一、Expression and characterization of mouse lactate dehydrogenase subunit C in Escherichia coli.（论文文献综述）
李尧慧[1]（2021）在《近平滑假丝酵母（S）—羰基还原酶不同聚合体的结构与功能及催化机制》文中认为近平滑假丝酵母来源的（S）-羰基还原酶同工酶（SCR、SCR1、SCR2和SCR3）具有anti-prelog特性,能催化潜手性酮生成（S）-手性醇。这几种同工酶属于短链脱氢酶/还原酶（SDRs）家族,在溶液中多以同源四聚体或者同源二聚体存在,极少数以单体形式存在。酶聚合体形态的变化会引起其催化功能的变化,但目前酶聚合体形态的变化与酶分子催化机制的关系鲜有报道。因此研究SDRs酶类的不同聚合体结构与功能之间的关系,解析其分子识别催化机制,对指导制备多酶体手性催化剂具有重要的理论意义。本论文以近平滑假丝酵母Candida parapsilosis CCTCC M203011来源的（S）-羰基还原酶系（SCR、SCR1、SCR2和SCR3）为研究对象,结合酶动力学、X-射线衍射技术、冷冻电镜和生物信息学技术,阐明了SDRs对称型四聚体界面是维持酶活性口袋结构的必要条件;并基于（S）-羰基还原酶的不同聚合体状态的酶动力学差异,揭示了其四级结构与功能的关系;利用光谱学手段,探索了（S）-羰基还原酶四聚体界面的变化对酶活力的调控的分子机制,为酶分子的改造提供了一个新的思路,为多酶体催化的设计作了理论铺垫。论文的主要研究结果如下:（1）构建了SCR2的近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC M203011同源表达体系,实现了（S）-1-苯基-1,2-乙二醇（（S）-PED）的高效制备。通过构建C.parapsilosis胞内表达SCR2的重组质粒p CP-his6-scr2,将其转化到C.parapsilosis感受态细胞中,获得重组菌C.parapsilosis/p CP-his6-scr2。以重组菌全细胞为催化剂,在最优转化条件p H 5.5和35℃下,在1 m L体系中高效催化底物2-羟基苯乙酮,合成产物（S）-PED,产物的光学纯度和得率均高达99%以上。在预制备规模（500 m L）的体系中,（S）-PED的产物光学纯度达99%,最终分离得率约为70%。（2）实现了SCR2在C.parapsilosis的分泌表达,发现并验证了SCR、SCR2和SCR3之间存在相互作用,将这几种同工酶在大肠杆菌中共表达和纯化,成功获得了电泳纯的异源聚合体蛋白SCR2-SCR。通过在SCR2的N端添加假丝酵母来源信号肽和前导肽sy,构建了近平滑假丝酵母分泌表达SCR2的重组菌C.parapsilosis/p CP-sy-his-scr2,其胞外发酵上清的纯化样品被用于MALDI-TOF-MS分析后,发现（S）-羰基还原酶SCR、SCR1、SCR2和SCR3的特征性肽段共存于的纯化样品中,进一步的Pull-down实验证明SCR、SCR2和SCR3之间存在相互作用。构建strep标签融合的SCR和histidine标签融合的SCR2,共转化大肠杆菌后,对重组蛋白进行纯化,获得电泳纯的异源聚合体蛋白SCR2-SCR。（3）揭示了寡聚相互作用对SDRs酶活性口袋结构维持的必要性。通过X-射线衍射技术,解析了同源聚合体SCR、SCR/NADPH、SCR2/NADPH、SCR2/NADP和异源聚合体SCR2-SCR/NADPH的晶体结构,发现其聚合体形态均为保守的对称型四聚体,而C末端带有组氨酸标签的SCR2-his6的晶体结构（PDB ID 3CTM）为半解离状态的四聚体（不对称型四聚体）。全原子重叠比较发现对称型四聚体和不对称型四聚体的活性口袋附近的四聚体界面螺旋（T122-D144和S172-L197）的构象有明显差异。结合酶动力学数据、晶体结构数据以及冷冻电镜结构数据,证明了SCR对称型四聚体界面的寡聚相互作用对维持酶活性口袋结构的必要性,并通过数据挖掘和结构分析证实了该规律适用于SDRs家族的其他成员。（4）理性设计获得二聚体形态的蛋白SCR-his6/A193E,揭示了SCR聚合体形态的变化对酶动力学的影响。利用尺寸排阻与多角度静态光散射实验证明SCR-his6在p H 6.0的酶催化反应的条件下约76%被解离为二聚体,约24%保留为四聚体形态。通过晶体结构分析,理性改造SCR-his6和SCR2-his6,获得在溶液中以二聚体形态存在的突变体SCR-his6/A193E、SCR2-his6/A193E和SCR2/A193E。酶活力测试表明二聚体蛋白SCR-his6/A193E、SCR2-his6/A193E和SCR2/A193E对底物2-羟基苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯完全失活,因此推断SCR-his6在反应过程中由四聚体解离为二聚体是酶活力降低的主要原因。（5）探索并论证了对称型四聚体SCR和二聚体SCR-his6/A193E酶活差异的根本原因及其四聚体界面调控的分子机制。利用稳态内源性荧光光谱,分析SCR和SCR-his6/A193E在溶液中的色氨酸差向异性的变化,进而计算对称型四聚体SCR和二聚体SCR-his6/A193E与辅酶NADP以及底物4-氯乙酰乙酸乙酯的解离常数（KD）。二聚体SCR-his6/A193E和辅酶NADP的KD约为SCR的2倍,而SCR-his6/A193E/NADP与底物4-氯乙酰乙酸乙酯的KD约为SCR的8倍。因此,SCR-his6/A193E不仅可以与辅酶和底物结合,而且它们与辅酶和底物的结合能力与SCR相比无明显差异。通过Perrin plot图像可知蛋白差向异性的变化主要来自蛋白局部结构的变化。通过解析SCR/NADP/4-氯乙酰乙酸乙酯的晶体结构,结合不同聚合体形态结构的差异构象区域（T122-D144和S172-L197）和Perrin plot图像中荧光差向异性的变化,论证了不同聚合体形态的表观差向异性主要来自W123和W137。蛋白四聚体界面通过调节W137的旋转扩散系数,进而调节W123的旋转扩散系数,影响活性口袋的构象动态变化,最终影响酶活力。
王凯凯[2]（2021）在《代谢工程改造大肠杆菌和凝结芽孢杆菌生产生物活性物质》文中研究表明生物活性物质,如N-乙酰氨基葡萄糖等,具有消炎、抗氧化作用,且在人体免疫调节方面也发挥着重要的作用。目前这些物质大多是利用化学方法进行生产,但该方法具有生产原料受限、污染环境等缺陷,难以满足生产需求。随着合成生物学的迅猛发展,使得利用宿主固有的遗传特性,通过代谢工程改造获得高产生物活性物质的工程菌株成为可能。大肠杆菌和凝结芽孢杆菌作为常见的原核微生物,具有代谢周期短、生长速度快、易于高密度发酵等诸多优势,是工业生产生物活性物质的理想底盘宿主。但由于凝结芽孢杆菌转化方法效率较低以及大肠杆菌部分基因的编辑效率也相对较低,使得对它们的代谢改造受到了一定限制。因此,本研究对大肠杆菌的基因编辑方法进行了优化,构建了产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌株并进行了摇瓶发酵,同时优化了凝结芽孢杆菌的电转化方法并建立了接合转移方法,基于建立的转化方法对其代谢改造方法进行了探索。结果如下:优化大肠杆菌CRISPR-Cas9系统的Cas9蛋白和同源臂-gRNA之间的比例,提高了大肠杆菌MG1655（DE3）的基因编辑效率。单基因敲除效率最高可达100%,单基因替换效率最高可达94%。同时对pNW33N质粒、p JZ23-1质粒（携带有CRISPR-Cas9系统）转化凝结芽孢杆菌时的培养条件、抗生素浓度、电转化参数等关键因素进行了研究。结果表明,当筛选平板的氯霉素浓度为7μg/m L时,电转化效率最高可达2.3×105cfu/μg,接合转移方法转化效率最高可达2.2×103 cfu/m L。基于建立和优化的凝结芽孢杆菌的转化方法,导入CRISPR-Cas9系统并进行基因编辑,结果表明除异丙基苹果酸合酶基因（Isopropylmalate synthase,leuA）在编辑后出现了野生型和突变型混合菌株外,其余基因敲除的尝试均未成功。在大肠杆菌MG1655（DE3）的代谢改造中,基于优化的CRISPR-Cas9系统敲除代谢关键基因阻断了糖酵解途径（EMP途径）和磷酸戊糖途径（PPP途径）,并对代谢改造突变体的碳源利用及生长特性进行了研究。将N-乙酰氨基葡萄糖合成关键酶基因在代谢改造的大肠杆菌底盘工程菌中进行表达,并对发酵条件进行了优化,在摇瓶发酵试验中获得了较高的N-乙酰氨基葡萄糖的积累。具体为:通过敲除EMP途径关键基因pfkA、pfkB以及PPP途径关键基因zwf,获得果糖-6-磷酸积累的底盘工程菌,并在底盘工程菌中过表达谷氨酰胺果糖-6-磷酸转氨酶GlmS、果糖-1-磷酸酶YqaB、葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶Gna-1以及甘油激酶GlpK,获得产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌株。通过RT-qPCR分析了底盘工程菌代谢途径断点上下游基因的表达状况。试验结果显示,EMP途径阻断的宿主其fbaB、zwf基因表达量都上调了约6倍,表明宿主在生长压力下碳流绕过代谢断点进入了下游EMP途径并增加了PPP途径的通量。而EMP和PPP双途径阻断的宿主fruK基因上调23倍,猜测碳流可能由果糖-1-磷酸途径合成果糖-1,6-二磷酸进入EMP途径。在MK培养基中,EMP途径阻断的产物合成菌株摇瓶发酵N-乙酰氨基葡萄糖的产量达到31 mg/L,EMP、PPP双途径阻断的产物合成菌株中N-乙酰氨基葡萄糖的产量为14 mg/L。发酵培养基优化结果表明,在MK培养基中添加10%LB（MK1培养基）可有效提高突变株的生长速率和生物量。突变株经12 h发酵,生物量基本与野生株保持一致。EMP途径阻断的产物合成菌株N-乙酰氨基葡萄糖的合成量为0.69 g/L,相比于培养优化之前产量提升了约22倍,乙酸生成量相比于野生株降低了55%;EMP、PPP双途径阻断的产物合成菌株N-乙酰氨基葡萄糖的合成量提高了约200倍,由14 mg/L增加至2.8 g/L,同时乙酸生成量相比于野生株降低了64%,并且积累的乙酸可被菌体重吸收,重吸收率高达87.5%。综上,本研究基于优化的CRISPR-Cas9系统对大肠杆菌MG1655（DE3）菌株的EMP和PPP途径进行了系统的代谢改造,建立了具有优良性状的底盘工程菌株,并通过引入N-乙酰氨基葡萄糖合成途径和甘油利用基因,使菌体可同时利用甘油、葡萄糖进行生长和产物合成,提高了产物转化效率。本研究为N-乙酰氨基葡萄糖的规模化生产和推进其在饲料、医药中的应用奠定了一定的理论基础,同时拓宽了微生物代谢改造生产生物活性物质的思路。另外,本研究也对凝结芽孢杆菌的代谢改造方法进行了探索。建立和优化了凝结芽孢杆菌的质粒转化方法,为凝结芽孢杆菌的代谢改造奠定了基础。
