一、梗阻性肾病肾间质纤维变性的代谢机制（论文文献综述）
杨洁珂[1]（2021）在《原儿茶醛抑制lncRNA9884介导的炎症以改善肾脏纤维化的研究》文中研究指明目的:慢性肾脏病（CKD）及其引起的终末期肾病（ESRD）是危害人类健康的主要疾病之一,其发病率高、并发症多,已经成为引起全球性关注的公共健康问题,给家庭和社会造成了巨大的经济负担。根据美国肾脏数据系统（USRDS）2019年的年报,目前CKD在全球一般人群患病率约为14.5%,其中每100名患者中就有三分之二的病人会发展为不可逆的肾功能衰竭,需要引起广泛的重视。然而目前慢性肾脏病的防治手段较为局限,口服药物和替代治疗方法的选择面都很狭窄,且费用昂贵,亟需开发新药或者新的治疗手段来降低患者治疗成本并有效缓解疾病的进展。长久以来,我国多年来的深厚中医文化底蕴沉淀出了许多对于慢性肾病有效的经方,但因其中药成分繁多,治疗机制复杂难辨,难以形成国际认可并统一的治疗准则。亟待我们深入挖掘其中的小分子成分并探索研究其具体的分子机制。本研究通过构建单侧输尿管阻塞（UUO）诱导的小鼠体内纤维化及炎症的模型和体外提取原代肾小管上皮细胞（TECs）使用TGF-β1诱导刺激纤维化以及IL-1β诱导刺激炎症模型,使用血清肾功能检测、组织切片病理染色、Western Blot、Real-time PCR、ELISA、CCK8毒性分析、免疫组织化学染色和免疫荧光标记、过表达质粒等实验方法和指标,旨在探讨中草药丹参的主要单体成分原儿茶醛（PCA）治疗梗阻性肾病的作用,以及调控lnc RNA9884（LRNA9884）发挥抗炎和抗纤维化的潜在分子机制。方法:首先建立体内SPF级C57BL/6小鼠的梗阻性肾病UUO模型,30只雄性小鼠被随机分为假手术组（Sham组）、梗阻性肾病模型组（UUO组）、低剂量原儿茶醛治疗组（10 mg/kg/d PCA,UUO+PCA 10）和高剂量原儿茶醛治疗组（40 mg/kg/d PCA,UUO+PCA 40）。PCA治疗组手术前腹腔注射给药一次,之后连续注射7天,每日一次,其余各组小鼠每日给予等体积生理盐水腹腔注射。7日之后,麻醉小鼠心脏采血并处死小鼠收集血清和处理肾脏用于开展实验。检测小鼠血清肌酐、尿素氮肾功能指标,组织切片行HE、Masson染色观察肾脏病理学改变情况;免疫组化、免疫荧光或者蛋白印迹,realtime-PCR检测α-SMA、Fibronectin、Smad3、NF-κB、Collagen I及MCP-1、i NOS、COX-2、IL-1β、TNF-α和IL-6的表达;利用realtime-PCR检测LRNA9884表达情况;ELISA测定血清中促炎细胞因子IL-1β,TNF-α和IL-6的分泌情况。在体外利用TECs分别建立IL-1β刺激诱导的细胞炎症模型和TGF-β1刺激诱导的细胞纤维化模型,并同时予以PCA不同浓度治疗组（20μM,40μM,80μM）一同处理24小时后,收集细胞上清和细胞,并及时提取蛋白、RNA冻存用于后续的实验。免疫荧光染色近端肾小管标志物AQP1、CK18以检测所提取TECs细胞纯度;CCK-8检测不同浓度PCA干预后的细胞活力并筛选出适宜浓度作为体外治疗的剂量;利用蛋白印迹,realtime-PCR实验方法检测各组细胞中α-SMA,Fibronectin,Collagen I,Smad3,NF-κB及MCP-1,i NOS,COX2,TNF-α和IL-6的表达;通过realtime-PCR检测各组细胞中LRNA9884的表达情况;ELISA测定细胞上清液中促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌情况;进一步通过体外转染pc DNA3.1-LRNA9884质粒在TECs中过表达LRNA9884,检测上述指标的变化情况。结果:通过血清肌酐、尿素氮的检测结果以及观察组织切片HE染色情况我们发现予以PCA治疗可部分逆转UUO引起的肾功能不全和病理改变。Masson染色及纤维化代表指标α-SMA,Fibronectin,Collagen I蛋白和m RNA水平realtime-PCR检测发现予以PCA治疗可显着减轻UUO所引起的纤维沉积。通过免疫荧光、蛋白印迹,realtime-PCR以及ELISA检测发现PCA干预后在蛋白和m RNA水平上均降低了UUO所引起的炎症细胞因子的过度表达。进一步检测发现PCA降低了NF-κB和Smad3通路的活化以及LRNA9884的表达。根据CCK-8检测结果筛选出药物适宜治疗浓度（20μM,40μM,80μM）,通过蛋白印迹,realtime-PCR检测发现PCA可以抑制IL-1β诱导的TECs中i NOS、COX2、MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-1β促炎细胞因子在蛋白和m RNA水平上的表达。ELISA检测细胞上清发现促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达同样被PCA干预后抑制。蛋白印迹检测进一步发现磷酸化的NF-κB激活受到抑制,realtime-PCR检测发现LRNA9884的表达在PCA干预后呈剂量依赖性下降,结果提示我们PCA的抗炎作用于调控LRNA9884有着密切关系。进一步通过转染pc DNA3.1-LRNA9884质粒在TECs中过表达LRNA9884时,上述指标在蛋白和m RNA水平上的表达均显着逆转,表明PCA的确可通过介导LRNA9884/MCP-1信号通路来抑制炎症反应。进一步使用PCA干预TGF-β1刺激的TECs,我们发现PCA能抑制TGF-β1诱导的纤维化模型中磷酸化的Smad3的活化,在蛋白和m RNA水平上均减轻纤维相关指标α-SMA,Fibronectin,Collagen I的表达,从而阻止上皮-间质转化（EMT）。结论:1.原儿茶醛可改善UUO小鼠肾功能损害,减轻肾小管的坏死。2.原儿茶醛在体内外均可抑制小鼠肾脏上皮-间质转化的发生和促炎因子的浸润。3.原儿茶醛可通过下调LRNA9884/MCP-1信号途径减轻炎症以改善肾间质纤维化。总之,原儿茶醛可通过抑制LRNA9884和NFκB信号途径引起的炎症反应以减轻阻塞性肾病的纤维化,研究结果为PCA在未来应用于临床治疗奠定了新的理论基础。
边红萍[2]（2021）在《基于“肾主水”理论探讨金匮肾气丸治疗慢性肾功能衰竭的实验研究》文中研究说明研究目的本研究工作以2.5%腺嘌呤混悬液灌胃与单侧输尿管结扎两种方法复制CRF大鼠模型,以金匮肾气丸“补益肾气”为治法,研究肺、肾、膀胱上APQ1-4的表达,探讨机体水液代谢的调控与机理,评价中医“肾主水”理论的科学性,为金匮肾气丸在中医慢性肾脏病的治疗与干预水液代谢调控提供实验依据。研究方法1金匮肾气丸治疗腺嘌呤慢性肾功能衰竭大鼠实验研究将60只健康雄性SD大鼠,随机分正常组（n=20只）和腺嘌呤造模组（n=40只）,适应性喂养1周后,用2.5%的腺嘌呤悬浊液剂量为250mg/（kg·d）灌胃复制CRF模型4周,两组中各取10只大鼠进行血、尿肾组织病理检测,评估腺嘌呤CRF大鼠模型。剩余40只大鼠分为正常组、CRF模型组、金匮肾气丸中剂量、金匮肾气丸高剂量4组,每组10只。金匮肾气丸中、高剂量组分别给予对应浓度剂量金匮肾气丸溶液灌胃,正常组、CRF模型组大鼠予以等量蒸馏水灌胃,治疗4周,比较各组大鼠24h-UTP,血常规、血生化与肾脏病理指标。2金匮肾气丸治疗UUO慢性肾功能衰竭大鼠实验研究50只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组（n=10只）和UUO造模组（n=40只）。采用UUO手术法复制CRF模型,将大鼠10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉,在左肾下极临近肾门处及输尿管的上1/3处用0#丝线结扎并剪断,缝合肌肉皮肤组织。假手术组大鼠给予等量10%水合氯醛腹腔麻醉开腹,仅钝性分离左侧输尿管并不予以结扎;正常组不做任何手术处理。UUO术后2周随机抽取10只大鼠评估UUO法CRF大鼠模型。剩余40只大鼠再分为假手术组、UUO模型组、金匮肾气丸中剂量组、金匮肾气丸高剂量组,每组10只。假手术组、UUO模型组采用蒸馏水灌胃;金匮肾气丸中、高剂量治疗组分别给予对应浓度剂量的金匮肾气溶液灌胃,疗程4周,比较各组大鼠的24h-UTP,血常规与生化、肾脏病理指标。（正常组同实验第一部分）3.慢性肾功能衰竭大鼠水通道蛋白表达的实验研究金匮肾气丸治疗4周,腺嘌呤灌胃与UUO法CRF各组大鼠获取肾脏、肺脏、膀胱组织,用Western blotting检测对应的水通道蛋白AQP1、AQP2、AQP3、AQP4,将不同蛋白条带图像用Image J软件进行灰度值分析,对应DAPDH蛋白条带作进行数据矫正。4.采用SPSS18.0软件对实验结果进行分析,计量资料用均数±标准差（x±s）表示,多组间均数的比较采用两独立样本t检验和单因素方差分析,双侧检验,检验水准α=0.05,P<0.05定义为统计差异性显着。研究结果1.腺嘌呤造模组4周大鼠24h U-TP、BUN、Scr与正常组比较均增高,统计有显着性差异（P<0.05）,大鼠肾脏病理损伤与CRF病理表现一致。金匮肾气丸治疗各组与腺嘌呤模型组24h U-TP、BUN、Scr水平比较降低,有显着统计学差异（P<0.05）,金匮肾气治疗组各组大鼠肾脏病理损伤与腺嘌呤模型组相比,有不同程度减轻。2.UUO术后2周大鼠24h U-TP、BUN、Scr水平与正常组比较均升高,统计有显着性差异（P<0.05）,UUO大鼠肾脏病理损伤与CRF病理表现一致。金匮肾气丸各治疗组与UUO模型组24h U-TP、BUN、Scr水平比较降低,有显着统计学差异（P<0.05）。金匮肾气治疗组各组大鼠肾脏病理损伤与UUO模型组相比,有不同程度减轻。3.各组大鼠肾脏、肺脏、膀胱AQP蛋白检测中（1）腺嘌呤模型组大鼠肾脏AQP1-4与膀胱AQP3表达上调,与正常组比较有显着性差异（P<0.05）。肺脏AQP1与膀胱AQP1表达下调,与正常组比较有显着性差异（P<0.05）。（2）UUO模型组大鼠肾脏AQP1与AQP4、肺脏AQP1、膀胱AQP4表达下调,与正常组比较统计有显着性差异（P<0.05）;膀胱AQP3表达上调,与正常组比较统计有显着性差异（P<0.05）。（3）腺嘌呤CRF金匮肾气丸中高剂量治疗组肾脏AQP1-4均有下调,与腺嘌呤模型组比较统计有差异显着性（P<0.05）。膀胱AQP1水平上调,与腺嘌呤模型组比较统计有差异显着性（P<0.05）。（4）UUO金匮肾气丸高剂量治疗组膀胱AQP4蛋白明显上调,与UUO模型组比较有显着性差异（P<0.05）。研究结论1、金匮肾气丸可以改善腺嘌呤与UUO慢性肾功能衰竭大鼠的生存质量,改善肾功能,减少24h尿蛋白定量,减轻大鼠肾脏的病理损害,可不同程度改善肾脏纤维化损伤程度。2、金匮肾气丸治疗UUO与腺嘌呤CRF大鼠,通过调节不同种类与部位AQP表达发挥作用。两者侧重有不同,金匮肾气丸治疗腺嘌呤CRF主要下调肾脏AQP1-4和上调膀胱AQP1表达。金匮肾气丸治疗UUO大鼠,其肾脏与肺脏AQP2、AQP3、AQP4表达上调不显着,而以膀胱AQP4蛋白表达上调突出。
