一、全长cDNA文库的构建和新基因全长cDNA克隆的策略（论文文献综述）
蒋雨函[1]（2017）在《长白山药用真菌鸡爪苓菌核cDNA文库构建及EST序列分析》文中认为鸡爪苓[Polyporus umbellatus（Pers.）Fries]是我国长白山区特有的猪苓种质资源,具有一定的药用价值。鸡爪苓的生活史经历菌丝体-菌核-子实体3个重要时期。本论文研究鸡爪苓菌核表达序列标签（EST）,为深入研究该珍稀药用真菌的生长发育、代谢调控以及优质种质资源的开发、利用与保护提供理论基础。以采自吉林省蛟河市天南乡解放村的鸡爪苓菌核为原始材料,通过Trizol改良法提取总 RNA,产量为 6.24μg;SMARTTM cDNA Library Construction Kit试剂盒构建cDNA文库,原始文库的滴度3.4×106pfu/mL,重组率为93.68%,扩增文库滴度为1.304×1010pfu/mL,文库容量约为3.13×1012pfu;随机筛选500个单独克隆进行单方向测序,获得455条有效的EST序列,经聚类分析得到单基因簇共349条,文库冗余度为23%;参照拟南芥功能分类标准,将BLAST x比对结果中具有已知功能的78条单基因簇分成9类,分别是代谢、能量、转录、蛋白质合成、细胞结构、胞内运输、信号转导、抗性防御及未确定分类;仅有183条获得1条或1条以上GO术语,其中细胞组分包括7个部分,分子功能包括5个部分,生物学过程包括16个部分;发现12条全长的ESTs序列,均含有开放阅读框和蛋白质保守结构域,预测其编码的蛋白质并进行生物学信息分析。结果表明,成功提取鸡爪苓菌核总RNA,并构建了高质量cDNA文库,EST测序分析鸡爪苓菌核形成及发育过程中的功能基因,并为目的基因的特异性克隆奠定理论基础。
张冬桃[2]（2016）在《乌龙茶做青过程香气形成相关基因的分离与表达》文中进行了进一步梳理乌龙茶是福建省最主要的生产茶类,2014年乌龙茶产量达19.75万t,占全省茶叶总产量的53%。乌龙茶加工工艺独特,成品茶香气浓郁,滋味浓醇甘爽,品质优异,深受广大消费者的青睐,具有较高的经济价值和广阔的市场前景。茶叶香气物质的形成与萜烯类代谢途径、苯丙烷代谢途径、脂类代谢途径、氨基酸代谢途径、糖苷水解途径、儿茶素代谢途径等密切相关。做青工序是乌龙茶加工过程的关键工序,与成品茶的香气形成密切相关。本研究以铁观音鲜叶为供试材料,构建铁观音均一化cDNA文库,进行EST测序与分析,筛选出乌龙茶香气形成相关基因;以铁观音鲜叶和杀青前叶片为供试材料,构建抑制差减杂交cDNA文库,采用Northern-blotting筛选该文库,筛选出差异基因的阳性克隆,通过测序与EST分析,对香气形成相关基因进行生物信息学分析,预测其功能;采用荧光定量PCR技术,对获得的香气形成相关基因在茶树新梢不同发育时期、不同叶位及做青过程不同阶段的表达量进行检测,通过本研究初步阐明了乌龙茶做青过程中香气形成的分子机制,对于茶树种质创新、抗性育种、高香茶产品的研制都具有理论意义及应用价值。本研究的主要研究结果如下:1.构建了铁观音茶树均一化全长cDNA文库,分离出若干与乌龙茶香气形成相关的关键基因:以铁观音鲜叶总RNA为供试材料,结合两步法逆转录、抑制LA-PCR和DSN处理的方法,构建了铁观音茶树均一化全长cDNA文库,发现了若干参与乌龙茶香气形成的重要基因。经检测,该文库的初始滴度为1.97×105 cfu/mL,重组率为96.4%,插入片段在250-2 500 bp之间,平均大小为1200 bp,文库质量良好。从该文库随机挑取211个克隆进行测序,共获得178条有效的ESTs序列;序列拼接后有9条重复,冗余率为5.0%,因此首批共获得169条茶树ESTs。将测序结果在NCBI核酸数据库中进行Blast N 比对后,对序列进行功能注释和归类分析,结果显示,已知功能基因序列107条（约占63%）,推测的功能基因序列36条（约占21%）,未知基因序列19条（约占11%）,已知染色体定位基因序列7条（约占4%）;从中发现5个基因与乌龙茶香气形成相关,分别为NDR、IDI、NMT、HMGCL和SSL,其中参与萜类代谢途径3个（IDI、NDR和SSL）,参与脂肪酸代谢途径（HMGCL）和苯丙烷代谢途径（NMT）各1个;同时还获得了 bHLH、WRKY和MYB等转录因子基因。2.构建了铁观音DSN介导-抑制差减杂交cDNA文库,筛选获得若干乌龙茶差异表达的香气相关基因:以铁观音鲜叶和杀青前叶总RNA为供试材料,经过两步法逆转录、ds cDNA扩增、ds cDNA杂交、DSN处理及差异cDNA扩增等步骤,成功构建了 DSN介导-抑制差减杂交cDNA文库,该文库的初始滴度为4.3×104cfu/mL,重组率为98%,插入片段在250-2500 bp之间,平均大小为1800bp;从该文库中随机挑取260个克隆,进行反向Northern-Blotting筛选,获得62个阳性克隆,阳性率为23.8%,对阳性克隆进行测序,获得了 60条有效序列,有2条出现重复,冗余率为3.22%;BLAST分析结果表明,在所获得的60条差异基因序列中,有34条为已知的功能基因序列,有10条为推测的功能基因序列,有12条为未知基因序列;其中与乌龙茶香气有关的差异基因序列有4条,分别为:G-10-H、SHT、SAMT和XPT,且这些差异基因是萜类代谢途径的关键基因,还获得了 14条与逆境胁迫相关的基因及激素应答的转录因子基因序列（ASIL、乙烯反应转录因子、乙烯应答元等）。3.对所获得的9个乌龙茶香气形成相关基因（CsIDI、NDR、G-10-H、SAMT、XPT、SHT、SSL、HMGCL和NMT）进行了生物信息学分析:对乌龙茶香气相关基因的克隆进行测序,结果表明:（1）CsIDI全长cDNA为1200 bp,含有194bp的5’-UTR、305 bp的3/-UTR和717 bp的ORF,编码238个氨基酸;（2）NDR序列长度为1075bp,含有44 bp的5/-UTR、128 bp的3’-UTR和903 bp的ORF,编码300个氨基酸;（3）G-10-H序列长度为 1713bp,含有 56 bp 的 5’-UTR、163 bp 的 3’-UTR 和 1494bp 的 ORF,编码 497 个氨基酸;（4）SAMT序列长度为 1019bp,含有 111 bp 的 5/-UTR、164 bp 的3/-UTR 和 744 bp 的ORF,编码247个氨基酸;（5）XPT序列长度为1568bp,含有109 bp的5’-UTR、139 bp的3’-UTR和1320 bp的ORF,439个氨基酸;（6）SHT序列长度为1532bp,含有69bp的5’-UTR、98 bp的3’-UTR和1365 bp的ORF,编码454个氨基酸;（7）SLL序列长度为1395bp,含有 93 bp 的5/-UTR、165 bp 的 3’-UTR 和 1137 bp 的 ORF,编码 378 个氨基酸;（8）HMGCL序列长度为 1553bp,含有 51 bp 的 5’-UTR、509 bp 的 3/-UTR 和 993 bp 的 ORF,编码 330个氨基酸;（9）NMT序列长度为1964bp,含有47 bp的5’-UTR、348 bp的3/-UTR和1569 bp的ORF,编码522个氨基酸。BLAST P分析结果表明,CsIDI基因在氨基酸序列上与葡萄、黄芪、橄榄、芝麻等植物的同源性都很高,达94%以上;NDR与咖啡、番茄、杨树、麻风树等植物的同源性不高,在68%～70%;G-10-H与黄金鸡纳树、蛇根草、水甘草的同源性较低,仅为65%～68%;SAMT与茶树（登录号:JQ406919.1）的同源性为99%,与可可、杨树、甜橙的同源性均为60%以上;XPT与芝麻、烟草、胡杨树、咖啡等植物的同源性均在73%～76%以上;SHT与莲、葡萄、梨树、苹果等植物的同源性均在54%～56%;SSL与葡萄、枣、柑橘、甜橙等植物同源性在68%～73%;HMGCL与出芽短梗霉菌的丙酮酸羧基转移酶、出芽短梗杆菌的HMGCL和黑醋杆菌的醛缩酶（二磷酸果糖酶）的同源性为77%～99%;NMT与葡萄、枣、芝麻、柑橘同源性在70%～82%。