一、糖皮质激素受体配体结合区的克隆及酵母双杂交诱饵载体的构建和表达（论文文献综述）
郑博伟[1]（2020）在《E种肠道病毒HY12株VP1宿主互作蛋白的筛选及鉴定》文中认为牛肠道病毒（Bovine enterovirus,BEV）感染是临床上以消化系统和呼吸系统病症为特征的传染病,给养牛业造成了较为严重的经济损失。目前,国内许多地区报道有该病的暴发。由于本病在国内为新发传染病,有关该病的发病机理及病毒与宿主细胞间的互作等方面缺乏研究。本研究应用酵母双杂交技术,以肠道病毒HY12毒株的结构蛋白VP1构建重组质粒,表达诱饵蛋白,通过筛选及鉴定与VP1互作的宿主蛋白,探究病毒与宿主蛋白之间的相互作用,以期确定VP1蛋白在病毒入侵机体过程中的功能,为最终阐明肠道病毒感染机制奠定基础。为筛选E种肠道病毒HY12毒株编码的VP1蛋白的宿主互作蛋白,本实验应用PCR技术扩增出HY12病毒VP1蛋白基因的完整序列,并将其克隆到酵母载体pGBKT7中,构建重组诱饵质粒pGBKT7-VP1。将重组质粒转化到酵母菌株AH109中,通过对比重组质粒组和空白质粒组不同时间点的OD600值,检测其对酵母细胞的毒性,并把含有诱饵重组质粒的酵母菌涂布在缺陷型培养基上验证其自激活活性。将转有诱饵载体的AH109菌株与表达酵母双杂交MDBK细胞cDNA文库的Y187菌株混合培养,通过缺陷型培养基筛选杂交成功的菌落,并应用序列测定与比对分析等方法进行验证。提取阳性菌落的酵母质粒,通过PCR和α-半乳糖苷酶实验,筛选到12个潜在VP1蛋白的互作蛋白。将构建好的pbJun-VP1和pbFOS-候选蛋白共转入293T细胞中,通过双分子荧光互补技术,在荧光显微镜下观察二者是否互作。同时,构建真核重组质粒pcDNA3.1B-VP1和pCMV-Tag 2B-候选蛋白,利用免疫共沉淀技术验证相互作用关系。综上所述,本研究通过PCR等技术成功构建出酵母双杂交体系所需的诱饵载体pGBKT7-VP1,通过缺陷型培养基以及对OD600值的测定验证无自激活活性和细胞毒性。文库菌液的滴度为108 cfu/mL,随机挑取的44个克隆的插入片段大小范围为200 bp～2 000 bp,说明文库多态性良好,丰度较高。将转有诱饵载体的AH109菌株与含有酵母双杂交MDBK细胞cDNA文库的Y187菌株混合培养,通过缺陷型培养基及PCR等方法共筛选到12个阳性克隆,即潜在互作蛋白,经序列测定与比对分析后,挑选其中两个蛋白PAK1和ACTG1,经α-半乳糖苷酶实验初步验证VP1与PAK1及ACTG1之间可能存在相互作用关系。构建真核重组质粒,经Western Blot验证,VP1、PAK1和ACTG1均可在细胞中表达。利用免疫共沉淀实验和双分子荧光互补实验进一步验证其与VP1蛋白的互作关系,为BEV感染机制及病毒结构蛋白VP1功能的研究奠定基础。
周炎[2]（2020）在《烟草硝酸还原酶基因NIA启动子的克隆及其互作蛋白的筛选》文中研究说明为了更好的调控硝酸根同化过程和硝酸信号的响应,筛选鉴定烟草中硝酸还原酶基因NIA1启动子、NIA2启动子的互作蛋白以及假定顺式元件NRE2的结合蛋白,本实验以烟草基因组为模板,选取NIA基因上游1 kb左右片段,设计引物,克隆烟草NIA基因启动子片段,构建瞬时表达载体用于鉴定。以普通烟草品种K326为材料,依照Clontech公司的酵母单杂交系统筛选方法完成了 K326酵母单杂交cDNA文库的构建及NIAl基因启动子、NIA2基因启动子和4×NRE2顺式元件的转录因子筛选。结果表明,经过生物信息学分析及瞬时转染GUS基因鉴定,所克隆NIA上游片段具有启动子功能。酵母单杂交文库构建成功。经测序比对,NIA1启动子、NIA2启动子、4×NRE2片段分别筛选出8、3、3个cDNA序列,分别对其进行生物信息学分析,结果显示14个蛋白基因序列中有12个为烟草同源基因,利用PredictProtein在线工具对比对到的阳性克隆氨基酸序列进行分析预测。结合位点预测结果表明,NIA1启动子诱饵片段筛选到的5个阳性克隆蛋白序列和NIA2启动子诱饵片段筛选到的2个以及4×NRE2诱饵片段筛选到的2个共9个阳性克隆蛋白序列同时含有DNA/RNA结合区以及蛋白质结合区,具有与核酸序列和蛋白质结合的功能,可满足转录因子结构中的DNA结合域要求。其余阳性克隆蛋白序列中都存在多个蛋白结合位点,可能与其他蛋白形成配体后共同参与调控某些生命过程,但其具体功能尚需进一步验证。
刘佩佩,苗晶晶,刘力铷,姚琳琳,潘鲁青[3]（2019）在《菲律宾蛤仔雌激素相关受体基因克隆及互作蛋白筛选》文中指出采用RACE技术克隆鉴定了菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）雌激素相关受体（rpERR）基因的cDNA序列。rpERR基因全长序列为2 340 bp,开放阅读框ORF为1 453 bp,编码484个氨基酸,理论分子量为54.5 kDa。氨基酸序列同源性分析表明菲律宾蛤仔ERR与脊椎动物ERRγ同源性相近,与其他无脊椎动物聚为一个分支,与虾夷扇贝的ERR同源性最高。rpERR含有核受体超家族通常的6个结构域。通过qRT-PCR技术检测发现ERR在菲律宾蛤仔的鳃、消化盲囊、性腺、闭壳肌和外套膜组织中各组织中均有表达,在性腺中的表达量最高。运用酵母双杂交技术对菲律宾蛤仔酵母cDNA文库进行互作蛋白筛选、测序及生物信息学分析,获得了菲律宾蛤仔ERR互作蛋白为cAMP应答元件结合蛋白。根据rpERR的生物信息学分析、各组织中表达特征以及互作蛋白推测其功能可能涉及性腺发育与物质能量代谢等重要生物学过程的调节。
李文宇[4]（2019）在《柔嫩艾美耳球虫侵入部位特异性关键分子及其受体研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道上皮细胞内,引起鸡产生食欲不振、消瘦、血便等一系列临床症状的寄生虫病。其发病率高,是严重危害养禽业发展的重要疾病之一,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。艾美耳球虫属主要寄生于鸡的肠道,不同种球虫具有明显的寄生部位特异性,但其机制机理尚不明确。有研究显示,柔嫩艾美耳球虫微线蛋白3（EtMIC3）可能是柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）侵入盲肠细胞过程中,决定其寄生部位特异性的关键分子。本研究进一步通过观察鸡球虫侵入相关分子微线蛋白（EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1）与鸡不同肠段的结合情况,从而确定E.tenella侵入部位特异性关键分子。