6的纳米粒的制备及测定 |
| 3.细胞摄取能力的增强 |
| 4.联合治疗增强了对细胞的毒性 |
| 5.细胞凋亡程度的增加 |
| 6.活/死细胞实验 |
| 7.细胞中活性氧含量测定 |
| 8.细胞周期检测 |
| 9.微管形态观察 |
| 10.纳米粒在高尔基体的靶向研究 |
| 11.钙网蛋白外翻能力的考察 |
| 12.Western Blot检测蛋白的表达 |
| 12.1 细胞培养及总蛋白提取 |
| 12.2 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 三、本章小结 |
| 第六章 对以CS-cys-Rh-PFC聚合物构建的DTX/CRP-NPs的体内评价 |
| 一、材料和仪器 |
| 1.材料 |
| 2.仪器 |
| 3.实验用动物 |
| 二、方法和结果 |
| 1.DiR的含量测定 |
| 2.B16F10细胞荷瘤C57BL/6N小鼠模型的构建 |
| 3.CRP-NPs在小鼠体内分布研究 |
| 4.体内单线态氧生成能力的评估 |
| 5.体内缺氧环境的改善 |
| 6.纳米粒中DTX的药代动力学研究 |
| 6.1 DTX的测定方法 |
| 6.1.1 色谱条件 |
| 6.1.2 血浆的处理方法 |
| 6.1.3 专属性考察 |
| 6.1.4 DTX标准曲线方程的建立 |
| 6.1.5 精密度考察 |
| 6.1.6 回收率考察 |
| 6.2 大鼠的药代动力学实验 |
| 6.2.1 分组和给药方法 |
| 6.2.2 药代动力学结果 |
| 7.抗肿瘤实验 |
| 8.对血清内细胞因子的考察 |
| 9.体内抗肿瘤免疫应答的研究 |
| 9.1 肿瘤组织中T细胞的表达 |
| 9.1.1 FCM考察肿瘤组织中T细胞的表达 |
| 9.1.2 免疫荧光染色法考察T细胞的表达 |
| 9.2 小鼠体内淋巴结中DCs的成熟情况研究 |
| 10.肿瘤组织切片考察 |
| 11.安全性考察 |
| 三、本章小结 |
| 全文总结与展望 |
| 1. 全文总结 |
| 2. 创新点 |
| 3. 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）兰坪虫草多糖缓解博来霉素引起的小鼠肺纤维化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺纤维化的研究概况 |
| 1.1.1 肺纤维化的发病机制 |
| 1.1.2 肺纤维化的治疗现状 |
| 1.2 多糖的概述 |
| 1.2.1 多糖的结构分析 |
| 1.2.2 多糖的药理活性研究 |
| 1.3 兰坪虫草的研究进展 |
| 1.3.1 兰坪虫草的成分研究 |
| 1.3.2 兰坪虫草的活性研究 |
| 1.4 本课题研究的目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 兰坪虫草多糖缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和仪器 |
| 2.2.1 实验动物材料 |
| 2.2.2 实验主要试剂 |
| 2.2.3 实验主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠肺纤维化模型制备方法 |
| 2.3.2 实验动物的分组及给药 |
| 2.3.3 实验动物的处理与标本采集 |
| 2.3.4 小鼠生理状况观察与测定 |
| 2.3.5 肺组织病理学检测及评分 |
| 2.3.6 肺组织重要生理生化指标检测 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 兰坪虫草多糖对肺纤维化小鼠生活状态的影响 |
| 2.5.2 兰坪虫草多糖对肺纤维化小鼠肺组织形态及肺系数的影响 |
| 2.5.3 兰坪虫草多糖明显降低了肺纤维化小鼠肺组织病理学评分 |
| 2.5.4 兰坪虫草多糖显着降低了肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量 |
| 2.5.5 兰坪虫草多糖显着改善了肺纤维化小鼠肺部氧化应激状态 |
| 2.6 讨论与小结 |
| 第3章 兰坪虫草多糖对小鼠肺纤维化的治疗机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和仪器 |
| 3.2.1 实验动物材料 |
| 3.2.2 实验主要试剂 |