郑海兰[3]（2021）在《FG-4592通过干预RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性炎症对UUO大鼠肾纤维化的保护作用》文中提出目的:FG-4592（Roxadustat,罗沙司他）是一种新型HIF-脯氨酸羟化酶抑制剂,已被证明对急性肾损伤具有肾保护作用。然而,它在慢性肾脏疾病进展中的作用在很大程度上是未知的。本研究旨在评估FG-4592是否通过干预单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）大鼠的坏死性炎症来减缓肾纤维化,对慢性肾脏病具有肾保护作用。方法:80只7周龄（体重240～250g）SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠均自由饮水和进食,适应性喂养1周后大鼠随机分成10组（n=8/组）。行单侧输尿管结扎术前,大鼠禁食12小时,给予正常饮水。造模前分为假手术组（Sham group）和UUO模型组,其中UUO模型组采用分离大鼠左侧输尿管进行双结扎造模,Sham组只分离左侧输尿管后不结扎输尿管。在术前,UUO模型组的大鼠提前48小时给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）和/或腹腔注射Nec-1（2mg/kg/d）行预处理,UUO造模后继续治疗14天,并分别于7天、14天处死大鼠。（1）Sham7组:给予等量的生理盐水灌胃7天;（2）Sham14组:给予等量的生理盐水灌胃14天;（3）UUO7组:单侧输尿管结扎术后7天;（4）UUO14组:单侧输尿管结扎术后14天;（5）UUO7+FG组:单侧输尿管结扎并给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）7天;（6）UUO14+FG组:单侧输尿管结扎并给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）14天;（7）UUO7+Nec-1组:单侧输尿管结扎并给予腹腔注射Nec-1（2mg/kg/d）7天;（8）UUO14+Nec-1组:单侧输尿管结扎并给予腹腔注射Nec-1（2mg/kg/d）14天;（9）UUO7+FG+Nec-1组:单侧输尿管结扎并给予灌胃 FG-4592（10mg/kg/d）和 Nec-1 腹腔注射（2mg/kg/d）7 天;（10）UUO14+FG+Nec-1 组:单侧输尿管结扎并给予灌胃FG-4592（10mg/kg/d）和Nec-1腹腔注射（2mg/kg/d）14天。右侧颈内静脉采血,用全自动生化分析仪检测血肌酐（Serumcreatinine,Scr）及血尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）。采集肾组织标本,常规石蜡包埋和切片,Masson染色法观察肾间质纤维化（Tubulointerstitial fibrosis,TIF）程度,PAS染色观察肾小管组织损伤,使用电子显微镜观察肾组织的线粒体等超微结构变化。在分子水平上,免疫印迹法检测了RIP1-RIP3-MLKL 信号轴蛋白表达、IL-1β、IL-18 和 NLRP3 和促炎介质（MCP-1、TNF-α和TLR-2）的表达、检测肾小管间质纤维化相关致纤维因子TGF-β1和CTGF表达,从坏死性凋亡、NLRP3炎症体和促炎介质的角度评价了 FG-4592对UUO诱导的坏死性炎症的影响。检测了氧化应激相关蛋白SOD、MnSOD、NOX-2、NOX-4表达和血清及尿中8-OHdG表达水平,为明确对于内质网应激的影响检测了 CHOP、BiP、IRE-1α和ATF-6的表达,以及为明确对线粒体功能障碍的影响,检测了 TOMM20、NDUFA10、SDHA、DrP-1和OPA1,此外还检测了 Bcl-2/Bax 比值和活化型caspase-3蛋白以及HIF-1α/Wnt3α/β-catenin/GSK-3β信号传导通路相关蛋白的表达。结果:1.在分子水平上,RIP1-RIP3-MLKL信号轴蛋白在UUO肾脏组织中的表达逐渐增加,FG-4592和Nec-1治疗后均可减少RIP1-RIP3-MLKL信号轴蛋白表达,且FG-4592和Nec-1联合治疗组中相关蛋白减少更加显着。电镜下可见UUO肾组织的肾小管上皮细胞聚集坏死、肿胀、上皮细胞微绒毛脱落、细胞溶解。2.UUO7 或 UUO14 组中明显上调了 IL-1β、IL-18 和 NLRP3 和促炎介质（MCP-1、TNF-α和TLR-2）的表达,而FG-4592和Nec-1均可逆转这种表达,且FG-4592和Nec-1联合治疗组中相关蛋白减少更加显着。3.UUO7或UUO14组TIF增加明显,使用FG-4592或Nec-1治疗的UUO7、UUO14组的纤维化评分增加明显减少,而联合使用FG-4592和Nec-1组则进一步明显降低。免疫印记分析表明,与UUO组相比,FG-4592或Nec-1处理后明显抑制了致纤因子TGF-1和CTGF的表达,且呈时间依赖性。4.FG-4592预处理后上调了 SOD1和MnSOD蛋白的表达,而下调了 NOX-2和NOX-4蛋白的表达,提示通过保持氧化酶和抗氧化酶平衡抑制UUO引起的氧化应激。此外,通过氧化应激标志物8-OHdG在血清和尿液中的浓度在UUO7组高于Sham组,在UUO14组最高,而给予FG-4592的UUO组血清和尿液中8-OHdG的浓度则低于Sham组,而联合给予FG-4592及Nec-1的UUO组血清和尿液中的8-OHdG的显着下降等,再次确认了 UUO引起肾损伤与氧化应激密切相关,且FG-4592可逆转UUO引起的氧化应激效应。5.电镜下观察到UUO肾组织的粗面内质网核糖体脱颗粒、囊腔断开、扩张、囊泡化变性,以及过氧化物酶体空泡化变性,而滑面内质网几乎保持正常结构。免疫印迹分析显示,与形态学结果相一致,免疫印迹分析提示UUO明显上调内质网应激相关基因的表达,呈时间依赖性,包括CHOP、Bip、IRE-1α和ATF-6,但FG-4592治疗在观察的两个时间点均明显减少了它们的表达。6.电镜清楚地显示,UUO肾组织中被破坏的线粒体结构,表现为线粒体数量显着减少,空泡变性、嵴扩张,线粒体融合（fusion）,线粒体自噬（mitophagy）,线粒体分裂（fission）两个或三个以上的子细胞器。免疫印迹分析显示,与Sham组相比,UUO肾组织中TOMM20、NDUFA10和SDHA的表达明显受到抑制,而FG-4592预处理可逆转其蛋白的表达。此外,FG-4592明显降低了 DrP-1（裂变蛋白）的表达,但增加了 OPA1（融合蛋白）的表达。7.TUNEL阳性细胞定量计数显示,UUO组TUNEL阳性细胞数增加,:FG-4592治疗组在UUO第7天和第14天均明显减少了 TUNEL阳性细胞数。免疫印迹分析显示,给予FG-4592预处理的UUO组大鼠可显着调节Bcl-2/Bax 比值,并恢复活化型caspase-3蛋白的表达以利于细胞的生存。8.UUO以时间依赖的方式诱导Wnt3α/β-catenin/GSK-3β的激活,而FG-4592处理可抑制其表达。结论:1.UUO可引起RIP1-RIP3-MLKL相关蛋白过度表达,同时引发细胞焦亡、坏死性炎症以及肾纤维化,呈时间依赖性。2.坏死性炎症与氧化应激所致线粒体功能障碍、内质网应激和细胞凋亡紧密相关。3.上述改变均被FG-4592或RIP1抑制剂Nec-1所逆转,说明FG-4592通过抑制RIP1-RIP3-MLKL诱导的坏死性炎症从而改善UUO肾纤维化。4.FG-4592的抗纤维化作用可能是通过干预HIF-1α/Wnt/catenin/GSK信号通路而完成。
李雪艳[4]（2021）在《RNA甲基化m6A修饰在梗阻性肾病肾间质纤维化中的作用及机制研究》文中研究表明目的:先天性梗阻性肾病（Congenital obstructive nephropathy,CON）是儿童终末期肾病的主要原因,同时也是导致肾移植的第二位原因,其典型病理改变为肾间质纤维化。在CON的众多病因中,肾盂输尿管连接部梗阻是较为常见的一种。现有研究表明手术解除梗阻后并不能完全逆转梗阻后肾间质纤维化的进程。与此同时,先天性肾单位数目的减少会阻碍梗阻性肾损伤的恢复,并进一步导致额外的肾单位丢失。因此,阐明梗阻性肾病肾脏损伤的发病机制,寻找相应的关键靶分子及潜在的干预靶点,并采取相应的干预措施,对于延缓或逆转肾间质纤维化的进展,进而挽救肾脏功能具有重要的临床意义。特定的表观遗传修饰可以沉默或增强由DNA转录引发的基因表达模式,从而引起病理改变或疾病的发生。同时,表观基因组及转录组会随着环境、生理或病理等的变化而变化,从而对各种刺激的转录反应做出更细微和更具体的适应性变化。目前研究提示多种表观遗传机制（如DNA和组蛋白的非共价修饰以及非编码RNA的调控等）均不同程度地参与了慢性肾脏疾病肾纤维化的发生发展过程及相关病理改变。然而,RNA的化学修饰在输尿管梗阻引起的肾间质纤维化病理过程中的作用尚不明确。在目前已报道的多达170种RNA转录组水平的化学修饰中,N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）是真核生物mRNA和长链非编码RNA转录后最常见的修饰方式。m6A修饰在细胞中的功能众多,现已知其参与细胞分化、癌症进展、昼夜节律、精子发生、神经功能和性别决定以及X染色体失活等诸多生物学过程。m6A修饰位点附近的序列具有高度保守性的特点,mRNA上m6A修饰主要发生在RRm6ACH（R:嘌呤;H:非鸟嘌呤）序列的腺嘌呤上,主要在转录起始区、蛋白质编码区（Coding sequence,CDS）和3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）等区域分布。其中,CDS的终止密码子附近和3’UTR的前1/4处是m6A修饰发生的最常见区域。与DNA甲基化和组蛋白修饰相似,m6A修饰也是个可逆的过程。不同刺激信号作用下,m6A甲基转移酶和去甲基化酶动态识别修饰位点,阅读蛋白读取m6A修饰信号以及下游功能复合物的募集等,共同介导了mRNA的不同生物学过程。所以,把m6A修饰酶的动态调控作为研究的切入点,有望在一定程度上阐明疾病发生的表型和细胞信号通路中所涉及的潜在mRNA的m6A修饰机制。基于此,本研究通过构建小鼠左侧输尿管完全梗阻（Complete unilateral ureteral obstruction,CUUO）模型,检测CUUO术后肾组织总RNA的m6A修饰水平、m6A修饰酶[包括m6A甲基转移酶3（Methyltransferase-like protein 3,METTL3）、甲基转移酶14（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）、肾细胞瘤1-结合蛋白（Wilms’tumour-associated protein,WTAP）、去甲基化酶脂肪量和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）及Alk B同源蛋白5（Alk B Homolog 5,ALKBH5）]以及肾纤维化中上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）标志物等指标表达的动态变化。同时,借助RNA甲基化免疫共沉淀（Methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP）及高通量测序技术绘制CUUO术后7天m6A修饰图谱,筛选并验证具有明显m6A修饰差异的转录本。在此基础上,体外通过构建敲减及过表达慢病毒来改变METTL3的表达,检测小鼠肾小管上皮细胞（Mouse renal tube epithelial cells,TCMK-1）总RNA的m6A修饰水平、细胞活性、细胞凋亡及EMT标志物的改变。同时,验证METTL3参与LZTR1 mRNA m6A修饰的调节。本研究相关内容将为进一步阐明RNA甲基化m6A修饰参与梗阻性肾间质纤维化的病理生理机制提供重要实验证据。研究方法:1、CUUO模型的构建和肾间质纤维化指标、m6A修饰水平、m6A修饰酶的检测:（1）构建C57雄鼠CUUO模型及假手术模型,于术后1、3、5、7和14天收集血清及肾组织标本;（2）采用苦味酸比色法、脲酶法分别检测血清中肌酐和尿素氮的含量;（3）采用比色法、实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）技术检测假手术组及CUUO组肾组织总RNA的m6A修饰水平、甲基转移酶（METTL3、METTL14、WTAP）、去甲基化酶（ALKHB5和FTO）、EMT特征性指标（E-cadherin、α-SMA和VIMENTIN）的表达;（4）TGF-β1转染TCMK-1细胞后,检测细胞中m6A修饰水平、m6A修饰酶及EMT标志物的表达。2、CUUO-7天肾组织m6A表观转录组信息概况和RNA测序与MeRIP测序的关联分析:（1）选择CUUO组及假手术组7天肾组织进行MeRIP高通量测序,检测具有显着m6A修饰差异的mRNA位点（以Fold-change>1.5为界）及其富集情况,并进行保守基序（motif）、GO和KEGG等分析;（2）采用RNA高通量测序技术,筛选CUUO组及假手术组肾组织中明显差异化表达的转录本,进行聚类、GO和KEGG等富集和通路分析;（3）通过进行RNA测序与MeRIP测序（“差异表达转录本”及“差异m6A修饰水平转录本”）联合分析揭示m6A修饰调控的mRNA;（4）利用q RT-PCR及MeRIP-q PCR实验验证组间差异化表达的mRNA及其m6A修饰水平的变化。3、METTL3调控的m6A修饰变化对TCMK-1细胞活力、细胞凋亡及EMT表型的影响:（1）构建敲减及过表达METTL3慢病毒,分别转染TCMK-1细胞,采用CCK-8、流式细胞术、Western blot等技术检测TCMK-1细胞活力、凋亡、EMT表型及ERK1/2和p ERK1/2的表达;（2）构建敲减LZTR1慢病毒转染TCMK-1细胞,采用CCK-8、Western blot等技术检测TCMK-1细胞活力、ERK1/2和p ERK1/2的表达;（3）MeRIP-q PCR检测过表达METTL3的TCMK-1细胞LZTR1 mRNA的m6A修饰水平。