并在此基础上,构建鸡盲肠上皮细胞的cDNA文库,通过酵母双杂交方法确定E.tenella侵入部位特异性关键分子的受体分子,并通过GST-pulldown技术进行验证。对受体分子进行基因克隆及表达,制备抗血清,分析抗血清对球虫侵入宿主是否具有阻断作用,以及观察受体在鸡不同肠段的分布情况。本研究对于阐明鸡球虫侵入部位特异性的分子机制具有重要意义,也为鸡球虫病的防控提供新思路。1.E.tenella微线蛋白与鸡不同肠段结合能力的分析通过免疫组织化学方法观察微线蛋白EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1与鸡不同肠段（前段、中段、后段和盲肠）的结合能力。结果发现EtMIC3与盲肠具有明显的结合作用,与其它肠段没有明显的结合作用。EtMIC2和EtAMA1与鸡肠段（前段、中段、后段和盲肠）没有明显的结合作用;用EtMIC3抗血清封闭E.tenella子孢子,计算子孢子的侵入抑制率。结果显示EtMIC3抗血清对子孢子侵入盲肠组织的抑制率为63.63%。而在对照组中,PBS和空白大鼠血清不能对E.tenella子孢子侵入盲肠组织引起明显的阻断作用,表明EtMIC3抗血清能够显着阻断E.tenella子孢子侵入盲肠组织的能力。结果显示EtMIC3分子可能是E.tenella侵入部位特异性的关键分子。2.鸡盲肠上皮细胞文库的构建提取并纯化鸡盲肠上皮细胞中总RNA,构建鸡盲肠上皮细胞cDNA文库。构建诱饵质粒pDHB1-EtMIC3,将其转入NMY51酵母菌株中,确定诱饵质粒pDHB1-EtMIC3能否在酵母中进行表达。结果表明获得了高纯度的鸡盲肠上皮细胞RNA,鸡盲肠上皮细胞cDNA初级文库滴度为3×106CFU/mL,扩增后文库滴度约为3×109CFU/mL。文库中插入的片段长度约为400 bp-2000 bp,平均长度大于1000 bp。综上所述,可以用于筛选EtMIC3的受体分子。3.EtMIC3鸡盲肠上皮细胞受体分子的鉴定通过酵母双杂交系统进行EtMIC3受体分子的筛选,经返回性验证发现有8个与EtMIC3结合的受体分子。通过对受体分子的基因克隆及蛋白表达,并经GST-pulldown验证,发现2个能够与EtMIC3分子结合的蛋白:BCL2 associated athanogene 1（BAG1）;Endonuclease,polyU-specific-like（ENDOUL）。对鸡盲肠上皮细胞中EtMIC3受体分子的研究有利于阐明E.tenella侵入部位特异性机制。4.受体分子在肠道分布情况及其抗血清对子孢子侵入的阻断作用观察通过免疫组织化学的方法观察受体分子BAG1、ENDOUL在鸡不同肠段（前段、中段、后段和盲肠）的分布情况。将BAG1、ENDOUL受体分子蛋白分别免疫鸡,制备受体分子特异性免疫抗体。将BAG1、ENDOUL抗血清通过静脉注射至鸡体内,通过攻虫试验分析受体分子抗血清对E.tenella侵入是否具有阻断作用。免疫组织化学试验结果显示,2种受体分子主要分布于鸡盲肠,不在其他肠段分布;攻虫试验结果显示,与对照组相比,BAG1、ENDOUL抗血清组能够显着减缓鸡球虫感染造成的体重下降,说明BAG1、ENDOUL抗血清对E.tenella的感染具有一定的阻断作用。
李彤亚[5]（2019）在《HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究》文中研究指明由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染引起的获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome,ADIS）是威胁人类最严重的传染病之一,它能破坏人体的免疫系统降低机体的免疫力,并引发严重的并发症,目前没有特效的治疗药物,HIV致病机制研究及药物靶标寻找的是对于人类健康和社会稳定有重要意义。Nef蛋白是HIV的负调控因子,主要表达于CD4+T细胞。Nef诱导的AIDS样症状主要表现为凋亡细胞的增加,且Nef基因突变或者缺失与长期不发病或病程进展缓慢的AIDS（Long-term Nonprogressors/Slowprogressors,LTNP/LTSP）的发生显着相关。Nef能下调CD4、CD28、CD86、MHC-I、MHC-II等细胞表面受体的表达,干扰免疫细胞的监视和清除,实现HIV-1的免疫逃逸;还能通过与诱凋亡因子及某些激酶直接结合抑制凋亡通路,使被感染细胞的存活期延长,利于病毒复制和感染力增强。我们通过酵母双杂交实验发现了Nef与细胞色素b（cytochrome b,Cyto b）C端（169-380 aa）存在相互作用,并通过免疫共沉淀验证了两者能在体内结合。而且我们发现Cyto b与Fas介导的凋亡有关。目前对于线粒体参与的凋亡通路,研究者的目光大都聚集在Cyto c上,Cyto c是线粒体凋亡通路的核心蛋白,通过与Apaf-1等辅助蛋白形成凋亡体,活化caspase并激发级联反应最终导致细胞的凋亡。而我们的研究结果证明Cyto b介导的凋亡与Apaf-1形成凋亡体无关,独立存在于Cyto c经典凋亡通路之外。我们的研究还发现,Nef可以抑制Apaf-1诱导的细胞凋亡,这说明了Nef是Cyto c凋亡通路的负调控因子。此外,我们用Fas的单抗C11刺激细胞的Fas凋亡通路,证明了Nef能通过直接与Cyto b的结合抑制Fas凋亡信号诱导的细胞凋亡。我们利用B型HIV-1的假病毒HIV-1BA-L感染Jurkat T细胞,证明了HIV-1可以通过与Cyto b的结合抑制Fas凋亡通路。迄今为止,关于Cyto b相关的凋亡通路及其机制的研究较少,我们的研究在这方面做出了初步探索,对于加深Nef诱导免疫逃逸机制的认识具有重要意义,也提供了治疗HIV的潜在靶点,然而深入的机制仍需进一步发现。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染可以引起急、慢性肝炎,还与肝衰竭、肝硬化以及肝癌的发生发展有密切关系。乙型肝炎（Hepatitis B）是全球范围内的重要传染病,有较高的传染性和致死率。目前对于乙肝仍然缺乏有效的治疗药物。乙肝的治疗目标是持续抑制HBV的复制,减少肝细胞损伤,延缓肝炎演变为肝硬化（liver cirrhosis,LC）和肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的进程。HBV很难在体内完全清除,这与其复杂的免疫逃逸机制有关。干扰素（interferon,IFN）是一种广泛表达的细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。