| 3.2.3 实验主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验动物的处理与标本收集 |
| 3.3.2 实时荧光定量PCR检测 |
| 3.3.3 蛋白质免疫印迹分析法检测 |
| 3.3.4 免疫组织化学检测 |
| 3.3.5 免疫荧光检测 |
| 3.4 统计分析 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 兰坪虫草多糖显着减少肺巨噬细胞的募集 |
| 3.5.2 兰坪虫草多糖有效抑制促炎因子和促纤维化因子的表达 |
| 3.5.3 兰坪虫草多糖明显提高肺组织细胞自噬水平 |
| 3.5.4 兰坪虫草多糖明显抑制PI3K/ AKT/ m TOR信号通路的表达 |
| 3.5.5 兰坪虫草多糖显着减少ECM沉积 |
| 3.6 讨论与小结 |
| 第4章 结论及展望 |
| 4.1 研究结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（5）肺癌免疫化疗及LCN2干预治疗的探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤多样性与肿瘤转移 |
| 1.1.1 肿瘤微环境的多样性 |
| 1.1.2 肿瘤转移 |
| 1.2 肺癌多样性 |
| 1.2.1 肺癌种类的多样性 |
| 1.2.2 肺癌微环境的成分多样性 |
| 1.2.3 肺癌免疫逃逸的多样性 |
| 1.3 免疫原性细胞死亡 |
| 1.3.1 未折叠蛋白反应与内质网压力 |
| 1.3.2 危险相关的模式分子DAMP |
| 1.3.3 基于ICD的治疗方案 |
| 1.4 肺癌的药物治疗 |
| 1.4.1 靶向肿瘤细胞治疗 |
| 1.4.2 靶向血管生成治疗 |
| 1.4.3 免疫治疗 |
| 1.5 肿瘤恶液质 |
| 1.5.1 肿瘤恶液质的临床症状 |
| 1.5.2 肿瘤恶液质的机制及临床治疗 |
| 1.6 铁死亡 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 临床标本 |
| 2.1.3 动物体内实验相关试剂 |
| 2.1.4 细胞系及培养试剂 |
| 2.1.5 菌体培养相关试剂 |
| 2.1.6 质粒提取及转染相关试剂 |
| 2.1.7 小鼠鉴定试剂 |
| 2.1.8 流式细胞术相关试剂 |
| 2.1.9 细胞分选试剂 |
| 2.1.10 细胞杀伤相关试剂 |
| 2.1.11 RNA提取及逆转录相关试剂 |
| 2.1.12 免疫荧光相关试剂 |
| 2.1.13 免疫组化相关试剂 |
| 2.1.14 ELISA试剂 |
| 2.1.15 western blot试剂 |
| 2.1.16 组织及血清铁检测试剂 |
| 2.1.17 脂肪过氧化及脂肪ROS检测试剂 |
| 2.1.18 实时荧光定量PCR试剂 |
| 2.2 实验耗材与仪器 |
| 2.2.1 实验耗材 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 肿瘤细胞系流式检测 |
| 2.3.3 肿瘤细胞系免疫荧光 |
| 2.3.4 小鼠鉴定 |
| 2.3.5 Cre及LCN2过表达慢病毒制备 |
| 2.3.6 小鼠皮下瘤模型的构建及治疗 |
| 2.3.7 LLC细胞肺转移模型构建及治疗 |
| 2.3.8 Kras小鼠自发肺癌的诱导及治疗 |
| 2.3.9 Kras自发肺癌瘤传瘤模型构建及治疗 |
| 2.3.10 体内细胞清除及治疗 |
| 2.3.11 LLC细胞诱导的小鼠恶液质模型构建及治疗 |
| 2.3.12 体内LCN2过表达 |
| 2.3.13 肺癌PDX诱导的小鼠恶液质模型的构建 |
| 2.3.14 小鼠流式细胞术检测 |
| 2.3.15 NK细胞分选及体外杀伤 |
| 2.3.16 中性粒细胞及巨噬细胞分选及PCR检测 |
| 2.3.17 ELISA |
| 2.3.18 组织HE染色 |
| 2.3.19 组织免疫组化 |
| 2.3.20 组织免疫荧光 |
| 2.3.21 组织RNA提取及RT-PCR |
| 2.3.22 western blot |
| 2.3.23 组织及细胞实时荧光定量PCR |
| 2.3.24 组织及血清铁含量检测 |
| 2.3.25 脂肪组织脂质过氧化检测 |
| 2.3.26 脂肪细胞脂质ROS检测 |
| 2.3.27 血清蛋白芯片 |
| 2.3.28 脂肪组织RNA seq |