在线软件SOPMA分析CsIDI蛋白是Nudix水解酶家族成员,包含IPP异构酶位点、Idi蛋白保守区、金属结合部位和活性部位区;NDR是NADB家族成员,具有carb-red-PTCR-like和fabG保守的结构域,包含NDR的活性部位、辅酶结合部位和底物结合部位;G-10-H是p450 家族成员,包含 P450-rel-GT-act 和 P450-cycloAA-1 CypX 位点、PLN02738 和 MRS6 等结构功能域;SAMT是Methyltransf-7超级家族家族成员,包含Methyltransf和PLN02668两个结构功能域;XPT蛋白是EamA超级家族成员,包含EamA和TPT结合位点;SHT是Condensation和BAHD酰基转移酶家族成员;SSL是Str-synth和NHL超级家族成员,包含NHL和YvrE功能结构域;HMGCL是TIM-phosphate-binding超级家族成员,包含DRE-TIM-HMGL保守功能结构域及活性部位、金属结合部位;NMT包含rRNA-processing和nop2p保守功能结构域。综上所述,本研究所获得的9个香气基因均是茶树CsIDI、NDR、G-10-H、SAMT、XPT、SHT、SSL、HMGCL和NMT的同源基因,除了HMGCL参与脂肪酸代谢途径、NMT参与苯丙烷代谢途径外,其余7个基因均参与萜类代谢途径。4.筛选出了乌龙茶香气形成相关基因（CsIDI、NDR、G-10-H、SAMT、XPT、SHT、SSL、HMGCL和NMT）在不同发育时期、不同叶位及做青过程不同阶段表达量的变化规律:以茶树GAPDH为内参基因,采用荧光定量PCR技术,检测这9个基因在在不同发育时期、不同叶位及做青过程不同阶段表达量的动态变化,结果表明,在萜类代谢途径中,CsIDI、NDR、G-10-H、SAMT、XPT、SHT和SSL的表达量,随着发育过程和做青过程的推进,呈上调趋势,第三叶和第四叶的表达量高于第一叶和第二叶,与乌龙茶采摘标准需一定成熟度的开面叶相一致。参与脂类代谢途径途径的HMGCL在铁观音做青过程中,该基因的表达量也呈上调趋势,且上调幅度较大;HMGCL的表达量随着发育过程的推进和叶位的下移,表达量出现上调趋势,与乌龙茶采摘需要一定成熟度相一致。NMT参与苯丙烷代谢途径,其表达量在做青过程中动态表达呈上调趋势,且上调幅度较大;发育过程和不同部位的动态表达随发育进程和成熟度增加而增加,与乌龙茶采摘标准需要一定成熟度相一致。
黄佳榕[3]（2016）在《福建柏叶片cDNA文库的构建及EST分析》文中进行了进一步梳理福建柏,为柏科福建柏属,是国家二级保护植物,也是我国特有的珍贵树种。本文从福建柏的资源概述、生物学特性及生态学习性、生态园林应用价值、培育及栽培技术等方面总结,在更深层次的分子克隆、代谢途径及蛋白功能的研究基本属于空白,有待于进一步探究。本研究采用多种福建柏叶片总RNA提取方法,并建立cDNA文库和EST分析。本研究主要结论如下：1、对比CTAB法、Trizol法、CTAB-LiCl法、天根RNA提取试剂盒法、百泰克RNA提取试剂盒法共5种方法提取总RNA。试验结果表明：采用CTAB-LiCl法提取福建柏叶片总RNA,提取的总RNA能达到试验要求,只是时间较长、过程相对繁琐,但成本较低,其它4种方法不适合提取福建柏叶片总RNA。2、选取符合要求的福建柏叶片总RNA进行cDNA文库的构建,在合成cDNA的过程中,对dscDNA的起始材料、LD-PCR最优循环数和载体连接比例进行了优化,最终得到了质量符合要求的cDNA文库。试验分别确定了ds cDNA合成的原始材料是第一链原液2μL,最优循环数为第18循环,载体与cDNA的最佳连接比例是1：1.96,文库滴度为3.6x106cfu·mL-1,重组率为84.6%,检测到插入的片段大小在400-2000bp之间,扩增后的文库平均滴度是5.61×107cfu·mL-1。3、通过测序共获得212个有效的EST序列,GC的含量为46.8%,平均长度530.83bp;对212条序列进行拼接与聚类,共得到77条单拷贝序列（unigene）,文库的冗余度为53.3%。福建柏叶片中低丰度表达的基因有29条,占37.66%；中丰度表达的基因有41条,占53.25%；高丰度基因有7条,占9.09%。4、对77条unigenes进行同源性分析和序列比对。77条unigenes有10条无显着同源性,比例为13%,是新序列；67条有显着同源性,比例为87%,其中包含已知功能的蛋白共14条,占18.2%,以及预测蛋白共38条,占49.4%,而未知蛋白共15条,占19.4%。5、与Blast2GO数据库比对进行基因功能注释。77条unigenes在blast2GO总共获得注释的GOterm数目为162个,平均每条序列得到3.136个GO术语。并且将其归结为3类：生物学过程（Biological Process）、分子功能（Molecular Function）、细胞组件（Cellular Component）。6、对EST序列进行物种相似性分析,福建柏叶片与北美云杉的相似性最高,并未检测到与福建柏属的相似性,说明本属植物在分子生物学方面研究较少。
谢德金[4]（2016）在《草珊瑚叶片cDNA文库构建及EST分析》文中指出草珊瑚Sarcandra glabra （Thunb.）Nakai是金栗兰科草珊瑚属（Sarcandra）常绿半灌木,是一种传统的中草药。本研究从草珊瑚的本草考证、生物学特征、资源概述、化学成分、药理作用及草珊瑚研究现状这6个方面进行了综述。草珊瑚的研究多集中于栽培技术、化学成分、质量控制、种质资源遗传多样性等方面,而对于深层次的分子克隆、代谢途径及蛋白功能的研究鲜有报道,有待于进一步探究。本研究以适宜的草珊瑚叶片总RNA提取方法为基础,构建了草珊瑚叶片的cDNA文库并进行了初步的生物信息学分析。主要研究内容和结果如下：1、本研究用CTAB法、CTAB-Trizol法、Trizol法、CTAB-LiCl法、天根RNA提取试剂盒法、百泰克RNA提取试剂盒法共6种方法提取草珊瑚叶片的总RNA。研究结果表明：采用天根试剂盒快速提取草珊瑚叶片总RNA,提取的总RNA能达到试验要求；同时CTAB-LiCl也是一种选择,只是时间较长、过程相对繁琐,其它4种方法不适合提取草珊瑚叶片总RNA。2、将提取的符合要求的草珊瑚叶片总RNA进行cDNA文库的构建,在合成cDNA的过程中,对ds cDNA的起始材料、最优循环数和载体连接比例进行了优化。分别确定了ds cDNA合成的起始材料是第一链原液2μL,第18循环为最优循环,载体与cDNA的最佳连接比例是1：1.98,文库滴度为1.14×107 cfu·mL 1,检测到插入的片段大小在500～3000bp之间,平均约1000bp,扩增后的文库平均滴度是0.94×108 cfu ·mL-1。3、经测序共得到177个有效的EST序列,GC的含量为41.9%,平均长度790bp；对177条序列进行拼接与聚类,共得到151条单一序列（unigene）,其包含有12个片段重叠群（contig）及139个单基因（singleton）,文库的冗余度为14.7%。草珊瑚叶片中低丰度表达的基因有139条（92.05%）：中丰度表达的基因有10条（6.62%）；高丰度表达基因有2条（1.32%）。对151条单一序列进行同源性分析和序列比对。有32条（21%）无同源性,是新序列；119条（79%）有同源性,包括24条已知功能的蛋白和91条的预测蛋白,而未知蛋白有4条（3%）。5、用Blast2GO、KEGG软件进行相关基因功能注释和代谢通路分析。119条unigenes在blasOGO共获得了415个GO terms,并且将其归结为3类：生物学过程（Biological Process）、分子功能（Molecular Function）、细胞组件（Cellular Component）。生物学过程共185个GO terms,占44.85%；分子功能有104个GO terms,占25.06%；细胞组件则有126个GO terms,占30.36%。共获得具有KEGG注释的序列有50条。获得KEGG注释的50条序列根据BRITE功能等级分类,共统计出：有29条序列信息与代谢相关,有19条序列与遗传信息加工有关,有10条序列属于环境信息加工方面的内容,有11条是参与细胞过程的序列,有25条相关序列信息属于生物体系统的范畴,而属于人类疾病相关的序列信息有32条,共126条。6、物种相似性分析方面,草珊瑚叶片与莲花的相似性最高,但并没有检测到与同属植物的相似性,说明本属植物基因组、转录组及蛋白组方面的研究较少。