刘金彬[3]（2020）在《奇异变形杆菌代谢芳香族氨基酸的机理研究及其初步应用》文中认为芳香族氨基酸在肠道微生物作用下的代谢产物,能够将各种因素与宿主生理病理联系在一起,积累到一定剂量时可以进行药理学干预。奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）是人体肠道中的一种条件致病菌,其丰度随着肠道炎症的发生而增加。本文以P.mirabilis JN 458为出发菌株,确定了L-芳香族氨基酸的代谢途径,利用生物信息学分析其基因组,确定了参与代谢的相关基因,通过体外生化实验验证了代谢相关酶的功能,利用RT-q PCR解析了L-芳香族氨基酸代谢相关基因的调控,并利用大肠杆菌构建了一条新的2-苯乙醇合成途径。主要研究结果如下:（1）确定了芳香族氨基酸的代谢途径及潜在基因。通过代谢物分析确定了P.mirabilis JN 458的17种L-芳香族氨基酸代谢产物。基于上述的代谢物分析,确定了L-芳香族氨基酸的代谢途径。通过对P.mirabilis的基因组进行生物信息学分析,共获得了25个可能参与L-芳香族氨基酸代谢的潜在基因。其中,获得了2个L-芳香族氨基酸转氨酶基因,8个α-羟酸脱氢酶基因,3个醛脱氢酶基因,以及3个ω-转氨酶基因。此外,P.mirabilis JN 458中的2个L-氨基酸脱氨酶基因,5个醇脱氢酶基因,1个L-芳香族氨基酸脱羧酶基因和1个α-酮酸脱羧酶基因也可能参与L-芳香族氨基酸代谢。（2）验证了L-芳香族氨基酸代谢相关酶的功能。体外生化实验表明,2个芳香族氨基酸转氨酶均能够催化L-芳香族氨基酸转化为相应的芳基丙酮酸,而且还能够催化2-苯乙胺转化为苯乙醛。芳香族氨基酸转氨酶（AAAT-1）以α-酮戊二酸为氨基受体,对L-酪氨酸和L-色氨酸的kcat/Km值分别为6.61 s-1·mmol-1和2.79 s-1·mmol-1。5个α-羟酸脱氢酶（MDH、ALLD、GHRA、GHRB和PHDGH）等能够催化芳基丙酮酸转化为芳基乳酸。MDH对苯丙酮酸的kcat/Km值为1.31 s-1·mmol-1。3个醛脱氢酶（SADH、ALDH和BADH）均能够催化芳基乙醛转化为芳基乙酸。ALDH以NADP+为辅酶时,对苯乙醛的kcat/Km值为2.3 s-1·mmol-1。（3）RT-q PCR解析了L-芳香族氨基酸代谢相关基因的表达的水平。利用RT-q PCR解析了P.mirabilis JN 458代谢L-苯丙氨酸转化为2-苯乙醇3条途径11个相关基因的表达水平。结果发现:在有氧条件下,P.mirabilis JN 458通过L-氨基酸脱氨酶途径、Ehrlich途径和L-氨基酸脱羧酶途径代谢L-苯丙氨酸转化为2-苯乙醇的11个基因参与上调,在厌氧条件下,P.mirabilis JN 458通过Ehrlich途径代谢L-苯丙氨酸转化为2-苯乙醇的9个基因参与上调。P.mirabilis JN 458中除了代谢L-芳香族氨基酸转化为芳基乙醇外,还有3条其他L-芳香族氨基酸代谢途径。通过RT-q PCR解析了P.mirabilis JN 458代谢L-芳香族氨基酸转化为相应产物的22个相关基因的表达水平。结果发现,在有氧条件下,P.mirabilis JN 458代谢L-芳香族氨基酸流向芳基乳酸、芳基乙酸、芳基乙胺和芳基乙醇的19个相关基因参与上调,在厌氧条件下,P.mirabilis JN 458能够代谢L-芳香族氨基酸流向流向芳基乳酸、芳基乙酸、芳基乙胺和芳基乙醇的18个相关基因参与上调。（4）在大肠杆菌中构建了一条新颖的2-苯乙醇合成途径。通过质粒p ACYCDuet-1表达L-氨基酸脱氨酶和α-酮酸脱羧酶,p ETDuet-1表达醇脱氢酶（ADH-1）,构建了重组菌E-p AEAKa。重组菌E-p AEAKa能够转化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇。L-氨基酸脱氨酶（Pm LAAD）是重组菌的限速酶,通过模型指导Pm LAAD进行了改造。将野生型Pm LAAD进行了三点突变,构造了突变体Pm LAAD V438G/K147V/K151E。突变体Pm LAAD V438G/K147V/K151E的相对酶活力是野生型Pm LAAD的3.53倍。通过质粒p RSFDuet-1表达突变体Pm LAAD V438G/K147V/K151E和α-酮酸脱羧酶,p ETDuet-1表达醇脱氢酶（ADH-4）和葡萄糖脱氢酶,构建了重组菌E-p REm KAG。将重组菌的转化条件进行了优化,在40℃,p H=7.0条件下,重组菌E-p REm KAG(OD600=13)在8 h能够将10 g·L-1 L-苯丙氨酸转化生成7.28±0.19 g·L-1 2-苯乙醇,转化率达到98.46%。在5 L发酵罐中进行了转化,在通气量为0.4 vvm,葡萄糖添加量为20 g·L-1时,E-p REm KAG全细胞转化10 g·L-1 L-苯丙氨酸生成7.24±0.12 g·L-1 2-苯乙醇,转化率达到97.92%。
张婷[4]（2020）在《L-乳酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶高效制备L-苯乳酸》文中指出L-苯乳酸（L-phenyllactic acid,L-PLA）是一种高附加值的天然有机酸,对食源性致病菌和腐败菌具有广谱抑菌性,易被人体代谢吸收,可代替防腐剂应用于食品和饲料中。L-PLA作为许多药物和材料的合成前体,在医药和材料领域的重要作用备受关注。目前,报道的关于生物合成L-PLA的产量和生产效率较低,限制了L-PLA的大规模制备。本研究以干酪乳杆菌Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶突变体L-LcLDH1Q88A/I229A为研究对象,通过与葡萄糖脱氢酶共同构建体内和体外辅酶循环体系,并利用体外双酶偶联不对称还原苯丙酮酸（Phenylpyruvate,PPA）,为实现L-PLA的工业化生产奠定基础。利用L-LcLDH1Q88A/I229A和嗜酸热源体Thermoplasma aciddophilium葡萄糖脱氢酶SyGDH,构建体内辅酶循环体系和体外辅酶循环体系。成功构建了共表达重组菌E.coli/pET-22b-Lcldh1Q88A/I229A/pET-28a-Sygdh,利用其不对称还原PPA,反应生成L-PLA的产量明显高于E.coli/pET-22b-Lcldh1Q88A/I229A。对共表达重组菌的表达条件进行优化,在最佳诱导表达条件下（温度15℃、IPTG 0.6 mM、诱导时间12 h）,L-LcLDH1Q88A/I229A的酶活性为158.7 U·g-1（湿菌体）,SyGDH酶活性为44.6 U·g-1（湿菌体）,分别较未优化前提高了17.1%和39.5%。将E.coli/pET-22b-Lcldh1Q88A/I229A、E.coli/pET-28a-Sygdh诱导表达后进行细胞破碎,得到粗酶液,经纯化得到纯酶液。分别将L-LcLDH1Q88A/I229A和SyGDH的粗酶、纯酶偶联,构建体外辅酶循环体系。利用共表达重组菌全细胞、粗酶体系和纯酶体系分别催化10 mM PPA,所得L-PLA的产率分别为86.9%、91.3%、99.6%,只有纯酶体系无副产物生成,因此纯酶体系最适合用于不对称还原PPA制备PLA。为降低酶的制备成本,尝试将L-LcLDH1Q88A/I229A在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中分泌表达以及对SyGDH的粗酶液进行热处理。SDS-PAGE分析显示,毕赤酵母重组酶L-LcLDH1Q88A/I229A（Pp）的表观分子量为36.8 kDa,发酵液中杂蛋白少,比活性为270.5U·mg-1。经纯化后,测定动力学参数,Vmax为627.0 U·mg-1,催化效率kcat/Km为94.3mM-1·s-1,分别是大肠杆菌重组酶L-LcLDH1Q88A/I229A（Ec）的26.1和25.5倍。SyGDH粗酶液经50℃、1 h的热处理,残余酶活性为93.1%,与毕赤酵母发酵液reLcLDH1Q88A/I229A偶联不对称还原10 mM PPA,产率可达99.6%,未产生副产物。优化其催化条件,在40℃、pH 5.0,reLcLDH1Q88A/I229A添加量10 U·mL-1,热处理过的SyGDH添加量1 U·mL-1,NAD+浓度2.0 mM、葡萄糖浓度120 mM的体系中,可在2 h内催化100 mM PPA生成L-PLA的产率为99.2%,辅酶循环数TTN为49.6。为实现辅酶高效循环再生,通过筛选比较,选择亲和NAD+、耐热、耐酸的球形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus G10来源的葡萄糖脱氢酶突变体LsGDHD255C,代替SyGDH用于体外辅酶循环体系,当NAD+浓度为0.1 mM时,其可在2 h内催化100 mM PPA生成L-PLA的产率为99.5%,辅酶循环数TTN为995,提高了19.1倍。优化LsGDHD255C的添加量,其添加量为4 U·mL-1时,反应时间可缩短至30 min。最后,利用reLcLDH1Q88A/I229A偶联LsGDHD255C的体外辅酶循环体系,在催化反应过程中,通过三次补加PPA,反应最终积累的L-PLA浓度高达359.8 mM,eep>99%,时空产率为10.0g·L-1·h-1,平均转化率为269.3 g·g-1·L-1。分离纯化样品,高手性纯的L-PLA得率为70.6%。
沈威[5]（2020）在《运动发酵单胞菌双报告基因系统及CRISPR-Cas12a基因组编辑系统的构建与应用》文中认为运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是一种兼性厌氧革兰氏阴性细菌。作为天然产乙醇菌株,运动发酵单胞菌是目前构建生物燃料及其他生物基平台化合物的底盘细胞之一。但是,目前对运动发酵单胞菌的基因功能和代谢机制等仍缺乏全面的了解,能够应用于运动发酵单胞菌基因工程改造的生物元件如启动子和核糖体结合位点（Ribosomal binding site,RBS）等比较匮乏,且用于筛选鉴定相关生物元件的平台及基因组改造的遗传操作体系尚待完善,制约了相关领域的理论研究和实践应用。围绕运动发酵单胞菌生物元件的挖掘与鉴定以及高效、快捷基因组编辑工具的开发,本研究首先建立了一套基于流式细胞术的双报告基因系统,可实现对运动发酵单胞菌生物元件的定量鉴定。该系统以Lac UV5启动子驱动的m Cherry作为内参,以待检测调控生物元件驱动的EGFP作为研究对象,通过流式细胞术检测结果计算的EGFP/m Cherry比值确定生物元件的相对强度。本研究还通过系统生物学数据挖掘和生物信息学分析,预测了强度不同的38个启动子和4个RBS生物元件,进而通过双报告基因系统测定了其强度,结果表明预测结果与实验结果之间具有较高的一致性,可应用于运动发酵单胞菌调控生物元件的鉴定,满足代谢工程和合成生物学实践的需要。利用来源于Francisella novicida U112的Cas12a（Fn Cpf1）,本研究也建立了基于外源CRISPR-Cas系统的运动发酵单胞菌基因组编辑工具。首先在Z.mobilis subsp.mobilis ZM4中构建了可诱导表达Cas12a核酸酶进行基因组编辑的重组菌株,在靶向gRNA引导下能够实现对靶基因位点基因组的切割功能。随后利用该系统,通过gRNA引导靶向运动发酵单胞菌内源质粒的复制酶位点,实现了内源质粒的消除,且效率能达到100%。在ss DNA作为模板的条件下,该系统可以在基因组上实现精准、高保真的碱基替换。本研究建立的CRISPR-Cas12a基因组编辑工具,可高效、快捷地对运动发酵单胞菌基因组进行替换、删除和插入,编辑效率可达90%以上。借助CRISPR-Cas12a系统,本研究将编码乳酸脱氢酶的异源基因导入运动发酵单胞菌基因组,成功构建了一株产乳酸的重组菌株。本研究也开展了将CRISPR-Cas12a系统进一步改造为CRISPRi/a基因组转录调控工具的工作。首先通过定点突变的方式将编码Cas12a核酸酶的基因进行改造,分别构建了失去核酸酶活性的dCas12a突变体dCas12a（D917A）和dCas12a（E1006A）。实验结果表明这两个单点突变体对靶基因的抑制没有明显差异。CRISPR-dCas12a系统靶向启动子区域的两条链时均有较好的抑制效果,但是当该系统靶向编码区时,gRNA与模板链的结合较非模板链具有更好的抑制效果。其次,gRNA序列长度（<15 nt）及gRNA的错配会影响CRISPR-dCas12a系统的抑制效果,当gRNA序列中第2到第6位碱基出现错配后,该系统基本无抑制效果。此外,本研究也尝试构建基于CRISPR-dCas12a的运动发酵单胞菌转录激活系统CRISPRa。通过将RNA聚合酶的ω亚基与dCas12a融合表达,然后靶向基因组的特定序列以激活基因表达,但对下游基因表达量进行检测分析的实验结果表明上述CRISPRa系统未能达到预期的激活效果,尚需进一步优化改造。总之,本研究建立了基于流式细胞术的双报告基因系统和CRISPR-Cas12a基因编辑工具,可用于鉴定启动子、RBS和UTR等非编码序列调控生物元件的强度以及基因的替换、删除和插入,为合成生物学研究及代谢工程改造提供了工具。同时,本研究也构建了基于CRISPR-dCas12a的CRISPRi基因抑制表达系统,并尝试构建了用于激活下游基因表达的CRISPRa系统,为运动发酵单胞菌的研究提供了研究基因功能和代谢网络调控的工具。