| 2.3.29 统计分析 |
| 第三章 曲美替尼联合IL-12有效治疗KRAS驱动的肺癌 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 曲美替尼上调肺癌肿瘤细胞的免疫原性 |
| 3.3 曲美替尼联合IL-12有效抑制LLC皮下瘤的生长,并在体内上调肿瘤细胞的免疫原性 |
| 3.4 曲美替尼联合IL-12有效抑制Kras突变驱动的自发肺癌的生长,并在体内上调肿瘤细胞的免疫原性 |
| 3.5 曲美替尼联合IL-12有效抑制Kras自发肺癌组织来源的移植瘤的生长,并在体内上调肿瘤细胞的免疫原性 |
| 3.6 曲美替尼联合IL-12明显促进肺癌微环境中T和NK细胞的活化 |
| 3.6.1 曲美替尼联合IL-12明显促进Kras自发肺癌组织来源的移植瘤中T细胞和NK细胞的活化 |
| 3.6.2 曲美替尼联合IL-12明显促进LLC肺转移肿瘤中T和NK细胞的活化 |
| 3.6.3 曲美替尼联合IL-12明显促进Kras自发肺癌早期肺脏中T和NK细胞的活化 |
| 3.6.4 曲美替尼联合IL-12明显降低Kras自发肺癌早期肺脏中免疫抑制性细胞的比例 |
| 3.6.5 曲美替尼联合IL-12明显促进Kras自发肺癌中期肺脏中T和NK细胞的活化 |
| 3.7 曲美替尼联合IL-12明显上调肺癌微环境中NK细胞及CD8+T细胞的抗肿瘤能力 |
| 3.7.1 曲美替尼联合IL-12明显促进肺癌微环境中NK细胞及CD8+T细胞的抗肿瘤功能分子的表达 |
| 3.7.2 曲美替尼联合IL-12明显促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力 |
| 3.7.3 曲美替尼联合IL-12治疗依赖于NK和CD8+T细胞发挥抗肿瘤功能 |
| 3.8 讨论 |
| 第四章 LCN2驱动肿瘤恶液质引发的全身性组织萎缩 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 恶液质病人体内高表达LCN2 |
| 4.3 建立LLC细胞诱导的恶液质小鼠模型 |
| 4.4 恶液质小鼠体内高表达LCN2 |
| 4.5 LCN2促进小鼠恶液质的发生 |
| 4.6 恶液质状态下LCN2主要由中性粒细胞产生 |
| 4.6.1 恶液质小鼠多种组织中髓系细胞增加 |
| 4.6.2 恶液质小鼠及病人的LCN2主要产生自中性粒细胞 |
| 4.7 清除中性粒细胞明显缓解恶液质造成的萎缩 |
| 4.8 抗体清除LCN2明显缓解恶液质造成的萎缩 |
| 4.9 恶液质小鼠脂肪细胞铁死亡途径上调导致脂肪组织萎缩 |
| 4.10 铁死亡抑制剂DFO治疗明显缓解恶液质造成的萎缩 |
| 4.11 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间获得的主要成果 |
| 附录 |
（6）纳米甘草酸增强家兔波氏杆菌OMV免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 革兰氏阴性菌外膜囊泡(OMV)研究进展 |
| 1.1 OMV的生物发生 |
| 1.1.1 包膜交联的调节 |
| 1.1.2 膜曲率诱导分子的聚集 |
| 1.1.3 磷脂积累 |
| 1.2 OMV的生物医学应用 |
| 1.2.1 OMV作为细菌疫苗 |
| 1.2.2 OMV作为疫苗佐剂 |
| 1.2.3 OMV作为癌症免疫治疗剂 |
| 1.2.4 OMV作为药物传递载体 |
| 1.3 展望 |
| 2 甘草酸的药理作用及其纳米化的研究进展 |
| 2.1 甘草酸的药理作用 |
| 2.1.1 抗炎症作用 |
| 2.1.2 器官保护作用 |
| 2.1.3 免疫调节作用 |
| 2.1.4 其他药理作用 |
| 2.2 纳米化研究 |
| 2.2.1 纳米载体包裹甘草酸的研究 |
| 2.2.2 甘草酸自组装纳米载体应用于多种药物的递送 |
| 2.3 展望 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 兔波氏杆菌外膜囊泡的制备及其蛋白质成分分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及主要试剂 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 OMV制备方法的筛选 |
| 1.2.2 OMV制备条件的优化 |
| 1.2.3 OMV理化性质的研究 |