IFN的生理作用是通过信号通路调节IFN诱导基因的转录来实现的。病毒感染首先诱发机体的天然免疫,IFN诱导的效应因子的表达是机体抗病毒感染的第一道防线。因而,研究HBV逃避IFN相关的天然免疫的机制的研究有重要的现实意义。干扰素诱导跨膜蛋白家族（interferon-inducible transmembrane protein,IFITM）是IFN的诱导重要的抗病毒、抗肿瘤的效应因子。它们主要由IFNγ通过诱导Jak-stat1信号通路诱导产生,具有广谱的抗病毒效应,如艾滋病毒（HIV）、SARS冠状病毒（SARS-CoV）、甲型流感病毒（IAV）、登革热病毒（DFV）和水泡性口膜炎病毒（VSV）等。但是,IFITM抗HBV的机制鲜见报道。HBV e蛋白有较强的免疫调节作用,与乙肝的发病机制有着密切的关系。我们为了研究HBV免疫逃逸的可能机制,首先利用酵母双杂交实验筛选能与HBe相互作用蛋白,发现ARID2编码的BAF200蛋白与HBe存在直接的相互作用。然而,HBe作为一种分泌蛋白,实际上难以在空间上与定位于核内的BAF200发生相互作用。但是,与HBe的基因序列大部分相同的HBV核心蛋白（HBc）大多位于胞质,于是我们推测HBc也可能与BAF200存在体内的相互作用。为验证此想法,我们进行了免疫共沉淀实验,实验结果表明HBc和BAF200确实存在体内的相互作用。SWI/SNF家族是染色质重构复合物。SWI/SNF家族有BAF复合物和PBAF复合物两种形式,组成它们的亚基大多数是相同的,但BAF250只存在于BAF复合物,而BAF200和BAF180是PBAF的特有的亚基。据报道,只有PBAF复合物能调节细胞内核受体-配体依赖的转录活动。我们通过实验证实了,IFITM1的表达依赖于BAF200而并非BAF180。而且,我们发现IFNα对BAF200的调控并不STAT1的磷酸化,暗示IFNα诱导IFITM1的信号通路并不是JAK-STAT1途径。我们将pHBV1.31质粒转染HepG2细胞,并通过ELISA实验和荧光定量PCR,证明了IFNα的刺激可以显着降低HBeAg、HBsAg含量以及HBV DNA的拷贝数。这说明IFNα对HBV有抗病毒作用。此外,我们在HepG2和HepG2.2.15细胞内,通过干扰IFITM1基因的转录,证实了IFITM1介导了IFNα诱导的抗细胞生长作用。我们的实验还证明了,HBc能通过与BAF200的结合抑制IFNα诱导的IFITM1的表达,这可能是HBV免疫逃逸的机制之一,因而本研究为抗HBV复制和抗乙肝药物的研发提供了新思路。综上,我们探讨了关于HIV Nef蛋白和HBV HBc蛋白对宿主细胞的相互作用有机制,丰富和补充了对两种病毒感染及免疫逃逸机制的认识。
张涛,白皓,王令,路宏朝,杜伟立,刘欢,杨理凯[6]（2018）在《酵母双杂交筛选与小鼠维生素D受体互作的蛋白》文中认为通过酵母双杂交实验技术筛选小鼠VDR相互作用的蛋白质,评价不同蛋白与VDR的结合活性,以期获得基于互作影响雄性生殖能力基因。扩增小鼠VDR完整CDS序列,克隆至诱铒表达载体pGBKT7,经菌落PCR、DNA测序鉴定,获得重组载体pGBKT7-VDR。随后将重组载体转化至酿酒酵母AH109,并进行毒性和自激活检测;然后与含小鼠cDNA文库的Y187酵母杂交,获得阳性克隆,经HindⅢ酶切,测序分析VDR互作候选蛋白的核酸序列,再检测β-半乳糖苷酶活性,评价候选蛋白与VDR作用力的强弱。结果表明,从小鼠cDNA文库中获得12个与VDR互作的候选蛋白。初步检测到12个蛋白可能与VDR互作,其中3个蛋白因子可能与VDR结合并调控蛋白激酶磷酸化或去磷酸化以影响精子形成、发育和精子活力。
杜伟立[7]（2018）在《维生素D受体（VDR）调控雄性生殖相关基因表达及其互作蛋白筛选研究》文中研究指明维生素D受体（Vitamin D Receptor,VDR）作为核转录因子,广泛分布于多种组织细胞。VDR通过参与AKT、Wnt/β-Catenin及NF-κB等关键信号通路,调节体内钙盐离子平衡、抑制细胞增殖以及刺激细胞成熟等生理功能。VDR突变或缺失会引发睾丸、皮肤、骨骼、乳腺及前列腺等组织发生病变。本研究前期发现雄性VDR敲除小鼠生殖能力较低,推测VDR基因敲除影响雄性小鼠的生殖机能。因此,本研究首先采用RNA-seq技术检测6月龄野生鼠和VDR敲除鼠睾丸组织,初步分析野生鼠和敲除鼠差异表达基因,筛选与雄性生殖机能相关的差异基因,通过qPCR技术验证其表达水平;其次,从小鼠cDNA文库中,采用酵母双杂交技术筛选与VDR互作的蛋白因子,分析其生理功能;结合RNA-seq数据和酵母双杂交筛选结果,进一步揭示VDR通过直接和间接作用影响雄性小鼠生殖机能的分子机制,为解析VDR的生理功能提供基础理论数据。本研究主要获得实验结果如下:1.与野生鼠比较,VDR敲除鼠的肺、肾、皮肤、小肠、睾丸和胸腺等组织中VDR基因的转录表达水平显着增强,但Western-blot实验在VDR敲除鼠的皮肤、小肠、肾脏及睾丸等组织中未检测VDR表达。另外,本研究通过qPCR证明不同组织中受VDR调控的基因CYP24A1转录表达水平显着降低。所有数据说明本实验用鼠为全身性VDR基因敲除小鼠,VDR敲除后影响了其靶基因的表达,为后续实验提供了实验材料保证。2.分析睾丸转录组测序数据,在野生鼠与敲除鼠中共获得258个差异表达基因,其中上调基因122个,下调基因136个;其中KLK1、KLHL4、Angptl4和Car3等基因与雄性生殖相关,Azgp1和ApoF基因与脂代谢相关,最终通过qPCR进一步验证。3.通过酵母双杂交技术从小鼠cDNA文库中筛选获得12个与VDR互作的候选蛋白,其中AKAP10、FKBP51蛋白因子可能与VDR结合调控蛋白激酶磷酸化或去磷酸化以影响精子形成、发育和精子活力等;CYP2J5蛋白可能与VDR结合而调节睾酮激素代谢或介导其他蛋白因子与VDR结合影响细胞增殖、分化、迁移和运动,甚至脂代谢等相关功能。