杨子晨[6]（2019）在《噬菌体在烧伤泛耐药细菌感染治疗中的机制研究》文中指出感染是烧伤后的一种常见严重并发症,细菌是感染最常见的病原体。近年来抗生素的滥用使现有的抗生素失效,并加速了耐药菌的出现和扩散。根据耐受抗生素种类的数量,耐药菌分为耐药、多耐药（multi-drug resistant）、泛耐药（extensively-drug resistant）甚至是全耐药的（pan-drug resistant）。鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是目前烧伤分离率最高的致病菌,均有非常强的适应能力和广泛的抗生素耐药性。由于新型抗生素的研究发展速度远远滞后于细菌的突变速度,这使得泛耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的感染治疗相当困难。自从1915年首次发现噬菌体后不久,人们就成功地将噬菌体应用到泛耐药菌感染的治疗中。自然界中作为细菌的天敌,噬菌体的数目是细菌的十倍以上。然而目前已测序的噬菌体只有一千多种,人们对噬菌体-宿主之间的相互作用及噬菌体基因功能和作用机制的了解更是冰山一角。这些知识的匮乏阻碍了人们对噬菌体这一巨大的抗菌资源的利用。因此,为了充分利用噬菌体对抗形势严峻的烧伤后泛耐药菌感染,我们迫切地需要对噬菌体-宿主相互作用及噬菌体基因的功能和作用机制有更深入地了解。以下为本文的主要研究内容及结果:第一部分鲍曼不动杆菌噬菌体-宿主相互作用研究:1.我们进行了鲍曼不动杆菌AB1噬菌体φAbp1感染后的转录组测序（RNA-seq）,从转录组水平描述在宿主菌中φAbp1感染期间与宿主的相互作用。结果显示,φAbp1基因的表达与普通的裂解性噬菌体模式不同:在φAbp1进入宿主菌后的中期（10分钟）,所有φAbp1中间基因的表达达到峰值,此时φAbp1通过调节越来越多的宿主差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）开始劫持细胞资源。大多数宿主基因在整个感染过程中组成性表达,只有少部分（约六分之一）宿主基因受到了噬菌体调控,其中上调的宿主DEGs显着超过下调的DEGs,并且在不同阶段这些受调控的DEGs的功能分组是有明显区别的,这表明φAbp1是精确地控制而不是简单地禁止宿主基因。同时,从临床角度来看,噬菌体“治疗”宿主菌时,引起了宿主菌毒力和耐药基因的明显变化,这警示我们在未来使用噬菌体疗法时需要仔细考虑此方面可能产生的副作用。第二部分铜绿假单胞菌噬菌体φPaP3基因产物Gp68功能机制研究:2.课题组前期研究发现铜绿假单胞菌噬菌体φPaP3的orf67/orf68/orf69基因簇在噬菌体-宿主相互作用网络中处于核心调控位置。将铜绿假单胞菌PA3导入pHerdB20Torf67/orf68/orf69质粒后,我们发现orf67/orf68/orf69基因簇可以抑制宿主菌PA3的生长,其中orf68对生长的抑制效果最为明显,我们将orf68的基因产物命名为Gp68。进一步的研究发现表达Gp68的PA3宿主菌生长速度抑制主要是由于细胞分裂受抑制导致的。通过对单独过表达Gp68的PA3宿主菌进行RNA-seq发现这种分裂抑制作用与宿主菌中控制分裂的minD基因高度相关;且敲除和回补这个基因证明Gp68确实通过minD抑制细菌分裂。但作为一个核心控制基因,Gp68的功能显然不仅限于此。3.我们发现PA3菌体中表达Gp68后不再合成绿脓菌素（pyocyanin）。绿脓菌素是铜绿假单胞菌及其毒力的重要标志和重要原因,且绿脓菌素的生产是受到群体感应系统（Quorum-sensing System）复杂调控的。因此绿脓菌素合成的缺失,暗示Gp68还可以影响铜绿假单胞菌的群体感应系统,从而影响宿主菌的毒力和耐药性等能力。进一步的研究证实Gp68通过上调转录因子mvaT基因,抑制了宿主菌PA3全部群体感应系统基因的表达,从而抑制了宿主菌PA3绿脓菌素的合成,并抑制了PA3的毒力和耐药性。4.联用多种方法综合分析铜绿假单胞菌噬菌体φPaP3基因产物Gp68对宿主菌的影响:在第三、四章中联合RNA-seq、表型分析和CRISPR基因敲除的基础上,进一步利用CHIP-seq、基因报告系统等技术确定Gp68是一种转录增强子结合蛋白,在宿主基因组上具有广泛的结合位点。这种成套研究思路可以扩展应用于对其他噬菌体基因功能和机制的研究。综上所述,我们对鲍曼不动杆菌φAbp1治疗宿主菌AB1时全基因组转录水平的影响有了深入的了解,探讨了噬菌体治疗时对宿主菌毒力及抗生素耐药性的影响,这将有助于我们更好地了解噬菌体疗法对宿主菌产生的各方面影响。我们绘制的基因水平的噬菌体φAbp1-AB1宿主相互作用网络,为后续噬菌体抑菌蛋白的筛选以及噬菌体-宿主相互作用的深入解析提供了研究基础。此外我们对铜绿假单胞菌噬菌体φPaP3基因产物Gp68的功能及作用机制进行了研究,发现Gp68可以强力抑制细菌分裂,减弱细菌毒力和耐药性,并证实了Gp68通过转录增强作用,促进宿主的负调控基因,完成噬菌体接管（take-over）宿主的新机制。对于Gp68作用机制的研究思路可以作为未来噬菌体基因功能研究的基本思路的参考。
胡瞬[7]（2019）在《菊糖在结核分枝杆菌和寨卡病毒亚单位疫苗中的佐剂作用研究》文中研究表明佐剂已经成为亚单位疫苗不可或缺的重要组成部分,同时也是制约亚单位疫苗发展的重要因素。目前临床使用的佐剂数量有限,而且还存在不同程度的不良反应,因此,亟待开发更加安全有效的亚单位疫苗佐剂。菊糖（Inulin）是由D-果糖经β-1,2糖苷键连接而成的一种天然果糖聚合物,其来源广泛、价格低廉、安全性高、生物相容性好,而且具有免疫调节功能。因此,菊糖具有作为亚单位蛋白疫苗佐剂的良好潜力。为了研究菊糖对亚单位蛋白疫苗的佐剂效果,制备了基于菊糖化学修饰的结核分枝杆菌疫苗和寨卡病毒疫苗,通过研究两种疫苗的免疫原性,分别评价菊糖在细菌性疫苗和病毒疫苗中的佐剂作用。目前疫苗佐剂的递送主要利用物理混合的方法,根据静电吸附或微球包裹的原理加载抗原。但由于菊糖呈电中性,因此不能直接吸附抗原,而使用额外的添加材料包裹菊糖和抗原,可能会引起机体非特异性免疫应答,并造成一定的安全性问题。为了弥补上述传统方法带来的缺陷,采用化学修饰的方法,将抗原和佐剂共价结合,使得抗原与佐剂同时到达抗原提呈细胞（APCs）,从而增强细胞对抗原的摄取,刺激机体产生更强的免疫应答。菊糖与蛋白抗原共价结合成为一种新型的抗原递送系统,可以形成半衰期较长的亚单位疫苗。通过探讨菊糖与免疫系统的相互作用机制,研究菊糖对疫苗的佐剂作用。全文的主要研究结果如下:（1）菊糖在结核分枝杆菌亚单位蛋白疫苗中具有良好的佐剂效果首先,表达并纯化得到一种结核分枝杆菌抗原融合蛋白,即CFP10-TB10.4融合蛋白（CT）。菊糖与载体蛋白CRM197共价结合成CRM-inu。然后将结合物（CRM-inu）与CT结合形成亚单位疫苗CT-CRM-inu,研究此亚单位疫苗的免疫原性和药代动力学特性。在BALB/c小鼠的体内试验表明,CRM-inu修饰使CT特异性IgG抗体滴度显着升高。与CT组相比,CT-CRM-inu组的CT特异性IgG滴度在第14天、21天、28天分别增加了11.0倍（P<0.05）、8.6倍（P<0.05）、20.6倍（P<0.05）;与此同时,CT-CRM-inu组Th1型细胞因子IFN-γ和TNF-α在脾脏淋巴细胞中的表达分别增强了24.1（P<0.05）和2.4倍（P<0.05）;Th2型细胞因子IL-5和IL-10在脾脏淋巴细胞中的表达分别增强了7.8倍（P<0.05）和3.5倍（P<0.05）,这表明CRM-inu共价修饰能够提高机体CT蛋白特异性的体液免疫和细胞免疫应答。此外,重要的是研究证明小鼠血清样本中未检测出抗菊糖抗体,菊糖佐剂自身免疫原性极低,具有良好佐剂潜力。菊糖修饰的CT蛋白对小鼠心、肝和肾功能没有明显影响,具有良好的安全性。为了进一步研究菊糖的佐剂作用机制,测定了菊糖佐剂修饰的疫苗在SD大鼠体内的药代动力学特征。结果表明,通过CRM-inu修饰,与CT组相比,CT-CRM-inu组的血浆半衰期7.0±0.2 h延长至26.4±0.1 h,药时曲线下面积AUC0-144 h由1228.5±323.5μg mL-1h-1增加至7284.4±535.1μg mL-1h-1,生物利用度的清除率Cl/F由0.32±0.02μg/μg mL-1h-1下降至0.15±0.02μg/μg mL-1h-1。由此可知,CRM-inu修饰可显着延长CT在免疫系统中的暴露时间,提高疫苗的吸收利用程度,降低CT在血清中的清除速率,达到诱导机体产生更强烈的CT特异性免疫应答的目的。（2）菊糖作为寨卡病毒亚单位蛋白疫苗E蛋白佐剂具有良好的效果首先表达并纯化得到作为抗原的寨卡病毒包膜蛋白（E蛋白）。为了提高E蛋白的免疫原性,选用TLR7受体激动剂洛索立宾（Loxoribine,Lox）,与菊糖共同修饰E蛋白,制备了一系列集免疫刺激分子、递送系统以及抗原为一体的新型E蛋白亚单位疫苗Lox-E-inu。疫苗的免疫原性和免疫机理研究结果表明:菊糖协同洛索立宾作为E蛋白的佐剂,可诱导E蛋白的特异性IgG抗体产生以及T细胞反应。与单独的E蛋白组相比,Lox-E-I1组在第7天、第14天和第21天的特异性IgG滴度分别增加了4.0倍（P<0.05）、9.5倍（P<0.05）和25.0倍（P<0.05）。Lox-E-inu组Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2以及Th2型细胞因子IL-10的脾淋巴细胞数目分别增加了2.8倍（P<0.05）、1.5倍（P<0.05）、1.9倍（P<0.05）和1.8倍（P<0.05）;提高了CD4+T亚群细胞（P<0.05）和CD8+T亚群细胞（P<0.05）的数量,而CD4+T和CD8+T细胞数的比值并没有显着的变化（P>0.05）。此外,血清样本中没有检测出抗菊糖抗体,表明菊糖自身的免疫原性极低,具有良好的佐剂潜力。为进一步探讨菊糖和Lox的佐剂作用机理,采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对DC细胞的荧光强度进行分析发现,Lox-E-inu组树突状细胞（imDC细胞）摄取FITC标记疫苗的比率（56.97%）要显着高于单独E蛋白组（11.81%）,平均荧光强度（94.82）高于单独E蛋白组（12.26）,证实菊糖协同Lox佐剂能促进imDC细胞对抗原的高效摄取。此外,疫苗Lox-E-inu接种对小鼠心、肝和肾功能没有明显影响。上述研究结果表明,菊糖和Lox偶联递送E蛋白是增强体液免疫和细胞免疫的有效策略,其主要机制是通过提高imDC细胞对抗原的摄取,促进imDC细胞的分化与成熟,有利于提高DC细胞对抗原的递呈效率。