| 1.3 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 OMV最优制备工艺的建立 |
| 2.2 OMV理化性质研究 |
| 2.2.1 OMV的 TEM、SEM和粒径检测结果 |
| 2.2.2 OMV蛋白成分的分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 纳米甘草酸结合波氏杆菌OMV体外对小鼠巨噬细胞活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验细胞及主要试剂 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 GAN的制备及理化性质研究 |
| 1.2.2 GAN结合波氏杆菌OMV的制备及评价 |
| 1.2.3 FITC-GAN的制备和OMV的荧光标记 |
| 1.2.4 巨噬细胞的培养 |
| 1.2.5 CCK-8 法检测GAN-OMV对巨噬细胞增殖的影响 |
| 1.2.6 巨噬细胞体外细胞因子的分泌 |
| 1.2.7 GAN-OMV在巨噬细胞内的分布 |
| 1.2.8 巨噬细胞吞噬GAN-OMV的途径 |
| 1.3 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 纳米甘草酸结合波氏杆菌OMV理化性质研究 |
| 2.1.1 GAN理化性质研究 |
| 2.1.2 GAN-OMV理化性质研究 |
| 2.2 GAN-OMV对巨噬细胞增殖的影响 |
| 2.3 GAN-OMV对巨噬细胞细胞因子分泌的影响 |
| 2.4 GAN-OMV富集到巨噬细胞的作用途径 |
| 3 讨论 |
| 第四章 纳米甘草酸结合波氏杆菌OMV对小鼠免疫活性的评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物及主要试剂 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 疫苗制备 |
| 1.2.2 试验动物免疫 |
| 1.2.3 小鼠血清Ig G抗体及其亚型检测 |
| 1.2.4 小鼠血清细胞因子的检测 |
| 1.2.5 小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应检测 |
| 1.2.6 小鼠脾脏淋巴细胞上清细胞因子检测 |
| 1.2.7 小鼠B淋巴细胞和T淋巴细胞的流式检测 |
| 1.2.8 建立波氏杆菌血清杀菌试验 |
| 1.2.9 免疫小鼠攻毒后肺部含菌量的检测 |
| 1.3 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 GAN-OMV对小鼠淋巴细胞水平的影响 |
| 2.2 GAN-OMV对抗原特异性抗体及其亚型水平的影响 |
| 2.3 GAN-OMV对脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.4 GAN-OMV对 T细胞、B细胞数量的影响 |
| 2.5 脾脏淋巴细胞上清、血清细胞因子水平的检测 |
| 2.6 补体介导的小鼠血清杀菌试验 |
| 2.7 GAN-OMV对攻毒后肺部含菌量的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（7）榄香烯对三阴性乳腺癌小鼠的治疗效果与作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 榄香烯简介 |
| 1.2 榄香烯抗肿瘤效应 |
| 1.2.1 引起细胞周期阻滞 |
| 1.2.2 诱导细胞凋亡 |
| 1.2.3 抑制血管生成 |
| 1.2.4 抑制肿瘤细胞侵袭和转移 |
| 1.2.5 逆转耐药及放、化疗增敏 |
| 1.3 榄香烯临床试验研究概述 |
| 1.3.1 恶性胸腹腔积液 |
| 1.3.2 中晚期肝癌 |
| 1.3.3 肺癌 |
| 1.3.4 胃癌 |
| 1.3.5 其他肿瘤 |
| 1.4 本课题研究思路 |
| 第二章 实验材料、仪器设备和实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞来源和相关培养试剂 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 PCR引物 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.1.6 溶液配制 |