王自文[8]（2016）在《柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4功能特性的初步研究》文中研究指明本文以对鸡危害最为严重的E.tenella为研究对象,对E.tenella新基因EtCDPK4特性、酶活性及在E.tenella发育过程中所执行的功能进行了研究和分析,为探讨E.tenella入侵宿主细胞的机制和研制高效、安全的抗球虫疫苗和新药物奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因的克隆及生物信息学分析利用3’-和5’-RACE技术获得EtCDPK4的全长cDNA序列,该序列大小是2 499 bp,包括5’-端185bp UTR序列,不含有CAAT和TATA序列;3’-端UTR序列,长511 bp,含Ploy（A）尾,没有典型AATAAA序列;ORF长1 803 bp,编码600个氨基酸,预测分子量68.3 kDa;对EtCDPK4编码蛋白的跨膜结构、疏水性、信号肽、理化性质、抗原位点和保守功能模块进行预测。结果显示:该基因编码蛋白没有信号肽和跨膜结构域,可能有16个抗原位点,推测具有良好抗原性。功能结构域分析EtCDPK4可能含2个N-端糖基化位点,3个N-端豆蔻酰化位点,7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,10个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点,5个EF-Hand模体Ca2+结合结构域。该基因编码蛋白具有CDPKs家族成员特征性保守结构域。利用qRT-PCR检测EtCDPK4在E.tenella 4个不同发育阶段转录水平差异,结果表明EtCDPK4在E.tenella孢子化卵囊和子孢子阶段均有转录,且子孢子阶段转录水平最高,与孢子化卵囊阶段相比差异极显着。2.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4重组蛋白表达及其特性的初步研究将EtCDPK4连接到原核表达载体pColdⅠ中,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经1 mmol/L IPTG诱导表达可溶性重组蛋白His-EtCDPK4（rEtCDPK4）。利用Ni柱亲和层析纯化rEtCDPK4,纯化的可溶性蛋白免疫新西兰大白兔获得兔抗重组蛋白多克隆抗体IgG,经western-blot分析表明rEtCDPK4具有良好的抗原性。利用IFA技术对EtCDPK4天然蛋白在球虫入侵DF-1细胞后不同发育阶段分布和定位进行分析,结果显示,该蛋白主要位于E.tenella子孢子和第二代裂殖子核前端膜表面;当子孢子入侵DF-1细胞12 h后,蛋白主要位于虫体顶端和带虫空泡膜上,此时表达量极速增加;子孢子入侵DF-1细胞36 h后,表达量下降,主要位于滋养体边缘;虫体刚发育至未成熟裂殖体时,蛋白表达量迅速增加,蛋白均匀分布于整个虫体,当虫体发育为中等阶段未成熟裂殖体时,表达量降低,发育为成熟裂殖体时,表达量又迅速上升,绿色荧光强度变强变亮。E.tenella子孢子入侵DF-1细胞体外抑制实验显示,使用兔抗rEtCDPK4多克隆抗体处理E.tenella子孢子后,与正常兔血清IgG对照组相比子孢子入侵DF-1活力显着减弱,且随着抗体处理子孢子浓度不断增大,入侵细胞能力逐渐降低,当抗体浓度为400μg/mL时,抑制率高达52%。通过免疫印迹检测E.tenella 4个发育阶段EtCDPK4翻译水平结果显示,EtCDPK4蛋白在E.tenella 4个不同发育阶段均有翻译,但在E.tenella第二代裂殖子中翻译水平最高。3.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4催化活性的初步研究通过构建体外磷酸化反应体系,探究了可溶性rEtCDPK4的酶催化活性特性、不同Ca2+浓度对rEtCDPK4酶活性大小影响以及rEtCDPK4酶活性特异性抑制剂的体外筛选和体内临床验证。结果表明,rEtCDPK4酶活性大小在0.87 nmol·min-1·ml-1左右;rEtCDPK4蛋白激酶活性正常发挥要完全依赖于酶活反应体系中Ca2+,当Ca2+浓度为0时,rEtCDPK4没有任何酶活性,不能够使底物短多肽磷酸化,随着酶活反应缓冲溶液中Ca2+浓度不断升高,可以明显看到rEtCDPK4的酶反应催化活性是不断的增强的;通过体外磷酸化酶活性反应的筛选和E.tenella子孢子体外入侵抑制实验的临床验证,筛选出4种效果较好的EtCDPK4酶催化活性抑制剂,分别是:W-7、H-7、H-89以及Myristoylated Protein Kinase Peptide Inhibitor。这4种抑制剂都能够在一定程度上有效抑制E.tenella子孢子入侵DF-1细胞的能力。4.柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4相互作用底物的筛选为了获得E.tenella子孢子或第二代裂殖子入侵阶段EtCDPK4的相互作用蛋白,构建了EtCDPK4的BD诱饵质粒,利用酵母双杂交技术将BD诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4筛选E.tenella子孢子或第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库获得与EtCDPK4相互作用的底物蛋白。将构建的BD诱饵蛋白进行自激活活性、细胞毒性及诱饵蛋白c-Myc-EtCDPK4是否在宿主酵母菌中表达进行检测。结果表明,构建的酵母BD诱饵蛋白没有自激活活性、细胞毒性且在酵母中能表达,因此可用于酵母双杂交筛选。通过使用BD诱饵蛋白对E.tenella子孢子或第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库的筛选,在SD/-Ade/-Trp/-His/-Leu/X-α-GAL缺陷性固体培养基上共获得88个蓝色酵母单克隆菌落,其中80个成功转化大肠杆菌TOP10进行测序;序列经BLAST分析后,得到10个可能与EtCDPK4相互作用的蛋白,包括未知基因9个,已知基因1个,未命名蛋白6个,4个已报道蛋白,即EtSerpin,Etm094G10,Etm109G06,EtGMP。利用Co-IP的方法验证了EtCDPK4和EtSerpin相互作用关系,结果表明EtCDPK4与EtSerpin存在相互作用关系。
李剑,饶凯锋,马梅,王子健[9]（2008）在《核受体超家族及其酵母双杂交检测技术》文中研究表明环境污染物的内分泌干扰问题近年来引起了极大的关注,大量研究证实:核受体是内分泌干扰的重要作用位点.论文在总结国内外相关研究基础上,对生物体内核受体超家族的组成、结构特征、作用模式进行了概括总结;对环境内分泌干扰物干扰核受体超家族最新研究进展给予了评述;对酵母双杂交检测技术的原理及其在核受体超家族和环境内分泌干扰效应研究中的应用进行了探讨,指出应将酵母双杂交检测技术与核受体超家族研究相结合,建立成组重组核受体基因双杂交酵母体系,应用于多种内分泌干扰效应和作用机制的系统研究.