王西成[5]（2012）在《葡萄cDNA文库构建及鲜食与酿酒葡萄果实发育相关基因的表达分析》文中研究说明葡萄是世界性的重要果树,也是我国的重要果树树种之一,它在我国果树产业中占据重要地位,其栽培面积和产量位于世界水果的前列,特别是鲜食葡萄已连续多年稳居世界首位,但葡萄新基因的发掘和果实发育相关基因研究方面进展较慢。本研究在构建葡萄花和果实EST文库的基础上,进一步进行了EST-SSR标记的开发,同时还利用基因芯片技术对鲜食和酿酒葡萄果实发育相关基因的表达情况进行了初步分析。主要结果如下：1.构建葡萄花、果cDNA文库是开展葡萄花及果实发育的分子机理研究的重要工作基础,有助于重要相关基因的克隆、功能分析、调控及其利用。本研究以生产上广泛栽培、性状优良且极具代表性的‘夏黑’葡萄为试材,应用优化的Creator SMART cDNA Construction Kit技术,构建了‘夏黑’葡萄花和果实的cDNA文库。文库的滴度为1.2x106pfu/mL,库容为6.0×106pfu。从文库中随机挑取30个克隆进行菌落PCR鉴定的结果显示：插入片段大小为1.0-3.0kb,重组率为99%。研究结果表明,该葡萄cDNA文库具备较高的质量。2.本研究通过‘夏黑’花和果实cDNA文库的构建,获得了7,561个阳性克隆,有6,320个携带cDNA片段,进一步经序列拼接共获得3,582个unigenesi（登录号：GW836604-GW840185）。BLASTx比对结果表明,在所获得的3,582unigenes中,有913个为已知功能基因,主要涉及原料的运输与代谢、翻译与修饰、功能预测、能量代谢等；12个为功能未知基因；381个为新基因。基因定位结果表明,在所获得的381个新的EST序列中,有289个能够匹配到葡萄基因组的19条染色体上。3.本研究利用MISA软件对来自所构建文库的3,582个unigenes进行SSR位点的搜索,结果在459条序列中共发掘出SSR位点540个,候选SSR位点出现的频率为15.08%。二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸重复单元的SSR数目分别为135（3.77%）、270（7.54%）、59（1.65%）、29（0.81%）和47（1.31%）。利用Primer3.0Plus软件随机设计了47对引物用于PCR扩增,用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分析这些SSR引物的PCR扩增产物多态性。47对引物中有20对引物能在20个葡萄品种中扩增出理想的PCR产物,占总引物的42.55%。其中,18对引物扩增条带具有多态性。4.为获取鲜食和酿酒葡萄果实发育过程中与品质形成有关基因的差异表达情况,本研究制备了一个含有15,403条EST序列的基因芯片对其进行分析。结果表明在果实的整个生长发育阶段,鲜食和酿酒葡萄之间共有2,493个差异表达基因,其中在鲜食葡萄中上调表达基因1,244个,下调表达基因1,249个。利用荧光定量PCR技术对随机选择的19个基因的表选情况进行验证分析,其中有18个基因的表达水平与芯片检测结果相一致。BLAST2G0分析结果显示：共有172个差异表达基因（52个上调,120个下调）具有功能注释,分属于生物过程、分子功能和细胞成分三类不同水平。差异表达基因主要参与代谢、细胞生理、应激反应等生物过程,与结合、催化活性等分子功能有关,作用空间分布在细胞或细胞器中。KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）pathway分析结果显示鲜食与酿酒葡萄差异表达基因主要参与碳水化合物代谢、次生代谢、脂代谢、能量代谢等多个代谢途径。
肖小军[6]（2012）在《水稻灌浆初期高温胁迫下的籽粒全长cDNA文库构建》文中研究说明前期研究中,本课题组采用基因差异显示技术和比较蛋白质组学方法获得了与水稻灌浆期应答高温热害有关的54个差异表达基因片段和21个差异表达蛋白,但是54差异表达基因片段和21个差异表达蛋白并非mRNA全长,为获得mRNA全长构建水稻灌浆初期高温胁迫下的籽粒全长cDNA文库。本文以高温胁迫条件和常温对照条件下的水稻籽粒混合样品,利用Clontech公司生产的SMART PCR cDNA SynthesisKit反转试剂盒合成双链cDNA;通过分段回收和纯化cDNA后,克隆到T载体并转化大肠杆菌DH5α通过单克隆挑取和培养,获得了7974个阳性克隆,其中插入目的cDNA片段大于1.0kb的克隆有5074个,占克隆总数的63.6%;插入目的片段小于1.0kb的克隆数为2900个、占克隆总数的36.4%。随机挑取其中34个克隆进行测序,测序结果在Genbank的水稻EST数据库比对,结果显示插入目的片段大于1.0kb的克隆中,75%为水稻EST数据库中最长的cDNA;同时,比对结果显示,基因OsP0003和OsP0012与籽粒育性相关的ESTs高度同源,基因OsP0004、OsP0023、OsP0029和OsP0032与干旱胁迫相关的ESTs。从文库克隆的数量和测序及比对结果可以看出,本文所建文库包含水稻中绝大多数基因表达的cDNA信息,文库质量较好,为进一步获得与水稻灌浆期耐热性相关的差异表达基因和编码差异表达蛋白基因的EST全长奠定了良好的基础。
谢禄山[7]（2011）在《油桐种子EST文库构建及FAD2等重要基因全长cDNA克隆》文中研究指明油桐是我国特有的木本油料树种,所产桐油经济价值特高,广泛应用于高级油漆、涂料、油墨等制造业,又可供制生物柴油、树脂、人造橡胶、皮革、塑料、颜料及医药等。油桐种质资源是我国特有的基因资源,在基因表达水平开展对油桐品质及产量形成相关基因的研究,对油桐分子育种具有重要的理论意义和实践价值。本文以油桐对年桐品种为试材,构建种子cDNA文库、EST文库,并对EST序列进行全面分析,对重要基因全长cDNA克隆等方面进行了研究,主要结果有：（1）油桐近成熟种子cDNA文库的构建。采用Unizol方法提取总RNA,经Oligotex mRNA kit分离并纯化得到mRNA,在SuperSciptTM ⅡRnaseH-Reverse Transcriptase等的作用下合成cDNA,与pBluescriptⅡSK（+）XR载体连接重组并转化感受态细胞DH10B,成功地构建了油桐对年桐近成熟种子的cDNA文库。文库总容量为8.53×106,重组率为88.95%,插入片段长度500-1500bp。构建的文库质量高,为进一步建立油桐EST文库、开展基因分离鉴定、制作油桐基因芯片和基因表达检测等奠定了良好基础。（2）油桐近成熟种子EST文库的构建。以构建的油桐对年桐近成熟种子cDNA文库为材料,随机挑选3203个阳性克隆进行5’端测序,获得了具代表性的表达序列标签（EST）。经分析、整理,获得3202有效EST序列,平均长度554bp,500-700bp的ESTs占73.6%；在线CAP3拼接,共获得876个非冗余基因序列,其中重叠群202,单一EST序列674。重叠群的EST拷贝数从2个到106个不等,拷贝数为2的最多,达81个；拷贝数为3的有29个；拷贝数7个以上的出现频率多为1或2。油桐对年桐品种的EST文库系国内首次构建,为油桐功能基因组及遗传改良等的进一步研究提供了资源基础。（3）油桐EST序列功能注释。3202个有效EST序列中,1954个为功能已知基因序列,423个为功能未明确的基因序列,760个为相似性较低的基因序列,44个为没有重要相似性的基因序列,21个非植物类基因序列。1954个功能已知的基因序列中,非冗余基因序列467个,包括重叠群序列176个,单一序列291个,涉及379种功能基因；其中与油桐本种同源的序列133个,与同属千年桐同源的序列349个；与大戟科变叶木等11种植物同源的序列1347个。与其他科属植物同源的序列125个。（4）油桐种子EST文库已知功能基因表达分析。油桐近成熟种子表达的379个已知功能基因归为物质代谢、能量代谢、细胞生长发育、转录、蛋白质合成、蛋白质定位与贮藏、载体、细胞结构、信号转导、抗病与防卫、次生代谢及未分类基因等12大类,蛋白质合成相关基因的表达最丰富,占49.6%,蛋白质定位与贮藏蛋白相关基因占21.9%,抗病和防卫相关基因占8.1%；其他各类的相关基因表达量均不足5%。