| 2.2 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞活性检测（CCK8方法） |
| 2.3.3 Annexin V-FITC/PI试剂食检测细胞凋亡 |
| 2.3.4 DCFH-DA探针方法检测巨噬细胞内ROS |
| 2.3.5 qRT-PCR检测巨噬细胞Il-1β和Tnf-α的表达 |
| 2.3.6 电子顺磁共振波谱(ESR)法检测ROS |
| 2.3.7 乳腺癌原位移植瘤模型建立 |
| 2.3.8 榄香烯治疗乳腺癌原位移植瘤小鼠预实验 |
| 2.3.9 治疗效果评价实验 |
| 2.3.10 生存期实验 |
| 2.3.11 统计学分析 |
| 第三章 榄香烯抗乳腺癌肿瘤活性研究 |
| 3.1 榄香烯的细胞毒性 |
| 3.2 榄香烯对乳腺癌移植瘤小鼠的治疗作用 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 榄香烯抗乳腺癌肿瘤的作用机制研究 |
| 4.1 榄香烯对肿瘤缺氧微环境的调控和抑制肿瘤血管形成与转移 |
| 4.2 榄香烯对肿瘤组织炎性微环境的影响 |
| 4.3 榄香烯对活性氧(ROS)的影响 |
| 4.3.1 榄香烯对ROS的清除作用 |
| 4.3.2 榄香烯对肿瘤组织中ROS的清除作用 |
| 4.4 榄香烯对巨噬细胞的作用 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 展望 |
| 全文参考文献 |
| 附录1 非论文综述 肿瘤微环境与肿瘤细胞糖代谢 |
| 参考文献 |
| 附录2 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）协同功能微泡构建及其在非小细胞肺癌治疗中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词注释表 |
| 绪论 |
| 文献综述一 具有免疫治疗作用的协同功能微泡研究进展 |
| 文献综述二 微波消融在肺癌的治疗中的研究进展 |
| 第一部分 协同功能微泡构建及其对非小细胞肺癌细胞的作用及其机制 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二部分 载多西他赛和anti-PD-L1 mAb的协同功能微泡在超声下协同治疗非小细胞肺癌 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三部分 载多西他赛、Bindarit和anti-PD-L1 mAb的协同功能微泡治疗肺癌微波消融残余灶 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）灸治乳腺癌：从减轻化疗毒副作用到抑制瘤体生长的探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一章 理论研究 |
| 1. 乳腺癌发病及研究进展 |
| 1.1 国内外流行病学研究 |
| 1.2 发病机制研究 |
| 1.3 分型分类研究 |
| 2. 乳腺癌患者治疗及其毒副作用 |
| 2.1 乳腺癌治疗方法 |
| 2.2 治疗后毒副反应及干预 |
| 3. 灸治肿瘤 |
| 3.1 艾灸减轻化疗后毒副作用 |
| 3.2 艾灸对肿瘤免疫影响的研究 |
| 3.3 艾灸通过调节基因调控、蛋白表达发挥抗肿瘤作用 |
| 3.4 艾灸调节其它因素发挥抗肿瘤作用 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 艾灸降低乳腺癌化疗所致毒副反应的临床疗效观察 |
| 1. 临床实验资料 |
| 1.1 病例资料 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳排标准 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 医学伦理原则与质量控制 |
| 1.6 安全性评价 |
| 1.7 治疗方案 |
| 1.8 统计学方法 |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 两组乳腺癌患者基线资料对比 |
| 2.2 两组乳腺癌患者白细胞计数比较 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 艾灸对乳腺癌化疗毒副反应的影响 |