夏媛媛[8]（2019）在《亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究》文中研究表明腈水合酶（Nitrile hydratase,简称NHase;EC:4.2.1.84）能够催化腈在常温中性条件下与水化合形成酰胺,是替代高温强酸催化工艺实现酰胺类大宗化学品绿色制造的关键酶种。常见NHase是含?和?亚基的金属酶,酶的成熟遵循亚基自身交换机制。但酶的热稳定性和有机溶剂耐受性较差,难以满足工业化生产对酶学性质的应用要求。因此,亟需发掘新型NHase,改良酶的催化性能。本研究依据新发现的领鞭毛虫（Monosiga brevicollis）单肽链腈水合酶的蛋白结构特点,对恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida 5B/NRRL-18668）腈水合酶进行亚基融合重构,大幅提高腈水合酶的热稳定性和产物耐受性;又研究了来源于P.putida 5B和玫瑰色红球菌（Rhodococcus rhodochrous J1）的腈水合酶亚基融合突变体的活化机理,揭示了调控蛋白对于融合型腈水合酶的激活机制。主要研究结果如下:（1）对P.putida 5B来源的腈水合酶PpNHase进行亚基融合重构,获得了活性和稳定性均大幅提高的亚基融合型腈水合酶。基于M.brevicollis单链腈水合酶的蛋白结构特点,采用亚基融合策略对PpNHase进行改造,获得了两种活性和稳定性均大幅提高的亚基融合型腈水合酶。其中共表达调控蛋白的融合型腈水合酶NHase-（BA）P14K的比酶活比PpNHase提高了54%,而融合了调控蛋白的融合型腈水合酶NHase-（BAP14K）的比酶活较PpNHase提高了39%,两者在50°C的半衰期分别为PpNHase的2.8倍和2倍,对烟酰胺的产物耐受性也较PpNHase有一定的提高。（2）基于半理性改造,进一步提高腈水合酶的稳定性。以NHase-（BA）P14K为出发蛋白,通过结合点突变扫描程序和分子动力学模拟手段,建立了一个高效的小型突变库,并从中筛选出三个酶活和稳定性均提高的突变体B-M150C、B-T173Y和B-S189E,其催化效率较出发蛋白提高了1.1倍、1.5倍和2.2倍,在50°C的半衰期分别较出发蛋白提高了32%、7%及107%。（3）解析了融合型腈水合酶的成熟活化机理。通过优化表达策略,获得了来源于P.putida 5B和R.rhodochrous J1的腈水合酶调控蛋白P14K及NhlE。在此基础上对腈水合酶激活机制进行了探究。用单独的调控蛋白在体外与同源的不含钴的融合型腈水合酶进行混合后,获得了活化的成熟酶;此外,用调控蛋白激活不同来源的腈水合酶,也可以实现部分激活。本结果表明,调控蛋白起着类似金属伴随子的作用,协助输送钴离子到腈水合酶中;另外,调控蛋白不仅可以激活同源腈水合酶,也能激活异源腈水合酶,但对于自身来源的腈水合酶有着更高的激活效率。（4）成功表达M.brevicollis来源的单链腈水合酶Mb NHase。以大肠杆菌作为表达宿主对Mb NHase进行了可溶性表达,并测定了其比酶活为88.4 U·mg-1。根据调控蛋白可以激活异源腈水合酶的结论,构建了MbNHase与两种调控蛋白P14K、NhlE共表达的质粒,表达纯化后酶活测定发现,比酶活分别为220.2 U·mg-1和127.0 U·mg-1,是MbNHase的2.5和1.4倍。结果表明,两种细菌来源的调控蛋白可以协助真核来源的天然融合型腈水合酶提高活性。
王宝慧[9]（2019）在《成纤维细胞生长因子14表达及神经保护作用研究》文中研究指明成纤维细胞生长因子14为FGF家族成员之一,主要表达于中枢神经,其基因突变与神经系统异常疾病紧密相关,但目前关于FGF14与相关疾病及其作用机制方面的研究尚处于起始阶段。因此,本研究通过基因工程技术克隆FGF14基因片段、构建工程菌株及在大肠杆菌中的表达、纯化工艺研究,并研究FGF14蛋白对NIH3T3、PC12细胞促增殖活性及对Aβ25-35诱导PC12细胞建立阿尔兹海默症模型的神经保护作用。本课题的研究结果如下:FGF14基因片段与pET15b表达载体连接形成重组质粒,转化到感受态BL21（DE3）中,将重组FGF14蛋白在大肠杆菌表达体系中高密度表达。通过超声破碎方法破碎菌体使目的蛋白释放,经SDS-PAGE方法验证得出FGF14蛋白大部分以包涵体形式表达。通过包涵体清洗、盐酸胍变性,采用稀释复性方法使蛋白恢复其正常的空间结构,再通过表达载体具有组氨酸标签与镍柱特异性亲和特性进行纯化获得较高纯度FGF14蛋白。表达纯化工程化技术的建立为FGF14蛋白应用和机制研究提供了保障。选择NIH3T3、PC12细胞利用CCK8的方法检测FGF14蛋白促增殖生物学活性。经检测发现在无肝素存在条件下FGF14蛋白对NIH3T3、PC12细胞促增殖活性不明显或无促增殖活性,而FGF14在与一定浓度肝素结合的条件下在PC12细胞中具有了明显的促增殖活性。活性检测方法的建立为FGF14蛋白的定性和定量提供了重要依据。利用Aβ25-35损伤PC12细胞研究FGF14蛋白对神经保护作用。采用Aβ25-35损伤浓度为40μmol/L、作用时间为48 h,成功构建神经损伤模型;通过剂量摸索发现FGF14蛋白在416 ng/mL浓度范围内,减轻Aβ25-35导致的神经损伤呈现出剂量依赖性,同时在该浓度范围内能够显着抑制LDH、MDA的释放,证明FGF14蛋白对PC12细胞具有神经保护作用。利用荧光以及流式的技术方法同样证明FGF14蛋白具有较好的神经保护作用。进一步,利用Western Blot技术证明FGF14蛋白是通过MAPK信号通路发挥神经保护作用。
李丹[10]（2019）在《人精子特异性乳酸脱氢酶L153X突变体原核和真核表达载体的构建及鉴定》文中进行了进一步梳理乳酸脱氢酶C4（lactate dehydrogenases C4,LDH-C4）是上世纪60年代由Goldberg和Blanco等人发现的乳酸脱氢酶同工酶之一,特异地表达于成熟雄性哺乳动物和鸟类的生殖系统中,又称睾丸或者精子特异性乳酸脱氢酶[1,2]。LDH-C4由4个C亚基组成,催化丙酮酸和乳酸之间的可逆性反应,是精子能量代谢的关键酶,参与精子的生成、代谢及获能等过程[3,7]。前期,本课题组在精子LDH-C4活性低下的不明原因不育的男性患者中行LDHC基因检测,发现一名患者LDHC基因第5外显子的第40位碱基由正常的T变成G,所转录mRNA第153位密码子由编码亮氨酸的密码子TTA变成终止密码子TGA,并将此突变命名为L153X突变[8]。前期研究表明,该突变所转录的终止密码子提前（premature termination codons,PTC）的mRNA逃脱了真核细胞中无义密码介导的 mRNA 降解（nonsense-meditated mRNA decay,NMD）的监控机制,并被翻译成了截短多肽[9]。为了研究L153X截短突变引起男性不育的分子机制,本研究采用分子克隆技术,构建了 L153X突变体原核表达载体pET-28a（+）-153X,与野生型原核表达载体pET-28a（+）-LDHC进行体外诱导表达产物酶活性比较,由此验证了课题组前期关于L153X截短突变导致LDH-C4酶活性降低或丧失的预测;为了研究杂合突变个体精子成熟前胞浆内的野生型C亚基和L153X突变型C亚基之间可能存在的相互作用,本研究构建了真核表达载体pVAX1-LDHC及pVAX1-L153X,并利用基于兔网织红细胞裂解产物的TNTT7快速偶联的体外转录/翻译系统,模拟含野生型LDHC基因纯合个体及含L153X突变体纯合或杂合个体体内不同亚基的组成情况,通过比较体外表达产物的酶活性差别,结合课题组前期的分子生物学预测结果分析野生型C亚基和突变型C亚基之间的可能的相互作用。本研究为LDHC基因突变导致男性不孕提供了分子遗传角度的病因学解释,为全面了解该基因突变对LDH-C4功能的影响奠定了一定基础。
二、Expression and characterization of mouse lactate dehydrogenase subunit C in Escherichia coli.（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Expression and characterization of mouse lactate dehydrogenase subunit C in Escherichia coli.（论文提纲范文）
（1）近平滑假丝酵母（S）—羰基还原酶不同聚合体的结构与功能及催化机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 短链脱氢酶/还原酶的研究现状 |
| 1.1.1 短链脱氢酶/还原酶的生物催化功能及其应用价值 |
| 1.1.2 SDRs的研究表达体系 |
| 1.1.3 近平滑假丝酵母来源的(S)-羰基还原酶的研究进展 |
| 1.2 SDRs的三级结构特点和分子催化机制 |
| 1.3 SDRs四级结构的特点及其功能 |
| 1.3.1 SDRs同源聚合体的亚基之间的相互作用及其功能 |
| 1.3.2 SDRs异源聚合体的亚基之间的相互作用及其功能 |
| 1.3.3 非协同相互作用的四聚体界面寡聚相互作用的机制 |
| 1.4 酶的分子识别催化机制 |
| 1.5 本论文的立题依据和研究内容 |
| 1.5.1 立题依据和研究意义 |
| 1.5.2 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 (S)-羰基还原酶的同源表达及其全细胞转化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 近平滑假丝酵母基因组的提取 |
| 2.2.5 基因克隆和近平滑假丝酵母重组菌株的构建 |
| 2.2.6 重组蛋白的同源表达 |
| 2.2.7 粗酶液酶活力的测定 |
| 2.2.8 全细胞不对称转化 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 重组型近平滑假丝酵母的筛选 |
| 2.3.2 SCR2在近平滑假丝酵母中的同源表达 |
| 2.3.3 重组菌全细胞转化2-羟基苯乙酮生成(S)-PED的初始pH和温度的优化 |
| 2.3.4 重组菌对底物2-羟基苯乙酮的耐受性的研究 |
| 2.3.5 重组菌全细胞还原2-羟基苯乙酮生成(S)-PED的制备级规模的研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 (S)-羰基还原酶异源聚合体的发现及功能鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要仪器和试剂 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 近平滑假丝酵母基因组的提取 |
| 3.2.5 基因克隆和近平滑假丝酵母重组菌株的构建 |
| 3.2.6 SCR2蛋白的同源表达、纯化和Western blot分析 |
| 3.2.7 基因克隆和大肠杆菌重组菌株的构建 |
| 3.2.8 蛋白纯化缓冲液的配制 |
| 3.2.9 TEV蛋白的表达及其纯化 |
| 3.2.10 (S)-羰基还原酶同源聚合体的过量表达及其纯化 |
| 3.2.11 异源聚合体的过量表达和纯化 |
| 3.2.12 酶活力和酶动力学的测定 |
| 3.2.13 酶的最适温度和最适pH的测定 |
| 3.2.14 酶的温度和pH稳定性的测定 |
| 3.2.15 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析胞外上清纯化产物 |
| 3.2.16 蛋白质体外结合实验(Pull-down) |
| 3.2.17 蛋白分子量分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 近平滑假丝酵母分泌表达SCR2重组菌的构建及其表达 |
| 3.3.2 C.parapsilosis/pCP-sy-his_6-scr2胞外发酵上清发现SCR同工酶特征性肽段 |
| 3.3.3 Pull down验证SCR2及其同工酶之间的相互作用 |
| 3.3.4 (S)-羰基还原酶异源聚合体形成随时间变化的规律 |
| 3.3.5 亲和标签对(S)-羰基还原酶的酶学性质的影响 |
| 3.3.6 带有小分子短肽类标签的异源聚合体的表达纯化 |
| 3.3.7 异源聚合体SCR2-SCR酶动力学特性分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 不同聚合体形态的(S)-羰基还原酶晶体结构解析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 基因克隆和大肠杆菌重组菌株的构建 |
| 4.2.3 TEV蛋白的过量表达和纯化 |
| 4.2.4 同源聚合体蛋白的过量表达和纯化 |
| 4.2.5 异源聚合体的过量表达和纯化 |
| 4.2.6 液相色谱分析异源聚合体蛋白的组分 |
| 4.2.7 尺寸排阻与多角度静态光散射计算蛋白在溶液中的分子量 |