郝坡[10]（2008）在《活细胞内筛选地塞米松衍生物作用靶蛋白的研究》文中研究指明第一部分糖皮质激素受体结合域诱饵表达载体的构建和鉴定目的构建糖皮质激素受体α配体结合域（GRα-LBD）的诱饵表达载体,为小分子配体酵母三杂交系统的建立奠定基础。方法RT-PCR扩增K562细胞的GRα-LBD,克隆入诱饵载体pGBKT7中,测序正确后,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-GRα-LBD转化到酵母AH109细胞中,提取酵母蛋白,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况。同时检测诱饵蛋白的毒性、渗漏和自激活作用。结果成功扩增了GRα-LBD,并分别成功克隆到pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性、渗漏和自激活作用,Western blot分析也证实了酵母细胞表达诱饵蛋白。结论成功构建了GRα-LBD酵母诱饵表达载体,为建立小分子配体酵母三杂交系统奠定了基础。第二部分人K562细胞cDNA文库的扩增、纯化、鉴定和酵母细胞转化目的对预转化到大肠DH5α中的人K562细胞cDNA文库进行扩增,纯化和鉴定并将文库质粒转化酵母为下一步的靶蛋白的筛选做准备。方法对K562细胞cDNA文库进行扩增,提取文库质粒,将文库质粒转化酵母Y187细胞,并用PCR和酶切鉴定转化结果。结果成功的扩增人K562细胞cDNA文库,并验证了文库的多样性,将文库质粒成功转化酵母Y187细胞。结论K562细胞cDNA文库的成功扩增,纯化,鉴定,为进一步的文库筛选奠定了基础。第三部分酵母三杂交技术筛选地塞米松衍生物作用的靶蛋白目的通过酵母三杂交技术在人K562细胞cDNA中筛选地塞米松衍生物作用的靶蛋白。方法通过将转化有诱饵质粒pGBKT7-GRα-LBD的酵母AH109细胞、转化有文库质粒的酵母Y187细胞和终浓度为0.4μg/ml的地塞米松衍生物三种物质放到一起交配后,将交配后的细胞铺于SD/-Trp/-Leu/-His的缺陷培养基上,然后将SD/-Trp/-Leu/-His培养基上生长的克隆挑取到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade /X-α-gal的缺陷培养基上进行营养缺陷筛选,重复挑取三次后仍为蓝色的克隆可能是阳性克隆,然后提取酵母质粒并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取大肠杆菌DH5α中的质粒,并通过对所提取的所有文库质粒进行PCR扩增和对PCR产物的单酶切分析,将文库质粒归类,归类后从每一类中随机选择一个代表,通过酵母回转实验进行验证。酵母回转实验阳性的质粒送上海生工测序,通过对测序结果的比对和进一步的分析来确定所筛选到的靶蛋白的特征。结果共测序43个,其中有6个是重复的,实际上我们共筛选到37个不同的蛋白,经过回转实验验证,证明20个是阳性克隆,其中一个是新蛋白。从中选择6个进行一对一的酵母交配实验后,发现DDX28和RanBP9/RanBPM是与地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白。结论本研究我们筛选到了2个与地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白,分别是DDX28和RanBP9/RanBPM。这将为地塞米松衍生物抗肿瘤的分子机制研究提供线索。
二、糖皮质激素受体配体结合区的克隆及酵母双杂交诱饵载体的构建和表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、糖皮质激素受体配体结合区的克隆及酵母双杂交诱饵载体的构建和表达（论文提纲范文）
（1）E种肠道病毒HY12株VP1宿主互作蛋白的筛选及鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 肠道病毒研究进展 |
| 2 酵母双杂交系统研究进展 |
| 第二章 酵母双杂交系统筛选HY12株VP1的宿主互作蛋白 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 HY12株VP1与PAK1和ACTG1 相互作用的验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）烟草硝酸还原酶基因NIA启动子的克隆及其互作蛋白的筛选（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 烟草氮素研究进展 |
| 1.1.1 氮素对烟草生长发育的影响 |
| 1.1.2 氮素同化过程 |
| 1.1.3 硝酸还原酶的研究进展 |
| 1.2 启动子 |
| 1.2.1 启动子的结构与类型 |
| 1.2.2 启动子研究方法 |
| 1.3 转录因子 |
| 1.3.1 转录因子的结构 |
| 1.3.2 转录因子的功能 |
| 1.3.3 转录因子研究方法 |
| 1.4 酵母单杂交 |
| 1.4.1 酵母单杂交的原理 |
| 1.4.2 酵母单杂交的主要步骤 |
| 1.4.3 酵母单杂交的优缺点 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 试验材料及仪器 |
| 3.2 烟草基因组模板的获得 |
| 3.3 NIA1、NIA2基因启动子片段的克隆 |
| 3.4 诱饵序列的获得 |
| 3.5 启动子重组载体构建及植株转化 |
| 3.6 GUS活性分析及酶联免疫反应定量分析 |
| 3.7 运用SMART~（TM）技术构建烟草K326品种cDNA文库 |
| 3.8 诱饵载体的构建和诱饵报告菌株的获得 |
| 3.9 报告基因本底表达水平的测定 |
| 3.10 酵母单杂交文库的构建和初步筛选 |
| 3.11 阳性互作的确认和质粒的提取鉴定 |
| 3.12 互作蛋白的生物信息学分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 NIA1与NIA2基因启动子片段的克隆 |
| 4.2 NIA1及NIA2基因启动子序列分析 |
| 4.2.1 NIA1基因启动子序列分析 |
| 4.2.2 NIA2基因启动子序列分析 |
| 4.3 GUS组织染色及定量分析结果 |
| 4.4 诱饵报告菌株的PCR鉴定 |
| 4.5 诱饵报告菌株的AbA背景抑制浓度测定 |
| 4.6 烟草K326 cDNA文库构建结果 |
| 4.7 酵母单杂交文库的初步筛选结果 |
| 4.8 酵母质粒的提取与鉴定 |
| 4.9 NIA启动子片段结合蛋白的生物信息学分析 |
| 4.9.1 NIA1启动子片段筛选阳性克隆生物信息学分析 |
| 4.9.2 NIA2启动子片段筛选阳性克隆生物信息学分析 |
| 4.9.3 4×NRE2诱饵片段筛选阳性克隆生物信息学分析 |
| 4.9.4 阳性克隆三维结构同源建模及进化树的构建 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 所克隆的NIA1与NIA2上游片段有启动子基本功能且功能强弱受NRE2元件影响 |
| 5.2 三个诱饵片段均筛选到多个阳性克隆 |
| 5.3 筛选的部分阳性克隆被预测有转录因子功能 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
（3）菲律宾蛤仔雌激素相关受体基因克隆及互作蛋白筛选（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 菲律宾蛤仔ERR基因全长克隆 |
| 1.3 菲律宾蛤仔ERR序列的生物信息学分析 |
| 1.4 组织特异性分析 |
| 1.5 pGBKT7-ERR诱饵质粒构建及其自激活活性与细胞毒性检验 |
| 1.6 pGBKT7-ERR诱饵互作蛋白筛选 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 rpERR的序列分析 |
| 2.2 rpERR同源性分析与进化分析 |
| 2.3 组织特异性表达分析 |
| 2.4 ERR 相互作用蛋白的筛选 |
| 3 讨论 |
（4）柔嫩艾美耳球虫侵入部位特异性关键分子及其受体研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡球虫病及鸡球虫侵入机制研究 |
| 1 鸡球虫病 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 防治 |
| 1.3 鸡球虫的侵入部位特异性及其侵入机制 |
| 2 微线蛋白(MICs)及其在顶复门原虫侵入过程中的作用 |
| 2.1 微线蛋白(MICs)概述 |
| 2.2 微线蛋白(MICs)分子结构域及其功能 |
| 2.3 微线蛋白(MICs)在鸡球虫及其他顶复门原虫侵入过程中的作用 |
| 参考文献 |
| 第二章 蛋白质相互作用的研究技术 |
| 1 检测未知相互作用蛋白方法 |
| 2 检测已知相互作用蛋白方法 |
| 3 蛋白质相互作用技术的应用 |
| 参考文献 |
