一、植物转基因沉默与病毒抗性（论文文献综述）
朱鹏翔[1]（2021）在《NbLTP1调控烟草系统性抗性防御TMV侵染的作用机理及其抗体制备》文中提出非特异性脂质转移蛋白（nsLTPs）是存在于高等植物中富含半胱氨酸的小分子碱性蛋白,属于病程相关蛋白家族,据报道,它们在植物的各种生理过程中发挥着重要作用,如脂质传递、信号转导和病原菌防御等。然而,这些蛋白在植物免疫应答中的潜在分子机制尚不清楚。为研究nsLTPs在调控植物应答生物与非生物胁迫的反应中起的作用,本研究以本氏烟（Nicotiana benthamiana）为材料,成功克隆非特异脂质转移蛋白NbLTP1全长基因,其开放阅读框序列为360bp,编码119个氨基酸,分子量为12.44kDa,为疏水性蛋白,等电点为7.45,并预测和分析了 NbLTP1蛋白结构。NbLTP1蛋白含有8个保守的半胱氨酸残基和2个保守的五肽结构域,并在N端存在信号肽,存在跨膜区,包含7个α螺旋,4对二硫键和1个稳定的疏水腔,在进化上高度保守。另外,本氏烟NbLTP1与烟草NaLTP1高度同源。以上结果表明,NbLTP1属于LTP家族中的Type Ⅰ类。目前有关烟草中NbLTP1的异源表达、纯化和抗体制备等研究相对较少,一定程度上制约了 NbLTP1的进一步研究。因此我们构建了原核表达载体pET28a-NbLTP1,进行了蛋白纯化实验,制备NbLTP1多克隆抗体。结果表明,本研究在前期研究基础上,首先,去除N端信号肽序列,构建了重组pET28a-NbLTP1原核表达载体,并在大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中成功表达了 NbLTP1蛋白,并且优化了蛋白表达条件,其中IPTG终浓度为1 mM、诱导温度为37℃时,NbLTP1蛋白表达水平最高。其次,通过Ni-NTA柱层析方法获得了纯化的NbLTP1蛋白。再次,利用获得纯化蛋白免疫新西兰大白兔后制备了 NbLTP1蛋白多克隆抗体,并进行了效价检测。结果表明抗血清效价良好,说明我们成功获得抗NbLTP1血清,可用于后续实验。本部分研究成功纯化出NbLTP1蛋白并制备了血清,为进一步研究其功能奠定基础。为进一步研究NbLTP1在防御烟草花叶病毒（TMV）侵染中的作用,我们进行了一系列的实验。首先,我们检测了被TMV侵染的本氏烟体内NbLTP1基因的表达,结果表明TMV侵染诱导NbLTP1基因的表达。其次,我们通过病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）沉默本氏烟中的NbLTP1,荧光定量PCR结果表明通过VIGS可以显着抑制NbLTP1基因的表达,在接种TMV后,沉默植株中ROS积累增多,丙二醛含量显着升高,TMV病毒的复制量显着升高。在沉默植株中,本氏烟中SA合成和信号途径的关键酶基因以及SA介导的病程相关蛋白基因的表达表达显着下调,结果表明沉默NbLTP1抑制水杨酸信号途径。第三,进一步通过In-Fusion克隆技术成功构建了过量表达载体,通过遗传转化,得到转基因株系OE12和OE14,在接种TMV后,OE12和OE14植株中ROS积累变少,丙二醛含量降低,TMV病毒的复制量也显着降低。因此这些结果表明,提高本氏烟中NbLTP1的表达量,可以减少TMV侵染造成的ROS积累,减轻细胞膜受到的氧化损伤,减少TMV病毒的积累量,增强了本氏烟对TMV的抗性。同样,本氏烟中SA合成和信号途径的关键酶基因以及SA介导的病程相关蛋白基因的表达显着上调,过量表达NbLTP1激活水杨酸信号途径。第四,亚细胞定位结果表明,在本氏烟草表皮细胞中,对照空载体的荧光信号主要集中在细胞核和细胞壁中,而NbLTP1融合蛋白的绿色荧光信号主要集中在细胞壁上,而细胞核中没有出现荧光,因此,NbLTP1可能主要在细胞壁中发挥作用。综上所述,NbLTP1通过激活SA介导的信号通路,使本氏烟抗性增强,提高了本氏烟抗TMV侵染的能力。我们的研究结果为进一步研究NbLTP1基因在响应胁迫应答过程中的重要作用奠定了基础。
贺浪[2]（2021）在《陆地棉候选感黄萎病基因的克隆及功能研究》文中认为棉花是世界上最主要的农作物之一,棉花生产的稳定性,对我国经济发展至关重要。棉花黄萎病（Verticillium wilt）是影响棉花生产的最主要病害,我国的黄萎病菌主要是大丽轮枝菌（Verticillium dahilae Kleb.）。目前,棉花抗黄萎病的机制尚不清楚,且黄萎病菌在土壤中的存活时间长,现有的防治药剂效果并不理想。因此,挖掘棉花与黄萎病菌互作的相关基因,进一步研究相关基因的功能,为培育棉花抗黄萎病提供候选基因。本论文通过对前期转录组测序分析的基础上,筛选了3个下调表达基因Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7进行调控抗黄萎病机理的研究,为培育棉花抗黄萎病品种奠定理论基础。1)利用Real-time PCR技术研究Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7在陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中的表达模式。结果表明,黄萎病菌侵染不同抗感材料后,在感病品种中3个基因对比CK的表达呈现上调表达,在抗病品种中三个基因对比CK的表达无显着差异或者呈现下调表达的趋势。通过外源植物激素水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）处理,Gh TGA7、Gh BZR1的表达能被外源SA、JA诱导,Gh WRKY74的表达能被外源SA、JA抑制。2)利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）,发现Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7沉默感病品种86-1植株,发现其对棉花黄萎病菌的抗病性增强。对Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7沉默植株的叶片进行台盼蓝染色,发现基因Gh TGA7、Gh WRKY74、Gh BZR1沉默植株具有减缓细胞坏死的作用。3)利用RACE技术获得Gh BZR1、Gh WRKY74基因全长。Gh BZR1基因全长1515bp,3′UTR350bp,5′UTR 223bp,ORF 942bp,具有BES1＿N超家族结构域,启动子序列中有两个与参与脱落酸的反应的ABRE顺式作用元件;还有一个MYB结合位点参与类黄酮生物合成基因调控的MBSI作用元件。Gh WRKY74基因全长1786bp,其中3′UTR 514bp,5′UTR 291bp,ORF 995bp,Gh WRKY74属于Ⅱd组WRKY成员,该蛋白具有一个WRKY结构域和C2H2模式（CX（4-5）CX（22-23）HXH）的锌指结构。用电子克隆技术获得Gh TGA7基因全长,Gh TGA7全长1786bp,3′UTR 69bp,5′UTR 348bp,ORF 1074bp,该蛋白上有典型的b ZIP蛋白的DNA结合域与DOG1蛋白结构域。另外,通过亚细胞定位技术构建Gh BZR1、Gh WRKY74、Gh TGA7表达载体,在烟草中瞬时表达,结果表明3个基因均定位于细胞核,符合转录因子的特征。4)利用超表达技术,研究转基因Gh BZR1拟南芥对棉花黄萎病的抗性,筛选到的T2代阳性植株进行抗黄萎病鉴定。结果表明,超表达Gh BZR1的转基因拟南芥对黄萎病易感性增强。对防御通路相关基因的表达量分析发现,转Gh BZR1基因拟南芥SA通路相关基因At PR-1、At PR-5、At PAL1的表达量显着上调,JA通路相关基因At PDF1.2、At LOX2的表达受到抑制。因此,Gh BZR1负调控作用参与棉花黄萎病抗性和JA相关通路。
张明钰[3]（2021）在《智能聪有效组分的筛选及抗病毒研究》文中认为病毒几乎能侵染所有植物,且必须在寄主细胞内营寄生生活。由于植物没有完整的免疫系统,病毒病的防治较为困难。目前,对病毒病的防治仍然以化学防治为主,由于用量大、施药方式不科学,造成大量农药残留、作物药害、环境污染等一系列不良现象,且生产成本高,严重制约了现代农业可持续发展,甚至危及人类健康。因此,寻找作用范围广,安全高效的抗植物病毒制剂是当前农业生产所必需的。智能聪（ZNC）是近几年从野生沙棘植株中分离得到的一株丝状真菌宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）经过发酵提取出来的一种超高活性的植物免疫诱抗剂。已有研究表明,ZNC具有促进植物生长、提高作物产量、保护植物免受病原菌侵染的能力。由于ZNC是一种混合物,具体是哪种组分对增强植物抗病性起到关键作用,尚不清楚。本研究以马铃薯X病毒（PVX）和烟草花叶病毒（TMV）为防治对象,开展ZNC有效抗病毒组分的筛选及诱发植物抗病毒机制的研究,为植物免疫诱抗剂—ZNC的进一步开发和利用奠定了基础。主要结果与结论如下:（1）ZNC是由16种不同组分组成的混合物。将ZNC溶解后,利用高效液相色谱仪进行分离,结果显示ZNC是由16种不同的组分组成,并进一步纯化得到16种组分溶液,分别编号为F1-F16。（2）Fraction 8为ZNC最佳有效抗病毒组分。将ZNC的16种不同组分配制成浓度为100 ng/m L溶液,分别喷施本氏烟草,2 h后摩擦接种带有GFP标签的PVX病毒（PVX-GFP）,以dd H2O处理为对照,在接种后第5 d观察发现,喷施Fraction 2、6、8、10、11、15的烟草GFP荧光强度均弱于dd H2O处理的,其中喷施Fraction 8的烟草GFP荧光强度最弱。利用实时荧光定量（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）进一步定量测定了各处理植株系统叶中PVX-CP基因表达量,结果显示,喷施Fraction 8处理的烟草体内病毒含量最低。从而确定Fraction 8为ZNC最佳有效抗病毒组分。（3）Fraction 8对病毒具有显着的预防效果。选取长势一致的本氏烟草,分别做先喷施Fraction 8后接种PVX-GFP和先接种病毒后喷施Fraction 8,观察GFP荧光现象并检测病毒积累量。结果发现:先接种病毒再喷施Fraction 8,PVX-CP的表达量略低于喷施dd H2O的烟草植株,但差异不显着;而先喷施Fraction 8再接种病毒,PVX-CP的表达量明显低于喷施dd H2O的烟草植株。上述结果表明ZNC的Fraction 8组分对病毒具有较好的预防效果。（4）Fraction 8抗病毒最佳使用浓度为150 ng/m L。将Fraction 8配制成5个浓度梯度,以dd H2O处理为对照,分别喷施本氏烟草,2 h后摩擦接种PVX-GFP。接种后第5 d观察GFP荧光现象并检测病毒积累量。结果发现,随着Fraction 8浓度的提高,荧光强度和植株内病毒的含量逐渐降低,浓度为150 ng/m L处理的荧光强度和病毒含量达到最低;且当浓度达150 ng/m L以上时,其荧光强度和病毒的含量不再呈现明显的降低趋势。从而确定Fraction 8抗病毒最佳使用浓度为150 ng/m L。（5）Fraction 8增强植物对烟草花叶病毒（TMV）的抗性。选取长势一致的本氏烟草,分别喷施dd H2O和Fraction 8,2 h后摩擦接种带有GFP标签的TMV（TMV-GFP）。接种后第8 d发现,喷施Fraction 8的本氏烟草荧光程度明显弱于dd H2O处理的本氏烟草。用q RT-PCR的方法检测不同处理下的本氏烟草植株中的TMV-CP基因表达量,结果与表型一致,表明Fraction 8对TMV也有同样的预防效果。上述结果说明,ZNC的Fraction 8组分可能对植物病毒病具有广谱抗性。（6）Fraction 8能够促进水杨酸的积累并激活SA信号通路。对Fraction 8和dd H2O分别处理不同时间的本氏烟草叶片进行液相色谱测定,结果显示,在各个时间点,喷施Fraction 8的叶片中SA含量均明显高于dd H2O处理,且随着时间延长不断积累,并在4 h时达到最高。q RT-PCR检测结果显示,SA信号通路的标志基因NPR1、PR1的表达水平明显提高,说明Fraction 8能够促进SA积累,并激活SA信号通路。（7）Fraction 8能够促进活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的积累。对喷施Fraction 8和dd H2O后的本氏烟草于不同时间取材,进行DAB染色和NBT染色。DAB染色结果显示,Fraction 8处理的叶片的染色深度明显强于dd H2O处理,且随着时间延长,颜色先变深后变浅,在4 h时染色程度最深,表明Fraction 8试剂能够明显促进过氧化氢的积累。NBT染色结果显示,Fraction 8处理的叶片的染色深度与dd H2O处理的差异不明显,且随着时间延长,颜色没有明显变化,表明Fraction 8不能促进超氧阴离子的积累。利用q RT-PCR的方法检测不同处理后本氏烟草中ROS合成与清除基因的表达水平,结果发现,随着时间的延长,植物中Rboh A和Rboh B等ROS合成基因的表达水平逐渐提高,4 h达到最高水平;同时CAT,SOD和APX等ROS清除基因的表达水平下降至较低水平,表明Fraction 8是通过促进ROS合成基因和抑制ROS清除基因的表达促进了ROS的积累。植物为了应对各种生物和非生物胁迫,细胞ROS信号与钙信号之间相互整合,并作出特异性响应。用荧光标记的Fluo-3AM对细胞内Ca2+进行评价,Fraction 8处理的保卫细胞中有显着荧光,表明Fraction 8可促进Ca2+内流,激活RBOHs进而产生ROS。综上结果表明,Fraction 8能够激活ROS信号通路,与增强植物抗病能力密切相关。（8）Fraction 8通过SA途径增强RNA沉默并诱发植物抗病毒。取转Nah G基因本氏烟草植株和非转基因本氏烟草,分别喷施Fraction 8和dd H2O,2 h后用p ROK-II::GFP瞬势侵染烟草叶片,在处理后的第3 d用Fusion FX SPECTRA多功能成像仪观察GFP的荧光强度。结果发现,非转基因本氏烟草植株经Fraction 8处理后的荧光强度明显弱于对照,而转Nah G基因本氏烟草植株经Fraction 8处理后的荧光强度与对照无明显差异;同时,对两种烟草分别喷施Fraction 8和dd H2O后接种PVX-GFP病毒,发现转Nah G基因本氏烟草在喷施Fraction 8后无明显预防效果。结果表明,Fraction 8可能通过SA信号途径增强RNA沉默并诱发病毒抗性。综上所述,本研究从ZNC混合物分离纯化出16种不同组分,确定了ZNC最佳抗病毒组分为Fraction 8,其最佳使用浓度为150 ng/m L,对植物病毒病具有显着的预防效果,且具有广谱抗性。抗性机理的研究显示,Fraction 8能够激活ROS信号通路,并通过SA信号途径增强RNA沉默,从而诱导植物产生抗病性。该研究为智能聪（ZNC）在植物抗病毒方面的进一步开发和利用奠定了基础。