说明材料采集时油桐种子正处蛋白质合成与贮藏高峰期。其中与脂肪酸代谢相关的功能基因有Δ12油酸脱饱酶（FAD2）、B-酮脂酰ACP合成酶（KASI）、烯脂酰基酰基载体蛋白还原酶（EAR）、参与柠檬酸穿梭的苹果酸脱氢酶、2,4-二烯脂酰CoA还原酶、3-酮脂酰辅酶A硫解酶、脂肪酸β一氧化多功能蛋白等,其中Δ12油酸脱饱酶（FAD2）基因属高丰度表达。与油脂贮藏相关的油体蛋白Oleosin基因高丰度表达。与贮藏蛋白相关的基因有蛋白A3前体、豆球蛋白B前体、11S球蛋白β亚基前体、豆球蛋白类蛋白、种子贮藏蛋白等,多为高丰度表达。与抗性相关的基因35种,主要有金属硫蛋白、热激蛋白、亲环素、脱水素、翻译控制肿瘤蛋白、富含脯氨酸蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶等高丰度表达的基因。与能量代谢相关的基因主要有果糖二磷酸醛缩酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸葡萄糖变位酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶等低丰度表达的基因。与蛋白质合成相关基因64种,主要有18S核糖体RNA、26S核糖体RNA、小亚基核糖体RNA、30S核糖体蛋白、40S核糖体蛋白、50S核糖体蛋白、60S核糖体蛋白、翻译起始因子等；与氨基酸代谢相关的序列4条。与蛋白质结构相关基因17条,主要有前折叠素相关蛋白、蛋白质二硫键异构酶、泛素等。与信号转导相关的基因序列32条,涉及23种功能基因。与基因转录相关的基因序列36条,涉及24种功能基因。与次生代谢相关基因23种44条序列。与物质转运相关基因序列23条。（5）油桐FAD2基因的全长cDNA克隆。所克隆的FAD2基因序列长1537bp,含长度为1146bp的完整编码序列,编码383个氨基酸。其氨基酸序列有3个多变区,N端的起始段6个氨基酸为信号肽序列,3个组氨酸簇高度保守。酶蛋白分子量44144.4Da,等电点p18.57,有5个跨膜结构域,说明FAD2为膜结合酶,在N端、C端及中间各有一强亲水区,为膜外结构区；中间若干区段为疏水区,为膜内结构区,组氨酸簇位膜表面,二级结构中α螺旋主要位于肽链C端,β折叠链较短,卷曲主要位于肽链N端。（6）油桐核糖体蛋白及rRNA基因的全长cDNA克隆。60S核糖体蛋白L8的基因序列长1086bp,含有长783bp的完整编码序列,编码261个氨基酸。氨基酸序列近N端和近C端高度保守,C端尾部变化较大。酶蛋白分子量28175.3Da,pI11.44,为碱性蛋白。N端、C端各具强亲水性,中间则亲水区与疏水区相间。二级结构上,卷曲主要位于肽链的中部,β折叠链较短,α螺旋较少,主要位于N端和C端。18SrRNA基因序列全长2523bp,26SrRNA基因序列长2933bp。不同产地和不同生存环境的物种,其rRNA基因有不同的碱基组成,亲缘关系越近的物种间碱基相似性越大,构建rRNA基因进化树是检测物种基因同源性和鉴别物种有力的辅助工具。26SrRNA和18SrRNA分别参与到核糖体大小亚基的自组装形成中,rRNA分子内有大量的反向互补序列,形成大量局部双链区并自卷曲和折叠而形成稳定的“茎环状”结构。rRNA分子结构有大量链内双链区,双链间有较小的内凸环,侧凸环成链的拐点,较大环则成为双链定向的环岛,双链末端为发夹结构,呈长臂状的“吸臂”,这有利于rRNA分子与核糖体蛋白结合形成结构稳定的核糖体亚基。
陈罡[8]（2011）在《野生茄子（Solanum torvum）叶片cDNA文库构建及耐盐相关基因StBADH遗传转化番茄》文中研究说明野生茄子（Solanum torvum Swartz）,原产于印度尼西亚的爪哇岛,具有优良的抗病性及抗逆性。日本科学家于1986年引种后,经过多年选育,已育成茄子设施栽培上专用耐盐砧木品种’Torvum Vigor’。本研究构建了野生茄子’Torvum Vigor’叶片cDNA文库并分析其EST序列,结合RT-PCR技术克隆了耐盐相关基因StBADH。将耐盐相关基因StBADH用于构建抗除草剂植物表达载体pCAMBIA3301-StBADH-T800,并将其遗传转化盐敏感‘金棚一号’番茄,获得了抗除草剂的转基因番茄植株。主要研究结果如下：1.以’Torvum Vigor’叶片为试验材料,采用改进的SMART （Switching mechanism at 5’-end of RNA transcript）技术和LD-PCR （Long-distance PCR）方法,利用pBluescript II SK （+）载体构建了cDNA文库。该文库初始滴度为3.6×106 cfu·mL-1,扩增后文库滴度达1.2×1010 cfu·mL-1。经过蓝白斑计数,文库的重组率高达99%,平均插入片段长度为0.4-2.5 kb。表明所构建的文库是一个高质量的全长cDNA文库,达到了用于目的基因分离筛选的建库要求。2.在构建的野生茄子叶片cDNA文库中随机挑选427个阳性克隆进行测序,获得的原始序列去除不可读序列后,共得到364条高质量的EST序列,序列递交NCBI数据库（GenBank登录号：JK265131-JK265494）。在已递交的364条EST序列中,74.72%含有全长编码区。BLASTX分析表明62.4%的EST序列与其他物种的一些已报道的蛋白具有很高的同源性,获得了9个与耐盐性状等有关基因的EST序列（耐盐相关基因5个）。3.通过RT-PCR技术从’Torvum Vigor’叶片中,克隆了耐盐相关基因StBADH （GenBank登录号：JN812057）。该基因核苷酸序列全长1518 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码505个氨基酸残基,推测的蛋白质分子量为55.9 kDa,理论等电点为5.42,其氨基酸序列与番茄的同源性达96%。通过系统进化树分析表明,’Torvum Vigor’甜菜碱醛脱氢酶与同科植物番茄最先聚类。4.利用内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ分别双酶切pT800质粒DNA（含有CaMV35S启动子、pUC18Polylinker多克隆位点、Nos终止子）与植物表达载体pCAMBIA3301（含bar）,构建中间载体pCAMBIA3301-T800。再将StBADH和中间载体pCAMBIA3301-T800分别通过内切酶Sma Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切,成功地构建了抗除草剂植物表达载体pCAMBIA3301-StBADH-T800,并将此质粒利用冻融法导入根癌农杆菌LBA4404。5.利用番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）栽培品种‘金棚一号’下胚轴和子叶外植体,研究了不同苗龄和激素配比对不定芽分化及生根的影响。并用根癌农杆菌介导法将抗除草剂植物表达载体pCAMBIA3301-StBADH-T800遗传转化‘金棚一号’番茄。结果表明：以10 d苗龄的下胚轴和子叶在MS+0.2 mg·L-1 ZT+1 mg·L-1 IAA芽诱导培养基上不定芽再生频率最高,下胚轴为83.3%、子叶为75.6%。MS + 0.5 mg·L-1 IAA是诱导不定芽生根的理想培养基,7d后生根率为100%。番茄遗传转化过程中不定芽再生培养基中添加bialaphos的最佳筛选浓度为2 mg·L-1,生根培养基中添力口bialaphos的最佳筛选浓度为1mg·L-1,羧苄青霉素的抑菌浓度为500 mg·L-1。最终遗传转化率平均为2.5%（2/80）。所得到抗性植株均表现出对除草剂Basta的抗性,叶片和根系分别经组织化学染色检测,GUS显色均为蓝色；StBADH、bar以及GUS基因PCR检测均为阳性,获得2株T0代转基因番茄植株。