4、统计学分析:实验数据分布用均数±标准差表示,其中每组实验数据至少设置三个生物学重复。使用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 8.0软件进行数据处理及分析,采用独立样本t检验和单因素方差分析进行组间差异检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1、CUUO组肾组织肾间质纤维化、m6A修饰水平及相关酶表达的改变（1）随梗阻时间延长,CUUO组肾损伤逐渐加重;肾组织总RNA的m6A修饰水平在术后1周内呈时间依赖性下降,在第7天检测到最低的水平;（2）METTL3和METTL14的下调以及FTO的上调可能是总RNA的m6A修饰水平在特定时间减少的原因;（3）TGF-β1诱导TCMK-1细胞导致α-SMA、VIMENTIN表达上升,E-Ca表达下降;WTAP、FTO表达上升,METTL14表达下降。综上,我们选择CUUO-7天组的肾组织进行MeRIP测序。2、CUUO-7天肾组织RNA测序与MeRIP测序的联合分析结果（1）CUUO-7天组和假手术组的肾组织中所检测的507个基因共鉴定出823个具有显着m6A修饰差异的转录本;在含有单一m6A修饰位点的转录本中,修饰水平上调占54.7%,下调占82.2%;一半以上的m6A修饰位点位于3’UTR区;m6A修饰峰数大于1的转录本的m6A修饰位点主要位于3’UTR区;（2）差异甲基化基因主要与TGF-β信号通路（对于下调的基因）和轴突信号通路（对于上调的基因）显着相关;（3）RNA-seq和MeRIP-seq关联分析显示,在91个基因中有173个m6A修饰峰存在显着差异,甲基化修饰上调的转录本有79个,甲基化修饰下调的转录本有94个。在甲基化修饰上调的79个转录本中,72个转录本表达同步上调,7个反向下调;在甲基化修饰下调的94个转录本中,35个转录本同步下调,59个反向上调。（4）在CUUO-7天肾组织中,TGF-β和WNT通路中甲基化程度显着降低的BAMBI、SMAD7、NKD1和SENP2是相应通路的抑制分子;（5）CUUO-7天肾组织中GADD45g、ENPEP、LZTR1和转录因子ZEB1、SNAI2的mRNA甲基化修饰水平发生了显着变化。3、METTL3调控的m6A修饰作用的体外验证（1）敲减METTL3能促进TCMK-1细胞的增殖活性;过表达METTL3则能促进TCMK-1细胞早期凋亡的发生,抑制增殖活性,促进EMT过程;（2）敲减LZTR1能促进TCMK-1细胞的增殖活性;（3）敲减METTL3、敲减LZTR1均能显着上调p ERK1/2的表达;（4）过表达METTL3后LZTR1 mRNA m6A修饰水平及其mRNA表达显着上升。结论:1、m6A修饰水平的变化与梗阻性肾病肾间质纤维化的严重程度显着相关,其中METTL3、METTL14和FTO表达的改变可能在该疾病相关转录本的m6A修饰的调控中起重要作用。2、特异m6A修饰转录本参与梗阻肾病肾间质纤维化病理过程中,其中大部分富集在TGF-β,WNT,NORCH、MAPK等信号通路上。3、METTL3可通过作为m6A甲基转移酶进而调控TCMK-1细胞的m6A修饰的改变,并介导TCMK-1细胞增殖、凋亡及EMT过程。METTL3可能参与了LZTR1mRNA m6A修饰的调控。METTL3可能通过调控LZTR1 mRNA m6A修饰参与MAPK/ERK1/2信号通路的激活,进而影响TCMK-1细胞增殖活性和EMT过程。
刘舸[5]（2021）在《miR-187-3p通过靶向调控PTRF抑制先天性肾积水肾功能损伤的机制研究》文中研究指明研究背景与目的:肾盂输尿管连接部梗阻（ureteropelvic junction obstruction,UPJO）引起的先天性肾积水是小儿常见的泌尿系统畸形。它是胎儿、婴儿和儿童先天性尿路梗阻的主要原因。先天性梗阻性肾病是儿童和婴儿慢性肾病（chronic kidney disease,CKD）和终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）最常见的病因之一,表现为进行性不可逆的结构损害和/或肾功能损害,越来越被认为是一个重要的公共卫生健康问题。尿路梗阻后引起肾功能损伤是一个多基因、多因子和多机制共同作用的复杂过程,涉及到氧化应激、细胞凋亡、炎症反应、上皮间质转化及纤维化的多种病理进程。在过去的十年中,许多研究致力于探索CKD进展的分子机制,已经证明多种经典信号通路在该疾病进展过程中发挥着不可替代的作用,然而,基因相关的上游分子表达及调控与肾纤维化和功能损害的发生机制尚不清楚。MicroRNAs（miRNAs或miRs）是一类内源性的、小的、非编码的RNA,在转录后水平对基因表达起着重要的调控作用。以往的临床和实验动物研究表明,miRNAs在各种肾脏疾病的发病机制中发挥着重要作用,miRNAs可能作为生物学标志物或用于干预疾病进展来诊断或治疗疾病。但这些研究要么基于动物模型,要么仅限于某一个感兴趣的miRNA。通过高通量测序技术获得正常分肾功能和分肾功能下降的先天性肾积水患儿肾脏组织中差异表达的miRNAs,验证并且筛选出在先天性肾积水患儿肾功能损伤过程中起到关键作用的miRNAs,针对这方面的设想,我们展开了第一部分的实验。通过转染人肾小管上皮细胞系（human kidney epithelial cell line,HK-2）观察差异miRNAs对细胞上皮间质转化功能的影响。通过数据库预测软件挑选有可能与差异miRNAs靶向结合的m RNA,通过细胞转染实验扩增和抑制差异miRNAs筛选出反向变化的m RNA,通过文献检索,筛选出既往双荧光素酶报告基因检测证实二者之间存在调控关系的m RNA,并得到差异miRNAs可以通过靶向结合的m RNA调控HK-2细胞上皮间质转化功能,针对这部分设想,我们展开了第二部分实验。制作新生大鼠单侧输尿管完全梗阻模型模拟人类先天性肾积水,收集肾脏组织,验证差异miRNAs和靶向结合的m RNA在输尿梗阻组及正常组中差异表达。通过鼠尾静脉注射方法将差异miRNAs agomir转染肾积水动物模型,在体内实验中验证二者之间的调控关系,并得到差异miRNAs可以通过靶向结合的m RNA调控新生大鼠单侧输尿管完全梗阻后肾组织的上皮间质转化功能。针对这部分设想,我们展开了第三部分实验,为更好地探讨差异miRNAs在先天性肾积水肾功能损伤中发挥作用提供科学依据,为将来实现miRNAs作为先天性肾积水患儿肾功能损伤的诊断生物学标志物或分子治疗奠定重要基础。研究方法:1、我们选取了肾盂输尿管交界处梗阻所致的先天性肾积水患儿,按照术前利尿性肾核素显像显示的分肾功能,将其分为肾功能正常组（分肾功能大于45%）,肾功能损伤组（分肾功能小于30%组）,手术时取材,获取肾实质最薄处肾组织,立即在液氮中冷冻,并于-80°C冰箱低温保存,用于高通量测序、qRT-PCR检测。2、通过高通量测序技术筛选肾功能损伤组及正常组肾脏组织中差异表达的miRNAs,预测其亲本基因富集的主要功能和信号通路,应用qRT-PCR对差异表达的miRNAs在患儿肾脏组织、新生大鼠输尿管单侧梗阻模型及HK-2细胞模型进行验证,获得差异miRNAs在动物模型及细胞模型中的时空表达情况。3、通过数据库预测与差异miRNA结合的m RNA,利用HK-2细胞转染实验扩增和抑制miRNA187-3p筛选出反向变化的m RNA,通过文献检索,筛选出既往双荧光素酶报告基因检测证实miR-187-3p与PTRF和NT5E之间存在直接靶向调控关系,验证miR-187-3p通过靶向结合PTRF调控HK-2细胞上皮间质转化、纤维化及TGFβ/Smad2通路的功能。4、制作新生鼠单侧输尿管梗阻模型,应用免疫组织化学方法对PTRF和NT5E在梗阻后肾组织的表达进行定位,在输尿管梗阻及正常新生大鼠的肾脏组织中验证miR-187-3p、PTRF和NT5E的表达差异。检测上调或下调miRNA187-3p对输尿管梗阻后肾脏上皮间质转化、纤维化及TGFβ/Smad2通路的影响。5、统计分析:Western blot如条带差异不明显,则使用Image-J软件检测条带相对密度。Real-time PCR数据用2-△△Ct值表示,应用SPSS21.0统计软件进行统计学分析,应用Graph Pad Prism 8绘制图表。对数据进行t检验,所有的实验数据均以均值±标准差来表示,p<0.05认为有统计学差异。结果:1、所有先天性肾积水患儿均为胎SFU4度肾积水。用于高通量测序的6例患儿中,肾功能正常组年龄分布在6-14周（中位年龄10周）,肾功能异常组年龄分布在7-18周（中位年龄10周）。用于结果验证的另6例患儿中,肾功能正常组年龄分布为12～20周（中位年龄13周）,肾功能异常组年龄分布为6～22周（中位年龄12周）。高通量测序结果提示,肾功能下降及肾功能正常的先天性肾积水患儿肾脏组织中共得到22个差异表达的miRNA,与肾功能正常组相比,肾功能下降组中5个miRNA表达上调,17个miRNA表达下调。选择12个人鼠同源的miRNA在患儿肾组织、动物模型肾组织、细胞模型中进行RT-q PCR验证,发现miR-21-5p和miR-187-3p在组间表达存在差异,与测序结果基本一致,但差异倍数有所不同。其中miR-187-3p在梗阻性肾疾病的miRNA-靶基因-信号通路网络尚未有研究,因此我们选择miR-187-3p作为进一步研究对象。2、在单侧输尿管梗阻动物模型和HK-2细胞模型中利用qRT-PCR技术验证miR-187-3p的时空表达趋势,与正常组相比,输尿管梗阻组和TGFβ诱导组的miR-187-3p表达在梗阻后早期升高,随着梗阻时间延长表达逐渐降低,于输尿管梗阻第5天和TGFβ诱导第6天降至正常组水平以下。与我们前期研究发现新生鼠输尿管梗阻5天后出现肾小管上皮间质转化相吻合。3、通过数据库预测与miR-187-3p结合的m RNA共23个,在HK-2细胞内验证得到miR-187-3p负向调控PTRF和NT5E的表达,过表达miR-187-3p后,PTRF和NT5E的表达均降低;抑制miR-187-3p表达后,PTRF和NT5E的表达均所增加。检索已发表的文献中双荧光素酶报告基因检测结果提示:miR-187-3p与PTRF和NT5E均存在结合位点,后二者是miR-187-3p的直接下游靶基因。我们构建了miR-187-3p的模拟物,将miR-187-3p的模拟物转染至细胞模型中,抑制了TGFβ诱导的上皮间质转化及纤维化作用,同时抑制了TGFβ/Smad2通路Smad2磷酸化的作用。由此我们得到,miR-187-3p通过负向调控PTRF和NT5E的表达,对HK-2细胞上皮间质转化功能和TGFβ/Smad2通路进行调控。4、我们构建了miR-187-3p的模拟物,将miR-187-3p的模拟物转染至动物模型体内,实验验证提示:miR-187-3p可以负向调控PTRF和NT5E的表达,抑制单侧输尿管梗阻模型中肾脏组织上皮间质转化、纤维化,同时抑制TGF/Smad2通路Smad2的磷酸化。因此,我们认为miR-187-3p靶向调控PTRF在先天性肾积水肾功能损伤中起到调节作用。结论:1、上述结果表明先天性肾积水患儿正常肾功能和肾功能下降的肾脏组织中miRNAs具有差异表达的特性。2、miR-187-3p与先天性肾积水肾功能损伤相关,miR-187-3p在梗阻性肾损伤早期肾脏组织中升高,晚期降低。miR-187-3p通过负向调控PTRF和NT5E抑制了先天性肾积水肾功能的进一步损伤。3、在肾脏组织中miR-187-3p表达增高会抑制肾组织上皮间质转化和纤维化的进展,同时抑制TGFβ/Smad2通路Smad2磷酸化的作用;在HK-2细胞中表达增高会抑制肾脏细胞上皮间质转化和纤维化,同时调控TGFβ/Smad2通路Smad2的磷酸化。