| 4.2.8 结晶条件的筛选、X-射线衍射数据的收集和结构解析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 异源聚合体SCR2-SCR的组成成分分析 |
| 4.3.2 异源聚合体SCR2-SCR和同源聚合体的结晶 |
| 4.3.3 X-射线衍射数据的处理和结构精修 |
| 4.3.4 晶体结构分析 |
| 4.3.5 同源聚合体和异源聚合体三级结构的保守性 |
| 4.3.6 (S)-羰基还原酶四聚体界面组分变化与其酶动力学特征的关系 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 寡聚相互作用维持SDRs酶的活性口袋的结构 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 图像数据分析与处理 |
| 5.2.3 目的蛋白的表达和纯化 |
| 5.2.4 酶活力和酶动力学的测定 |
| 5.2.5 尺寸排阻与多角度静态光散射分析蛋白聚合体的形态 |
| 5.2.6 冷冻电镜的样品准备、数据收集与处理 |
| 5.2.7 寡聚体界面被掩埋的溶剂可接触面积分析 |
| 5.2.8 SCR同系物的信息挖掘和比较 |
| 5.2.9 SCR同系物的进化树分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 (S)-羰基还原酶晶体结构证明其三级和四级结构的高度保守性 |
| 5.3.2 蛋白结构数据挖掘揭示SDRs家族对称型四聚体的高度保守性 |
| 5.3.3 SCR对称型四聚体界面平衡被破坏进而影响其酶活力 |
| 5.3.4 冷冻电镜结构数据证明对称型四聚体界面稳定SCR四聚体界面螺旋 |
| 5.3.5 对称型四聚体对SDRs家族四聚体界面螺旋的意义 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 SDRs聚合体形态变化影响酶活的分子机制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株与质粒 |
| 6.2.2 目的蛋白的过量表达和纯化 |
| 6.2.3 酶动力学的测定 |
| 6.2.4 SEC-MALS分析蛋白聚合体的形态 |
| 6.2.5 Rosetta Sequence_Tolerance分析 |
| 6.2.6 荧光光谱技术测定蛋白和小分子的解离常数 |
| 6.2.7 Nanodrop测定底物的紫外吸收光谱 |
| 6.2.8 SCR/NADP/4-氯乙酰乙酸乙酯的结晶及其X-射线衍射数据的收集和结构解析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 聚合体形态变化后的SDRs仍能保持与小分子的结合能力 |
| 6.3.2 (S)-羰基还原酶突变点的设计、酶活功能验证及其聚合体形态分析 |
| 6.3.3 稳态荧光光谱差向异性法测定(S)-羰基还原酶与小分子的解离常数 |
| 6.3.4 SCR/NADP/4-氯乙酰乙酸乙酯结构解析展示蛋白三元复合体的结构保守性 |
| 6.3.5 Perrin图像法研究分子旋转扩散对蛋白差向异性及界面动态性的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附表 |
（2）代谢工程改造大肠杆菌和凝结芽孢杆菌生产生物活性物质（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 凝结芽孢杆菌概述 |
| 1.1.1 凝结芽孢杆菌的生理特性 |
| 1.1.2 凝结芽孢杆菌的应用 |
| 1.2 大肠杆菌概述 |
| 1.2.1 大肠杆菌基因组特性 |
| 1.2.2 大肠杆菌的应用 |
| 1.3 基因编辑技术 |
| 1.3.1 ZFN基因编辑技术 |
| 1.3.2 TALEN基因编辑技术 |
| 1.3.3 CRISPR-Cas基因编辑技术 |
| 1.4 N-乙酰氨基葡萄糖概述 |
| 1.4.1 N-乙酰氨基葡萄糖的结构及性质 |
| 1.4.2 代谢工程改造微生物合成N-乙酰氨基葡萄糖研究进展 |
| 1.5 生物活性物质的检测方法 |
| 1.5.1 离子交换色谱法(IC)及衍生技术 |
| 1.5.2 气相色谱/质谱联用法(GC/MS) |
| 1.5.3 高效液相色谱法(HPLC)及衍生技术 |
| 1.6 本研究的内容与意义 |
| 1.6.1 本研究的内容 |
| 1.6.2 本研究的意义 |
| 第二章 大肠杆菌和凝结芽孢杆菌CRISPR-Cas9 基因编辑工具的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 培养基及试剂的配制 |
| 2.1.3 试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 引物设计、基因合成及核酸测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌CRISPR-Cas9 基因编辑工具的建立 |
| 2.2.2 凝结芽孢杆菌CRISPR-Cas9 基因编辑工具的建立 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 大肠杆菌CRISPR-Cas9 基因编辑方法的建立 |
| 2.3.2 凝结芽孢杆菌CRISPR-Cas9 基因编辑方法的建立 |
| 2.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 代谢工程改造大肠杆菌生产N-乙酰氨基葡萄糖 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株与质粒 |
| 3.1.2 培养基及试剂的配制 |
| 3.1.3 试剂及试剂盒 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.1.5 引物设计、基因合成及核酸测序 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 质粒构建与转化 |
| 3.2.2 工程菌株构建 |
| 3.2.3 菌体生长曲线绘制 |
| 3.2.4 碳源利用测定 |
| 3.2.5 大肠杆菌MG1655-?pfk A?pfk B?zwf菌株和MG1655-?pfk A?pfk B菌株RT-qPCR表征 |
| 3.2.6 产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌菌株发酵及产物检测 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌底盘细胞的构建 |
| 3.3.2 基因敲除对碳源分解代谢的影响 |
| 3.3.3 RT-qPCR检测突变株代谢通路中的关键基因 |
| 3.3.4 产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌工程菌株的构建 |
| 3.3.5 产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌工程菌株发酵结果 |
| 3.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 N-乙酰氨基葡萄糖合成菌株的发酵条件优化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验菌株与质粒 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.1.3 试剂及试剂盒 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.1.5 培养基及化学试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 发酵培养基优化 |
| 4.2.2 荧光定量RT-qPCR |
| 4.2.3 葡萄糖、甘油、乙酸、N-乙酰氨基葡萄糖的HPLC检测 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 发酵培养基对大肠杆菌生长的影响 |
| 4.3.2 大肠杆菌发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖产量及碳源利用 |
| 4.3.3 荧光定量PCR |
| 4.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）奇异变形杆菌代谢芳香族氨基酸的机理研究及其初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 芳香族氨基酸简介 |
| 1.2 芳香族氨基酸在肠道微生物中的代谢产物简介 |
| 1.2.1 苯环类L-芳香族氨基酸代谢产物简介 |
| 1.2.2 L-色氨酸在肠道中的代谢产物简介 |
| 1.3 芳香族氨基酸代谢产物在人体中的作用机制 |
| 1.3.1 芳香族氨基酸代谢物对人体健康的影响 |
| 1.3.2 芳香族氨基酸代谢物对人体疾病的影响 |
| 1.4 芳香族氨基酸在肠道微生物中代谢的研究进展 |
| 1.5 奇异变形杆菌 |
| 1.5.1 奇异变形杆菌的群集现象 |
| 1.5.2 奇异变形杆菌在肠道疾病中的研究进展 |
| 1.5.3 奇异变形杆菌在其他方面的研究进展 |
| 1.6 论文的立题依据和研究内容 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 奇异变形杆菌中芳香族氨基酸代谢产物分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌种培养 |
| 2.3.2 全细胞催化 |
| 2.3.3 样品处理 |
| 2.3.4 分析方法 |
| 2.3.5 代谢物分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 芳香族氨基酸代谢中间产物分析 |
| 2.4.2 芳基丙酮酸的代谢产物分析 |
| 2.4.3 芳基乙胺的代谢产物分析 |
| 2.4.4 氧对奇异变形杆菌中芳香族氨基酸代谢产物的影响 |
| 2.4.5 代谢途径分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 芳香族氨基酸代谢潜在基因的预测及生化分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 试剂 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 潜在基因的生物信息学分析 |
| 3.3.2 相关基因的克隆及重组菌的构建 |
| 3.3.3 重组菌株的诱导表达 |
| 3.3.4 重组蛋白的制备和分离纯化 |
| 3.3.5 分析方法 |
| 3.3.6 相关酶的酶学性质研究 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 代谢相关基因的预测 |
| 3.4.2 潜在基因的保守结构域分析 |
| 3.4.3 基因的分子克隆和表达 |
| 3.4.4 转氨酶的酶学性质 |
| 3.4.5 α-羟酸脱氢酶的酶学性质 |
| 3.4.6 醛脱氢酶的酶学性质 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 奇异变形杆菌中芳香族氨基酸代谢途径的解析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌种培养 |
| 4.3.2 RNA提取 |
| 4.3.3 cDNA合成 |
| 4.3.4 荧光定量PCR |
| 4.3.5 分析方法 |
| 4.3.6 数据分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 奇异变形杆菌在不同培养基中的生长曲线 |