| 第三章 E.tenella微线蛋白与鸡不同肠段结合能力的观察 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1的扩增及序列分析 |
| 2.2 EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1表达载体的构建 |
| 2.3 重组蛋白EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1的表达 |
| 2.4 微线蛋白EtMIC3、EtMIC2、EtAMA1与不同肠段的结合能力分析 |
| 2.5 EtMIC3抗血清对E.tenella子孢子侵入阻断作用的观察 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡盲肠上皮细胞酵母双杂交系统的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡盲肠细胞RNA检测 |
| 2.2 cDNA的合成与均一化 |
| 2.3 鸡盲肠上皮细胞cDNA文库质量的评价 |
| 2.4 重组诱饵质粒pDHB1-EtMIC3的构建与鉴定 |
| 2.5 诱饵质粒pDHB1-EtMIC3在NMY51酵母菌中的表达情况 |
| 2.6 酵母双杂交功能性检测 |
| 2.7 筛选3-AT的最适浓度 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 EtMIC3盲肠受体分子的筛选及其验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 酵母双杂交初次筛选 |
| 2.2 返回性验证 |
| 2.3 返回验证阳性捕获质粒中插入基因的鉴定 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.5 受体分子的扩增及序列分析 |
| 2.6 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.7 受体蛋白的表达、纯化及复性 |
| 2.8 pGEX-6p-1-EtMIC3载体的构建与表达 |
| 2.9 受体分子的GST-pulldown验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 EtMIC3受体分子在鸡不同肠段的分布及其抗血清对E.tenella侵入阻断作用分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 受体蛋白在不同肠段的分布 |
| 2.2 受体分子抗血清对E.tenella侵入阻断作用分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
（5）HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 本研究的创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 人类免疫缺陷病毒Nef蛋白调控Fas凋亡通路的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HIV及调控蛋白Nef |
| 1.1.1 HIV基因组 |
| 1.1.2 Nef的特点 |
| 1.1.3 Nef对表面受体的调控 |
| 1.1.4 Nef对信号通路的调控 |
| 1.2 细胞凋亡的信号途径 |
| 1.2.1 死亡受体介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.2 内质网介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.3 线粒体介导的凋亡信号通路 |
| 1.3 细胞色素B与细胞凋亡 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.2.1 菌株、细胞与动物 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 2.3 溶液的配制 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 酵母双杂交筛选 |
| 3.1.1 测定文库的滴度 |
| 3.1.2 扩增酵母文库 |
| 3.1.3 酵母菌的活化 |
| 3.1.4 小量转化诱饵蛋白质粒 |
| 3.1.5 文库质粒的转化 |
| 3.1.6 诱饵蛋白自身激活检测 |
| 3.1.8 酵母质粒的提取 |
| 3.1.9 DH5α感受态制备及质粒转化 |
| 3.2 重组质粒的构建 |
| 3.2.1 质粒的小量提取 |
| 3.2.2 限制性酶消化 |
| 3.3.3 用试剂盒回收DNA |
| 3.3.4 DNA片段和载体的连接 |
| 3.3 细胞培养和转染 |
| 3.3.1 细胞传代 |
| 3.3.2 细胞的转染 |
| 3.4 凋亡检测 |
| 3.5 多克隆抗体的制备 |
| 3.5.1 Cyto b免疫抗原的表达纯化 |
| 3.5.2 多克隆抗体的制备 |
| 3.6 线粒体的纯化 |
| 3.7 HIV-1BA-L假病毒的制备 |
| 3.8 免疫共沉淀实验 |
| 3.9 Western Blot实验 |
| 4 研究结果 |
| 4.1 Nef能直接与Cyto b结合 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 Cyto b与 Nef能产生体内的相互作用 |
| 4.2 胞质中的Cyto b参与了Fas凋亡通路 |
| 4.2.1 Cyto b免疫抗原的制备 |
| 4.2.2 Fas刺激后引起Cyto b的切割和C端从线粒体的释放 |
| 4.3 Nef抑制了Fas介导的细胞凋亡 |
| 4.4 Fas凋亡信号诱导Nef与 Cyto b的结合 |
| 4.5 Nef抑制了Cyto b介导的Fas凋亡途径 |
| 4.6 Nef是 Cyto b介导的Fas凋亡通路的抑制子 |
| 4.7 Nef也参与抑制了Cyto c介导的Fas凋亡途径 |
| 4.8 HIV感染细胞后,FasL诱生Cyto b的释放有所增强 |
| 5 结果讨论 |
| 第二章 乙型肝炎病毒核心抗原HBc抑制干扰素α诱导IFITM1 表达的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HBV及核心蛋白HBc |
| 1.1.1 HBV基因组 |
| 1.1.2 HBV与肝癌 |
| 1.1.3 HBc及其功能 |
| 1.2 IFN及其诱导的信号通路 |
| 1.2.1 干扰素的分类 |
| 1.2.2 干扰素的生物学作用 |
| 1.2.3 IFN诱导的信号通路 |
| 1.3 SWI/SNF家族 |
| 1.3.1 SWI/SNF的功能 |
| 1.3.2 BAF200 |
| 1.4 IFITM家族 |
| 1.4.1 IFITM家族的特点 |
| 1.4.2 IFITM1 及其功能 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.1.1 菌株与细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 RNA干扰试验 |
| 3.2 RT-PCR |
| 3.2.1 RNA提取所用器具的处理 |
| 3.2.2 细胞总m RNA的提取 |
| 3.2.3 RNA电泳检测 |
| 3.2.4 RNA的反转录 |
| 3.3 细胞活力检测 |
| 3.4 ELISA 实验 |
| 3.5 荧光定量PCR |
| 4 研究结果 |
| 4.1 HBc与 BAF200 的相互作用 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 HBc与 BAF200 存在体内的相互作用 |
| 4.2 BAF200 调控IFNα诱导的IFITM1 的表达 |
| 4.3 HBc通过与BAF200 相互作用抑制IFITM1 的转录 |
| 4.4 HBc与 BAF180 竞争性结合BAF200,破坏PBAF复合体的形成,进而削弱了BAF200对IFITM1 的表达调控 |
| 4.5 IFNα的诱导不影响STAT1 的磷酸化水平 |
| 4.6 HBc削弱BAF200 对细胞活性的影响 |
| 4.6.1 BAF200 通过IFITM1 对细胞活力进行影响 |
| 4.6.2 HBc可以削弱BAF200 对细胞活力的影响 |
| 4.7 IFNα诱导下BAF200和HBc对 HBV复制水平的影响 |
| 5 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的与学位论文相关的科研成果 |
| 致谢 |
（6）酵母双杂交筛选与小鼠维生素D受体互作的蛋白（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 VDR诱饵表达载体的构建 |
| 1.2.3 VDR表达及自激活检测 |
| 1.2.4 重组诱饵酵母与小鼠cDNA文库Y187酵母杂交 |