张露凡[4]（2021）在《小麦抗赤霉病基因PFT互作基因TaRBL的克隆及功能分析》文中研究表明赤霉病主要是由禾谷镰刀菌属引起的,能够破坏几乎所有的主要谷类作物,特别是小麦,使我国小麦严重减产,对我国粮食生产和食品加工方面造成严重影响。然而,目前在高抗品种的选育方面并未取得良好的进展。因此,挖掘和研究小麦抗赤霉病基因,对于提高小麦对抗赤霉病的抵御力和解析其中的抗赤霉病基因生长反应机制具有十分重要的意义。据前人研究发现,PFT（pore-forming toxin-like）（Ta PFT）基因是位于Fhb1位点上的抗性基因,但PFT的抗性机理并不清楚。本实验室前期利用PFT为诱饵蛋白筛选小麦酵母双杂文库后得到候选互作基因TaRBL（ricin-B-like lectin）,TaRBL编码篦麻毒素类凝集素。本研究通过在小麦品种苏麦3号中克隆得到TaRBL基因,构建酵母表达载体和双分子荧光互补载体验证TaRBL基因与Ta PFT基因互作,利用VIGS技术在小麦中对TaRBL基因进行初步功能验证,分析TaRBL基因在小麦抗赤霉病过程中的抗病机理。主要研究结果如下:1.利用文库插入序列在小麦基因组网站比对获得TaRBL全长编码区（CDS）序列,设计特异引物,利用苏麦3号cDNA通过PCR扩增得到了TaRBL基因CDS全长,经过序列分析表明该基因CDS全长为1023 bp,编码含有340个氨基酸的蓖麻毒素类凝集素蛋白。2.构建酵母表达载体对TaRBL基因与Ta PFT基因进行互作验证,结果显示该基因与Ta PFT基因在酵母中能够发生互作。构建双分子荧光互补载体在烟草中进一步验证互作关系,结果显示该基因与Ta PFT基因能够在烟草细胞中发生互作。这些结果表明TaRBL基因与Ta PFT基因在植物体外和体内均存在互作。3.通过对抗病品种苏麦3号和感病品种济麦22接种禾谷镰刀菌孢子,然后对接种的小麦TaRBL基因进行实时荧光定量分析,检测该基因在各个时间点的相对表达量,结果显示TaRBL基因受禾谷镰刀菌诱导后在抗病品种苏麦3号中上调表达,在感病品种济麦22中下调表达,表明TaRBL基因表达受赤霉病诱导,且其表达量与赤霉病抗性呈正相关。4.分别以抗病品种苏麦3号和感病品种济麦22为材料,利用BSMV-VIGS技术于穗期对TaRBL基因进行沉默,并接种禾谷镰刀菌鉴定沉默植株的抗性变化。结果显示沉默抗病品种苏麦3号的TaRBL基因后,导致其赤霉病抗性显着降低;沉默感病品种济麦22的TaRBL基因后,导致其明显更感病,抗性进一步降低。这些结果表明TaRBL基因沉默会降低小麦赤霉病抗性。5.构建TaRBL基因过表达载体,利用农杆菌介导法对感病小麦济麦22进行遗传转化,通过GUS染色和PCR扩增等方法鉴定转基因阳性植株。进一步通过离体叶片接种赤霉病孢子悬浮液方法对转基因阳性植株进行赤霉病抗性鉴定后显示TaRBL过表达小麦的赤霉病抗性显着提高,表明TaRBL为小麦赤霉病抗性基因。综上,本文克隆了TaRBL基因全长,生物信息学分析显示其编码蛋白为篦麻毒素类凝集素。通过不同抗感品种接种禾谷镰刀菌后的基因定量研究和VIGS技术对基因进行功能分析后表明该基因具有正调控的抗赤霉病作用。进一步通过构建过表达载体转小麦获得阳性转基因植株,并对其通过离体叶片进行赤霉病抗性鉴定后发现TaRBL过表达小麦的赤霉病抗性显着提高,证明TaRBL为小麦赤霉病抗性基因。该研究结果为培育新的抗病品种提供了基因基础和理论依据,对于解析小麦抗赤霉病机制提供新途径。
刘寒[5]（2021）在《转录因子NbWRKY18抗病毒功能研究》文中进行了进一步梳理WRKY是植物特有的一类转录因子,具有高度保守的WRKY结构域和锌指结构域,特异性的结合靶基因启动子区域W-box,调控靶基因表达。WRKY家族成员众多,主要分布于植物中,根据其保守的结构域及内含子特征,将WRKY分为3组,分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。本实验室前期研究显示本氏烟（Nicotiana benthamiana）WRKY18（NbWRKY18）基因可能参与植物病毒侵染过程,但其具体功能尚不清楚。为了探究该转录因子的生物学功能,本研究首先克隆NbWRKY18基因,序列比对及系统进化树分析表明NbWRKY18含高度保守的WRKY结构（WRKYGQK）和锌指结构（C2H2类型）,在分类上隶属于II a亚组;接着将NbWRKY18亚克隆至原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白,并进一步制备该蛋白特异性抗体。亚细胞定位分析表明NbWRKY18定位于细胞核。利用q RT-PCR技术分析发现NbWRKY18基因表达模式不仅受高盐、干旱影响且受4种植物病毒和水杨酸（SA）诱导,支持NbWRKY18基因参与植物病毒侵染过程的推论。为进一步探究NbWRKY18与植物病毒侵染关系,本研究将NbWRKY18基因置于组成型启动子控制之下,并利用农杆菌介导法转化本氏烟,获得过量表达NbWRKY18（35S:NbWRKY18）转基因植株;同时采用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术获得沉默NbWRKY18（TRV:NbWRKY18）植株。采用农杆菌浸润法接种融合绿色荧光蛋白（GFP）基因的番茄花叶病毒（Tomato Mosaic Virus,To MV）和芜菁花叶病毒（Turnip Mosaic Virus,Tu MV）侵染性克隆,荧光观测显示,2种病毒侵染的35S:NbWRKY18植株中GFP荧光强度均弱于非转基因对照植株中的荧光强度,而病毒侵染的TRV:NbWRKY18植株中GFP荧光亮度则强于对照植株中的荧光亮度,推测转录因子NbWRKY18具有抗病毒功能;进一步利用Northern blot和Western blot技术分析显示35S:NbWRKY18植株中To MV和Tu MV基因转录和翻译水平均低于对照,而TRV:NbWRKY18植株中To MV和Tu MV基因转录和翻译水平均高于对照,在分子水平上支持转录因子NbWRKY18具有抗病毒功能的推论。为了探索转录因子NbWRKY18的抗病毒机制,本研究又采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）方法测定35S:NbWRKY18、TRV:NbWRKY18以及对照植株中3种激素含量,结果显示,在35S:NbWRKY18植株中,水杨酸（SA）含量在接种病毒前后均显着高于对照植株,茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）含量均低于对照;而在TRV:NbWRKY18植株中激素含量呈相反的趋势,即SA含量低于对照,JA和ABA含量高于对照。这些研究结果表明,转录因子NbWRKY18可能通过影响激素含量,参与植物激素信号通路,正调控植物抗病毒反应。
吴昕扬[6]（2021）在《NbFLA34和NbHRLI4基因在芜菁花叶病毒侵染过程中的功能研究》文中提出植物病毒是严重危害农产品安全生产的生物因子,严重影响农产品的产量、品质,造成巨大的经济损失。马铃薯Y病毒属（genus Potyvirus）是植物病毒中最大的属,而芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,Tu MV）是其中危害较为严重的病毒之一。在植物病毒侵染寄主的过程中,寄主基因能够以不同的方式,调控寄主对病毒的抗性,从而抑制病毒侵染。挖掘、了解这些抗性基因在病毒侵染过程中的作用及其机制,有助于我们更好地理解病毒-植物互作关系,为植物抗病性的研究与调控提供理论基础。6K2是Tu MV的非结构蛋白,是病毒复制、病毒囊泡成熟等所必需的。在前期,对Tu MV 6K2蛋白进行酵母文库筛选的基础上,我们发现一个本氏烟类成束阿拉伯半乳糖蛋白（Fasciclin-like arabinogalactan,FLA）Niben101Scf12431g00010.1与6K2互作,将其命名为Nb FLA34。FLA类蛋白含主要参与纤维素沉积、细胞壁合成以及盐胁迫等过程。对本氏烟FLA家族进行系统鉴定发现,Nb FLA家族可分为4个亚类,在进化上每个亚类相对保守,且大部分Nb FLA成员在Tu MV侵染后下调表达。Nb FLA34属于亚类III,它的GPI锚定位点以及6K2的Gxxx G基序是二者互作的关键位点。Tu MV侵染能显着地下调Nb FLA34的转录本水平。沉默Nb FLA34后,寄主对于Tu MV的感病性增加,而过表达Nb FLA34能够抑制Tu MV的积累。但突变Nb FLA34 C端GPI后对Tu MV的抑制能力减弱。Nb FLA34依赖于6K2中Gxxx G基序与6K2互作,该基序也是6K2自身互作的关键位点。进一步研究发现,Nb FLA34能够以互作依赖的方式干扰6K2的自身互作,从而抑制6K2诱导的病毒囊泡的聚集和胞间连丝靶向。综上所述,本研究揭示了Nb FLA34通过干扰6K2的自身互作,影响病毒囊泡的功能,从而赋予寄主对Tu MV的抗病能力。同时,我们对Tu MV侵染本氏烟后进行转录组测序,筛选到了差异下调的类过敏反应病变诱导（HR-like lesion inducing,HRLI）基因成员Nb HRLI4。HRLI类基因是一类未被鉴定的内源基因,可能参与细胞坏死过程。沉默Nb HRLI4促进了病毒的侵染,并下调了SA途径基因的表达量。外源喷施SA能够减缓沉默Nb HRLI4后导致的感病性。而瞬时表达Nb HRLI4能够抑制病毒的积累,且令SA途径基因的表达量上调。单独瞬时表达Nb HRLI4能够诱导类HR细胞坏死,但在转Nah G基因的植物中细胞坏死程度降低,表明Nb HRLI4可能以SA依赖的方式诱导细胞死亡。同时,我们也发现Nb HRLI4与Tu MV-P3互作,突变互作关键位点后抑制了细胞坏死。综上所述,本研究揭示了Nb HRLI4通过SA介导的方式诱导细胞坏死从而调控寄主的基础免疫途径。这些研究对深入了解寄主组分参与对植物病毒的抗病过程有重要的价值。
刘敏[7]（2020）在《蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用》文中进行了进一步梳理植物病毒病由于严重影响作物正常生长发育,发病后又难以防治,造成巨大经济损失,如何有效防治病毒病一直是制约农业生产的重要问题。病毒在侵染寄主植物后,需利用寄主组分,进行复制和移动,因此如何抑制其复制与移动是防治植物病毒病的两个重要环节。植物蛋白酶抑制子（Plant Protease Inhibitor,PPI）是植物重要的防御组分,调控植物对病、虫与草等的抗性,但PPI对病毒的抗性研究还相对较少。NbSIPI6是一个被胁迫诱导表达的大豆胰蛋白酶抑制子家族成员,实验室前期研究发现烟草NbSIPI6可抑制PVX病毒的长距离移动,增强本氏烟对PVX的抗性。本实验想进一步探究NbSIPI6是否拮抗PVY,以此丰富PPI类基因对抗病毒的认识。本实验利用NbSIPI6融合GFP的转基因材料,分析NbSIPI6本氏烟对PVY病毒的抗性,并为亚细胞定位和后续免疫沉淀提供基础。此外,分析了NbSIPI6响应病毒与水杨酸（Salicylic acid,SA）的表达模式以及NbSIPI6对病毒基因沉默抑制子活性的影响,为探索蛋白酶抑制子在抗病毒中的相关作用机制提供依据。主要研究结果如下:1.构建NbSIPI6 C端超表达载体与关键氨基酸点突变NbSIPI6m融合GFP载体,遗传转化本氏烟。经GFP检测和Hyg抗生素筛选,分别获得3株与7株独立阳性株系。通过实时荧光PCR检测,发现阳性株系中NbSIPI6表达量明显高于野生型2.蛋白质发挥作用需要正确折叠为前提,有时融合蛋白会影响蛋白质正确折叠而使靶蛋白丧失功能。因此拟通过验证NbSIPI6-GFP转基因植株是否具有抗病毒功能,来确证转基因植物材料的可用性。利用获得的T1代转基因材料,接种PVX-INF1和PVY,与突变株系和野生型相比,超表达NbSIPI6-GFP植株显着抑制了病毒的扩散,抗病毒能力明显提高。这说明,NbSIPI6 C端融合GFP不改变NbSIPI6抑制病毒移动的功能,可以用于后续研究;第二,NbSIPI6对病毒抑制不仅局限于PVX,也可提高对PVY的抗性。3.为明确NbSIPI6的细胞定位,将质膜Marker mCherry在NbSIPI6-GFP超表达株系叶片中瞬时表达,激光共聚焦检测发现,（1）瞬时表达部分区域呈现黄色,表明NbSIPI6与mCherry重合,即定位于细胞膜;（2）在细胞内其它区域还有清晰的绿色呈现,表明NbSIPI6不仅存在于细胞质膜,在细胞其他区域也有分布;（3）水杨酸或PVX处理后,NbSIPI6表达量显着高于对照,说明NbSIPI6的表达能够响应水杨酸与PVX。4.基因沉默是植物抵御病毒的重要方式,病毒常常利用基因沉默抑制子来抑制植物的基因沉默作用。因此我们想探究NbSIPI6是否具有拮抗病毒沉默抑制子功能。将实验室前期构建的NbSIPI6-1300和NbSIPI6m-1300等超表达载体分别与病毒沉默抑制子Hc-Pro和P19组合,再与GFP-1300共注射16c本氏烟,通过检测绿色荧光有无和强度,评价NbSIPI6对沉默抑制子的作用。研究发现,NbSIPI6与Hc-Pro或P19组合中,绿色荧光呈现出与注射Hc-Pro/P19沉默抑制子的相似强度,推测NbSIPI6可能不具有抑制病毒沉默抑制子。