| 4.4.2 qPCR引物的验证 |
| 4.4.3 RT-q PCR解析奇异变形杆菌中2-苯乙醇合成的基因调节机制 |
| 4.4.4 RT-q PCR解析奇异变形杆菌中芳香族氨基酸代谢的基因调节机制 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 奇异变形杆菌中2-苯乙醇合成途径在大肠杆菌中的构建 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.2.4 试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 菌种培养 |
| 5.3.2 质粒和重组菌的构建 |
| 5.3.3 重组菌株的诱导表达 |
| 5.3.4 全细胞催化 |
| 5.3.5 分析方法 |
| 5.3.6 全细胞催化反应的条件优化 |
| 5.3.7 定点突变 |
| 5.3.8 突变体的相对酶活力分析 |
| 5.3.9 重组菌E-pREmKAG的5 L罐发酵与转化 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 大肠杆菌重构2-苯乙醇途径 |
| 5.4.2 重组菌株产2-苯乙醇的验证 |
| 5.4.3 Pm LAAD的改造 |
| 5.4.4 构建生产菌株 |
| 5.4.5 重组菌E-pREmKAG全细胞转化条件的优化 |
| 5.4.6 重组菌E-pREmKAG的5 L发酵罐诱导表达及转化 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:作者在攻读博士学位期间成果 |
| 附录 II:基因序列 |
| 附录 Ⅲ:用于统计学分析的P值 |
（4）L-乳酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶高效制备L-苯乳酸（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词注释表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 苯乳酸的概述 |
| 1.1.1 苯乳酸的结构和理化性质 |
| 1.1.2 苯乳酸的抑菌作用 |
| 1.1.3 苯乳酸的应用价值 |
| 1.2 苯乳酸的生物制备 |
| 1.2.1 微生物发酵法 |
| 1.2.2 生物酶催化法 |
| 1.3 乳酸脱氢酶 |
| 1.3.1 催化机理 |
| 1.3.2 来源和性质 |
| 1.4 辅酶再生系统 |
| 1.4.1 葡萄糖脱氢酶 |
| 1.4.2 辅酶循环策略 |
| 1.5 大肠杆菌和毕赤酵母表达系统 |
| 1.5.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.5.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.6 本课题的立题依据和主要研究内容 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和工具酶 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试剂、溶液和培养基 |
| 2.1.4 主要软件和网站 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 共表达重组菌的构建及其不对称还原PPA |
| 2.2.2 L-LcLDH1~(Q88A/I229A)与SyGDH酶液的制备及酶活性测定 |
| 2.2.3 辅酶NADH循环体系的验证和比较 |
| 2.2.4 L-LcLDH1~(Q88A/I229A)在毕赤酵母中表达及其酶学性质分析 |
| 2.2.5 SyGDH(Ec)粗酶的热处理 |
| 2.2.6 体外双酶偶联不对称还原苯丙酮酸催化条件的优化 |
| 2.2.7 NAD~+偏好性GDH在大肠杆菌中的表达以及稳定性分析 |
| 2.2.8 体外双酶偶联高效制备L-PLA的应用研究 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 体内辅酶循环体系的构建 |
| 3.1.1 共表达重组菌的构建 |
| 3.1.2 L-LcLDH1~(Q88A/I229A)与SyGDH的诱导表达 |
| 3.1.3 重组E.coli全细胞不对称还原PPA能力比较 |
| 3.1.4 共表达重组菌的诱导表达条件优化 |
| 3.2 体外辅酶循环体系的构建 |
| 3.2.1 游离酶的制备 |
| 3.2.2 辅酶NADH循环体系的构建和验证 |
| 3.3 L-LcLDH1~(Q88A/I229A)在毕赤酵母中表达 |
| 3.3.1 重组表达质粒的构建 |
| 3.3.2 重组毕赤酵母转化子的构建 |
| 3.3.3 重组毕赤酵母的诱导表达 |
| 3.3.4 重组酶的酶学性质测定 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 体外双酶偶联不对称还原苯丙酮酸的催化条件优化 |
| 3.4.1 GDH的热处理 |
| 3.4.2 温度和pH对催化反应的影响 |
| 3.4.3 PPA浓度对催化反应的影响 |
| 3.4.4 reLcLDH1~(Q88A/I229A)添加量对催化反应的影响 |
| 3.4.5 NAD~+浓度对催化反应的影响 |
| 3.4.6 葡萄糖浓度对催化反应的影响 |
| 3.4.7 小结 |
| 3.5 NAD~+偏好性GDH在 E.coli中的表达及其稳定性分析 |
| 3.5.1 辅酶再生GDH的选择拟定 |
| 3.5.2 BsGDH~(E170K/Q252L)和LsGDH~(D255C)表达载体的构建 |
| 3.5.3 BsGDH~(E170K/Q252L)和LsGDH~(D255C)的诱导表达和酶活性的测定 |
| 3.5.4 BsGDH~(E170K/Q252L)和LsGDH~(D255C)的稳定性分析 |
| 3.6 体外双酶偶联制备L-PLA的应用研究 |
| 3.6.1 NAD~+浓度的优化 |
| 3.6.2 LsGDH~(D225C)(ht)添加量的优化 |
| 3.6.3 体外双酶偶联不对称还原PPA的反应进程 |
| 3.6.4 分批添加PPA高效制备L-PLA |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（5）运动发酵单胞菌双报告基因系统及CRISPR-Cas12a基因组编辑系统的构建与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 绪论 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 运动发酵单胞菌 |
| 1.1.1 运动发酵单胞菌简介 |
| 1.1.2 运动发酵单胞菌生理特点 |
| 1.1.3 运动发酵单胞菌基因组注释和分析 |
| 1.1.4 运动发酵单胞菌的性状改良 |
| 1.1.5 运动发酵单胞菌遗传操作系统 |
| 1.2 非编码生物元件的筛选和鉴定 |
| 1.2.1 非编码生物元件 |
| 1.2.2 非编码生物元件的鉴定方法 |
| 1.2.3 基因表达调控系统 |
| 1.3 常用的基因编辑技术 |
| 1.3.1 锌指核酸酶(ZFNs) |
| 1.3.2 类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs) |
| 1.3.3 CRISPR基因编辑系统 |
| 1.4 CRISPR-Cas系统简介 |
| 1.4.1 CRISPR-Cas系统的发现 |
| 1.4.2 CRISPR-Cas系统的分类 |
| 1.4.3 CRISPR-Cas系统的结构 |
| 1.4.4 CRISPR-Cas系统的作用机制 |
| 1.4.5 CRISPR-Cas系统的应用研究 |
| 1.4.6 CRISPR-Cas12a系统 |
| 1.4.7 Anti-CRISPR-Cas系统 |
| 1.4.8 Cas蛋白突变体 |
| 1.4.9 CRISPR-Cas系统在运动发酵单胞菌的应用现状 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 |
| 1.5.1 双报告基因检测系统的构建及遗传元件的筛选 |
| 1.5.2 运动发酵单胞菌基因编辑系统的构建 |
| 1.5.3 运动发酵单胞菌基因表达调控系统的构建 |
| 第2章 双报告基因检测系统的构建及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 培养基及培养条件 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.2.4 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 感受态制备方法 |
| 2.3.2 载体构建方法 |
| 2.3.3 转化方法 |
| 2.3.4 重组菌株的筛选 |
| 2.3.5 PAGE电泳及蛋白质印记 |
| 2.3.6 流式细胞术分析荧光强度 |
| 2.3.7 荧光定量PCR |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 荧光蛋白的选择及鉴定 |
| 2.4.2 运动发酵单胞菌对诱导物的耐受分析 |
| 2.4.3 双荧光系统的构建 |
| 2.4.4 利用双荧光报告系统鉴定基因元件 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 CRISPR-Cas12a介导的基因编辑系统 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基及培养条件 |
| 3.2.3 主要实验试剂 |
| 3.2.4 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 CRISPR-Cas12a重组菌株构建 |
| 3.3.2 CRISPR靶向质粒的构建 |
| 3.3.3 乳酸产量检测方法 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 CRISPR-Cas12a重组菌株及编辑质粒的构建 |
| 3.4.2 CRISPR-Cas12a重组菌株的功能验证 |
| 3.4.3 CRISPR-Cas12a介导的内源质粒消除 |
| 3.4.4 CRISPR-Cas12a介导的ssDNA重组 |
| 3.4.5 CRISPR-Cas12a介导的基因敲除和基因替换 |
| 3.4.6 CRISPR-Cas12a系统协助构建产乳酸菌株 |
| 3.4.7 在运动发酵单胞菌中重构NHEJ修复途径 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 CRISPR-dCas12a介导的基因调控系统 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 培养基及培养条件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 定点突变 |
| 4.3.2 重组菌株的构建 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 重组菌株的构建 |
| 4.4.2 重组菌株的功能验证 |
| 4.4.3 CRISPR-dCas12a系统抑制报告基因的表达 |
| 4.4.4 靶向链的选择对影响抑制效果的影响 |
| 4.4.5 两种突变方式对抑制效果的影响 |
| 4.4.6 gRNA的错配对抑制效果的影响 |
| 4.4.7 gRNA的序列的长度对抑制效果的影响 |
| 4.4.8 CRISPR-dCas12a系统介导的转录激活系统 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 结合组学数据及双报道基因体系实现生物元件的挖掘与鉴定 |