| 1.2.5 候选酵母菌株的β-半乳糖苷酶活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 VDR诱饵表达载体 (pGBKT7-VDR) 的构建 |
| 2.2 VDR诱饵蛋白表达检测及自激活验证 |
| 2.3 删除转录激活域后VDR诱饵表达载体的构建及自激活验证 |
| 2.4 酵母双杂交效率验证及阳性克隆筛选 |
| 2.5 候选阳性克隆鉴定分析 |
| 2.6 β-半乳糖苷酶活性检测 |
| 3 讨论 |
（7）维生素D受体（VDR）调控雄性生殖相关基因表达及其互作蛋白筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 维生素D受体 |
| 1.1.1 VDR结构及功能 |
| 1.1.2 VDR基因组及非基因组效应 |
| 1.1.3 VDR相互作用蛋白因子效应 |
| 1.1.4 VDR的生理学功能及相关疾病 |
| 1.2 转录组分析研究进展 |
| 1.3 研究的目的意义 |
| 第2章 VDR及相关基因在VDR敲除鼠不同组织的表达分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 敲除鼠表型观察 |
| 2.2.2 VDR及相关基因表达鉴定 |
| 2.2.3 蛋白水平检测敲除鼠VDR表达 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 敲除鼠表型分析 |
| 2.3.2 WesternBlot检测VDR在不同组织的表达差异 |
| 2.3.3 VDR敲除鼠VDR基因表达分析 |
| 2.3.4 VDR敲除鼠中维生素D代谢相关基因表达水平检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 VDR敲除鼠睾丸组织转录组测序分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验引物 |
| 3.2 实验步骤 |
| 3.2.1 小鼠睾丸组织总RNA提取 |
| 3.2.2 小鼠睾丸组织转录组测序 |
| 3.2.3 基因表达谱分析 |
| 3.2.4 实时荧光PCR验证基因表达水平 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 测序质量评估 |
| 3.3.2 基因组组装及注解 |
| 3.3.3 差异表达基因筛选 |
| 3.3.4 GO富集分析 |
| 3.3.5 KEGG功能富集分析 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR验证差异表达基因 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 酵母双杂交筛选VDR互作蛋白 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物、菌株及质粒 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 VDR诱饵表达载体(pGBKT7-VDR)的构建与鉴定 |
| 4.2.2 WesternBlot检测VDR基因在酿酒酵母AH109中表达 |
| 4.2.3 重组表达载体pGBKT7-VDR表达VDR诱饵蛋白自激活检测 |
| 4.2.4 删除转录激活域后VDR诱饵表达载体构建与鉴定 |
| 4.2.5 VDR互作蛋白筛选 |
| 4.2.6 β-阳性克隆测定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 VDR诱饵表达载体(pGBKT7-VDR)的构建 |
| 4.3.2 VDR诱饵蛋白表达检测 |
| 4.3.3 VDR诱饵蛋白自激活验证 |
| 4.3.4 删除转录激活域后VDR诱饵表达载体的构建及自激活验证 |
| 4.3.5 酵母双杂交效率验证及阳性克隆筛选 |
| 4.3.6 VDR互作蛋白鉴定 |
| 4.3.7 阳性克隆鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4功能特性的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 钙调素（CaM） |
| 1.1.1 钙调素的结构和功能 |
| 1.1.2 钙调素在生物体中的分布以及作用机制 |
| 1.1.3 钙调素在寄生虫中所起的作用 |
| 1.2 钙网织蛋白（CRT） |
| 1.2.1 钙网织蛋白的结构和功能 |
| 1.2.2 钙网织蛋白在细胞中的分布以及作用机制 |
| 1.2.3 钙网织蛋白在寄生虫中所起的作用 |
| 1.3 钙依赖蛋白激酶（CDPKS） |
| 1.3.1 钙依赖蛋白激酶的结构和功能 |
| 1.3.2 钙依赖蛋白激酶在生物体中的分布以及作用机制 |
| 1.3.3 钙依赖蛋白激酶在寄生虫中所起的作用 |
| 1.4 膜联蛋白（Annexin） |
| 1.4.1 膜联蛋白的结构与功能 |
| 1.4.2 膜联蛋白在生物体中的分布以及作用机制 |
| 1.4.3 膜联蛋白在寄生虫中所起的作用 |
| 1.5 展望 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 实验所需主要试剂 |
| 2.2.4 主要实验所需仪器 |
| 2.2.5 实验所需试剂配制方法 |
| 2.2.6 柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段虫体的收集与纯化 |
| 2.2.7 柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA的抽提 |
| 2.2.8 柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA末端快速扩增法（RACE）模板的制备 |
| 2.2.9 目的基因cDNA 5’-末端和 3’-末端序列的扩增 |
| 2.2.10 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4蛋白基因的生物信息学分析 |
| 2.2.11 反转录合成与制备柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段cDNA模板 |
| 2.2.12 柔嫩艾美耳球虫目的基因EtCDPK4完整开放阅读框的PCR扩增 |
| 2.2.13 钙依赖蛋白激酶4在柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段转录水平的差异分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 纯化和收集柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的虫体 |
| 2.3.2 柔嫩艾美耳球虫虫体总RNA的提取 |
| 2.3.3 柔嫩艾美耳球虫EtCDPK4基因的克隆 |
| 2.3.4 柔嫩艾美耳球虫EtCDPK4基因的生物信息学预测和分析 |
| 2.3.5 柔嫩艾美耳球虫EtCDPK4在4个不同发育阶段的转录水平差异分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4蛋白表达及其特性的初步研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验寄生虫虫株、载体和细胞 |
| 3.2.3 实验所需试剂 |
| 3.2.4 实验所需主要仪器设备 |
| 3.2.5 主要实验所需试剂的配制方法 |
| 3.2.6 重组表达系统pColdⅠ-EtCDPK4和pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4构建与鉴定 |
| 3.2.7 重组表达质粒pColdⅠ-EtCDPK4和pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4的表达 |
| 3.2.8 原核表达系统pColdⅠ-EtCDPK4表达重组蛋白的纯化 |
| 3.2.9 rEtCDPK4重组蛋白多克隆抗体的制备与抗体的纯化 |
| 3.2.10 重组蛋白rEtCDPK4的免疫原性和反应原性检测分析 |
| 3.2.11 DF-1 细胞的复苏与传代培养 |
| 3.2.12 EtCDPK4在柔嫩艾美耳球虫入侵DF-1 不同发育阶段的分布与定位分析 |
| 3.2.13 间接免疫荧光鉴定重组真核表达质粒pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4在DF-1中的表达情况 |
| 3.2.14 兔抗rEtCDPK4重组蛋白多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞的体外抑制分析 |
| 3.2.15 EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球虫4个不同的发育阶段中蛋白质翻译水平的差异分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 EtCDPK4原核表达重组质粒的构建 |