李方方[8]（2014）在《中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA抑制转录后基因沉默的机理研究》文中研究说明中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）伴随的卫星DNAβ（Tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB）对于诱导症状、增强病毒的致病性及抑制RNA沉默是必需的,而TYLCCNB编码唯一的βCl蛋白不仅是致病因子,也是RNA沉默抑制子。但到目前为止,βC1抑制RNA沉默的机理尚不清楚。为了解析βCl蛋白抑制RNA沉默的机制、明确RNA沉默途径中抵抗双生病毒侵染的关键基因的作用,本文开展了以下研究：1βC1蛋白抑制RNA沉默的机制：我们利用芯片技术比较了TYLCCNV/TYLCCNB和TYLCCNV侵染本氏烟后差异性表达的基因,以及βC1转基因本氏烟植株相对于野生型植株的差异性表达的基因。我们发现TYLCCNB或βC1显着上调本氏烟一个钙调素类似蛋白基因Nbrgs-CaM的表达,而且TYLCCNB的侵染还能够上调普通烟和番茄中Nbrgs-CaM同源物的表达。我们利用经典的农杆菌浸润RNA沉默抑制试验,发现本氏烟、普通烟和番茄rgs-CaMs都能够抑制转录后基因沉默（Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS）,而且Nbrgs-CaM还能抑制TYLCCNV诱导的基因沉默,因此证明了这些rgs-CaMs是植物内源的RNA沉默抑制子。我们利用35S启动子转基因过量表达Nbrgs-CaM,发现转基因植株表现出与βC1转基因植株类似的发育缺陷表型。通过构建Nbrgs-CaM双链发夹RNA沉默载体获得了Nbrgs-CaM基因表达下调的转基因植株,我们发现在该转基因植株上βC1失去了诱导典型症状及抑制PTGS的能力,表明Nbrgs-CaM介导了βCl诱导症状及抑制PTGS的功能。此外,我们还发现Nbrgs-CaM及其在普通烟与番茄中的同源物对TYLCCNV在茄科寄主中的致病力起了重要作用。2RDR6介导的RNA沉默在抵御双生病毒侵染中的作用：通过分析pC1与Nbrgs-CaM对正链RNA及双链RNA介导RNA沉默的抑制,我们发现两者只能抑制正链RNA诱导的PTGS,而不能抑制双链RNA诱导的PTGS,同时发现它们也只能抑制次级小干扰RNA（small interfering RNAs,siRNAs）的产生而不能抑制初级siRNAs的产生。进一步分析发现βC1通过上调Nbrgs-CaM的表达抑制NbRDR6介导的RNA沉默,而NbRDR6沉默的转基因植株不仅阻断了TYLCCNV诱导的基因沉默,还表现出对双生病毒侵染的超敏感性。另外,我们发现RDR6在决定双生病毒的寄主范围中起重要的作用,TYLCCNV能够突破寄主限制侵染拟南芥rdr6突变体。3SGS3介导的RNA沉默在抵御双生病毒侵染中的作用：在拟南芥中,RDR6可与双链RNA结合蛋白SGS3互作并形成复合体,在次级siRNAs合成中起重要作用。为了研究Nbrgs-CaM是否会影响NbSGS3的功能,我们克隆了NbSGS3基因并对其功能进行分析。我们发现NbSGS3在正链RNA诱导的基因沉默、GFP系统沉默的建立及维持、双生病毒诱导的基因沉默及双生病毒的抗性方面起了重要作用,而且NbSGS3能够协同NbRDR6参与对双生病毒的抗性。此外通过酵母双杂交与双分子荧光互补实验,我们还发现Nbrgs-CaM与NbSGS3能够互作,并且Nbrgs-CaM的过表达不仅能够影响NbSGS3的亚细胞定位,使其不能定位于’siRNA-bodies’上,也会降低NbSGS3蛋白在植物中的表达水平。4DNAβ上调Nbrgs-CaM表达的机理分析：利用甲基化抑制剂和Chop-PCR方法对Nbrgs-CaM启动子进行甲基化分析,我们发现其启动子处于甲基化状态,而且表达βC1能够降低Nbrgs-CaM启动子的甲基化水平；对pC1的核定位突变体进行分析,我们发现该突变体不仅不能抑制Nbrgs-CaM启动子的甲基化,也不能上调Nbrgs-CaM的表达及抑制PTGS.对Nbrgs-CaM启动子的序列进行克隆,我们获得了该启动子驱动报告基因GUS和GFP表达的转基因本氏烟植株,并且发现TYLCCNV伴随的TYLCCNB的侵染能够特异地上调Nbrgs-CaM启动子驱动的报告基因的表达。我们的这些发现阐述了一个全新的机制：病毒编码的RNA沉默抑制子能够利用植物内源RNA沉默抑制子Nbrgs-CaM抑制RNA沉默及诱导症状,并强调了RDR6与SGS3在抵抗双生病毒侵染的RNA防卫反应中的重要地位；同时我们也发现了βC1抑制TGS产生的效应能够作用于PTGS,从而明确了βC1在抑制TGS与PTGS这两个途径之间的关系。
白描[9]（2012）在《番茄RNA沉默体系的鉴定及其抗病毒新方法的研究》文中认为RNA沉默利用负调控手段,在基因的转录和转录后水平,介导的序列特异性的基因沉默；其在植物生长发育、基因组的稳定、对逆境和胁迫的响应与防御等方面发挥着重要作用。RNA沉默途径具有多样性,涉及的关键基因也比较多,在拟南芥等模式植物上研究的比较清楚。番茄是果实发育研究的重要的模式生物,但对其RNA沉默系统的认识还不系统和完整。在番茄生产栽培中,病毒（如番茄黄化曲叶病毒,TYLCV和黄瓜花叶病毒,CMV）的危害很严重。寄主直接抵抗病毒的分子机制主要有RNA沉默和抗性基因这两大类,而二者之间的差异与联系研究较少。本研究通过对番茄RNA沉默系统核心蛋白,sRNA组学特征及其功能和耐感（针对TYLCV）品种间RNA沉默系统特征的比较,来全面地认识番茄RNA沉默系统及与病毒抗性关系。另外,还开展了系统性基因沉默增强嫁接番茄病毒抗性的研究。获得了如下主要研究结果：1、本文研究了番茄RNA沉默系统的核心基因：在番茄中鉴定了7个DCL、15个AGO和6个RDR基因。系统进化树分析,认为这些基因均可被分类为4类。比较了这些基因的结构和序列相似性、对其进行了番茄基因组上的定位,并且利用网络数据库和半定量RT-PCR,鉴定了不同组织或器官以及在不同非生物胁迫和在TYLCV病毒胁迫下的表达。在非生物胁迫和TYLCV侵染后,发现一些特定基因的表达获得了提高。从SlDCL2s的串联重复和表达模式来看,DCL2家族在番茄进化过程中可能具有重要作用。2、调查了番茄内源sRNA组和降解组组学特征：利用高通量测序方法,比较了内源sRNA在不同耐（含Ty-1）感品种及TYLCV病毒侵染前后差异；鉴定了30个保守的：miRNA,预测了1666个新的1niRNA。首次,利用降解组鉴定出了番茄所有保守miRNA以及1575条新的miRNA的切割靶标。利用较严格的标准,对耐感样本接种病毒前后miRNA表达差异的比较发现,大部分保守miRNA和新的miRNA对病毒产生了响应,靶标功能分析证明这些niRNA可能与植物抗性或症状形成相关。本研究对样本中siRNA也进行了详细分析,各样本间siRNA变化差异较大,表明寄主内源siRNA对病毒的侵染做出了响应。对siRNA靶标预测发现,众多siRNA的靶标都与抗病相关。这暗示siRNA具有作为植物免疫系统调控的重要功能。以上数据与分析为番茄的RNA沉默系统的全面认识提供重要基础。3、深入分析了侵染TYLCV后抗感品种中vsRNA及其功能差异：利用高通量测序方法,首次比较了耐病品种相对于感病品种中vsRNA的生产与功能差异。结果发现：vsRNA的产生没有碱基偏好；不同长度vsRNA连续分布于病毒基因组;vsRNA的分布存在热点,可能与转录本的重叠和转录本二级结构相关。首次利用降解组为vsRNA提供了直接的病毒转录本切割/降解证据。利用BSP调查了病毒DNA的甲基化情况,发现抗感品种编码区均呈现低甲基化；而在IR区互补链具有高度甲基化,暗示24nt vsRNA可能介导了IR区甲基化。本研究通过比较病毒DNA.mRNA与vsRNA的表达量与趋势,提出在寄主诱导的病毒抗性作用中,RNA介导的病毒免疫要滞后于Ty-1基因的作用,且其对病害的抑制作用是有限的。4、进行了RNA沉默与嫁接技术结合获得病毒（CMV）抗性材料的实践：分别以CMV的5个基因为靶标,通过农杆菌介导的转化,成功获得53株Kan抗性及PCR阳性植株。通过对扦插苗接种CMV鉴定抗性发现,1A-CP中存在不同程度的抗性,其中1A和3A共有6株、2A有7株、2B有8株以及5株CP转基因番茄展现出对CMV的高抗。本研究利用扦插的方法,获得了大量的砧木后代,在生产上对于抗性材料的繁殖是十分有益的。以高抗的转基因植株作为砧木嫁接非转基因番茄品种,发现其病毒抗性可进行有效传递。而嫁接接穗成功获得病毒抗性,为园艺植物嫁接育种提供了依据。另外,砧木中超表达的NptⅡ基因的rnRNA并未在接穗中检测到,这可能为消除消费者对GMO生物安全性的忧虑提供新的途径。本研究的意义在于：1、为理解番茄的RNA沉默体系,研究其核心基因在番茄生长发育或不同逆境条件下的功能,提供了重要信息；2、为理解植物sRNA特征及其功能提供数据；3、为认识Ty-1基因和RNA沉默介导的病毒抗性之间的异同提供了证据；4、实践了RNA沉默技术在病毒抗性上的应用,提出了高效安全的转基因抗病毒新策略。
姜芳[10]（2011）在《马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA和人工的miRNA介导的病毒抗性的影响》文中指出基因沉默是生物体长期以来形成的一种防御机制,阻止外源基因、转座因子、病毒等外源核酸的侵入,保护生物基因组的完整性。小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）和微小RNA（microRNA, miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子,是沉默RNA的最主要组成部分。RNA介导的病毒抗性（RNA mediated virus resistance, RMVR）是RNA沉默的一种表现形式,侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性,因此在转录后基因沉默所导致的RNA降解过程中,RNA降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因RNA一起降解。RMVR具有抗病程度高（近乎免疫）、抗性持久、生物安全性高等优点。在基因沉默的研究中已发现“位置效应”的存在,siRNA的有效性可能受到靶序列所处的位置影响。在RNA介导的植物病毒抗性研究中,目前尚未见有关“位置效应”的系统报道。本研究以马铃薯Y病毒外壳蛋白为靶基因分别以hpRNA和人工的miRNA两种方式构建RNA干扰的植物表达载体,系统性的比较PVY CP基因不同区段对RNA介导的病毒抗性的影响,为寻找引发基因沉默的有效片段及更好利用RMVR培育抗病毒转基因植物提供了依据。研究结果和主要结论如下:（1）马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性的影响将PVY CP基因人工的划分为16段各50bp的区段。通过PCR扩增,得到相应的不同区段的正向和反向的片段,通过酶切连入植物表达载体pROKⅡ中;热激法转化大肠杆菌DH5α,筛选并获得hpRNA结构的植物表达载体pROK CPs（pROK CP9pROK CP16）。用成功构建的16个植物表达载体（另外8个为吴斌构建）瞬时侵染本生烟验证其有效性,Northern Blot结果显示,16个植物表达载体均能在植物体内成功表达产生siRNA,且瞬时表达的siRNA能有效地下调靶基因PVY CP的表达。将构建的8个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定转基因植株。T0代转基因植株自交,种子置于含卡那霉素的筛选培养基上进行筛选,共得到的pROK CP9pROK CP16各50株、62株、56株、55株、45株、63株、72株和55株T1代转基因植株。抗病性分析发现除了转基因株系pROK CP1、pROK CP2、pROK CP3、pROK CP4未获得抗性植株外,其余12个转基因株系中抗性植株的比例分别为27.15%、6.27%、67.65%、70.83%、66.01%、61.34%、66.04%、23.59%、11.11%、55.56%、77.78%和67.25%。结果表明在利用hpRNA介导的抗PVY病毒的研究中,以PVY CP基因上的50bp序列为茎足以介导宿主植株的基因沉默的产生,但由于hpRNA靶位置的差异产生不同的抗病效率,靶向于3′端nt701nt750区段表现最高水平的抗性;且以CP基因3′端为靶序列的hpRNA转基因植株比以5′端为靶序列的植株更能有效地介导对PVY的抗性。