张计育[9]（2011）在《湖北海棠抗病相关基因的克隆及其功能分析》文中认为湖北海棠（Malus hupehensis （Pamp.） Rehd）是原产于我国的抗性较强的苹果砧木之一,是研究木本植物抗逆性机制非常重要的植物材料。本文以‘湖北海棠’为试材,构建了水杨酸处理后的湖北海棠全长cDNA文库,从中分离了MhNPRl、MhTGA2转录因子以及病程相关蛋白基因（Mhchititl、MhGlu、MhPR1、和MhPR5）序列,对这些基因表达特性和功能进行了分析,建立了利用口蹄疫病毒2A序列构建植物三价融合表达载体的技术体系,构建了三价融合表达载体MhTNC （MhGGA2-2A-MhNPR1-2A-Mhchitl）,并对其功能进行了初步分析,主要结果如下：1.以湖北海棠为材料,经水杨酸处理后,通过改良的CTAB法提取总RNA,纯化后构建全长cDNA文库。结果表明：提取的总RNA无降解,无污染。mRNA弥散带主要集中在500～2000 bp左右,没有rRNA残留。dscDNA弥散带主要分布于300-2000bp之间,PCR验证后片段大小分布于200-2000bp之间,说明合成dscDNA质量较好,成功地构建了全长cDNA文库。2.湖北海棠MhNPRl基因的全编码区cDNA序列为1761bp,命名为MhNPR1 GenBank序列登录号FJ5981431。基因组全编码区序列长为2259bp,GenBank序列登录号GU183100。序列比对结果表明,该基因编码区与拟南芥AtNPR1,水稻OsNPRl基因类似,含有3个内含子和4个外显子。MhNPRl基因组序列的长度和拟南芥相近,其内含子相对位置也同于拟南芥。该蛋白包括9个保守的半胱氨基酸残基、BTB和ANKREPREGION两个结构域。分离了1238bp的上游启动子序列,序列分析表明,该基因的5’UTR区含有一个601bp的内含子,该启动子区域含有1个水杨酸作用元件、2个乙烯响应元件、2个茉莉酸甲酯响应元件、3个赤霉素响应元件、2个热胁迫响应元件、1个厌氧响应元件,1个加强转录元件。另外,还包括一些光响应元件。3.利用实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）研究了植物激素SA、MeJA、ACC和生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫处理后的MhNPR1基因的表达情况。结果表明：MhNPRl在湖北海棠叶片中的表达量最大；SA在叶片、茎、根中均可以诱导该基因的表达,MeJA、ACC仅在根中诱导该基因的表达；苹果轮纹病病原菌在转录水平上未能诱导该基因的表达；苹果蚜虫在叶片和茎中可以诱导该基因的表达。4.构建了湖北海棠MhNPR1基因的植物双元表达载体,通过农杆菌介导法将其转化模式植物烟草,通过PCR和RTPCR对其抗性株系进行检测,MhNPR1基因已经成功地插入烟草基因组中并得到了表达。转基因烟草株系中NtPR1、NtPR3和NtPR5基因的表达量得到了上调,T1代植株在苗期表现出较强的抗灰霉病能力。转基因烟草株系中抗渗透胁迫NtSPS、NtSAM1、TOBLTP、ERD10A、ERD10B、ERD10C、ERD10D和抗氧化基因NtCA、NtSOD、NtRbohD的表达量得到了上调。转基因烟草株系T1植株在种子发芽、苗期都表现出较强的抗盐性,To代植株、T1代植株在种子发芽、苗期表现出较强的抗渗透胁迫能力。总之,湖北海棠MNPR1基因在植物的防御反应中具有多重抗性。5.通过RACE技术结合电子克隆的方法克隆了湖北海棠一个bZIP类转录因子,利用生物信息学的方法对其进行序列分析。实验结果表明,该基因全长1541bp,最大开放阅读框为999bp,编码333个氨基酸,5’UTR区有191bp,3’UTR区有351bp。氨基酸序列含有典型的bZIP结构域,亮氨酸结构域,在氨基酸的C端含有YX2RL[RQ]ALSS[LS]W结构,属于典型的bZIP-D结构。系统进化树分析表明：湖北海棠MhTGA2与菜豆TGA2.1、菜豆TGA2.2、葡萄TGA2、杨树TGA2.1亲缘关系最近,聚为一类,说明我们克隆的bZIP类转录因子属于TGA2类转录因子,命名为MhTGA2, Gen Bank上的登录号为FJ598138。亚细胞定位实验表明MhTGA2蛋白定位于细胞核中。MhTGA2在叶片中的表达量最大；SA、MeJA、ACC可以诱导MhTGA2基因的表达；苹果轮纹病病原菌未能诱导该基因的表达。转MhTGA2基因烟草中NtPRs （NtPR1、NtPR2、NtPR3）以及抗逆相关基因NtSOD、NtPPO、NtPAL、NtAPX的表达量得到了提高。6.克隆了湖北海棠第1类几丁质酶基因,命名为Mhchitl。亚细胞定位研究表明该基因位于细胞膜和细胞壁。植物激素SA.MeJA.ACC可以诱导湖北海棠叶片、茎、根中Mhchitl基因的表达。苹果轮纹病病原菌可以诱导Mhchitl基因的表达,3h后表达量增加,6h后表达量达到最大,随后表达量降低。在湖北海棠叶片、茎中,苹果蚜虫可以诱导该基因的表达。将该基因构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草。与非转基因烟草相比,转基因烟草中抗逆相关基因NtSOD.NtAPX.NtPPO,和NtPAL的表达量增加。转基因烟草株系抗灰霉病能力增加,抗PEG6000能力增强。说明Mhchot1基因不仅参与SA介导的抗病性,而且参与JA/ET介导的抗病性,具有多种抗逆功能。7.克隆了湖北海棠β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA序列和基因组DNA序列,该基因编码区含有一个内含子。该基因与桃、李和葡萄的核苷酸序列同源性为84、83、和77%,氨基酸序列同源性分别为84、74、和76%。通过基因组步移法克隆了该基因上游的启动子序列,启动子序列含有SA、MeJA和ET作用元件。利用荧光定量RT-PCR分析表明SA、MeJA和ACC均可以诱导湖北海棠叶片、茎、和根中的MhGlu基因的表达。在苹果轮纹病病原菌处理的96h内,湖北海棠MhGlu基因在24h时表达量开始上调,48h达到最大,随后降低。在湖北海棠叶片和茎中,苹果蚜虫可以诱导MhGlu基因的表达。总之,MhGlu基因是湖北海棠中抗生物胁迫的基因。8.分离了病程相关蛋白基因MhPR1、MhPR5的全编码区的cDNA和基因组DNA序列,MhPR1、MhPR5的最大开放阅读框分别为492bp、741 bp,分别编码162、246个氨基酸。MhPR5在基因编码区含有一个内含子,MhPR1没有内含子。这两个基因与苹果、梨的同源性较高,亲缘关系较近。通过与苹果基因组序列分析比较结果表明：MhPR1、MhPR5在苹果基因组中有多个拷贝,分别有4、3个拷贝。这两个基因在N端均含有一个信号肽,并且MhPR1、MhPR5分别含有6、10个保守的半胱氨基酸残基。荧光定量PCR分析结果表明MhPR1、MhPR5在湖北海棠各种组织中的表达存在差异。SA、MeJA、ACC在湖北海棠的叶、茎、和根中均可以诱导MhPR1和MhPR5基因的表达,分析表明MhPR1和MhPR5是湖北海棠SAR中的标记基因。9.以pMD19-T为中间载体,首先对其进行了改造,然后将MhTGA2、MhNPRl、和Mhchit1基因依次连接在中间载体上,命名为T2AN2AC,然后将其一并酶切,连接于植物表达载体上,成功地构建了植物三价融合表达载体,命名为MhTNC。通过农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草株系。通过PCR和RT-PCR实验表明,MhTGA2、MhNPR1、和Mhchit1三个基因已经成功地插入到烟草的基因组中,并且得到了转录。与野生型株系相比,转基因烟草株系表现出早花现象,矮化、节间数显着较少,节间显着增长。并且具有抗灰霉病和抗PEG6000的能力。