| 3.2 初步结论 |
| 3.3 存在的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 基础实验研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与仪器 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 试剂配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 造模、分组与处理 |
| 2.2 小鼠体质量与肿瘤体积、质量的测定 |
| 2.3 组织病理形态学观察 |
| 2.4 脏器指数测定 |
| 2.5 外周血白细胞及其分类计数检测 |
| 2.6 血清细胞因子检测 |
| 2.7 免疫组化化学技术 |
| 2.8 Western Blot法检测蛋白的表达 |
| 2.9 qPCR检测基因的表达 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 不同干预组对乳腺癌小鼠体质量影响 |
| 3.2 不同干预组对乳腺癌小鼠抑瘤效应差异的比较 |
| 3.3 不同干预组对乳腺癌小鼠肿瘤组织形态的影响 |
| 3.4 不同干预组对乳腺癌小鼠脏器指数的影响 |
| 3.5 不同干预组对小鼠外周血中白细胞及其分类计数的影响 |
| 3.6 不同干预组对乳腺癌小鼠血清细胞因子的影响 |
| 3.7 不同干预组对乳腺癌小鼠微血管及微环境相关蛋白的影响 |
| 3.8 不同干预组对乳腺癌小鼠PD-1和PD-L1表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 艾灸抑制肿瘤生长的效应证据 |
| 4.2 艾灸抑制肿瘤瘤体生长的可能机制 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1. 研究结果与结论 |
| 1.1 研究结果 |
| 1.2 研究结论 |
| 2 问题与展望 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）胆固醇-磷酸酪氨酸偶联物的酶促自组装用于卵巢癌联合治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 绪论 |
| 第一部分 PTC的EISA对卵巢癌细胞的抑制作用及机制 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 PTC的EISA对巨噬细胞极性的调控及机制 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分 PTC的EISA在卵巢癌中的联合抗肿瘤作用 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 全文小结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和科研成果 |
四、紫杉醇对小鼠巨噬细胞免疫活性的影响（论文参考文献）
- [1]杜仲叶多糖偶联OVA脂质立方液晶对小鼠免疫活性探究[D]. 杨杰. 西南大学, 2021
- [2]白头翁皂苷A3抑制巨噬细胞M2型极化抗三阴性乳腺癌转移的作用研究[D]. 刘雅慧. 江西中医药大学, 2021
- [3]基于硫酸软骨素和大黄酸的声动力抗肿瘤纳米粒的研究[D]. 张雅楠. 山东大学, 2021(11)
- [4]兰坪虫草多糖缓解博来霉素引起的小鼠肺纤维化[D]. 江敏. 昆明理工大学, 2021(01)
- [5]肺癌免疫化疗及LCN2干预治疗的探究[D]. 王栋. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [6]纳米甘草酸增强家兔波氏杆菌OMV免疫效果的研究[D]. 南黎. 浙江师范大学, 2021(02)
- [7]榄香烯对三阴性乳腺癌小鼠的治疗效果与作用机制研究[D]. 韩博. 北京协和医学院, 2020(02)
- [8]协同功能微泡构建及其在非小细胞肺癌治疗中的应用[D]. 李田宽. 东南大学, 2020(02)
- [9]灸治乳腺癌：从减轻化疗毒副作用到抑制瘤体生长的探索[D]. 薛宁. 南京中医药大学, 2020(01)
- [10]胆固醇-磷酸酪氨酸偶联物的酶促自组装用于卵巢癌联合治疗的研究[D]. 胡媛. 上海交通大学, 2020