转基因植株的Northern杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关,证实病毒抗性是由RNA介导的;对转基因植株的siRNA表达量的分析,表明植株对病毒的敏感程度与siRNA积累量之间没有明显的相关性。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果发现,几乎所有的抗性转基因植株的后代均表现很强的抗病毒侵染能力,说明由hpRNA介导的PVY抗性在T2代植株中能够稳定遗传。（2）马铃薯Y病毒CP基因不同区段对人工的miRNA介导的病毒抗性的影响以PVY CP基因的全长cDNA序列为靶基因,根据miRNA的特征选取8个不同的位置,M1（nt96nt115）、M2（nt140nt159）、M3（nt322nt341）、M4（nt380nt399）、M5（nt475nt494）、M6（nt567nt586）、M7（nt679nt698）和M8（nt735nt754）为amiRNA的靶区。选用拟南芥miR319a前体作为amiRNA表达的骨架,通过PCR扩增的方式替代掉原有的pre miR319a中具有生物学功能的miRNA和miRNA*,得到含有amiRNA和amiRNA*的DNA片段。将扩增产物连入植物表达载体pROKⅡ中。热激法转化大肠杆菌DH5α,筛选并获得重组表达载体pROK amiRcp1pROK amiRcp8。用构建的amiRNA表达载体瞬时侵染本生烟,Northern Blot验证其有效性,结果显示,8个amiRNA植物表达载体均能在植物体内成功表达amiRNA,且瞬时表达的amiRNA能有效地下调靶PVY CP基因的表达。将成功构建的amiRNA表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89。再生植株经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定为转基因植株。T0代自交后,经卡那霉素筛选和PCR鉴定,分别获得pROK amiRcp1pROK amiRcp8的T1代转基因植株98株、96株、114株、116株、117株、111株、110株和116株。抗病性结果显示,表达靶向于马铃薯Y病毒CP基因的amiRNA转基因植株能介导对马铃薯Y病毒的抗性,抗性比例分别为37.68%、50.29%、53.76%、37.75%、29.86%、17.05%、26.27%、64.69%。针对马铃薯Y病毒CP基因不同区段设计的amiRcps其转基因植株所介导的抗病性效果之间存在差异,靶向于3′端的amiRcp 8（nt735nt754）能表现更高水平的抗性。转基因植株的Northern杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,且植株的抗性与转基因的表达量成负相关,表明amiRNA介导的病毒抗性是由RNA介导的。对转基因植株的amiRNA的Northern Blot分析,结果显示,所有抗病转基因植株中都有amiRNA存在,且植株的抗性与amiRNA的表达量成正相关。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果发现,所有的抗性转基因植株的后代都表现高的抗病率,表明由amiRNA介导的PVY抗性在T2代植株中能够稳定遗传。
二、植物转基因沉默与病毒抗性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、植物转基因沉默与病毒抗性（论文提纲范文）
（1）NbLTP1调控烟草系统性抗性防御TMV侵染的作用机理及其抗体制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1 非特异性脂质转移蛋白简述 |
| 1.1 nsLTPs分类系统 |
| 1.2 nsLTPs的鉴定 |
| 1.3 nsLTPs的亚细胞定位 |
| 1.4 nsLTPs功能作用 |
| 2 植物抗病反应的机制 |
| 3 研究的目的与意义 |
| 第一章 NbLTP1的克隆和生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验所用植物及其生长条件 |
| 1.2 实验菌株和质粒载体 |
| 1.3 生化试剂 |
| 1.4 引物合成及测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 本氏烟NbLTP1的全长序列克隆 |
| 2.2 生物信息学分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 NbLTP1基因克隆 |
| 3.2 NbLTP1生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 第二章 本氏烟NbLTP1原核表达纯化及抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NbLTP1原核表达载体构建 |
| 2.2 蛋白的诱导与纯化 |
| 2.3 血清效价检测 |
| 3 讨论 |
| 第三章 本氏烟NbLTP1调控系统性抗性防御TMV侵染的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 基因的组织特异性表达 |
| 2.2 NbLTP1基因在TMV-GFP侵染阶段的表达分析 |
| 2.3 NbLTP1 VIGS沉默载体构建 |
| 2.4 NbLTP1基因沉默植株的获得及沉默效率检测 |
| 2.5 NbLTP1基因沉默植株对烟草花叶病毒的抗性分析 |
| 2.6 过量表达载体的构建 |
| 2.7 NbLTP1转基因植株的筛选 |
| 2.8 转基因植株对烟草花叶病毒的抗性分析 |
| 2.9 过量表达NbLTP1对SA信号通路相关基因表达的影响 |
| 2.10 NbLTP1亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）陆地棉候选感黄萎病基因的克隆及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 棉花黄萎病 |
| 1.1.1 棉花黄萎病的危害 |
| 1.1.2 棉花黄萎病菌的致病机理 |
| 1.1.3 棉花抗黄萎病机制 |
| 1.2 植物感病基因的研究 |
| 1.2.1 感病基因的定义 |
| 1.2.2 感病基因的发掘 |
| 1.2.3 感病基因的应用 |
| 1.3 基因功能的研究技术 |
| 1.3.1 病毒诱导的基因沉默技术 |
| 1.3.2 RACE技术 |
| 1.3.3 亚细胞定位 |
| 1.3.4 基因的过表达技术 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 目的基因的表达模式分析 |
| 2.1 试验材料与试剂 |
| 2.1.1 棉花品种与病菌 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试剂盒 |
| 2.1.4 试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 陆地棉的种植及培养 |
| 2.2.2 病菌的培养及活化 |
| 2.2.3 不同处理的陆地棉取样 |
| 2.2.4 荧光定量引物合成 |
| 2.2.5 不同抗病品种样品RNA的提取及反转录 |
| 2.2.6 陆地棉不同组织样品RNA的提取及反转录 |
| 2.2.7 植物激素处理后样品RNA的提取及反转录 |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同抗病品种中目的基因的表达模式 |
| 2.3.2 植物激素处理后的表达模式 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 VIGS技术验证基因的抗黄萎病能力 |
| 3.1 试验材料与试剂 |
| 3.1.1 棉花品种与病菌 |
| 3.1.2 载体与菌株 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 试剂盒与试剂 |
| 3.1.5 试验试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 棉株的种植及培养 |
| 3.2.2 克隆VIGS目的基因片段 |
| 3.2.3 沉默载体构建 |
| 3.2.4 重组VIGS载体转化农杆菌 |
| 3.2.5 棉株的接种 |
| 3.2.6 沉默棉株的目的基因表达量分析 |
| 3.2.7 病菌的活化及接种 |
| 3.2.8 沉默植株的抗病性鉴定 |
| 3.2.9 台盼蓝染色 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 沉默载体的构建 |
| 3.3.2 VIGS沉默棉株的表型 |
| 3.3.3 目的基因的表达量测定 |
| 3.3.4 沉默植株抗病性鉴定 |
| 3.4 台盼蓝染色 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 候选感黄萎病基因GhBZR1、GhWRKY74和GhTGA7的全长克隆 |
| 4.1 试验材料与试剂 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 所需仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 陆地棉86-1 的种植 |
| 4.2.2 RNA的提取 |
| 4.2.3 cDNA的合成 |
| 4.2.4 引物设计 |
| 4.2.5 GhBZR1、GhWRKY74 全长克隆 |
| 4.2.6 GhTGA7 全长克隆 |
| 4.2.7 GhBZR1、GhWRKY74和GhTGA7 的生物信息学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 基因GhBZR1 的克隆及生物信息分析 |
| 4.3.2 基因GhWRKY74 的克隆及生物信息分析 |
| 4.3.3 基因GhTGA7 的克隆及生物信息分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 基因GhBZR1、GhWRKY74和GhTGA7 的亚细胞定位分析 |
| 5.1 试验材料与试剂 |
| 5.1.1 植物材料与载体 |
| 5.1.2 仪器设备 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 植物材料的种植 |
| 5.2.2 目的基因的克隆 |
| 5.2.3 亚细胞定位载体构建 |
| 5.2.4 亚细胞定位载体35S::GhX-GFP转化农杆菌 |
| 5.2.5 烟草接种及结果观察 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 亚细胞定位载体的构建 |
| 5.3.2 激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 超表达技术研究GhBZR1 基因功能 |
| 6.1 材料于试剂 |
| 6.1.1 植物材料与病菌 |
| 6.1.2 载体与菌株 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 试剂盒与试剂 |
| 6.1.5 试剂的配制 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 GhBZR1 目的片段扩增 |
| 6.2.2 超表达载体构建 |
| 6.2.3 超表达载体pPZP111-eGFP-GhBZR1 转化农杆菌 |
| 6.2.4 拟南芥遗传转化 |
| 6.2.5 阳性苗筛选 |
| 6.2.6 基因GhBZR1 的表达分析 |
| 6.2.7 超表达植物的抗病性鉴定 |
| 6.2.8 转基因拟南芥抗病相关基因的表达 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 基因GhBZR1 超表达载体的构建 |
| 6.3.2 转基因拟南芥的筛选 |
| 6.3.3 超表达拟南芥黄萎病的抗性鉴定 |
| 6.3.4 超表达拟南芥抗性相关基因的表达分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）智能聪有效组分的筛选及抗病毒研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 植物病毒病 |
| 1.1.1 植物病毒病的危害 |
| 1.1.2 植物病毒病的种类 |
| 1.1.3 植物病毒防治策略 |
| 1.2 植物诱导抗性 |
| 1.2.1 植物免疫系统 |
| 1.2.2 植物诱导抗性的作用机制 |
| 1.2.2.1 组织病理学机制 |
| 1.2.2.2 生理生化机制 |
| 1.2.2.3 分子机制 |
| 1.3 植物免疫诱抗剂 |
| 1.3.1 植物免疫诱抗剂的概述 |
| 1.3.2 植物免疫诱抗剂的应用 |
| 1.4 RNA沉默与植物防御病毒的研究 |
| 1.4.1 RNA沉默的发现 |
| 1.4.2 RNA沉默的途径 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 免疫诱抗剂—智能聪 |