| 5.1.2 构建CRISPR-Cas12a基因编辑系统及其在代谢工程中的应用 |
| 5.1.3 开发基于CRISPR-dCas12a的基因调控工具 |
| 5.2 展望 |
| 5.2.1 以双报告基因平台为基础,研究生物元件的动态变化 |
| 5.2.2 构建crRNA共表达簇,实现多基因同步敲除或共抑制 |
| 5.2.3 构建靶向全基因组gRNA文库,用于功能性基因筛选研究 |
| 5.2.4 在运动发酵单胞菌中构建转录激活系统 |
| 5.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生在读期间成果 |
（6）噬菌体在烧伤泛耐药细菌感染治疗中的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 烧伤后感染严重危害患者安全,抗生素应用逐渐受限 |
| 1.2 噬菌体良好的抗菌效果日益受到重视,但其机制仍需研究 |
| 1.3 噬菌体-宿主相互作用研究意义重大 |
| 第二章 转录组学揭示鲍曼不动杆菌噬菌体-宿主相互作用网络 |
| 2.1 φAbp1 感染宿主菌的生长曲线和RNA-seq设计 |
| 2.2 φAbp1 接管宿主细胞中的转录资源 |
| 2.3 GO/KEGG分析 |
| 2.4 噬菌体-宿主相互作用分析 |
| 2.5 宿主菌AB1 耐药毒力基因表达分析 |
| 2.6 讨论和总结 |
| 第三章 铜绿假单胞菌噬菌体φPaP3 早期基因产物Gp68 抑制细菌分裂. |
| 3.1 orf67/orf68/orf69 基因簇作用研究 |
| 3.2 Gp68 显着抑制宿主菌PA3 的细菌分裂 |
| 3.3 RNA-seq寻找Gp68 抑制分裂的作用靶点 |
| 3.4 敲除、回补minD基因验证Gp68 作用靶点 |
| 3.5 总结与讨论 |
| 第四章 Gp68 降低细菌毒力耐药性 |
| 4.1 Gp68 抑制铜绿假单胞菌PA3 色素产生 |
| 4.2 RNA-seq寻找Gp68 抑制色素产生的靶点 |
| 4.3 敲除、回补mvaT基因证实Gp68 减弱细菌毒力和耐药性 |
| 4.4 讨论与总结 |
| 第五章 Gp68 作为转录因子,广泛调控细菌基因表达 |
| 5.1 Gp68 蛋白结合于于minD和 mvaT的 CDS前 |
| 5.2 生物信息学分析 |
| 5.3 基因报告系统证实Gp68 结合于靶基因的启动子区 |
| 5.4 讨论与总结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 噬菌体编码的抑菌蛋白研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 噬菌体治疗脓毒症的免疫作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 硕博连读期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（7）菊糖在结核分枝杆菌和寨卡病毒亚单位疫苗中的佐剂作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 概述 |
| 2 菊糖的研究进展 |
| 2.1 菊糖的结构 |
| 2.2 菊糖的理化性质 |
| 2.3 影响菊糖结构和含量的天然因素 |
| 2.4 菊糖的天然来源及提取 |
| 2.5 菊糖在植物中的功能 |
| 2.6 菊糖在功能食品中的应用 |
| 2.7 菊糖在药物中的应用 |
| 2.8 菊糖的免疫调节功能 |
| 2.9 菊糖的佐剂作用 |
| 3 亚单位疫苗佐剂研究进展 |
| 3.1 亚单位疫苗佐剂的重要性及其作用机制 |
| 3.2 亚单位疫苗佐剂的分类 |
| 3.3 亚单位疫苗递送系统 |
| 3.4 目前被批准使用的佐剂 |
| 3.5 目前佐剂的安全性及局限性 |
| 3.6 高效佐剂的策略 |
| 4 结核病及结核分枝杆菌疫苗 |
| 4.1 结核病流行现状 |
| 4.2 结核分枝杆菌简介 |
| 4.3 结核分枝杆菌疫苗卡介苗 |
| 4.4 新型结核病疫苗研制策略 |
| 5 寨卡病毒流行病学特征及疫苗进展 |
| 5.1 寨卡病毒生物学特征 |
| 5.2 寨卡病毒致病机制 |
| 5.3 寨卡病毒免疫应答特征 |
| 5.4 寨卡疫苗研究进展 |
| 5.5 寨卡疫苗研究挑战 |
| 6 本论文研究的目的意义及主要研究内容 |
| 6.1 本论文研究的目的意义 |
| 6.2 本论文研究的主要内容 |
| 第二章 菊糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料与试剂 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 融合蛋白CFP10-TB10.4的表达、纯化和鉴定 |
| 2.2 分子排阻色谱纯化 CFP10-TB10.4 融合蛋白疫苗 |
| 2.3 CFP10-TB10.4蛋白疫苗的质量控制 |
| 2.4 分子排阻色谱分析纯化后的CFP10-TB10.4融合蛋白疫苗 |
| 2.5 动态光散射分析佐剂修饰后的CFP10-TB10.4融合蛋白水化半径 |
| 2.6 圆二色光谱检测佐剂对CFP10-TB10.4融合蛋白二级结构的影响 |
| 2.7 内源荧光光谱检测佐剂对CFP10-TB10.4融合蛋白三级级结构的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 菊糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗免疫原性及药代动力学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 佐剂对CFP10-TB10.4 特异性抗体IgG滴度的影响 |
| 2.2 佐剂特异性IgG抗体滴度测定 |
| 2.3 血清中抗体的CFP10-TB10.4融合蛋白特异性检测 |
| 2.4 佐剂对脾淋巴细胞增殖水平的影响 |
| 2.5 佐剂对小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子水平的影响 |
| 2.6 佐剂对抗原在小鼠体内代谢动力学的影响 |
| 2.7 CT 样品药代动力学分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 结核分枝杆菌感染的免疫应答特征 |
| 3.2 菊糖与CRM_(197)协同使用对CFP10-TB10.4 蛋白免疫原性的影响 |
| 3.3 佐剂的免疫原性及安全性 |
| 3.4 菊糖协同CRM197作为佐剂的作用机制 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 菊糖修饰的寨卡病毒E蛋白亚单位疫苗的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂、质粒和仪器 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 E蛋白的表达,纯化和表征 |
| 2.2 寨卡E蛋白亚单位疫苗的纯化 |
| 2.3 圆二色光谱检测佐剂对E蛋白二级结构的影响 |
| 2.4 内源荧光光谱检测佐剂对E蛋白二级结构的影响 |
| 2.5 佐剂修饰后的寨卡E蛋白分子排阻色谱分析 |
| 2.6 动态光散射检测佐剂对的寨卡E蛋白分子半径的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 菊糖修饰的ZIKV亚单位疫苗免疫原性及佐剂作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 佐剂对小鼠IgG抗体滴度的影响 |
| 2.2 抗菊糖佐剂特异性抗体的检测 |
| 2.3 佐剂对小鼠脾淋巴细胞的转化率的影响 |
| 2.4 流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD4~+T和 CD8~+T亚群分布 |
| 2.5 流式细胞术检测脾淋巴细胞的胞内细胞因子 |
| 2.6 菊糖佐剂修饰对抗原提呈细胞摄取抗原E蛋白的影响 |
| 2.7 菊糖修饰的E亚单位疫苗安全性初步研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 ZIKV引起的免疫应答特征 |
| 3.2 菊糖和洛索立宾对E蛋白免疫原性的影响 |
| 3.3 菊糖和洛索立宾协同作用的机制 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 腈类化合物 |
| 1.1.1 腈类化合物的作用 |
| 1.1.2 腈类的微生物转化 |
| 1.2 腈水合酶 |
| 1.2.1 腈水合酶 |
| 1.2.2 腈水合酶的催化机理 |
| 1.2.3 腈水合酶的来源及基因结构 |
| 1.3 翻译后修饰 |
| 1.3.1 亚基自身交换 |
| 1.3.2 金属伴随子 |
| 1.4 腈水合酶的工业应用 |
| 1.5 腈水合酶的改造 |
| 1.5.1 腈水合酶生产存在的问题 |
| 1.5.2 大肠杆菌的异源表达 |
| 1.5.3 腈水合酶稳定性改造策略 |
| 1.6 本文研究内容 |
| 1.6.1 立题依据及研究意义 |
| 1.6.2 本文主要研究内容 |
| 第二章 亚基融合型腈水合酶的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与载体 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 培养基及培养条件 |
| 2.2.5 基因操作 |
| 2.2.6 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.7 酶活测定 |
| 2.2.8 钴含量测定 |
| 2.2.9 最适pH测定 |
| 2.2.10 热稳定性测定 |
| 2.2.11 产物耐受性测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 融合型腈水合酶的构建及表达 |
| 2.3.2 融合型腈水合酶的表征 |
| 2.3.3 调控蛋白融合位置的影响 |
| 2.3.4 融合型腈水合酶的理化性质测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 融合型腈水合酶的热稳定性改造 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株质粒 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 培养基及培养条件 |
| 3.2.4 基因操作 |
| 3.2.5 蛋白表达及纯化 |
| 3.2.6 酶活及动力学参数测定 |
| 3.2.7 动力学及热力学稳定性测定 |
| 3.2.8 同源建模 |
| 3.2.9 计算模拟 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 融合型腈水合酶的同源建模 |
| 3.3.2 融合型腈水合酶突变体库的构建 |
| 3.3.3 突变体的筛选 |
| 3.3.4 正向突变体的酶学表征 |
| 3.3.5 正向突变体的结构分析 |
| 3.3.6 正向突变体分子间相互作用探究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 融合型腈水合酶成熟机理探究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与载体 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 蛋白表达与纯化 |