范旭[6]（2021）在《Circ-0045861/miR-181d-5p及m6A修饰调控SIRT1在梗阻性肾损伤修复中的作用机制研究》文中研究说明目的:先天性梗阻性肾病是儿童慢性肾脏疾病的主要病因。超过50%的儿童慢性肾脏疾病为先天性肾脏和尿路畸形,其中大多数患儿伴有尿路梗阻。梗阻性肾病肾损伤原因复杂,尿路梗阻还常常合并肾发育异常。尽管临床上可以通过手术切除梗阻段,重建肾盂输尿管,但是仍然有部分患儿术后肾脏损伤无法恢复、甚至进展,导致远期肾脏功能恶化,最终需要血液透析和肾移植。这些问题提示梗阻的解除可能不足以逆转肾间质纤维化的进程。因此,寻找梗阻性肾病早期肾脏损伤的关键分子机制,早期干预肾间质纤维化的进展,挽救肾脏功能,具有重要的经济和社会意义。我们前期研究表明,能量代谢关键传感器-氧化应激传感器组蛋白脱乙酰酶（Sirtuin type 1,SIRT1）是肾脏发生上皮间充质转化、凋亡的关键蛋白。我们还进一步证实了SIRT1在发生EMT的体外培养的肾小管上皮细胞、新生鼠输尿管部分梗阻（Partial unilateral ureteral obstruction,PUUO）及大鼠输尿管完全梗阻（Complete unilateral ureteral obstruction,CUUO）动物模型中SIRT1在PUUO模型早期纤维化进程中起到促进纤维化的作用,SIRT1干扰载体通过调节Smad3通路延缓肾小管上皮细胞纤维化的进展。但是SIRT1又是如何被调控的,目前还不清楚,进一步深入研究SIRT1上游调控机制有助于寻找早期治疗梗阻性肾病肾损伤的新靶点。我们对手术治疗的肾盂输尿管交界处梗阻的肾积水患儿肾实质标本进行全基因组测序,比较分肾功能小于30%和分肾功能大于40%两组,miR-181d-5p和circ-0045861的表达具有明显差异。采用Targetscan及microRNA.org预测发现SIRT1与miR-181d-5p存在结合位点,同时采用circnet预测位于TNRC6C的circ-0045861与miR-181d-5p存在结合位点。我们进一步行q RT-PCR验证了miR-181d-5p和SIRT1在对照组、UUO术后2天和术后5天大鼠输尿管部分梗阻肾脏中的表达,UUO组miR-181d-5p在肾组织中表达下调,并随肾脏纤维化程度的加重表达逐渐降低,而SIRT1的表达随着肾纤维化程度的加重逐渐上升,提示miR-181d-5p与SIRT1二者的表达存在相关性。因此,我们提出新的假设,circ-0045861可能通过竞争性结合与3’UTR相结合的miRNAs,抑制miR-181d-5p的作用,从而上调SIRT1mRNA的转录,最终导致SIRT1蛋白表达异常,加强了SIRT1参与FOXO1对p53信号通路的调控,最终导致了梗阻性肾病肾脏损伤的发生发展。构建circRNA-miRNA-mRNA多维调控网络,有望首次清楚地了解circRNA,microRNA与SIRT1信号通路表达之间的关系,以及与梗阻性肾病肾脏纤维化发生发展的关系,并从RNA甲基化修饰的角度从转录水平深入理解疾病的发生机制,为早期诊断和治疗梗阻性肾病提供新思路,并为其它慢性肾脏疾病的发生发展机制提供新的线索,为早期诊断和治疗这些疾病提供新的靶点。研究方法:1、对肾盂输尿管梗阻性肾病（ureteropelvic junction obstruction）患儿行肾动态显像以检测分肾功能,将UPJO患儿分为分肾功能大于40%组,分肾功能小于30%组进行全基因组测序,并对结果进行分析,筛选出差异明显的circRNA及microRNA。体内体外实验验证circ-0045861、mir-181d-5p、SIRT1等细胞因子指标表达量。体外培养肾小管上皮细胞,通过TGF-β1诱导的EMT及H202诱导氧化应激,检测肾小管上皮细胞mir-181d-5p、circ-0045861和SIRT1的表达水平。选取新生鼠,制作输尿管单侧梗阻模型,体内检测UUO术后miR-181d-5p、circ-0045861与SIRT1的表达水平。2、通过体内、体外实验,干扰或过表达circ-0045861及miR-181d-5p,探讨circ-0045861/miR-181d-5p对SIRT1参与早期肾损伤的调控机制。细胞水平调控circ-0045861/miR-181d-5p后检测肾小管上皮细胞发生EMT、纤维化、凋亡及SIRT1/PI3K/AKT/FOXO1氧化应激通路的改变。体外培养肾小管上皮细胞,通过机械应力或TGF-β1促使细胞发生上皮间充质转化（EMT）,通过H2O2诱导细胞发生氧化应激。将细胞分为正常组、纤维化组、氧化应激三组,向三组分别加入circ-0045861或mir-181d-5p的抑制剂或模拟物,体外培养肾小管上皮细胞,构建mir-181d-5p与SIRT1的3’-UTR相结合的基因质粒、circ-0045861与SIRT1的3’-UTR相结合的基因质粒、circ-0045861与miR-181d-5p相结合的基因质粒以及其分别的突变型结合位点质粒。在肾小管上皮细胞中共转染miR-181d-5p或circ-0045861的抑制剂/扩增剂和报告基因,检测荧光素酶报道基因的活性,验证circ-0141134/miR-181d-5p/SIRT1mRNA是否存在结合位点。荧光原位杂交定位circ-0045861和miR-181d-5p的表达,检测上调或下调circ-0045861或miR-181d-5p对肾小管上皮细胞EMT、凋亡、纤维化、氧化应激、SIRT1/PI3K/AKT/FOXO1信号通路相关基因及蛋白质表达的影响。3、制作新生鼠输尿管梗阻动物模型,检测上调或下调circ-0045861或miR-181d-5p对输尿管梗阻后肾脏EMT、纤维化、凋亡及SIRT1氧化应激通路的影响。前期研究观察到新生鼠输尿管梗阻后2天出现足细胞转化,5天出现肾小管上皮细胞转化,因此分别于输尿管梗阻后1天、2天、3天和5天肾实质注射或经鼠尾静脉注射circ-0045861或miR-181d-5p的模拟物或抑制剂,检测输尿管梗阻前及梗阻后不同时间点circ-0045861/miR-181d-5p的表达,细胞凋亡、EMT、纤维化相关基因及蛋白质,SIRT1及PI3K/AKT/FOXO1信号通路相关基因及蛋白质表达的动态变化。4、通过建立小鼠输尿管梗阻模型,使用m6A测序分析结合RNA-seq,分析m6A修饰调控的分子蛋白、RNA,同时检测甲基化修饰酶METTL3,去甲基化修饰酶FTO,ALKBH5的表达,明确m6A修饰的调控机制,深入了解梗阻性肾病的发生发展机制。5、统计分析:Real-time PCR数据用2-△△Ct值表示,Western blot分析用Image J软件测量,使用相对密度展示结果,所有的实验数据均以均值±标准差来表示,应用SPSS19.0统计软件对于服从正态分布的数据实验组与对照组间比较采用两样本的t检验,对于不服从正态分布的数据,实验组组间比较采用Mann-Whitney U检验,p<0.05认为有统计学差异。结果:我们对分肾功能大于等于40%组和分肾功能小于30%组的UPJO患儿进行全基因组测序发现circRNA-0045861和miR-181d-5p的表达存在差异。HK-2细胞系中加入TGF-β1以诱导细胞纤维化,发现纤维化HK-2细胞中circ-0045861和SIRT1表达上调,miR-181d-5p表达下降。我们设计了circ-0045861的siRNA和miR-181d-5p的模拟物。向HK-2细胞中加入si-circ-0045861可以通过过表达miR-181d-5p抑制纤维化HK-2细胞的凋亡及纤维化。并通过双荧光素酶实验验证circ-0045861可与miR-181d-5p结合,fish实验证明circ-0045861和mir-181d-5p可共同定位于HK-2细胞质中。此外,我们进一步双荧光素酶实验证明,miR-181d-5p和SIRT1mRNA存在结合位点,在UUO动物模型和纤维化HK-2细胞模型,miR-181d-5p表达降低,SIRT1表达上升。我们构建了miR-181d-5p的模拟物,将模拟物转染入UUO模型和纤维化HK-2细胞中,发现miR-181d-5p mimics可以抑制UUO模型和纤维化HK-2细胞中的凋亡相关蛋白（p53,JNK,bax,caspase-9）和纤维化相关蛋白（α-sma,vim）的表达,并抑制了氧化应激相关蛋白（3-NT,Trx,p53）的的表达。梗阻性肾病中肾脏功能的下降受到RNA的m6A甲基化修饰调控,梗阻性肾病的病程进展与代谢过程,细胞过程的调节,细胞过程紧密等功能相关。而轴突接收信号通路、Gn RH信号通路与梗阻性肾病的肾脏功能的下降。其中,lncRNA ENSMUST00000149811.2,ENSMUST00000209614.在UUO模型中受到m6A甲基化修饰调控。结论:我们通过对分肾功能大于40%及分肾功能小于30%的UPJO患儿的肾脏组织进行全基因组测序,发现梗阻性肾病病程进展与细胞平衡代谢、单细胞生物进程、细胞外基质累积等生物代谢过程紧密相关,而梗阻性肾病肾脏功能的下降过程中,细胞粘附性信号通路和内质网蛋白形成信号通路的相关蛋白发生了改变,参与了肾脏功能下降的过程,而其中hsa＿circ＿0006577、hsa＿circ＿0045861与UPJO患儿的肾脏组织的肾脏纤维化关系密切,值得进行深入的研究。Circ-0045861在肾小管上皮细胞间质化过程中起重要调控作用,抑制circ-0045861可以抑制肾小管上皮细胞的纤维化及凋亡。miR-181d-5p在肾小管上皮细胞上皮间充质转化中表达下降,过表达miR-181d-5p可以抑制肾小管上皮细胞的纤维化及凋亡。而circ-0045861和miR-181d-5p,miR-181d-5p与SIRT1mRNA均存在结合位点。在梗阻性肾病的发病机制中circ-0045861作为ceRNA与miR-181d-5p结合以调控SIRT1的表达,进一步调节梗阻性肾病中氧化应激诱导的凋亡及纤维化。通过本研究发现,梗阻性肾病中肾脏功能的下降受到RNA的m6A甲基化修饰调控,其中m6A参与梗阻性肾病的多项病程进展,是病情发展的关键。
马飞[7]（2021）在《肾衰宁片对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化保护作用及Wnt/β-catenin信号通路的影响》文中研究表明目的探讨肾衰宁片对单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction UUO）大鼠肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）保护作用及Wnt/β-catenin信号通路的影响,为未来肾衰宁片治疗单侧输尿管梗阻的RIF临床试验展开提供依据。方法选取6～8周龄清洁级雄性Wistar大鼠45只,重量为180-220g,进行建模实验。将45只健康大鼠随机分成假手术组（S组,n=15）、模型组（U组,n=15）、肾衰宁片治疗组（T组,n=15）,每组15只。造模成功后,U组和S组每日给同体积的生理盐水进行灌胃,T组从术后的第一日起每日用0.19g/（kg·d）肾衰宁片灌胃。三组大鼠在术后的7、14、21日分别处死5只。检测血清肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）和尿微量白蛋白（m Alb）,并进行比较。采用HE染色法观察梗阻性肾病RIF病变严重程度。采用Masson染色法观察梗阻性肾病的肾间质胶原体积分数（Collagenvolume fraction,CVF）变化特点。通过免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测肾间质中Wnt和β-catenin的表达,并计算平均光密度值（Average Optical Density,AOD）进行比较。结果1、术后7d、14d、21d,U组血清CREA、BUN的数值均显着高于S组（P均<0.05）,其次为T组,S组最低,3组比较差异有统计学意义（P<0.05）,3组大鼠m Alb水平在7,14天无显着变化,但随着梗阻时间延长,到达21d各组尿蛋白水平出现显着变化,S组蛋白尿水平最低,T组次之,U组最高,3组比较差异有统计学意义（P<0.05）。2、U组和T组大鼠RIF病变严重程度评分均高于S组（P<0.01）;与U组相比,T组各个时间点的RIF病变严重程度评分均降低,但仍高于S组（P<0.05）。3、S组的肾间质基本正常,7d、14d、21d无变化;U组、T组蓝染纤维化主要出现在肾间质,三组肾间质CVF的比较,U组、T组CVF高于S组（P<0.01）,且随时间延长分数进行性增加（P<0.05）。各时间点T组分数均高于S组（P<0.05）,且低于U组（P<0.05）。4、Wnt1和β-catenin免疫组化染色阳性表达呈棕色,强阳性表达呈现褐色,S组表达呈阴性,U组、T组的阳性表达主要出现细胞质、细胞膜,并且在肾小管的上皮细胞和间质细胞上表达呈现强阳（P<0.05）,采用Image J软件计算Wnt1和β-catenin的半定量值AOD进行对比分析,S组数值最低,并且在7 d,14和21d无明显变化（P>0.05）,随时间的延长AOD逐渐增加（P<0.05）,各时间点T组数值高于S组（P<0.05）,且低于U组（P<0.05）,3组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论1、肾衰宁片可以改善UUO大鼠RIF的程度,发挥肾脏保护作用。2、肾衰宁片可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来发挥肾功能保护作用,可能对未来RIF新治疗方向有一定指导价值。