| 2.1.2 病原及植物材料 |
| 2.1.3 质粒、菌株 |
| 2.1.4 酶及各种生化试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 工具软件与数据库 |
| 2.1.7 PCR引物 |
| 2.2 材料准备及处理 |
| 2.2.1 本氏烟草的种植与处理 |
| 2.2.2 农杆菌介导的瞬时侵染烟草 |
| 2.2.3 马铃薯X病毒的活化与保存 |
| 2.2.4 本氏烟草的处理和取材方法 |
| 2.2.5 培养基 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 智能聪各组分的分离纯化 |
| 2.3.2 植物总RNA的提取 |
| 2.3.3 反转录合成cDNA |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR |
| 2.3.5 水杨酸检测 |
| 2.3.6 长波紫外灯的使用 |
| 2.3.7 活性氧检测 |
| 2.3.7.1 DAB染色检测过氧化氢的积累 |
| 2.3.7.2 NBT染色检测超氧阴离子的积累 |
| 2.3.8 钙离子信号的检测 |
| 2.3.8.1 本氏烟草叶片细胞内Fluo-3AM的装载 |
| 2.3.8.2 双光子共聚焦显微镜的使用流程 |
| 2.3.9 荧光强度的量化分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ZNC不同组分的分离纯化 |
| 3.2 ZNC的有效抗病毒组分的筛选 |
| 3.3 不同浓度Fraction8 对病毒的防治效果 |
| 3.4 Fraction8 不同处理方式对病毒的防治效果 |
| 3.4.1 先接种病毒后喷施Fraction8 的防治效果 |
| 3.4.2 先喷施Fraction8 后接种病毒的防治效果 |
| 3.5 Fraction8 增强植物对烟草花叶病毒(TMV)的抗性 |
| 3.6 Fraction8 诱导植物抗病毒机制研究 |
| 3.6.1 Fraction8 能够促进水杨酸的积累并激活SA信号通路 |
| 3.6.2 Fraction8 能够促进ROS的积累 |
| 3.6.3 Fraction8 能够促进Ca~(2+)内流 |
| 3.6.4 Fraction8 可能通过SA途径增强RNA沉默并诱发抗病毒性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Fraction8 对病毒具有显着的预防效果 |
| 4.2 Fraction8 诱发植物抗病毒的机制 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文及成果 |
（4）小麦抗赤霉病基因PFT互作基因TaRBL的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 小麦赤霉病研究现状 |
| 1.2.1 小麦赤霉病及其危害 |
| 1.2.2 赤霉病抗性类型 |
| 1.2.3 形态抗性机制 |
| 1.2.4 细胞学抗性机制 |
| 1.2.5 生理抗性机制 |
| 1.2.6 分子抗性机制 |
| 1.2.7 抗性相关基因 |
| 1.2.8 其他与赤霉病相关物质 |
| 1.2.9 研究目的及意义 |
| 第二章 小麦TaRBL基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要溶液和培养基的配制 |
| 2.2.2 小麦总RNA提取 |
| 2.2.3 小麦RNA反转录 |
| 2.2.4 TaRBL基因的克隆 |
| 2.2.5 实验所用引物 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 小麦TaRBL基因的克隆 |
| 2.3.2 小麦TaRBL蛋白的序列分析 |
| 2.3.3 小麦TaRBL蛋白的进化关系分析 |
| 2.3.4 本章小结 |
| 第三章 小麦TaRBL基因与PFT基因的互作分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料与载体 |
| 3.1.2 主要试剂及配制 |
| 3.1.3 植物培养 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 酵母双杂交载体构建 |
| 3.2.3 酵母感受态制备 |
| 3.2.4 酵母转化 |
| 3.2.5 PFT诱饵载体自激活检测与自毒检测 |
| 3.2.6 小麦TaRBL基因与Ta PFT基因互作验证 |
| 3.2.7 双分子荧光互补载体构建 |
| 3.2.8 农杆菌转化 |
| 3.2.9 双分子荧光互补试验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 酵母双杂与双分子荧光互补载体的构建 |
| 3.3.2 TaPFT蛋白的自激活与自毒检测 |
| 3.3.3 酵母双杂交验证TaRBL与 Ta PFT相互作用 |
| 3.3.4 双分子荧光互补试验验证互作 |
| 3.3.5 本章小结 |
| 第四章 TaRBL基因功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料及载体 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 不同抗感品种接种禾谷镰刀菌后TaRBL基因表达量的测定 |
| 4.2.2 FES的配制 |
| 4.2.3 VIGS载体构建 |
| 4.2.4 质粒线性化 |
| 4.2.5 病毒RNAs体外转录 |
| 4.2.6 小麦培养与病毒接种 |
| 4.2.7 禾谷镰刀菌孢子接种小麦 |
| 4.2.8 BSMV-VIGS沉默效率分析 |
| 4.2.9 TaRBL基因过表达载体的构建 |
| 4.2.10 小麦的遗传转化与鉴定 |
| 4.2.11 转基因小麦叶片DNA提取 |
| 4.2.12 转基因小麦叶片赤霉病抗性鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同抗感材料接种禾谷镰刀菌孢子后对TaRBL基因表达的影响 |
| 4.3.2 小麦VIGS的体系构建 |
| 4.3.3 BSMV-VIGS技术初步验证TaRBL基因功能 |
| 4.3.4 转基因植株GUS染色鉴定与PCR鉴定 |
| 4.3.5 转基因小麦叶片赤霉病抗性鉴定 |
| 4.3.6 本章小结 |
| 第五章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（5）转录因子NbWRKY18抗病毒功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 WRKY转录因子的研究概述 |
| 1.2 WRKY转录因子研究进展 |
| 1.2.1 WRKY的结构与分类 |
| 1.2.2 WRKY转录因子的生物学功能 |
| 1.2.2.1 WRKY参与植物的生长发育 |
| 1.2.2.2 WRKY参与植物非生物胁迫 |
| 1.2.2.3 WRKY参与生物胁迫 |
| 1.2.3 WRKY转录因子的调控网络 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第2章 NbWRKY18基因克隆与原核表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 本氏烟总RNA提取 |
| 2.2.2.2 设计引物 |
| 2.2.2.3 cDNA的获得 |
| 2.2.2.4 基因的克隆与纯化 |
| 2.2.2.5 载体线性化处理 |
| 2.2.2.6 重组载体的构建 |
| 2.2.2.7 载体转化大肠杆菌 |
| 2.2.2.8 阳性克隆的筛选 |
| 2.2.2.9 诱导原核表达及分析 |
| 2.2.2.10 Western blot分析 |
| 2.2.2.11 制备多克隆抗体 |
| 2.2.2.11.1 免疫兔子 |
| 2.2.2.11.2 血清效价的测定 |
| 2.2.2.11.3 抗血清特异性测定 |
| 2.2.2.11.4 抗体制备 |
| 2.2.2.11.5 提取植物总蛋白 |
| 2.2.2.12 NbWRKY18基因的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 NbWRKY18基因克隆及序列分析 |
| 2.3.2 原核表达载体构建 |
| 2.3.3 NbWRKY18原核表达分析 |
| 2.3.4 NbWRKY18抗体的特异性检测 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第3章 NbWRKY18基因表达模式及亚细胞定位分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 实验材料的处理 |
| 3.2.2.2 植物总RNA的提取 |
| 3.2.2.3 设计引物 |
| 3.2.2.4 cDNA的合成 |
| 3.2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 3.2.2.6 目的基因的获得 |
| 3.2.2.7 重组载体的获得 |
| 3.2.2.8 制备根癌农杆菌感受态细胞 |
| 3.2.2.9 质粒转化农杆菌感受态 |
| 3.2.2.10 农杆菌浸润本氏烟 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 非生物胁迫下本氏烟NbWRKY18表达模式分析 |
| 3.3.2 激素处理下本氏烟NbWRKY18表达模式分析 |
| 3.3.3 病毒胁迫下本氏烟NbWRKY18表达模式分析 |
| 3.3.4 NbWRKY18亚细胞定位分析 |
| 3.3.5 小结与讨论 |
| 第4章 NbWRKY18转基因植株的获得及抗病毒分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.0 材料 |
| 4.2.1 方法 |
| 4.2.1.1 RNA的提取 |
| 4.2.1.2 引物合成 |
| 4.2.1.3 目的基因的扩增以及纯化 |
| 4.2.1.4 载体的线性化处理 |
| 4.2.1.5 重组质粒的构建 |
| 4.2.1.6 阳性克隆的鉴定 |
| 4.2.1.7 重组质粒转化农杆菌 |
| 4.2.1.8 转基因植株的获得 |
| 4.2.1.9 CTAB法提取植物DNA |
| 4.2.1.10 转基因植株的PCR检测 |
| 4.2.1.11 Real-Time PCR筛选高表达植株 |
| 4.2.1.12 转基因植株的Western blot检测 |
| 4.2.2 农杆菌浸润接种 |
| 4.2.3 Northern blot |
| 4.2.4 液质联用分析植物激素含量 |
| 4.2.4.1 提取植物激素 |
| 4.2.4.2 质谱检测方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转基因植株的获得 |
| 4.3.2 转基因植株的阳性鉴定及表型分析 |
| 4.3.3 筛选NbWRKY18转基因高表达株系 |
| 4.3.4 NbWRKY18转基因植株激素含量分析 |
| 4.3.5 过表达NbWRKY18对ToMV侵染的影响 |
| 4.3.6 过表达NbWRKY18对TuMV积累的影响 |
| 4.3.7 分析TuMV/ToMV侵染后植物体内激素含量 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第5章 沉默NbWRKY18基因对病毒侵染的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.2.2.0 目的基因的扩增与纯化 |
| 5.2.2.1 VIGS载体的构建 |
| 5.2.2.2 农杆菌感受态的制备 |
| 5.2.2.3 重组质粒转化至农杆菌感受态细胞 |
| 5.2.2.4 VIGS沉默NbWRKY18基因 |
| 5.2.2.5 基因沉默效率的测定 |
| 5.2.2.6 Western blot |
| 5.2.2.7 Northern blot分析 |
| 5.2.2.8 植物激素的提取 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 本氏烟中沉默NbWRKY18基因的表型分析 |
| 5.3.2 沉默NbWRKY18基因对ToMV侵染影响 |
| 5.3.3 沉默NbWRKY18基因对TuMV侵染的影响 |
| 5.3.4 测定ToMV/TuMV侵染后NbWRKY18沉默植株的激素含量 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）NbFLA34和NbHRLI4基因在芜菁花叶病毒侵染过程中的功能研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒研究概述 |
| 1.1.1 Potyvirus的发生危害 |
| 1.1.2 Potyvirus的基因组结构特征 |
| 1.1.3 芜菁花叶病毒(TuMV)编码蛋白的功能研究进展 |
| 1.2 类成束阿拉伯半乳糖蛋白(Fasciclin-like arabinogalactan,FLA)研究概述 |