谢凯[10]（2010）在《嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA文库的构建及亲环蛋白基因的序列分析》文中研究表明池蝶蚌（Hyriopsis Schlegeli）原产于日本滋贺县的琵琶湖,属软体动物门、瓣鳃纲、蚌科、帆蚌属,与我国三角帆蚌为同属不同种。池蝶蚌无论形态、生长速度、产量、成活率、育珠能力皆优于其它淡水育珠蚌,更具有经济优势,因而国内已大力发展池蝶蚌作为我国的重要育珠对象之一。本研究构建了经过嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA全长文库并对部分序列进行了序列分析,并重点对免疫相关基因亲环蛋白（Cyp A）进行了较详细的序列分析。主要结果如下：1.利用灭活的嗜水气单胞菌（Aeromonas Hydrophila）诱导处于旺盛生长期（四龄）的池蝶蚌14h,采用Trizol试剂提取诱导后的池蝶蚌血细胞的总RNA。根据Creator SMART试剂盒用户手册,逆转录后,用LD-PCR合成双链cDNA,并逐步构建成池蝶蚌血细胞的全长cDNA文库。本文库为首次成功构建的淡水贝类池蝶蚌血细胞全长cDNA文库。原始文库的滴度为4×106cfu/cm3,重组率为90%,扩增后文库的滴度为3.55×109pfu/ml。2.从文库共随机测序102个样品,所得双向测序结果去除载体,拼接,并多序列比对去除重复序列后,余59条已知功能序列,其余为未知功能序列。序列中最小长度270 bp,最大长度为2153bp,平均大小608.6 bp,表明插入片段大小理想。已知基因根据其功能可分为以下几大类：基础代谢类基因,细胞凋亡,细胞分裂调节、蛋白质的装配、修饰与降解,DNA合成、转录、翻译及重组相关基因,核糖体基因和免疫相关基因。3.从文库中筛选获得免疫相关基因池蝶蚌亲环蛋白A（HsCyp A）全长基因并进行序列分析,池蝶蚌Cyp A基因全长1229个碱基,其在53-547位存在一个长495 bp的开放阅读框,编码164个氨基酸。其起始密码子是atg,终止密码子是taa。HsCypA序列还包括52bp的5’非编码区（untranslated region,UTR）,682bp的3’UTR,和29 bp的poly（A）尾,没有明显的加尾信号。ORF编码区蛋白的分子量为17.26 kDa,理论等电点PI=8.9。对Cyp A氨基酸序列二级结构进行了较详细的分析并进行了三维建模,同时构建了其系统进化树,分析表明亲环蛋白家族是一个在进化上非常保守的蛋白家族。本研究为课题组基础性工作,其研究成果将为大规模筛选文库、发现新的功能基因提供有效的平台,为免疫相关特定基因的研究提供了较好的依据。
二、全长cDNA文库的构建和新基因全长cDNA克隆的策略（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、全长cDNA文库的构建和新基因全长cDNA克隆的策略（论文提纲范文）
（1）长白山药用真菌鸡爪苓菌核cDNA文库构建及EST序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡爪苓研究概况 |
| 1.1.1 鸡爪苓的称谓及其形态特征 |
| 1.1.2 鸡爪苓的资源分布 |
| 1.1.3 鸡爪苓的分类地位 |
| 1.1.4 鸡爪苓研究的问题与展望 |
| 1.2 cDNA文库简介 |
| 1.3 表达序列标签(EST)的研究进展 |
| 1.3.1 EST的研究概况 |
| 1.3.2 EST技术的原理和方法 |
| 1.3.3 EST的应用 |
| 1.3.4 表达序列标签(EST)分析流程 |
| 1.4 EST序列分析在真菌学研究上的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 菌种与载体 |
| 2.1.4 常用培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取及检测 |
| 2.2.2 LD-PCR合成cDNA |
| 2.2.3 SMART cDNA文库的构建 |
| 2.2.4 载体λTriplE×2环化成质粒pTriplE×2 |
| 2.2.5 表达序列标签分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 总RNA的提取结果 |
| 3.2 双链cDNA的合成 |
| 3.3 cDNA的分级分离 |
| 3.4 计算原始文库重组率和滴度 |
| 3.5 PCR检测文库插入片段大小 |
| 3.6 计算扩增文库滴度 |
| 3.7 载体λTriplE×2环化成质粒pTriplE×2 |
| 3.8 测序结果 |
| 3.9 EST序列注释 |
| 3.10 Gene ontology基因功能分类 |
| 3.11 开放阅读框(ORF)和蛋白质功能预测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸡爪苓菌核总RNA提取 |
| 4.2 鸡爪苓菌核cDNA文库构建 |
| 4.3 鸡爪苓菌核ESTs的分析 |
| 4.4 鸡爪苓菌核ESTs基因功能的预测 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附图 |
（2）乌龙茶做青过程香气形成相关基因的分离与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 研究的背景与意义 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 茶叶香气物质研究现状 |
| 2.2 茶叶香气合成途径 |
| 2.3 加工对茶叶香气物质形成的影响 |
| 3 本研究的主要内容 |
| 4 本研究的技术路线 |
| 第二章 铁观音均一化cDNA文库的构建与EST分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 药品和试剂盒 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 铁观音鲜叶总RNA的提取 |
| 1.3.2 逆转录和双链cDNA的扩增与纯化 |
| 1.3.3 双链cDNA的均一化处理和均—化全长cDNA的扩增 |
| 1.3.4 均一化全长cDNA的克隆 |
| 1.3.5 测序与EST分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 铁观音鲜叶总RNA的质量与双链cDNA的扩增 |
| 2.2 DSN浓度对均一化cDNA扩增的影响 |
| 2.3 均一化cDNA文库的质量评价 |
| 2.4 均一化cDNA文库的EST分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 均一化cDNA文库的构建是发掘茶树重要代谢途径基因的有效方式 |
| 3.2 均一化cDNA文库的EST分析与乌龙茶香气相关基因的发掘 |
| 第三章 乌龙茶做青过程香气形成差异基因的分离 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 药品和试剂盒 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 铁观音鲜叶和杀青前叶片样品总RNA的提取 |
| 1.3.2 逆转录与双链cDNA的扩增与纯化 |
| 1.3.3 双链cDNA的杂交与DSN处理 |
| 1.3.4 差异cDNA的扩增与的克隆 |
| 1.3.5 反向Northern Blotting筛选阳性克隆 |
| 1.3.5.1 探针的制备及其效率的检测 |
| 1.3.5.2 插入cDNA片段与内参基因片段的扩增 |
| 1.3.5.3 杂交膜的准备与点膜 |
| 1.3.5.4 杂交与显色 |
| 1.3.6 阳性克隆的测序与EST分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 铁观音总RNA的质量与双链cDNA的扩增 |
| 2.2 不同浓度DSN处理对差异cDNA扩增效果的影响 |
| 2.3 cDNA文库的质量评价 |
| 2.4 抑制差减杂交cDNA文库的EST分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 抑制差减杂交和反向Northern-Blotting技术的改进 |
| 3.2 抑制差减杂交cDNA文库阳性克隆的EST分析与乌龙茶做青过程香气差异基因的发掘 |