| 3.3.2 EtCDPK4重组蛋白的诱导表达及其蛋白纯化 |
| 3.3.3 兔抗rEtCDPK4多克隆抗体的制备 |
| 3.3.4 rEtCDPK4重组蛋白免疫原性和反应原性的分析 |
| 3.3.5 柔嫩艾美耳球虫虫体CDPK4天然蛋白的间接免疫荧光定位 |
| 3.3.6 间接免疫荧光鉴定真核重组表达质粒pcDNA3.1-FLAG-EtCDPK4在DF-1细胞中的表达情况 |
| 3.3.7 兔抗rEtCDPK4多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1 细胞的体外抑制实验 |
| 3.3.8 柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段中EtCDPK4蛋白翻译的分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4催化活性初步研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验寄生虫虫株、细胞 |
| 4.2.2 实验所需试剂 |
| 4.2.3 实验所需主要仪器设备 |
| 4.2.4 实验所需试剂的配制方法 |
| 4.2.5 rEtCDPK4重组蛋白酶活性的测定 |
| 4.2.6 不同Ca~(2+)浓度对rEtCDPK4酶催化活性大小的影响 |
| 4.2.7 rEtCDPK4特异性抑制剂的筛选和显着性分析 |
| 4.2.8 筛选出的rEtCDPK4酶活性抑制剂抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞的体外入侵抑制试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 rEtCDPK4酶活性的测定 |
| 4.3.2 不同Ca~(2+)浓度对rEtCDPK4酶活性大小的影响 |
| 4.3.3 rEtCDPK4特异性抑制剂的筛选和显着性分析 |
| 4.3.4 筛选出的rEtCDPK4酶活性特异性抑制剂抑制子孢子对DF-1 细胞入侵试验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4相互作用底物筛选 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验所需酵母菌株、载体和细胞 |
| 5.2.2 酵母双杂交筛选cDNA文库 |
| 5.2.3 实验所需主要试剂 |
| 5.2.4 实验所需主要仪器 |
| 5.2.5 实验所需试剂的配制 |
| 5.2.6 酵母诱饵Et CDPK4质粒的构建 |
| 5.2.7 酵母菌株Y2HGold感受态细胞的制备 |
| 5.2.8 BD诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4转化入酵母Y2HGold感受态细胞 |
| 5.2.9 重组酵母诱饵菌的PCR鉴定 |
| 5.2.10 诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold酵母菌报告基因自激活活性的检测 |
| 5.2.11 诱饵pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold宿主酵母菌细胞毒性的检测 |
| 5.2.12 诱饵pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold酵母宿主菌中蛋白表达情况的检测 |
| 5.2.13 使用诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4靶菌株从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子酵母双杂交cDNA文库中筛选相互作用蛋白 |
| 5.2.14 使用免疫共沉淀（Co-IP）验证其中一个筛选到的阳性克隆EtSerpin |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 BD诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4的构建 |
| 5.3.2 诱饵重组质粒pGBKT7-EtCDPK4转化Y2HGold酵母菌的PCR鉴定 |
| 5.3.3 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold酵母菌报告基因自激活活性的检测 |
| 5.3.4 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4对Y2HGold宿主酵母菌细胞毒性的检测 |
| 5.3.5 重组诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold宿主酵母菌中蛋白表达情况的检测 |
| 5.3.6 酵母双杂交筛选到的阳性质粒测序分析结果和杂交效率分析 |
| 5.3.7 Co-IP验证EtCDPK4与阳性克隆EtSerpin相互作用关系 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）核受体超家族及其酵母双杂交检测技术（论文提纲范文）
| 1 核受体超家族 |
| 1.1 核受体超家族的定义 |
| 1.2 核受体的结构特征 |
| 1.3 核受体与激素相互作用 |
| 1.4 核受体的分类 |
| 2 核受体超家族与环境内分泌干扰物 |
| 2.1 雌激素受体 |
| 2.2 雄激素受体 |
| 2.3 甲状腺激素受体 |
| 2.4 维甲酸受体 |
| 2.5 其他受体 |
| 2.6 研究热点与发展趋势 |
| 2.6.1 成组核受体研究方法 |
| 2.6.2 内分泌干扰物诱导/抑制效应研究 |
| 2.6.3 内分泌干扰物代谢后作用于核受体研究 |
| 3 酵母双杂交技术 |
| 3.1 酵母双杂交技术的原理 |
| 3.2 酵母双杂交技术的应用 |
| 3.3 酵母双杂交载体与酵母宿主菌系统 |
| 3.4 在核受体超家族研究中的应用 |
| 3.5 在环境内分泌干扰物研究领域的应用 |
| 3.5.1 重组雌激素受体基因双杂交酵母 |
| 3.5.2 重组雄激素受体基因双杂交酵母 |
| 3.5.3 重组甲状腺激素受体基因双杂交酵母 |
| 3.5.4 重组维甲酸X受体基因双杂交酵母 |
| 3.5.5 重组雌激素受体相关受体基因双杂交酵母 |
| 3.5.6 成组重组核受体基因双杂交酵母用于内分泌干扰物作用机理研究 |
| 3.5.7 重组核受体基因双杂交酵母在环境污染监测中的应用 |
| 4 展望 |
（10）活细胞内筛选地塞米松衍生物作用靶蛋白的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 本课题的技术路线 |
| 第一部分 糖皮质激素受体结合域诱饵表达载体的构建和鉴定 |
| 1. 实验材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 人K562 细胞CDNA 文库的扩增、纯化、鉴定和酵母细胞转化 |
| 1. 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 酵母三杂交系统筛选地塞米松衍生物作用的靶蛋白 |
| 1. 实验材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
四、糖皮质激素受体配体结合区的克隆及酵母双杂交诱饵载体的构建和表达（论文参考文献）
- [1]E种肠道病毒HY12株VP1宿主互作蛋白的筛选及鉴定[D]. 郑博伟. 吉林大学, 2020
- [2]烟草硝酸还原酶基因NIA启动子的克隆及其互作蛋白的筛选[D]. 周炎. 河南农业大学, 2020(06)
- [3]菲律宾蛤仔雌激素相关受体基因克隆及互作蛋白筛选[J]. 刘佩佩,苗晶晶,刘力铷,姚琳琳,潘鲁青. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2019(S1)
- [4]柔嫩艾美耳球虫侵入部位特异性关键分子及其受体研究[D]. 李文宇. 南京农业大学, 2019
- [5]HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究[D]. 李彤亚. 武汉大学, 2019(06)
- [6]酵母双杂交筛选与小鼠维生素D受体互作的蛋白[J]. 张涛,白皓,王令,路宏朝,杜伟立,刘欢,杨理凯. 西北农业学报, 2018(09)
- [7]维生素D受体（VDR）调控雄性生殖相关基因表达及其互作蛋白筛选研究[D]. 杜伟立. 陕西理工大学, 2018(07)
- [8]柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4功能特性的初步研究[D]. 王自文. 中国农业科学院, 2016(02)
- [9]核受体超家族及其酵母双杂交检测技术[J]. 李剑,饶凯锋,马梅,王子健. 生态毒理学报, 2008(06)
- [10]活细胞内筛选地塞米松衍生物作用靶蛋白的研究[D]. 郝坡. 重庆医科大学, 2008(01)