| 1.2.1 FLA的分类地位与结构特征 |
| 1.2.2 FLA在生长发育过程中的作用 |
| 1.2.3 FLA在应对非生物胁迫中的作用 |
| 1.2.4 FLA在应对生物胁迫中的作用 |
| 1.3 植物过敏性反应诱导的细胞坏死 |
| 1.3.1 植物过敏性反应诱导的细胞坏死 |
| 1.3.2 植物水杨酸介导的植物细胞坏死 |
| 1.3.3 植物病毒与过敏性反应 |
| 1.3.4 植物类过敏反应病变诱导蛋白(HR-like lesion-inducing protein,HRLI) |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 本氏烟NbFLA家族全基因组鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 供试菌株及载体 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植物总RNA提取 |
| 2.3.2 基因组DNA去除与RNA逆转录 |
| 2.3.3 克隆载体的构建 |
| 2.3.4 表达载体构建 |
| 2.3.5 农杆菌转化与浸润本氏烟 |
| 2.3.6 病毒接种与接种后观察 |
| 2.3.7 实时荧光定量PCR (RT-qPCR) |
| 2.3.8 亚细胞定位实验 |
| 2.3.9 家族全基因组鉴定 |
| 2.3.10 系统进化分析和多序列联配 |
| 2.3.11 基因结构与保守结构域分析 |
| 2.3.12 启动子顺式作用元件与转录因子预测 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 NbFLA基因家族成员的全基因组鉴定 |
| 2.4.2 NbFLA基因家族成员的进化分析与多序列联配 |
| 2.4.3 NbFLA基因家族成员的结构与保守基序分析 |
| 2.4.4 NbFLA基因家族成员的顺式作用元件与转录因子预测 |
| 2.4.5 NbFLA蛋白家族成员的亚细胞定位分析 |
| 2.4.6 NbFLA基因家族成员的组织特异性分析 |
| 2.4.7 NbFLA基因家族成员响应生物胁迫的表达量分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 FLA基因家族的分类及特征 |
| 2.5.2 FLA基因家族的表达模式及其作用 |
| 第三章 NbFLA34通过干扰TuMV 6K2蛋白的自身互作参与寄主抵抗TuMV侵染的过程 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 供试菌株与载体 |
| 3.2 试剂与仪器 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 酵母双杂交(Yeast two hybrid,Y2H) |
| 3.3.2 双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC) |
| 3.3.3 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP) |
| 3.3.4 病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS) |
| 3.3.5 Western blotting |
| 3.3.6 烟草遗传转化——叶盘法 |
| 3.3.7 CTAB法抽提植物DNA |
| 3.3.8 转基因烟草鉴定 |
| 3.3.9 苯胺蓝染色 |
| 3.3.10 表达载体的构建 |
| 3.3.11 病毒接种与接种后观察 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 NbFLA34与TuMV 6K2蛋白互作 |
| 3.4.2 NbFLA34定位于细胞质膜并在TuMV侵染后显着下调 |
| 3.4.3 GPI信号和GxxxG基序是NbFLA34与TuMV 6K2互作的关键位点 |
| 3.4.4 NbFLA34沉默促进TuMV的侵染 |
| 3.4.5 TuMV的积累在拟南芥突变体fla2中显着增加 |
| 3.4.6 过表达NbFLA34阻碍了病毒的积累和胞间运动 |
| 3.4.7 GxxxG基序是TuMV 6K2自身互作的关键位点 |
| 3.4.8 NbFLA34干扰6K2的自身互作 |
| 3.4.9 NbFLA34阻碍病毒囊泡的形成和PD靶向 |
| 3.4.10 NbFLA34与四种potyviruses 6K2相互作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 NbFLA34在TuMV侵染过程中的生物学功能 |
| 3.5.2 6K2诱导的病毒囊泡及GxxxG基序 |
| 3.5.3 GPI锚定信号在NbFLA34功能中的作用 |
| 第四章 NbHRLI4依赖于SA途径调控细胞坏死和对TuMV的抗病性 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 试剂与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 酵母双杂交 |
| 4.3.2 双分子荧光互补 |
| 4.3.3 免疫共沉淀 |
| 4.3.4 VIGS |
| 4.3.5 实时荧光定量PCR |
| 4.3.6 Western blotting |
| 4.3.7 台盼蓝染色鉴定细胞坏死 |
| 4.3.8 H_2O_2检测 |
| 4.3.9 电解质渗透率测定 |
| 4.3.10 SA喷施 |
| 4.3.11 基因家族的生物信息学分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 NbHRLI家族成员的全基因组鉴定 |
| 4.4.2 NbHRLI家族成员的表达模式 |
| 4.4.3 NbHRLI4沉默增加TuMV的积累 |
| 4.4.4 瞬时表达NbHRLI4正调节寄主对TuMV的抗性 |
| 4.4.5 NbHRLI4依赖于SA途径诱导HR样细胞死亡 |
| 4.4.6 NbHRLI4依赖于SA调控寄主免疫 |
| 4.4.7 NbHRLI4与TuMV-P3相互作用并响应TuMV-P3的表达 |
| 4.4.8 NbHRLI4的四个膜互作区域对其与TuMV-P3的互作及其介导的坏死与抗病毒能力至关重要 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 NbHRLI4的表达量变化及其与P3的互作 |
| 4.5.2 SA在NbHRLI4介导的防御反应中的作用 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 NbFLA34在TuMV侵染过程中的作用 |
| 5.1.2 NbHRLI4在TuMV侵染过程中的作用 |
| 5.2 展望 |
| 5.2.1 TuMV对于NbFLA34的下调机制的探索 |
| 5.2.2 NbFLA34对于抵御potyviruses侵染的普遍性探索 |
| 5.2.3 NbHRLI4参与细胞坏死的其他途径的探索 |
| 5.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A:本研究中常用培养基与缓冲液的配制 |
| 1. 抗生素配制 |
| 2. Western blotting缓冲液 |
| 3. 培养基配制 |
| 4. 转基因材料培养的相关母液配方 |
| 5. 其它试剂的配制 |
| 附录B:本研究中使用的引物及其序列 |
| 作者简介 |
| 参与的课题 |
| 发表的论文 |
（7）蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物抗病毒的分子机制 |
| 1.1 植物病毒病 |
| 1.2 植物抗病毒的分子机制 |
| 1.2.1 R基因介导的抗病毒机制 |
| 1.2.2 基因沉默介导的抗病毒机制 |
| 2.马铃薯Y病毒的研究进展 |
| 2.1 马铃薯Y病毒 |
| 2.2 基因组结构 |
| 2.2.1 辅助成分蛋白酶HC-Pro |
| 3.蛋白酶抑制子(PI)在抗病中的研究进展 |
| 4.研究目的及意义 |
| 第二章 NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300载体构建及本氏烟遗传转化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂和培养基 |
| 2.3 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300融合载体的构建 |
| 2.3.1 NbSIPI6-pGEM T-Easy、NbSIPI6m-pGEM T-Easy及GFP-1300质粒的提取 |
| 2.3.2 目的载体的双酶切 |
| 2.3.3 NbSIPI6、NbSIPI6m片段及GFP-1300片段凝胶回收 |
| 2.3.4 连接与转化 |
| 2.3.5 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300载体的验证及测序 |
| 2.3.6 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300载体质粒提取 |
| 2.3.7 NbSIPI6-GFP-1300和NbSIPI6m-GFP-1300载体双酶切验证 |
| 2.4 农杆菌GV3101的转化 |
| 2.4.1 制备农杆菌感受态细胞 |
| 2.4.2 质粒转化农杆菌 |
| 2.5 载体遗传转化本氏烟 |
| 2.5.1 无菌播种本氏烟 |
| 2.5.2 扩大培养含表达载体的农杆菌菌液 |
| 2.5.3 预培养 |
| 2.5.4 烟草愈伤侵染共培养 |
| 2.5.5 烟草愈伤组织菌体洗涤及筛选 |
| 2.5.6 分化培养 |
| 2.5.7 生根培养 |
| 2.5.8 炼苗及种植 |
| 2.6 转基因烟草的验证 |
| 2.6.1 转基因烟草幼苗PCR鉴定 |
| 2.6.2 T0代转基因烟草PCR鉴定 |
| 2.7 实时定量PCR分析Nb SIPI6 的表达量 |
| 2.7.1 转基因烟草RNA的提取 |
| 2.7.2 靶基因cDNA一链的合成 |
| 2.7.3 实时荧光定量PCR检测T0代转基因苗的相对表达量 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 超表达NbSIPI6、点突变NbSIPI6m融合载体的构建 |
| 3.2 转基因植株的获得 |
| 3.3 转基因烟草植株鉴定 |
| 3.4 实时定量PCR分析Nb SIPI6 的表达 |
| 4 讨论 |
| 第三章 Nb SIPI6-GFP与 Nb SIPI6m-GFP转基因植株的抗病性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂与培养基 |
| 2.3 转基因烟草T1代抗生素抗性筛选 |
| 2.4 T1代转基因株系GFP荧光检测 |
| 2.5 转基因株系的抗病性分析 |
| 2.5.1 转基因株系接种PVX-INF1病毒 |
| 2.5.2 转基因株系接种PVY病毒 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转基因烟草T1代抗生素抗性筛选 |
| 3.2 T1代转基因株系GFP荧光检测 |
| 3.3 转基因烟草抗病性分析 |
| 3.3.1 转基因株系接种PVX-INF1 的表型 |
| 3.3.2 转基因株系接种PVY病毒后的表型 |
| 3.3.3 转基因株系接种PVY后 Nb SIPI6 的表达模式 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NbSIPI6 的亚细胞定位及表达特点 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂与培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 亚细胞定位 |
| 2.3.2 Nb SIPI6受外源水杨酸的诱导表达 |
| 2.3.3 Nb SIPI6受PVX病毒的诱导表达 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 亚细胞定位 |
| 3.2 NbSIPI6 受外源水杨酸(SA)的诱导表达 |
| 3.3 NbSIPI6受PVX的诱导表达 |
| 4 讨论 |
| 第五章 NbSIPI6对基因沉默的抑制作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与实验方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂与培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 烟草材料培养 |
| 2.3.2 农杆菌GV3101的转化 |
| 2.3.3 农杆菌扩大培养 |
| 2.3.4 农杆菌瞬时表达16c转基因烟草 |
| 2.3.5 检测NbSIPI6是否具有抑制沉默抑制子的活性 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 第六章 讨论与展望 |
| 1 研究讨论 |