李璐[8]（2020）在《自噬在草酸钙结晶肾损伤EMT中的作用及机制研究》文中研究说明泌尿系结石已成为一个全球性的卫生保健问题,发病率呈逐年递增趋势,而且结石经手术治疗后复发率高。随着病程迁延反复,结石所导致的梗阻性肾病已成为慢性肾脏病进展的主要病因之一。草酸钙是泌尿系结石的主要组成成分,草酸钙结石占泌尿系结石的80%以上。然而关于肾脏草酸钙结石形成的机制目前仍不十分明确,比较公认的学说包括:肾乳头钙斑学说、尿过饱和结晶学说、抑制因素缺乏学说、免疫抑制学说、多因素学说等。这些机制研究认为多种因素参与导致的肾小管损伤可能进一步促进结晶的成核、沉积。因此,肾小管损伤可能成为研究肾结石形成一个新的方向。我们结石团队前期的研究结果提示早在草酸钙结晶形成期,既有氧化应激、细胞凋亡、自噬的参与,亦发现有肾小管上皮细胞间质转分化（epithelial mesenchymal transition EMT）的发生,这些因素相互影响可进一步导致肾间质纤维化,加重肾脏病的进展。在此基础上,本课题拟进一步研究在草酸钙结晶形成期,细胞自噬如何参与肾小管上皮细胞损伤的进程,是否可通过调控自噬活性从而抑制结晶肾损伤EMT的发生,延缓慢性梗阻性肾病的进程,为临床治疗肾结石提供新的思路和理论基础。第一部分:结晶性肾损伤模型中自噬的表达情况目的:通过对草酸钙结晶肾损伤动物模型和细胞模型中自噬相关蛋白表达情况的检测,明确自噬是否参与草酸钙结晶的形成并进一步导致肾小管损伤。方法:1.利用乙醛酸盐连续腹腔注射一周构建小鼠结晶性肾损伤动物模型,于第8天处死小鼠,应用HE染色及冯库萨染色分别观察肾组织结构变化及钙盐沉积情况,并通过免疫组化、western-blot以及免疫荧光检测小鼠肾组织中自噬关键蛋白LC3B的表达情况。2.利用一水草酸钠刺激人肾小管上皮细胞（HK2）构建草酸钙结晶肾损伤细胞模型,通过对草酸钙结晶形成时间的观察,设置时间梯度为6h、12h、24h、48h、72h,一水草酸钠浓度梯度为0m M、0.5m M、1m M、2m M,首先利用CCK8试剂盒检测HK2细胞活性,其次利用western-bolt检测不同实验条件下自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1、ATG5的表达情况。结果:1.通过HE染色后可见,与正常对照组相比,乙醛酸盐建模组小鼠近端肾小管管腔肿胀,肾小管上皮细胞脱落;冯库萨染色可见建模组小鼠肾脏组织皮髓质交界处大量钙盐沉积。2.通过肾脏组织免疫组化染色以及免疫荧光显示:与空白对照组相比,建模组小鼠肾脏组织中LC3B表达量普遍较高。3.小鼠肾组织Westernblot结果显示模型组LC3B、Beclin-1表达量显着高于对照组。4.在一水草酸钠构建的HK2细胞结晶模型中,细胞活性随着一水草酸钠浓度的升高和/或刺激时间的延长而逐渐降低,在48h时细胞活性显着降低;而自噬相关蛋白的表达随着时间延长而升高,在作用24h时表达量最高,随后逐渐降低。结论:体内外实验均证实,早在草酸钙结晶形成期,自噬已经开始过度激活,参与并进一步影响了肾结石的发生发展。第二部分:草酸钙结晶肾损伤模型中EMT发生情况以及自噬活性对EMT的影响目的:验证早在肾结石形成早期—草酸钙结晶期已经出现肾小管上皮细胞间质转分化EMT,并且自噬参与了肾小管上皮EMT的进程,通过调控自噬活性可改善肾小管上皮细胞的损伤,并延缓草酸钙结晶肾损伤期EMT的发展。方法:1.取对照组与模型组小鼠肾脏组织通过免疫组化、western-blot检测各组小鼠肾组织中EMT相关蛋白以及自噬相关蛋白的表达情况;2.按照一水草酸钠刺激HK2细胞株的时间梯度进行分组,利用western-blot检测EMT相关蛋白的表达情况;然后加予自噬抑制剂以及自噬激动剂进一步将细胞进行分组:空白对照组、一水草酸钠建模组、模型+3MA组、模型+雷帕霉素组,通过wester-blot检测自噬相关蛋白LC3B、以及EMT相关蛋白的表达情况。结果:1.动物实验结果显示:与空白对照组相比,模型组小鼠肾脏组织中Ecadherin表达显着下调,而vimentin以及LC3B表达显着上调2.体外细胞实验结果显示:与空白对照组相比,实验组细胞随着一水草酸钠刺激时间的递增,上皮标志Ecadherin表达逐渐下调,而间皮标志α-SMA、Vimentin表达逐渐上调,在24h时趋势最显着;加入自噬抑制剂3MA后,自噬相关蛋白表达水平显着下降,同时间皮标志α-SMA、vimentin表达也显着下调而上皮标志E-cadherin表达显着回调;草酸钠+雷帕霉素组自噬相关蛋白LC3B表达上调,同时间皮标志α-SMA、vimentin表达上调,而上皮标志E-cadherin表达进一步下调。结论:通过体内外实验研究发现,草酸钙刺激可启动肾小管上皮细胞间质转分化（EMT）的进程,并且发现,EMT关键蛋白表达水平变化与自噬关键蛋白表达一致,通过调控自噬活性,发现EMT相关蛋白表达趋势与自噬表达趋势一致,因此推测草酸钙可诱导自噬过度激活从而促进了结晶肾损伤肾小管上皮细胞EMT发生发展。第三部分:草酸钙诱导的肾小管上皮细胞自噬调控结晶肾损伤EMT的机制研究目的:探讨自噬活性变化调控草酸钙结晶肾损伤EMT的潜在可能机制方法:我们提取对照组和乙醛酸盐造模组小鼠肾脏组织蛋白通过western-blot检测两组小鼠肾组织中p-m TOR、p-smad3的蛋白表达水平,以及四组细胞（对照组、草酸钠结晶组、3MA+草酸钠结晶组、雷帕霉素+草酸钠结晶组）中p-m TOR、psmad3的蛋白水平。结果:细胞实验以及动物实验结果均提示模型组p-m TOR显着下调,而psmad3呈上调趋势;在细胞模型中给予自噬抑制剂3MA后上调了p-m TOR蛋白水平从而导致p-smad3蛋白表达下调;模型组联合雷帕霉素处理后进一步抑制了pm TOR活性,导致p-smad3表达进一步上调。结论:草酸钙晶体刺激肾小管后抑制m TOR蛋白表达从而诱导自噬,自噬进一步通过调控smad分子通路促进肾小管EMT的发生。
潘雅婧[9]（2020）在《肾康注射液调节UUO小鼠肾纤维化及HUVEC血管生成的机制研究》文中研究表明目的:以VEGF为切入点,在动物和细胞实验探讨肾康注射液对UUO小鼠肾纤维化和HUVEC血管生成的调控作用及作用机制。方法:1.动物实验:将雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组（sham）、单侧输尿管梗阻组（UUO）、氯沙坦钾组（ARB）及高、中、低剂量肾康组（SKI-H、SKI-M、SKI-L）。除sham组外的各组行UUO手术;次日ARB组予氯沙坦钾（13 mg/kg·d）灌胃;SK]-H、SKI-M、SKI-L 组分别予 7.8 g/kg·d、3.9 g/kg·d、1.95 g/kg·d SKI 尾静脉注射。观察小鼠一般状态、记录体重变化。给药14天后检测血Scr、BUN、CysC水平;micro-CT检测肾脏血管分布;HE染色观察肾组织形态改变;天狼星红染色观察胶原沉积;IHC染色观察VEGF、VEGFR-2表达。2.细胞实验:将HUVEC分为空白组（CON）、SKI高剂量组（SKI-11）、SKI-低剂量组（SKI-L）、VE GF 沉默组（Si）、VEGF 沉默-SKI 高剂量组（Si-SKI-H）、VEGF 沉默-SKI 低剂量组（Si-SKI-L）。SKI-H、SKI-L 组分别予 8 mg/ml、2 mg/ml SKI干预 24 h;Si组通过RNAi转染沉默VEGF基因;Si-SKI-H、Si-SKI-L组在转染同时分别予8 mg/ml、2 mg/ml SKI干预24 h。观察血管生成情况,计算血管生成参数;real-time PCR和western blot法分别检测VEGF通路重要靶点基因和蛋白表达。结果:1.动物实验:给药14天后UUO组体重较sham组减轻（P<0.01）;ARB、SKI-H、SKI-M组体重较UUO组增高（P<0.05）。UUO组Scr、BUN、CysC水平较sham组升高（P<0.05,P<0.01）;ARB、SKI-H 组 Scr、BUN、CysC 水平较 UUO 组降低（P<0.05,P<0.01）。肉眼观察sham组双肾无明显异常改变;UUO组患侧肾脏表面粗糙、膨大、积水,肾盂肾盏扩张,实质变薄;SKI组患肾结构破坏较UUO组减轻。micro-CT见sham组肾血管密集,走向清晰;UUO组患肾血管疏松,分支减少、曲度下降;SKI组患肾血管损伤较UUO组减轻。HE染色见sham组肾脏结构完整,无明显病理损害;UUO组肾小管扩张,上皮细胞肿胀坏死,间质增宽伴炎性浸润;SKI组肾脏损伤较UUO组减轻。天狼星红染色（光镜）见sham组肾脏几乎无红染胶原;UUO组肾间质大量红色胶原聚集;SKI组红染程度较UUO组减轻。偏振光镜荧光信号变化与普通光镜所见大体一致。IHC示UUO组患肾VEGF、VEGFR-2表达较sham组降低（P<0.01）;SKI 组 VEGF、VEGFR-2 表达较 UUO 组降低（P<0.01）。剂量方面,SKI 减轻肾脏纤维化损伤和促进血管生成,以中、高剂量效果更优。2.细胞实验:沉默VEGF 24 h后Si组VEGF基因表达较CON组显着降低（P<0.01）,阴性对照组与CON组VEGF无显着差异（P>0.05）,验证转染稳定可行。血管生成方面,SKI组血管连接较CON组增多、血管网密度增大,血管生成参数提高,SKI促进HUVEC血管生成（P<0.01,P<0.05）。基因表达方面,与CON组相比,SKI-H 组 VEGF、VEGFR-2、eNOS 水平升高（P<0.05,P<0.01）;与 Si 组相比,Si-SKI-H 和 Si-SKI-L 组 VEGF、eNOS 水平升高（P<0.05,P<O.01）,SKI 上调 VEGF 通路靶点基因,且该效应在VEGF沉默时更突出。蛋白表达方面,在正常培养及VEGF沉默状态,SKI 均提高 VEGFR-2、p-VEGFR-2、eNOS、p-eNOS 表达水平（P<0.05,P<0.01）。结论:1.肾康注射液可改善UUO小鼠肾功能,缓解肾纤维化病理改变,减轻纤维化损伤;可缓解肾脏微血管网损伤,上调VEGF、VEGFR-2表达,促进患侧肾脏血管生成。2.肾康注射液可促进HUVEC血管生成;可上调HUVEC的VEGF、VEGFR-2基因表达;可提高VEGFR-2、eNOS总蛋白水平及磷酸化蛋白水平。3.肾康注射液可能通过调节VEGF/VEGFR-2及下游eNOS来改善肾纤维化损伤和促进血管生成。
秦田雨[10]（2020）在《肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究》文中指出[目的]从整体动物、细胞和分子水平,结合系统药理学靶点预测,研究中药复方肾康注射液（Shenkang,SK）对慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）和肾纤维化的保护作用和机制,为SK对CKD及肾纤维化的临床治疗提供更多的数据支持及科学依据。[方法]1.系统药理学:首先通过数据挖掘和文献查阅构建SK分子数据库,并通过药物相似性和药物半衰期评估来筛选活性分子;使用WES药物靶向模型来预测生物活性成分的直接药物靶向;使用Cytoscape 3.2软件构建复合物-靶标,靶标-通路和靶标-疾病网络,并根据BioGPS数据库确定靶标在组织和器官中的分布。2.整体动物:C57BL/6小鼠36只,采用随机对照设计法将小鼠按体重随机分为:假手术组,模型组,阳性药（ARB）组,SK高剂量组,SK中剂量组,SK低剂量组（n=6）。对模型组、ARB组、SK各剂量组小鼠实施UUO手术,制备肾纤维化模型,假手术组分离左输尿管但不结扎输尿管。术后第一天开始给药,共计14天。假手术组和模型组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,ARB组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10g,灌胃氯沙坦钾溶液0.15 mL（生药0.13 g）/10 g,SK高剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.08 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK中剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.04 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK低剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.02 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,实验过程中观察记录小鼠体重等一般情况,给药第13天行MRI扫描测定FA值明确活体肾纤维化程度,给药14天后摘眼球取血,称量肾脏重量,分别冻存固定肾脏。