| 第四章 乌龙茶香气相关基因的生物信息学分析及其表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 药品、试剂盒和仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 乌龙茶香气相关基因的生物信息学分析 |
| 1.3.2 乌龙茶香气相关基因的荧光定量PCR检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乌龙茶萜类代谢途径香气相关基因的生物信息学分析及其表达 |
| 2.1.1 异戊烯基焦磷酸异构酶基因(CsIDI) |
| 2.1.2 新薄荷醇脱氢酶基因(NDR) |
| 2.1.3 香叶醇10-羟化酶即牻牛儿醇羟化酶基因(G-10-H) |
| 2.1.4 水杨酸羧基甲基转移酶基因(SAMT) |
| 2.1.5 木酮糖-5-磷酸/磷酸转运蛋白(XPT) |
| 2.1.6 亚精胺羟化肉桂酰基转移酶(SHT) |
| 2.1.7 异胡豆苷合成酶(SSL) |
| 2.2 羟甲基戊二酸单酰辅酶A裂合酶基因(HMGCL)的生物信息学分析及其表达 |
| 2.3 腺苷蛋氨酸甲基转移酶基因(NMT)的生物信息学分析及其表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 乌龙茶萜类代谢途径香气相关基因与香气形成的关系 |
| 3.2 乌龙茶脂类代谢途径香气基因与茶叶香气形成的关系 |
| 3.3 乌龙茶苯丙烷代谢途径香气基因与茶叶香气形成的关系 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 保守结构域分析 |
| 2 蛋白二级结构预测 |
| 3 硕士期间发表论文 |
| 4 本论文项目支撑 |
| 致谢 |
（3）福建柏叶片cDNA文库的构建及EST分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 福建柏的简介 |
| 1.1.1 福建柏的生物学特性及生态学习性 |
| 1.1.2 福建柏的生态园林应用价值 |
| 1.1.3 福建柏的培育及栽培管理技术 |
| 1.1.4 福建柏的分子生物学研究进展 |
| 1.2 cDNA文库的研究进展 |
| 1.2.1 cDNA文库的基本概念 |
| 1.2.2 cDNA文库的分类及特点 |
| 1.2.3 全长cDNA文库的构建策略 |
| 1.3 表达序列标签(EST)技术的研究进展 |
| 1.3.1 表达序列标签的概念及原理 |
| 1.3.2 表达序列标签(EST)的应用 |
| 1.4 研究的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 主要试验设备 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.3.1 生化试剂 |
| 2.3.2 主要溶液配制与处理 |
| 2.4 RNA提取 |
| 2.4.1 试验前准备工作 |
| 2.4.2 CTAB法提取福建柏叶片总RNA |
| 2.4.3 CTAB-LiCl法提取福建柏叶片总RNA |
| 2.4.4 Trizol法提取福建柏叶片总RNA |
| 2.4.5 百泰克试剂盒法提取福建柏叶片总RNA |
| 2.4.6 天根试剂盒法提取福建柏叶片总RNA |
| 2.4.7 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性 |
| 2.4.8 微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度 |
| 2.5 福建柏叶片全长cDNA文库的构建 |
| 2.5.1 第一链cDNA的合成 |
| 2.5.2 ds cDNA的合成 |
| 2.5.3 cDNA片段的纯化分级 |
| 2.5.4 cDNA片段与载体的连接 |
| 2.5.5 连接产物的电转 |
| 2.5.6 cDNA文库质量检测 |
| 2.5.7 原始文库的扩增 |
| 2.6 EST测序与分析 |
| 2.6.1 EST测序 |
| 2.6.2 EST序列的初步处理 |
| 2.6.3 EST序列的分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 总RNA的提取 |
| 3.1.1 RNA的提取结果 |
| 3.1.2 不同方法对RNA提取结果的影响 |
| 3.2 全长cDNA文库的结果分析 |
| 3.2.1 dsDNA的合成 |
| 3.2.2 cDNA过柱分级纯化 |
| 3.2.3 文库质量评价 |
| 3.3 EST序列测定及生物信息学分析 |
| 3.3.1 EST片段的测序结果 |
| 3.3.2 有效EST序列的获取 |
| 3.3.3 EST序列的拼接及分析 |
| 3.3.4 EST序列的生物学信息分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 植物RNA提取策略 |
| 4.2.2 cDNA文库质量评价 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 附表 |
| 附图 |
| 致谢 |
（4）草珊瑚叶片cDNA文库构建及EST分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 草珊瑚的研究概况 |
| 1.1.1 本草考证 |
| 1.1.2 生物学特征和资源概述 |
| 1.1.3 化学成分及药理作用 |
| 1.1.4 草珊瑚的研究现状 |
| 1.2 全长cDNA文库的构建及应用 |
| 1.2.1 基本概念及特点 |
| 1.2.2 分类 |
| 1.2.3 全长cDNA文库的构建策略 |
| 1.3 表达序列标签(EST) |
| 1.3.1 基本概念及原理 |
| 1.3.2 EST分析的应用 |
| 1.4 药用植物次生代谢物在功能基因组学上的研究进展 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 主要试验设备 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.3.1 试验试剂 |
| 2.3.2 主要溶液配制与处理 |
| 2.4 RNA提取 |
| 2.4.1 CTAB法提取草珊瑚叶片总RNA |
| 2.4.2 CTAB-LiCl法提取草珊瑚叶片总RNA |
| 2.4.3 CTAB-Trizol法提取草珊瑚叶片总RNA |
| 2.4.4 Trizol法提取草珊瑚叶片总RNA |
| 2.4.5 百泰克试剂盒法提取草珊瑚叶片总RNA |
| 2.4.6 天根试剂盒法提取草珊瑚叶片总RNA |
| 2.4.7 RNA纯化 |
| 2.4.8 RNA质量检测 |
| 2.5 全长cDNA文库的构建 |
| 2.5.1 第一链cDNA的合成 |
| 2.5.2 双链cDNA的合成 |
| 2.5.3 cDNA片段的纯化分级 |
| 2.5.4 cDNA片段与载体的连接 |
| 2.5.5 连接产物的电转化 |
| 2.5.6 文库质量检测 |
| 2.5.7 原始文库扩增 |
| 2.6 EST测序与生物信息学分析 |
| 2.6.1 EST测序 |
| 2.6.2 序列的初步处理与EST序列生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 总RNA的提取 |
| 3.1.1 总RNA的纯度与浓度 |
| 3.1.2 总RNA的完整性 |
| 3.1.3 总RNA中的DNA去除及纯化 |
| 3.1.4 六种总RNA提取方法的成本和时间比较 |
| 3.2 cDNA文库结果分析 |
| 3.2.1 dsDNA的合成 |
| 3.2.2 cDNA分级分离 |
| 3.2.3 文库质量评价 |
| 3.3 EST序列测定及生物信息学分析 |
| 3.3.1 EST长度统计 |
| 3.3.2 序列重复性分析及基因表达丰度分析 |
| 3.3.3 ESTs功能统计 |
| 3.3.4 KO目录及KEGG注释 |
| 3.3.5 Blast2GO功能基因分类 |