| 4.2.4 腈水合酶的体外激活 |
| 4.2.5 紫外-可见光扫描 |
| 4.2.6 基于NanoLC-ESI-MS/MS的半胱氨酸氧化状态测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 融合型腈水合酶的体外激活 |
| 4.3.2 腈水合酶的紫外—可见光光谱扫描 |
| 4.3.3 融合型腈水合酶活性中心的翻译后修饰分析 |
| 4.3.4 融合型腈水合酶成熟机理 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 调控蛋白的金属伴随子功能探究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与载体 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 质粒构建 |
| 5.2.4 蛋白表达与纯化 |
| 5.2.5 酶活与动力学参数测定 |
| 5.2.6 钴离子的光谱扫描及含量测定 |
| 5.2.7 钴离子与调控蛋白的结合 |
| 5.2.8 测定调控蛋白与腈水合酶的结合 |
| 5.2.9 从头建模及分子动力学模拟 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 调控蛋白对融合型腈水合酶活性的影响 |
| 5.3.2 单独调控蛋白的获取 |
| 5.3.3 单独调控蛋白的表征 |
| 5.3.4 单独调控蛋白对融合型腈水合酶的体外激活 |
| 5.3.5 异源调控蛋白对融合型腈水合酶的体内激活 |
| 5.3.6 钴离子与调控蛋白体外结合的分析 |
| 5.3.7 调控蛋白与脱辅基酶的结合分析 |
| 5.3.8 调控蛋白模型的建立及动力学分析 |
| 5.3.9 调控蛋白钴离子结合位点的分析 |
| 5.3.10 金属伴随子激活模型 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 天然融合型腈水合酶成熟机理探究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株与载体 |
| 6.2.2 培养条件 |
| 6.2.3 基因合成及密码子优化 |
| 6.2.4 包涵体的检测 |
| 6.2.5 蛋白表达与纯化 |
| 6.2.6 酶活及热稳定性测定 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的异源表达 |
| 6.3.2 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的表达优化 |
| 6.3.3 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的活性及热稳定性 |
| 6.3.4 异源调控蛋白对M.brevicollis天然融合型腈水合酶的激活 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 ：作者在攻读博士期间发表的论文 |
（9）成纤维细胞生长因子14表达及神经保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 成纤维细胞生长因子概述 |
| 1.2 FGF14 研究进展 |
| 1.3 蛋白表达的研究进展 |
| 1.4 论文选题的目的及意义 |
| 1.5 本论文研究内容 |
| 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器与材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.2.1 菌种及载体 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.3.1 常用试剂配制 |
| 2.1.3.2 培养基配制 |
| 2.1.3.3 菌体处理缓冲液配方 |
| 2.1.3.4 细胞培养相关溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组蛋白表达载体的构建 |
| 2.2.1.1 目的基因合成 |
| 2.2.1.2 质粒抽提 |
| 2.2.1.3 pUC57-hFGF14 质粒及载体p ET15b质粒的双酶切 |
| 2.2.1.4 双酶切产物鉴定 |
| 2.2.1.5 酶切目的片段FGF14、载体p ET15bp片段胶回收 |
| 2.2.1.6 连接 |
| 2.2.1.7 转化 |
| 2.2.1.8 连接产物的鉴定 |
| 2.2.2 重组蛋白的诱导表达和纯化 |
| 2.2.2.1 重组载体的表达菌转化 |
| 2.2.2.2 重组蛋白扩大培养 |
| 2.2.2.3 重组蛋白的可溶性鉴定 |
| 2.2.2.4 包涵体的洗涤 |
| 2.2.2.5 包涵体的变复性 |
| 2.2.2.6 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.3 FGF14 在细胞中促增殖作用 |
| 2.2.3.1 NIH3T3 细胞,PC12 细胞的复苏、培养与保存 |
| 2.2.3.2 CCK8 法检测FGF14在NIH3T3 细胞中的促增殖活性 |
| 2.2.3.3 CCK8 检测FGF14在PC12 细胞中的促增殖活性 |
| 2.2.3.4 CCK8 法检测FGF14 结合肝素在PC12 细胞中的促增殖活性 |
| 2.2.4 FGF14对PC12 细胞的神经保护作用 |
| 2.2.4.1 Aβ25-35诱导PC12 细胞损伤阿尔兹海默症模型的构建 |
| 2.2.4.2 FGF14对Aβ25-35诱导PC12 细胞损伤模型的促增殖作用 |
| 2.2.4.3 FGF14对Aβ25-35细胞损伤阿尔兹海默症模型中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase LDH)活性检测 |
| 2.2.4.4 FGF14对Aβ25-35细胞损伤阿尔兹海默症模型中丙二醛(MDA)活性检测 |
| 2.2.4.5 Calcein-AM/PI双染色检测细胞凋亡 |
| 2.2.4.6 流式细胞仪检测细胞的凋亡率 |
| 2.2.5 FGF14对Aβ25-35细胞损伤阿尔兹海默症模型的保护作用机制研究 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 第三章 结果和分析 |
| 3.1 重组质粒的鉴定及序列分析 |
| 3.2 FGF14 蛋白的表达和纯化 |
| 3.2.1 FGF14 蛋白表达及条件优化 |
| 3.2.2 FGF14 蛋白的可溶性鉴定 |
| 3.2.3 FGF14 包涵体的洗涤 |
| 3.2.4 FGF14 包涵体的变性及复性 |
| 3.2.5 FGF14 蛋白的纯化 |
| 3.3 FGF14 在细胞中的促增殖作用 |
| 3.3.1 CCK8 法检测FGF14在NIH3T3 细胞中的促增殖作用 |
| 3.3.2 CCK8 法检测FGF14对PC12 细胞中的促增殖作用 |
| 3.3.3 CCK8 法检测FGF14 结合肝素在PC12 细胞中的促增殖活性 |
| 3.4 FGF14对PC12 细胞的神经保护作用 |
| 3.4.1 不同浓度Aβ25-35不同时间对PC12 细胞的损伤作用 |
| 3.4.3 不同浓度FGF14 蛋白对Aβ25-35诱导PC12 细胞建立损伤模型的保护作用 |
| 3.4.4 LDH和 MDA含量测定 |
| 3.4.5 Calcein-AM/PI双染色检测FGF14对Aβ25-35损伤PC12 阿尔兹海默症模型的保护作用 |
| 3.4.6 FGF14对Aβ25-35诱导的PC12 细胞凋亡的影响 |
| 3.5 FGF14对Aβ25-35诱导的MAPK信号通路的影响 |
| 第四章 全文讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在校期间成果及论文发表情况 |
（10）人精子特异性乳酸脱氢酶L153X突变体原核和真核表达载体的构建及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 人精子特异性乳酸脱氢酶概述 |
| 1.1.1 人精子特异性乳酸脱氢酶简介 |
| 1.1.2 人精子特异性乳酸脱氢酶的组织分布 |
| 1.1.3 人精子特异性乳酸脱氢酶在精子内定位 |
| 1.1.4 人精子特异性乳酸脱氢酶与其他LDH同工酶的异同 |
| 1.2 人精子特异性乳酸脱氢酶与精子功能 |
| 1.2.1 人精子特异性乳酸脱氢酶与能量代谢 |
| 1.2.2 人精子特异性乳酸脱氢酶与精子运动 |
| 1.2.3 人精子特异性乳酸脱氢酶与精子获能 |
| 1.2.4 人精子特异性乳酸脱氢酶与顶体反应 |
| 1.3 引起人精子特异性乳酸脱氢酶功能异常的三大因素 |
| 1.3.1 环境因素 |
| 1.3.2 免疫因素 |
| 1.3.3 遗传因素 |
| 1.4 人精子特异性乳酸脱氢酶的检测及应用前景 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 人精子特异性乳酸脱氢酶L153X突变体表达载体构建与鉴定 |
| 3.1.1 L153X突变体原核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.1.2 L153X突变体真核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.2 人精子特异性乳酸脱氢酶L153X突变体原核表达载体表达分析 |
| 3.2.1 原核表达载体诱导表达产物鉴定 |
| 3.2.2 讨论 |
| 3.3 人精子特异性乳酸脱氢酶L153X突变体真核表达载体表达分析 |
| 3.3.1 真核表达载体表达产物鉴定 |
| 3.3.2 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表交流论文 |
| 致谢 |
四、Expression and characterization of mouse lactate dehydrogenase subunit C in Escherichia coli.（论文参考文献）
- [1]近平滑假丝酵母（S）—羰基还原酶不同聚合体的结构与功能及催化机制[D]. 李尧慧. 江南大学, 2021
- [2]代谢工程改造大肠杆菌和凝结芽孢杆菌生产生物活性物质[D]. 王凯凯. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]奇异变形杆菌代谢芳香族氨基酸的机理研究及其初步应用[D]. 刘金彬. 江南大学, 2020(04)
- [4]L-乳酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶高效制备L-苯乳酸[D]. 张婷. 江南大学, 2020(12)
- [5]运动发酵单胞菌双报告基因系统及CRISPR-Cas12a基因组编辑系统的构建与应用[D]. 沈威. 湖北大学, 2020(01)
- [6]噬菌体在烧伤泛耐药细菌感染治疗中的机制研究[D]. 杨子晨. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019
- [7]菊糖在结核分枝杆菌和寨卡病毒亚单位疫苗中的佐剂作用研究[D]. 胡瞬. 湖南农业大学, 2019(01)
- [8]亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究[D]. 夏媛媛. 江南大学, 2019(12)
- [9]成纤维细胞生长因子14表达及神经保护作用研究[D]. 王宝慧. 温州大学, 2019(01)
- [10]人精子特异性乳酸脱氢酶L153X突变体原核和真核表达载体的构建及鉴定[D]. 李丹. 厦门大学, 2019(01)