| 2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（8）中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA抑制转录后基因沉默的机理研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 研究背景 |
| 1.1 双生病毒的发生与危害 |
| 1.2 菜豆金色花叶病毒属病毒的分类地位及基本特性 |
| 1.3 菜豆金色花叶病毒属病毒伴随卫星DNAβ的研究进展 |
| 1.3.1 DNAβ的基因组结构 |
| 1.3.2 DNAβ参与病毒症状的诱导 |
| 1.3.3 DNAβ参与PTGS的抑制 |
| 1.3.4 DNAβ参与TGS的抑制 |
| 1.3.5 DNAβ参与病毒的运动 |
| 1.3.6 DNAβ参与寄主防卫反应的抑制 |
| 1.4 RNA沉默与双生病毒 |
| 1.4.1 RNA沉默的基本机理 |
| 1.4.2 参与抗病毒的RNA沉默途径中的核心蛋白 |
| 1.4.3 病毒诱发的RNA沉默与编码的RNA沉默抑制子 |
| 1.4.4 双生病毒诱发的RNA沉默 |
| 1.4.5 双生病毒编码的RNA沉默抑制子 |
| 1.5 本项目的研究目的和意义 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 常规DNA克隆技术 |
| 2.1.1 PCR技术 |
| 2.1.2 PCR产物的纯化 |
| 2.1.3 载体的去磷酸化 |
| 2.1.4 连接 |
| 2.1.5 感受态细胞的制备 |
| 2.1.6 转化 |
| 2.1.7 菌落PCR筛选 |
| 2.1.8 重组质粒的提取 |
| 2.1.9 重组克隆的酶切鉴定 |
| 2.1.10 重组克隆的测序鉴定 |
| 2.2 重组质粒导入根癌农杆菌及农杆菌介导的植物接种 |
| 2.2.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 重组质粒电击转化根癌农杆菌 |
| 2.2.3 农杆菌的浸润及接种 |
| 2.3 烟草的遗传转化 |
| 2.3.1 农杆菌的培养 |
| 2.3.2 烟草叶片的准备 |
| 2.3.3 预培养 |
| 2.3.4 农杆菌的侵染 |
| 2.3.5 分化培养 |
| 2.3.6 生根培养 |
| 2.4 植物总DNA提取以及Southern blot分析 |
| 2.4.1 大量抽提植物DNA的方法(CTAB法) |
| 2.4.2 小量抽提植物DNA的方法(CTAB法) |
| 2.4.3 小量抽提植物DNA的方法(试剂盒法) |
| 2.4.4 Southern印迹分析 |
| 2.5 植物总RNA小量提取、RT-PCR及RT-qPCR |
| 2.5.1 植物总RNA的小量提取步骤 |
| 2.5.2 反转录RT-PCR及RT-qPCR |
| 2.6 Northern印迹杂交 |
| 2.6.1 mRNA的Northern印迹杂交 |
| 2.6.2 小RNA的分离及Northern blot |
| 2.7 原核蛋白的表达及纯化 |
| 2.7.1 原核蛋白的表达 |
| 2.7.2 原核蛋白的纯化 |
| 2.8 植物总蛋白的提取、蛋白的SDS-PAGE及Western blot杂交 |
| 2.8.1 植物总蛋白的提取 |
| 2.8.2 蛋白的SDS-PAGE及Western blot杂交 |
| 2.9 亲和层析法纯化血清中的抗体 |
| 2.9.1 亲和柱的制备 |
| 2.9.2 抗体的纯化 |
| 3 βC1上调本氏烟钙调素类似蛋白rgs-CaMs的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 载体构建 |
| 3.1.3 农杆菌介导的浸润及病毒的接种 |
| 3.1.4 转基因阳性植株的筛选与病毒侵染性的检测 |
| 3.1.5 烟草Microarray基因表达谱的制备及分析 |
| 3.1.6 本氏烟转录组的高通量测序 |
| 3.1.7 Northern blot及RT-qPCR的分析 |
| 3.1.8 酵母转化 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 卫星DNAβ编码的βC1蛋白能够诱导rgs-CaMs的表达 |
| 3.2.2 rgs-CaMs基因的序列分析 |
| 3.2.3 Nbrgs-CaM亚细胞定位及组织特异性表达分析 |
| 3.2.4 Nbrgs-CaM的转录激活作用分析 |
| 3.2.5 Nbrgs-CaM蛋白的纯化与多克隆抗体的制备 |
| 3.3 讨论 |
| 4 βC1与rgs-CaMs抑制RNA沉默的特性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 载体构建 |
| 4.1.3 农杆菌介导的浸润及接种 |
| 4.1.4 GFP荧光记录与样品采集 |
| 4.1.5 检测病毒侵染性及VIGS的效率 |
| 4.1.6 植物RNA与蛋白的杂交分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 Rgs-CaMs是内源的PTGS抑制子 |
| 4.2.2 Nbrgs-CaM能够抑制双生病毒诱导的内源基因沉默 |
| 4.2.3 Nbrgs-CaM与βC1抑制PTGS中dsRNA的产生 |
| 4.2.4 Ntrgs-CaM与Slrgs-CaM抑制PTGS中dsRNA的产生 |
| 4.2.5 Nbrgs-CaM对于βc1的RNA沉默抑制活性是必需的 |
| 4.3 讨论 |
| 5 Rgs-CaMs对βC1介导双生病毒致病性的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 载体构建 |
| 5.1.3 农杆菌介导的浸润及病毒的接种 |
| 5.1.4 转基因阳性植株的筛选 |
| 5.1.5 病毒侵染性的检测 |
| 5.1.6 Northern blot及RT-qPCR的分析 |
| 5.1.7 Western blot分析 |
| 5.1.8 Southern blot分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 Nbrgs-CaM转基因植株的表型分析 |
| 5.2.2 Nbrgs-CaM在βC1症状诱导中的功能 |
| 5.2.3 Rgs-CaMs对双生病毒致病性的影响 |
| 5.2.4 Nbrgs-CaM对CMV致病性的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 6 Nbrgs-CaM抑制RDR6介导的RNA沉默对双生病毒的抗性分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 pPVX-Nbrgs-CaM载体构建 |
| 6.1.3 农杆菌介导的浸润及接种 |
| 6.1.4 GFP荧光记录与样品采集 |
| 6.1.5 病毒侵染性及VIGS效率的检测 |
| 6.1.6 RNA与蛋白的杂交分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 Nbrgs-CaM与βC1能够抑制NbRDR6的表达 |
| 6.2.2 Nbrgs-CaM对于βC1抑制NbRDR6是必需的 |
| 6.2.3 Nbrgs-CaM过表达与NbRDR6沉默的植株均能抑制S-PTGS |
| 6.2.4 NbRDR6参与双生病毒诱导的RNA沉默 |
| 6.2.5 NbRDR6介导抗双生病毒的RNA沉默反应 |
| 6.2.6 RDR6限制了双生病毒的寄主范围 |
| 6.3 讨论 |
| 7 Nbrgs-CaM影响SGS3介导的RNA沉默对双生病毒的抗性分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 载体的构建 |
| 7.1.3 农杆菌介导的浸润及接种 |
| 7.1.4 GFP荧光记录与样品采集 |
| 7.1.5 检测病毒侵染性及VIGS的效率 |
| 7.1.6 Western blot分析NbSGS3蛋白的积累 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 NbSGS3序列分析及组织表达特异性 |
| 7.2.2 NbSGS3对于局部及系统S-PTGS的产生是必需的 |
| 7.2.3 NbSGS3对于系统沉默的维持是必需的 |
| 7.2.4 NbSGS3协同NbRDR6参与对双生病毒的抗性 |
| 7.2.5 Nbrgs-CaM能够与NbSGS3互作 |
| 7.2.6 NbSGS3的亚细胞定位分析 |
| 7.2.7 Nbrgs-CaM与NbSGS3能够相互影响细胞定位 |
| 7.2.8 Nbrgs-CaM下调NbSGS3蛋白的积累 |
| 7.3 讨论 |
| 8 βC1上调Nbrgs-CaM的机理分析 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 载体的构建 |
| 8.1.3 农杆菌的浸润与样品采集 |
| 8.1.4 GUS活性测定与染色分析 |
| 8.1.5 GFP紫外拍照、蛋白检测与活性分析 |
| 8.1.6 甲基化相关实验的方法 |
| 8.1.7 病毒侵染率及转基因植株的阳性筛选 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 βC1的核定位突变体对Nbrgs-CaM表达的影响 |
| 8.2.2 Nbrgs-CaM启动子的克隆 |
| 8.2.3 Nbrgs-CaM启动子瞬时表达的活性分析 |
| 8.2.4 Nbrgs-CaM启动子的甲基化分析 |
| 8.2.5 pC1对Nbrgs-CaM启动子甲基化的影响 |
| 8.2.6 Nbrgs-CaM启动子转基因的活性分析 |
| 8.2.7 双生病毒侵染对Nbrgs-CaM转基因启动子活性的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 9 全文小结与研究展望 |
| 9.1 全文小结 |
| 9.2 研究展望 |
| 附文1 印度绿豆黄化花叶病毒编码AC5基因功能的鉴定与分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 MYMIV侵染性克隆的构建 |
| 1.1.3 MYMIV AC5突变体侵染性克隆的构建 |
| 1.1.4 重组载体的构建 |
| 1.1.5 农杆菌的接种或者浸润 |
| 1.1.6 抑制子鉴定实验 |
| 1.1.7 荧光观察、拍照并采集样品 |
| 1.1.9 DAB染色分析 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 AC5的序列分析及转录起始位点的确定 |
| 1.2.2 AC5突变对MYMIV致病性的影响 |
| 1.2.3 PVX表达AC5蛋白的致病性分析 |
| 1.2.4 AC5基因的PTGS抑制子活性分析 |
| 1.2.5 AC5基因的TGS抑制子活性分析 |
| 1.2.6 AC5抑制PTGS的结构域的鉴定 |
| 1.2.7 AC5抑制TGS及致病性相关的结构域的鉴定 |
| 1.2.8 AC5转基因植株的分析 |
| 1.2.9 AC5转基因植株对MYMIV-AC5m毒力的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 附文2 番茄黄化曲叶病毒编码蛋白的致病性分析与TGS抑制子的鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 载体构建与农杆菌浸润 |
| 2.1.3 拍照、样品采集与Western blot实验 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 番茄黄化曲叶病毒编码蛋白的致病性分析 |
| 2.2.2 番茄黄化曲叶病毒抑制TGS能力的分析 |
| 2.2.3 番茄黄化曲叶病毒编码TGS抑制子的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 附文3 双生病毒在酵母系统中的复制机理探讨 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 载体构建 |
| 3.1.3 酵母转化 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 鉴定可在酵母中复制的双生病毒 |
| 3.2.2 酵母复制相关交体对MYMIV复制的影响 |
| 3.2.3 酵母突变体对Y194复制的影响 |
| 3.2.4 Y194复制模式的分析 |
| 3.2.5 Y194复制原点类似元件的鉴定 |
| 3.2.6 Y194中CEN元件的鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录A 本论文所用缩写词及中英文对照 |
| 附录B 本论文所用病毒缩写及中英文对照 |
| 附录C 常用缓冲液及培养基配方 |
| 作者简历及攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（9）番茄RNA沉默体系的鉴定及其抗病毒新方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 目录 |