比色法测定血肌酐、血尿素氮、血CysC水平,行HE和天狼星红染色观察患侧肾脏病理形态学和纤维化程度,透射电镜观察超微结构情况,Western Blot检测各组小鼠肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅰ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平,Real-time PCR检测假手术组、UUO组和SK中剂量组肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,FSP-1、ECM成分(Col Ⅲ,JAK2、STAT3、TGF-β1和负调节分子SOCS1,SOCS3 mRNA水平。3.细胞:NRK-49F细胞进行复苏传代培养,以10 ng/mL 的TGF-β1刺激48 h诱导NRK-49F细胞增殖活化,不同浓度SK（0,1,2,4mg/mL）干预后,观察细胞形态、Western Blot检测NRK-49F细胞成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅲ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平和负调节分子Prdx5的表达,Real-time PCR检测NRK-49F细胞肌成纤维细胞标志物α-SMA,JAK2、STAT3 mRNA 水平。[结果]1.系统药理学部分:以DL≥0.6为筛选标准,“HL=long”用于定义适当的HL范围。最终选出88种化合物作为活性分子。利用WES算法和CTD、TTD筛选结果,确定了 85个与治疗CKD相关的潜在化合物作用靶点,包括STAT3。通过KEGG数据库映射获得关键通路,包括NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF通路,结合CKD病理机制的相关进展,构建了 CKD治疗模块的通路,包括炎症、增殖、分化、迁移、通透性、降解等模块。对靶标-疾病相互作用网络的深入分析表明,SK治疗CKD主要通过影响6种疾病发挥作用:泌尿生殖系统疾病、代谢性疾病、内分泌疾病、心血管疾病,病理过程和免疫疾病。组织定位结果显示SK通过包括肾脏、肝脏、肺和心脏在内的组织模块发挥作用。2.整体动物部分:（1）肾功能检测:与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏血CREA、BUN、Cys-C水平显着性升高（p<0.01）;与UUO组相比,ARB和高剂量SK组小鼠血CREA水平显着降低（p<0.01）;与UUO组相比,ARB和SK各剂量组小鼠血BUN水平显着降低（p<0.05或p<0.01）;与UUO组相比,SK高剂量组小鼠血Cys-C水平显着降低（p<0.05）。（2）肾脏重量和病理检测:与假手术组相比,UUO模型组的患侧肾质量/体重、患侧肾/对侧肾质量、对侧肾质量/体重均显着增加（p<0.05或p<0.01）。但各药物治疗后对UUO小鼠肾脏重量各指标没有产生影响。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏FA值显着性升高（p<0.01）;与UUO组相比,ARB阳性药组、SK高中低剂量组FA值显着降低（p<0.01或p<0.001）,其中以SK中剂量组最为显着（p<0.001）。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏病理损伤明显;与UUO组比较,各治疗组肾脏损伤情况均有不同程度缓解,细胞外基质积聚、炎性细胞浸润、肾小管扩张和/或萎缩减轻,以SK中剂量组和高剂量组较好。与假手术组比较,UUO组小鼠天狼星红面积极显着增加（p<0.001）;与UUO组比较,ARB组、SK高、中、低剂量组小鼠患侧肾脏天狼星红染色红色面积显着减少（p<0.05或p<0.01）。电镜下观察各浓度SK对UUO所致的细胞器丰富的成纤维细胞增多,间质局灶胶原纤维增生和肾小管凋亡均有一定的改善作用。（3）Western blot检测:与假手术组相比,UUO组α-SMA蛋白水平显着增加（p<0.01）,与UUO比较,SK中剂量组和低剂量组显着下调了 UUO状态下的α-SMA蛋白水平升高（p<0.05）;与假手术组相比,UUO组Col Ⅰ蛋白水平显着增加（p<0.01）,与UUO 比较,SK中剂量组显着下调了 Col Ⅰ蛋白水平升高（p<0.05）;与假手术组相比,UUO组p-STAT3（Try705位点）/STAT3比例显着增加（p<0.01）,与UUO比较,SK中（p<0.01）、低剂量（p<0.001）组显着下调了 Try705位点的STAT3磷酸化程度;与假手术组相比,UUO组p-JAK2（Try1007位点）/JAK2比例有上升趋势,但无统计学差异,与UUO 比较,SK高剂量组显着下调了 Try1007位点的JAK2磷酸化程度（p<0.05）,（4）PCR检测:与假手术组相比,UUO组小鼠患侧ECM成分Col Ⅰ、Col Ⅲ、FN,成纤维细胞活化标志物α-SMA、FSP-1,以及 JAK2、STAT3、TGF-β、JAK2/STAT3 通路负调节因子SOCS1、SOCS3 mRNA水平显着上升（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;与UUO组相比,SK中剂量组显着降低了 Col Ⅰ、ColⅢ、FN,α-SMA、FSP-1,JAK2、TGF-β、SOCS1、SOCS3 mRNA 水平（p<0.05 或p<0.01）。3.细胞实验:TGF-β1诱导后,NRK-49F细胞的细胞骨架显示出内部微丝束,并逐渐增厚和伸长,丧失纺锤形或星形成纤维细胞外观。不同浓度的SK一定程度上逆转了TGF-β1诱导的形态变化和增殖。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞p-STAT3（Try705位点）/STAT3、Prdx5蛋白水平显着性升高（p<0.05）,p-JAK2（Try1007位点）/JAK2有一定程度升高但未达统计学意义（p>0.05）;与模型对照组相比,4 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的STAT3蛋白Try705位点的磷酸化水平显着降低（p<0.05）,1 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的JAK2蛋白Try1007位点的磷酸化水平显着降低（p<0.05）,4 mg/mL SK组细胞的Prdx5蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞α-SMA、JAK2、STAT3 mRNA水平显着升高（p<0.05或p<0.001）;与模型对照组相比,ARB及不同浓度SK均极显着地降低了α-SMA mRNA 水平（p<0.001）,与模型对照组相比,ARB、1mg/mL、2 mg/mL SK（p<0.05）及 4 mg/mL SK（p<0.01）显着降低了 STAT3 mRNA 水平,与模型对照组相比,ARB及4 mg/mL SK显着降低了 JAK2 mRNA水平（p<0.05）。[结论]（1）系统药理学预测显示SK中多种化合物可能通过作用于与炎症、凋亡、增殖等相关的NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF等多通路的靶点分子治疗CKD。（2）SK有效改善UUO小鼠肾功能指标和肾间质纤维化,其机制可能是通过调节JAK2/STAT3信号通路抑制成纤维细胞活化实现的,验证了系统药理学结果。（3）SK还能够抑制TGF-β1诱导NRK-49F增殖活化以及ECM产生,其作用机制可能是通过抑制JAK2/STAT3通路的激活介导的。
二、梗阻性肾病肾间质纤维变性的代谢机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、梗阻性肾病肾间质纤维变性的代谢机制（论文提纲范文）
（1）原儿茶醛抑制lncRNA9884介导的炎症以改善肾脏纤维化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分:原儿茶醛对小鼠慢性梗阻性肾脏疾病的作用 |
| 材料与方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.实验试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学处理应用 |
| 结果 |
| 1.原儿茶醛对梗阻性肾病小鼠肾脏外观及功能的影响 |
| 2.原儿茶醛改善梗阻性肾病小鼠肾脏结构变化 |
| 3.原儿茶醛对梗阻性肾病小鼠肾脏上皮-间质转化所导致纤维化的作用 |
| 4.原儿茶醛对梗阻性肾病激活巨噬细胞引起的炎症反应的影响 |
| 5.原儿茶醛改善梗阻性肾病小鼠炎症因子的蛋白表达 |
| 6.原儿茶醛改善梗阻性肾病小鼠促炎细胞因子的m RNA表达 |
| 7.原儿茶醛可参与调节NF-κB和 Smad3 信号途径 |
| 8.原儿茶醛可抑制梗阻性肾病小鼠中LRNA9884 的表达 |
| 第二部分:原儿茶醛分别在IL-1β诱导的炎症和TGF-β1 诱导的纤维化微环境中对小鼠原代肾小管上皮细胞的作用 |
| 材料与方法 |
| 1.细胞培养 |
| 2.实验试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学处理应用 |
| 结果 |
| 1.原代肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 2.原儿茶醛对肾小管上皮细胞的干预浓度筛选 |
| 3.原儿茶醛改善了IL-1β诱导的肾小管上皮细胞促炎因子的蛋白表达 |
| 4.原儿茶醛改善了IL-1β诱导的肾小管上皮细胞促炎因子和LRNA9884的mRNA表达 |
| 5.原儿茶醛对IL-1β诱导的肾小管上皮细胞形态的影响 |
| 6.过表达LRNA9884 阻碍了PCA在 IL-1β诱导的肾小管上皮细胞中的抗炎作用 |
| 7.原儿茶醛抑制了TGF-β1 诱导的肾小管上皮细胞间质转化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 综述 肾纤维化的发病机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（2）基于“肾主水”理论探讨金匮肾气丸治疗慢性肾功能衰竭的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Absract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 金匮肾气丸治疗腺嘌呤慢性肾功能衰竭大鼠实验研究 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 实验仪器与设备 |
| 1.4 实验动物分组 |
| 1.5 给药方法 |
| 1.6 观察指标 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 各组大鼠一般情况 |
| 2.2 各组大鼠体重变化 |
| 2.3 各组大鼠血常规与生化指标 |
| 2.4 各组大鼠24hU-TP |
| 2.5 腺嘌呤复制CRF大鼠模型 |
| 2.6 金匮肾气丸治疗后各组大鼠肾脏形态 |
| 2.7 金匮肾气丸治疗后各组大鼠肾脏病理 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 金匮肾气丸治疗UUO慢性肾功能衰竭大鼠实验研究 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品与试剂 |
| 1.3 实验仪器与设备 |
| 1.4 实验动物分组 |
| 1.5 UUO法复制CRF大鼠模型 |
| 1.6 给药方法 |
| 1.7 观察指标 |
| 1.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 各组大鼠一般情况 |
| 2.2 各组大鼠体重变化 |
| 2.3 各组大鼠血常规与生化指标 |
| 2.4 各组大鼠24hU-TP |
| 2.5 UUO法复制CRF大鼠模型 |
| 2.6 金匮肾气丸治疗后各组大鼠肾脏外形 |
| 2.7 金匮肾气丸治疗后各组大鼠肾脏病理 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 慢性肾功能衰竭大鼠水通道蛋白表达的实验研究 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备 |