| 第一章 前言 |
| 1 植物RNA沉默途径与功能 |
| 1.1 植物RNA沉默途径的多样性 |
| 1.2 植物RNA沉默途径中的核心蛋白 |
| 1.3 sRNA的生物学功能 |
| 1.4 植物RNA沉默的系统性 |
| 2 植物病毒与抗病毒反应 |
| 2.1 植物病毒 |
| 2.2 抗性基因介导的植物抗病反应 |
| 2.3 RNA介导的病毒免疫 |
| 3 RNA沉默技术在植物改良上的应用 |
| 3.1 植物RNA沉默的应用方式 |
| 3.2 应用前景与问题 |
| 4 研究的意义与内容 |
| 4.1 研究意义 |
| 4.2 研究内容与目标 |
| 第二章 番茄RNA沉默核心基因的鉴定及其表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 候选基因的预测鉴定 |
| 1.3 植物材料与胁迫处理 |
| 1.4 RNA提取与RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 番茄DCL、AGO和RDR基因的鉴定及其结构分析 |
| 2.2 DCL、AGO和RDR基因的进化树分析 |
| 2.3 DCL、AGO和RDR基因的染色体定位与序列相似性分析 |
| 2.4 不同组织和器官中的基因表达模式 |
| 2.5 TYLCV侵染和非生物胁迫下DCL、AGO和RDR的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 番茄Dicer-like蛋白及其功能多样性 |
| 3.2 番茄的Argonaute基因 |
| 3.3 番茄RDR基因功能 |
| 4 小结 |
| 第三章 番茄内源sRNA与降解组学特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 试验设计方案 |
| 1.3 植物材料病毒接种与样本采集 |
| 1.4 核酸的提取 |
| 1.5 sRNA组和降解组建库 |
| 1.6 数据的生物信息学分析 |
| 2 |
| 2.2 番茄miRNA的分析 |
| 2.3 番茄siRNA的分析 |
| 2.4 降解组数据分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 sRNA与病毒诱导的症状关系 |
| 3.2 sRNA参与的抗性调控 |
| 3.3 降解组数据分析 |
| 4 小结 |
| 第四章 番茄TYLCV耐感品种中病毒源小分子RNA特征与功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 荧光定量PCR |
| 1.3 重亚硫酸盐测序 |
| 1.4 数据的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 vsRNA的统计特征 |
| 2.2 vsRNA的发生与功能 |
| 2.3 耐感品种间的一致性与差异 |
| 3 讨论 |
| 3.1 寄主RNA沉默途径核心蛋白的作用 |
| 3.2 vsRNA的热点 |
| 3.3 vsRNA的功能 |
| 3.4 RNA沉默与病毒抗性基因 |
| 3.5 指导抗病毒应用 |
| 4 小结 |
| 第五章 利用系统性基因沉默提高嫁接番茄病毒抗性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 载体构建 |
| 1.3 番茄的遗传转化与繁殖 |
| 1.4 转基因植株的分子鉴定 |
| 1.5 RNA提取与RT-PCR分析 |
| 1.6 转基因株系的营养扩繁 |
| 1.7 转基因植株的CMV抗性鉴定 |
| 1.8 嫁接 |
| 1.9 砧木和接穗中IR源sRNA的检测 |
| 1.10 CMV的DAS-ELISA鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 植物表达载体构建与遗传转化 |
| 2.2 转基因植株的检测 |
| 2.3 转基因植株的CMV抗性检测 |
| 2.4 嫁接植株CMV抗性的鉴定 |
| 2.5 砧穗中NptⅡ转录本的检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同靶标间病毒抗性差异 |
| 3.2 转基因RNA沉默植株病毒抗性差异 |
| 3.3 RNA沉默效应的传递与应用意义 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 下一步工作设想 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录A：试剂与仪器 |
| 附A.1 常规试验试剂 |
| 附A.2 试验试剂配方 |
| 附A.3 试验用到的仪器 |
| 附件B：部分试验方法与步骤 |
| 附B.1 TYLCV病毒接种与检测 |
| 附B.2 sRNA高通量测序分析 |
| 附B.3 降解组测序分析 |
| 附B.4 DNA甲基化检测 |
（10）马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA和人工的miRNA介导的病毒抗性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 基因沉默 |
| 1.2 沉默RNA |
| 1.2.1 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA） |
| 1.2.2 微小RNA（microRNA，miRNA） |
| 1.2.3 siRNA 和miRNA 的联系和区别 |
| 1.2.4 其他参与沉默的小分子RNA |
| 1.3 RNA 沉默的作用机制 |
| 1.3.1 siRNA 途径 |
| 1.3.2 miRNA 途径 |
| 1.4 RNA 介导的病毒抗性 |
| 1.4.1 RNA 介导的病毒抗性的特点 |
| 1.4.2 RNA 介导的病毒抗性是转录后基因沉默的结果 |
| 1.5 基于siRNA 的抗病毒策略 |
| 1.6 植物抗病毒研究中高效的发夹RNA 植物表达载体的构建 |
| 1.6.1 hpRNA 茎结构长度的影响 |
| 1.6.2 hpRNA 环区域的影响 |
| 1.6.3 核酸序列同源性的影响 |
| 1.6.4 转录速度的影响 |
| 1.7 基于miRNA 的抗病毒策略 |
| 1.8 人工miRNA 技术的影响因素 |
| 1.8.1 amiRNA 序列的设计与优化 |
| 1.8.2 天然的miRNA 前体的选择 |
| 1.9 马铃薯Y 病毒与抗病毒基因工程 |
| 1.10 本研究的目的及其意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒源 |
| 2.1.2 供试植物 |
| 2.1.3 菌株、质粒 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 构建含发夹结构的转基因植物表达载体 |
| 2.2.1.1 植物表达载体的构建策略 |
| 2.2.1.2 PCR 扩增特异性引物设计 |
| 2.2.2 构建amiRNA 转基因植物表达载体 |
| 2.2.2.1 植物表达载体的构建策略 |
| 2.2.2.2 amiRNA 的筛选 |
| 2.2.2.3 引物的设计 |
| 2.2.3 PCR 扩增目的片段 |
| 2.2.4 目的片段与克隆载体的连接 |
| 2.2.5 目的片段和质粒DNA 的酶切 |
| 2.2.6 DNA 片段的回收（试剂盒法） |
| 2.2.7 目的片段与质粒DNA 的连接 |
| 2.2.8 感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 质粒DNA 向大肠杆菌中转化（热激法） |
| 2.2.10 转化菌落PCR 鉴定 |
| 2.2.11 质粒DNA 的大量提取（碱性SDS 法） |
| 2.2.12 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.13 重组质粒向农杆菌转化（冻融法） |
| 2.2.14 农杆菌介导的瞬时侵染 |
| 2.2.15 农杆菌介导的烟草转化 |
| 2.2.16 植物总DNA 的提取（CTAB 法） |
| 2.2.17 转基因植株的PCR 检测 |
| 2.2.18 转基因植株的抗病性鉴定及ELISA 检测 |
| 2.2.18.1 转基因植株的抗病性鉴定 |
| 2.2.18.2 转基因植株的ELISA 检测 |
| 2.2.19 Northern 杂交分析 |
| 2.2.19.1 转基因植株总RNA 的提取（Trizol 一步提取法） |
| 2.2.19.2 在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳 |
| 2.2.19.3 转膜 |
| 2.2.19.4 探针制备 |
| 2.2.19.5 DIG 标记有效性检测 |
| 2.2.19.6 杂交 |
| 2.2.20 转基因植株siRNA/miRNA 的提取及杂交分析 |
| 2.2.20.1 转基因植株siRNA/miRNA 的提取 |
| 2.2.20.2 siRNA/miRNA 电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳） |
| 2.2.20.3 siRNA/miRNA 转膜（电转膜）及固定 |
| 2.2.20.4 siRNA/miRNA 探针的制备 |
| 2.2.20.5 siRNA/miRNA 杂交 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 靶向于马铃薯Y 病毒CP 基因不同区段的hpRNA 介导的病毒抗性 |
| 3.1.1 hpRNAi 植物表达载体的构建 |
| 3.1.1.1 PVY CP 不同区段正向和反向目的片段的获得 |
| 3.1.1.2 正向目的片段与表达载体pROKⅡ的连接 |
| 3.1.1.3 反向目的片段与重组中间载体的连接 |
| 3.1.2 农杆菌介导的瞬时侵染验证hpRNAi 植物表达载体的有效性 |
| 3.1.2.1 转化农杆菌EHA105 菌株 |
| 3.1.2.2 瞬时表达靶向PVY CP 的siRNA 的检测 |
| 3.1.2.3 Northern 杂交检测瞬时侵染时靶RNA 的积累 |
| 3.1.3 转基因烟草的获得 |
| 3.1.4 转基因烟草的检测 |
| 3.1.5 转基因烟草的抗病性分析 |
| 3.1.6 转基因烟草的Northern 杂交分析 |
| 3.1.7 转基因烟草植株中siRNA 的杂交分析 |
| 3.1.8 T2代转基因植株的抗病性分析 |
| 3.2 人工的miRNA 介导的马铃薯Y 病毒抗性 |
| 3.2.1 amiRNA 的筛选及引物设计 |
| 3.2.2 拟南芥天然miRNA 前体的克隆 |
| 3.2.3 靶向于PVY CP 基因不同区段的人工miRNA 表达载体的构建 |
| 3.2.4 重组表达载体的鉴定 |
| 3.2.5 农杆菌介导的瞬时侵染检测amiRNA 表达载体的有效性 |
| 3.2.5.1 转化农杆菌EHA105 菌株 |
| 3.2.5.2 瞬时表达靶向PVY CP 的amiRNA 的检测 |
| 3.2.5.3 Northern 杂交检测靶RNA 的积累 |
| 3.2.6 转基因烟草的获得 |
| 3.2.7 转基因烟草的检测 |
| 3.2.8 转基因植株的抗病性分析 |
| 3.2.9 转基因烟草的Northern 杂交分析 |
| 3.2.10 转基因烟草植株中amiRNA 的杂交分析 |
| 3.2.11 T2代转基因植株的抗病性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 博士学位论文内容简介及自评 |
四、植物转基因沉默与病毒抗性（论文参考文献）
- [1]NbLTP1调控烟草系统性抗性防御TMV侵染的作用机理及其抗体制备[D]. 朱鹏翔. 扬州大学, 2021
- [2]陆地棉候选感黄萎病基因的克隆及功能研究[D]. 贺浪. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]智能聪有效组分的筛选及抗病毒研究[D]. 张明钰. 山东农业大学, 2021(01)
- [4]小麦抗赤霉病基因PFT互作基因TaRBL的克隆及功能分析[D]. 张露凡. 河南科技学院, 2021(07)
- [5]转录因子NbWRKY18抗病毒功能研究[D]. 刘寒. 浙江师范大学, 2021(02)
- [6]NbFLA34和NbHRLI4基因在芜菁花叶病毒侵染过程中的功能研究[D]. 吴昕扬. 浙江大学, 2021(01)
- [7]蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用[D]. 刘敏. 浙江师范大学, 2020(01)
- [8]中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA抑制转录后基因沉默的机理研究[D]. 李方方. 浙江大学, 2014(01)
- [9]番茄RNA沉默体系的鉴定及其抗病毒新方法的研究[D]. 白描. 湖南农业大学, 2012(06)
- [10]马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA和人工的miRNA介导的病毒抗性的影响[D]. 姜芳. 山东农业大学, 2011(08)