| 1.4 实验AQP检测 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 各组大鼠肾脏AQP蛋白检测结果 |
| 2.2 各组大鼠肺脏AQP蛋白检测结果 |
| 2.3 各组大鼠膀胱AQP蛋白检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结语 |
| 附录 文献综述 |
| 文献综述一 慢性肾功能衰竭研究进展 |
| 文献综述二 慢性肾功能衰竭中医药研究进展 |
| 文献综述三 水通道蛋白(AQPs)的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 读博期间发表的文章及参与的科研 |
| 致谢 |
（3）FG-4592通过干预RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性炎症对UUO大鼠肾纤维化的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物饲养及分组 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 SPF级大鼠饲养环境 |
| 2.1.3 实验动物分组 |
| 2.2 实验试剂与抗体及实验仪器 |
| 2.2.1 主要试剂及主要抗体 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 标本的采集 |
| 2.4 实验室检测 |
| 2.5 肾脏病理学检查 |
| 2.5.1 石蜡切片制作的基本过程 |
| 2.5.2 Masson三色染色 |
| 2.5.3 PAS染色 |
| 2.5.4 透视电镜标本观察 |
| 2.6 免疫组织化学染色 |
| 2.7 ELISA法检测血及尿8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHd G) |
| 2.8 免疫印迹法 |
| 2.9 原位Td T介导的d UTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)检测 |
| 2.10 统计学处理 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 各组大鼠生化检测结果评估 |
| 3.2 FG-4592 对UUO所致坏死性凋亡的影响 |
| 3.3 FG-4592 对UUO诱导的坏死性炎症的影响 |
| 3.4 FG-4592 对UUO所致肾纤维化的影响 |
| 3.5 FG-4592 对UUO所致氧化应激酶失调的影响 |
| 3.6 FG-4592 对UUO所致内质网应激的影响 |
| 3.7 FG-4592 对UUO所致线粒体结构的影响 |
| 3.8 FG-4592 对UUO所致细胞凋亡的影响 |
| 3.9 FG-4592对HIF-1α/Wnt/β-catenin/GSK信号通路的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 缺氧诱导因子-1研究进展 |
| 参考文献:(综述) |
| 附录:攻读学位期间发表的论文目录 |
（4）RNA甲基化m6A修饰在梗阻性肾病肾间质纤维化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分：RNA甲基化m~6A修饰与C57小鼠CUUO肾间质纤维化关系的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 C57雄性小鼠左侧输尿管完全梗阻模型的构建及标本收集 |
| 2.4 血清肾功能检测 |
| 2.5 肾组织总RNA的提取、定量及质控 |
| 2.6 肾组织RNA甲基化m~6A水平检测 |
| 2.7 肾组织RNA实时定量PCR检测 |
| 2.8 肾组织蛋白Western Blot检测 |
| 2.9 TCMK-1细胞培养 |
| 2.10 TGF-β1诱导TCMK-1细胞上皮间充质转化 |
| 2.11 细胞免疫荧光实验 |
| 2.12 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 动物实验分组及样本的收集 |
| 3.2 血清肾功能及肾组织中纤维化指标检测 |
| 3.3 梗阻肾组织RNA甲基化m~6A修饰及m~6A甲基化修饰酶的检测 |
| 3.4 免疫荧光实验检测TCMK-1细胞特征性指标及m~6A修饰酶的表达 |
| 3.5 TGF-β1诱导肾小管上皮细胞发生间充质转化 |
| 3.6 TGF-β1诱导下TCMK-1细胞m~6A修饰水平和m~6A修饰酶的表达变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分：CUUO术后7天肾组织RNA甲基化m~6A修饰表观转录组信息 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 C57雄性小鼠左侧输尿管完全梗阻模型的构建及标本收集 |
| 2.3 RNA甲基化免疫共沉淀高通量测序(MeRIP-seq) |
| 2.4 RNA高通量测序(RNA-seq) |
| 2.5 MeRIP-seq和RNA-seq关联分析 |
| 2.6 MeRIP-qPCR |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 C57小鼠左侧CUUO肾组织RNA甲基化m~6A测序相关结果及分析 |
| 3.1.1 m~6A修饰表观转录组分布 |
| 3.1.2 m~6A修饰表观转录组KEGG、GO分析 |
| 3.2 CUUO-7天肾组织RNA转录组信息 |
| 3.3 RNA测序与MeRIP测序关联分析 |
| 3.4 候选基因的选择及详细信息 |
| 3.5 目的基因MeRIP-PCR验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分：METTL3调控LZTR1 mRNA m~6A修饰在肾小管上皮细胞增殖与EMT中作用的研究 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 METTL3敲减及过表达慢病毒载体构建及转染 |
| 2.3 细胞活性检测 |
| 2.4 细胞凋亡检测 |
| 2.5 TCMK-1细胞总RNA的提取、定量和质控 |
| 2.6 RNA逆转录合成c DNA及实时定量PCR检测 |
| 2.7 RNA甲基化m~6A修饰水平检测 |
| 2.8 TCMK-1细胞Western Blot检测 |
| 2.9 RNA甲基化免疫共沉淀(MeRIP)及MeRIP-qPCR |
| 2.10 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 敲减、过表达METTL3后METTL3表达及总RNA甲基化m~6A修饰水平变化 |
| 3.2 敲减、过表达METTL3后TCMK-1纤维化指标表达的变化 |
| 3.3 METTL3的表达对TCMK-1细胞凋亡的影响 |
| 3.4 METTL3的表达对TCMK-1细胞增殖活性的影响 |
| 3.5 METTL3对LZTR1 mRNA m~6A修饰水平及LZTR1表达的调控 |
| 3.6 LZTR1的表达对TCMK-1细胞增殖活性的影响 |
| 3.7 METTL3、LZTR1调控MAPK/ERK1/2信号通路 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 RNA甲基化m~6A修饰与其参与的RNA生物调控过程 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）miR-187-3p通过靶向调控PTRF抑制先天性肾积水肾功能损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:不同DRF的UPJO所致先天性肾积水患儿肾脏组织中差异表达的miRNA筛选、验证的相关研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和取材 |
| 2.2.1 先天性肾积水患儿的筛选和肾脏组织标本收集 |
| 2.2.2 不同DRF的UPJO所致先天性肾积水患儿肾脏组织的miRNA高通量测序分析 |
| 2.2.3 SD正常大鼠和UUO大鼠模型构建 |
| 2.2.4 HK-2细胞培养及体外TGFβ诱导纤维化模型构建 |
| 2.2.5 应用qRT-PCR对测序结果进行准确性验证 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 UPJO所致先天性肾积水患儿临床资料 |
| 3.2 DRF正常组和下降组肾组织的差异miRNA高通量测序分析 |
| 3.2.1 筛选差异表达的miRNAs |
| 3.2.2 差异miRNAs亲本基因的富集分析 |
| 3.3 qRT-PCR验证差异表达的miRNAs的表达情况 |
| 3.3.1 qRT-PCR验证UUO新生大鼠肾组织中差异表达的miRNAs的表达情况 |
| 3.3.2 qRT-PCR验证UPJO所致先天性肾积水患儿肾组织中差异表达的miRNAs的表达情况 |
| 3.3.3 qRT-PCR验证TGFβ诱导HK-2细胞中差异表达的miRNAs的表达情况 |
| 3.4 预测差异表达miRNA的结合mRNA |
| 4 讨论 |
| 第二部分:miR-187-3p与PTRF靶向关系的确认及其调控HK-2细胞上皮间质转化和TGFβ/Smad2通路机制的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HK-2细胞传代培养 |
| 2.2.2 TGF-β1诱导HK-2的上皮间质转化 |
| 2.2.3 HK-2细胞病毒转染 |
| 2.2.4 miR-187-3p mimics及inhibitor转染HK-2细胞后qRT-PCR验证预测可能和miR-187-3p靶向结合的mRNA的表达情况 |
| 2.2.5 western blot检测miR-187-3p/PRTK对HK-2细胞上皮间质转化、纤维化及PTRF、NR5E、Smad2/P-Smad2的调控作用 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-187-3p mimics及inhibitor转染HK-2细胞后qRT-PCR验证预测可能和miR-187-3p靶向结合的mRNA的表达情况 |
| 3.2 miR-187-3p对HK-2细胞上皮间质转化、纤维化及PTRF、NT5E、Smad2/P-Smad2的调控作用 |
| 3.2.1 miR-187-3p调控PTRF和 NT5E的表达 |
| 3.2.2 miR-187-3p对HK-2细胞上皮间质转化、纤维化的影响 |
| 3.2.3 miR-187-3p对HK-2细胞Smad2/p-Smad2表达的影响 |
| 3.3 miR-187-3p/PTRF对HK-2细胞上皮间质转化、纤维化及PTRF、NR5E、Smad2/P-Smad2的调控作用 |
| 4 讨论 |
| 第三部分:大鼠单侧输尿管梗阻模型中验证miR-187-3p通过靶向PTRF调控抑制肾脏组织上皮间质转化和TGFβ/Smad2通路机制的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 新生大鼠UUO模型的构建 |
| 2.2.2 qRT-PCR验证注射miR-187-3p agomir后 UUO新生大鼠肾脏组织中miR-187-3p的表达情况 |
| 2.2.3 western blot验证miR-187-3p agomir对UUO新生大鼠肾脏上皮间质转化、纤维化和PERF、NT5E、Smad2/p-Smad2的调控作用 |
| 2.2.4 免疫组化对UUO新生大鼠肾脏中PTRF、NT5E的定位 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 注射miR-187-3p agomir后 UUO新生大鼠肾脏miR-187-3p的表达情况 |
| 3.2 miR-187-3p对UUO新生大鼠肾脏上皮间质转化和纤维化的调控作用 |
| 3.3 miR-187-3p对UUO新生大鼠肾脏NT5E、PTRF和 Smad2/p-Smad2的调控作用 |
| 3.4 UUO新生大鼠肾脏NT5E、PTRF的定位 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 综述 microRNA在肾脏纤维化中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）Circ-0045861/miR-181d-5p及m6A修饰调控SIRT1在梗阻性肾损伤修复中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:不同分肾功能先天性梗阻性肾积水患儿肾实质差异circRNA的筛选 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验标本 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 rRNA去除链特异性文库构建 |
| 2.2.2 小RNA文库构建 |
| 2.2.3 分析circRNA测序结果并进行全基因组差异表达分析并验证 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 纳入患儿临床基本信息 |
| 3.2 circRNA表达谱 |
| 3.3 对差异表达circRNA的所有来源基因进行GO富集分析 |
| 3.4 对差异表达circRNA的所有来源基因进行KEGG富集分析 |
| 3.5 验证差异circRNA的表达 |
| 3.6 circRNA-0045861 的结合位点的预测 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 circRNA-0045861和miR-181d-5p在梗阻性肾病及肾小管上皮细胞中的功能研究 |
| 5 前言 |
| 6 材料与方法 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.1.1 实验标本 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 试剂配制 |
| 6.2.2 HK-2 细胞传代培养及病毒转染 |
| 6.2.3 qRT-PCR检测circ-0045861、miR-181d-5p和 SIRT1的mRNA在各组中的表达情况 |
| 6.2.4 免疫荧光染色 |
| 6.2.5 Western-blot检测SIRT1等蛋白在各组中的表达情况 |
| 6.2.6 病毒(miR-181d-5p mimics, miR-181d-5p inhibitors,si-circRNA-0045861)接种后FITC-PI检测细胞凋亡 |
| 6.2.7 动物模型制备及组织标本收集 |
| 6.2.8 MASSON染色及免疫组化 |
| 6.2.9 TUNEL染色法 |
| 6.2.10 统计学分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 TGF-β1诱导HK-2后circ-0045861的表达 |
| 7.2 UUO术后肾脏及TGF-β1诱导HK-2细胞后miR-181d-5p的表达 |
| 7.3 UUO术后肾脏组织中及TGF-β1诱导HK-2细胞中后 SIRT1及SIRT1mRNA的表达丰度变化 |
| 7.4 circ-0045861对TGF-β1诱导HK-2细胞凋亡的影响 |
| 7.5 miR-181d-5p mimics对 HK-2 细胞凋亡的影响 |
| 7.6 miR-181d-5p mimics可抑制TGFβ1诱导的HK-2细胞的凋亡标志蛋白SIRT1,p53,bax,caspase-9的表达 |
| 7.7 检测miR-181d-5p mimics对TGFβ1干预后HK-2细胞纤维化的调控 |
| 7.8 miR-181d-5p agomir在UUO模型中上调miR-181d-5p的表达 |
| 7.9 miR-181d-5p对UUO术后肾脏纤维化的治疗作用 |
| 7.10 Western1Blot检测α-SMA和波形蛋白的表达 |
| 7.11 miR-181d-5p对UUO术后肾脏上皮细胞凋亡的治疗作用 |
| 7.12 miR-181d-5p对 UUO术后SIRT1 及凋亡相关指标p53,Bax,caspase-9 的表达及定位的影响 |
| 7.13 双荧光素酶实验证明miR-181d-5p与 circ-0045861存在结合位点 |
| 7.14 双荧光素酶实验证明miR-181d-5p与 SIRT1 3'-UTR存在结合位点 |
| 7.15 FISH共定位miR-181d-5p和 circ-0045861共同表达于细胞质 |
| 8 讨论 |
| 第三部分 m6A修饰在输尿管梗阻所致早期肾损伤中作用机制的研究 |
| 9 前言 |
| 10 材料及方法 |
| 10.1 主要试剂和仪器 |
| 10.1.1 实验大鼠及细胞 |
| 10.1.2 主要试剂 |
| 10.1.3 主要仪器 |
| 10.2 实验方法 |
| 10.2.1 动物模型制备及组织标本收集 |
| 10.2.2 动物样本总RNA提取 |
| 10.2.3 mRNA反转录成cDNA |
| 10.2.4 MeRIP-seq测序 |
| 10.2.5 提取m6A-RNA并 qRT-PCR检测m6A修饰的lncRNA |
| 10.2.6 统计学分析 |
| 11 结果 |
| 11.1 通过变性 琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性 和g DNA污染测试 |
| 11.2 检测m6A甲基化位点(peaks)并注释 |
| 11.3 差异甲基化PEAK检测 |
| 11.4 对差异表达lncRNA的所有来源基因进行GO富集分析 |
| 11.5 对差异表达lncRNA的所有来源基因进行KEGG富集分析 |
| 11.6 挑选差异lncRNA |
| 12 讨论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 非编码RNA在梗阻性肾病中的研究 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）肾衰宁片对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化保护作用及Wnt/β-catenin信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、文献综述 干预Wnt/β-catenin信号通路改善肾间质纤维化机制研究 |
| 参考文献 |
| 二、在学期间科研成绩 |
| 三、致谢 |
| 四、个人简历 |
（8）自噬在草酸钙结晶肾损伤EMT中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:草酸钙结晶肾损伤中自噬的表达 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果与讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:草酸钙结晶肾损伤模型中EMT表达情况以及自噬对EMT的影响 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果与讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 :草酸钙诱导的肾小管上皮细胞自噬参与结晶肾损伤EMT的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果与讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 自噬在慢性肾脏病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文以及科研成果 |
| 致谢 |
（9）肾康注射液调节UUO小鼠肾纤维化及HUVEC血管生成的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药防治慢性肾脏病肾纤维化研究进展 |
| 1. 病名 |
| 2. 病因病机 |
| 3. 临床治疗 |
| 4. 实验研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 肾康注射液治疗肾脏疾病研究概述 |
| 1. 药物基本情况 |
| 2. 临床疗效研究 |
| 3. 基础药理机制研究 |
| 4.发展前景 |
| 参考文献 |
| 综述三 血管生成在肾纤维化发生发展中作用的研究进展 |
| 1. 血管生成发生发展 |
| 2. 肾纤维化发生发展 |
| 3. 血管生成障碍与肾纤维化密切相关 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 肾康注射液对UUO小鼠肾纤维化和血管生成的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 肾康注射液对HUVEC血管生成和VEGF/VEGFR-2/eNOS的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要成果 |
（10）肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 慢性肾脏病肾纤维化的现代研究进展 |
| 1 病因研究 |
| 2 发病机制研究 |
| 3 治疗与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药防治慢性肾脏病研究进展 |
| 1 病名研究 |
| 2 病因病机研究 |
| 3 防治研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 肾康注射液治疗慢性肾脏病的系统药理学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果和讨论 |
| 3 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 肾康注射液对UUO小鼠肾间质纤维化的保护作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 肾康注射液对NRK-49F人鼠肾间质成纤维细胞活化的作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 主要研究成果 |
| 个人简历 |
四、梗阻性肾病肾间质纤维变性的代谢机制（论文参考文献）
- [1]原儿茶醛抑制lncRNA9884介导的炎症以改善肾脏纤维化的研究[D]. 杨洁珂. 西南医科大学, 2021(01)
- [2]基于“肾主水”理论探讨金匮肾气丸治疗慢性肾功能衰竭的实验研究[D]. 边红萍. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [3]FG-4592通过干预RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性炎症对UUO大鼠肾纤维化的保护作用[D]. 郑海兰. 延边大学, 2021(02)
- [4]RNA甲基化m6A修饰在梗阻性肾病肾间质纤维化中的作用及机制研究[D]. 李雪艳. 中国医科大学, 2021
- [5]miR-187-3p通过靶向调控PTRF抑制先天性肾积水肾功能损伤的机制研究[D]. 刘舸. 中国医科大学, 2021
- [6]Circ-0045861/miR-181d-5p及m6A修饰调控SIRT1在梗阻性肾损伤修复中的作用机制研究[D]. 范旭. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]肾衰宁片对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化保护作用及Wnt/β-catenin信号通路的影响[D]. 马飞. 锦州医科大学, 2021(01)
- [8]自噬在草酸钙结晶肾损伤EMT中的作用及机制研究[D]. 李璐. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [9]肾康注射液调节UUO小鼠肾纤维化及HUVEC血管生成的机制研究[D]. 潘雅婧. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究[D]. 秦田雨. 北京中医药大学, 2020(04)