| 3.3.6 物种相似性分布 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.1.1 RNA的提取 |
| 4.1.2 cDNA文库构建 |
| 4.1.3 EST序列的统计分析 |
| 4.1.4 EST序列的生物信息学分析 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 RNA的提取方法比较 |
| 4.2.2 cDNA文库质量评价 |
| 参考文献 |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附图 |
| 读研期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）葡萄cDNA文库构建及鲜食与酿酒葡萄果实发育相关基因的表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 cDNA文库相关研究 |
| 1.1 cDNA文库的构建方法 |
| 1.2 cDNA文库构建的载体种类及其优缺点 |
| 1.3 cDNA文库类型 |
| 1.3.1 经典cDNA文库 |
| 1.3.2 标准化cDNA文库 |
| 1.3.3 差减cDNA文库 |
| 1.3.4 染色体或区域特异性cDNA文库 |
| 1.3.5 PCR cDNA文库与RACE cDNA文库 |
| 1.3.6 固相cDNA文库 |
| 1.4 cDNA文库的应用 |
| 2 EST序列分析及应用相关研究 |
| 2.1 EST技术的形成与发展 |
| 2.2 EST技术的应用 |
| 2.2.1 遗传学图谱的构建 |
| 2.2.2 新基因的分离与鉴定 |
| 2.2.3 差异表达基因的研究 |
| 2.2.4 基因芯片的制备 |
| 2.2.5 电子克隆 |
| 2.2.6 比较基因组学研究 |
| 2.2.7 EST-SSR标记的开发 |
| 2.2.8 SNP标记的开发 |
| 3 基因芯片及其应用相关研究 |
| 3.1 基因芯片原理及其特点 |
| 3.2 基因芯片的种类 |
| 3.3 基因芯片检测过程 |
| 3.4 基因芯片技术在果树上的应用 |
| 3.5 问题及展望 |
| 第二章 夏黑葡萄花及果实cDNA文库的构建及鉴定 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取 |
| 1.2.2 总RNA中DNA的消化 |
| 1.2.3 mRNA的纯化 |
| 1.2.4 cDNA的合成 |
| 1.2.5 cDNA文库的构建 |
| 1.2.6 cDNA文库的滴度测定 |
| 1.2.7 cDNA文库的质量鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 葡萄花和果实中的总RNA质量鉴定 |
| 2.2 双链cDNA合成质量检测 |
| 2.3 cDNA文库的鉴定 |
| 2.4 cDNA文库的质量对EST序列的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三章 葡萄花、果实cDNA文库测序及EST序列分析 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 cDNA克隆的大规模EST测序 |
| 1.3 EST序列分析 |
| 1.4 EST功能注释和基因定位 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 葡萄花和果实EST序列的基本信息 |
| 2.2 Unigene的COG分类及功能注释 |
| 2.3 Unigene的功能注释 |
| 2.4 新EST序列的获得及基因定位 |
| 3 讨论 |
| 第四章 葡萄EST-SSRs标记的开发 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 不同葡萄品种DNA提取方法及步骤 |
| 1.4 葡萄EST序列中SSR搜索 |
| 1.5 葡萄EST-SSR引物设计 |
| 1.6 变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 |
| 1.7 葡萄EST-SSR引物筛选及多态性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DNA纯度和产率检测 |
| 2.2 DNA完整性检测 |
| 2.3 葡萄EST-SSR分布、频率和特点 |
| 2.4 葡萄EST-SSR引物的验证 |
| 2.5 葡萄EST-SSR引物多态性分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 鲜食与酿酒葡萄果实发育相关基因表达水平的比较 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 RNA提取 |
| 1.3 荧光探针的制备 |
| 1.4 芯片杂交 |
| 1.5 数据的采集与分析处理 |
| 1.6 转录差异基因的实时荧光定量PCR验证(qRT-PCR) |
| 2 结果 |
| 2.1 不同品种葡萄果实总RNA提取质量检测 |
| 2.2 鲜食和酿酒葡萄之间差异表达基因分析 |
| 2.3 差异表达基因功能注释及分类 |
| 2.4 差异表达基因的分层聚类分析 |
| 2.5 KEGG pathway分析 |
| 2.6 基因芯片所得差异表达基因的qRT-PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 读博期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（6）水稻灌浆初期高温胁迫下的籽粒全长cDNA文库构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 高温对水稻的影响 |
| 1.1.1 高温对生殖生长的危害 |
| 1.1.2 高温对水稻生理生化的影响 |
| 1.1.3 水稻耐热性遗传分析 |
| 1.1.4 水稻耐热性育种 |
| 1.1.5 水稻基因分离与克隆 |
| 1.2 cDNA文库研究进展 |
| 1.2.1 cDNA文库的类型 |
| 1.2.2 cDNA文库构建的流程 |
| 1.2.3 全长cDNA文库构建方法 |
| 1.2.4 全长cDNA文库的应用 |
| 1.3 水稻cDNA文库构建的研究现状 |
| 1.4 存在的问题 |
| 1.5 本研究的内容、目的和意义 |
| 第二章 水稻灌浆初期耐热的籽粒cDNA全长文库构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 水稻的培育 |
| 2.1.3 高温处理与取样 |
| 2.1.4 总RNA提取 |
| 2.1.5 总RNA质量检测 |
| 2.1.6 全长cDNA的合成 |
| 2.1.7 cDNA分段回收 |
| 2.1.8 cDNA的DH5α克隆 |
| 2.1.9 克隆的PCR检测 |
| 2.1.10 重复菌落的剔除 |
| 2.1.11 文库的重组率和滴度计算以及插入cDNA大小的统计分析 |
| 2.1.12 部分克隆的测序与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA检测结果 |
| 2.2.2 双链cDNA的合成 |
| 2.2.3 蓝白菌挑选 |
| 2.2.4 克隆的PCR检测 |
| 2.2.5 文库滴度和重组率检测结果 |
| 2.2.6 插入cDNA大小的分析 |
| 2.2.7 部分全长cDNA克隆的测序与比对结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）油桐种子EST文库构建及FAD2等重要基因全长cDNA克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 油桐的应用及研究现状 |
| 1.1.1 油桐的应用 |
| 1.1.2 油桐的研究状况 |
| 1.2 植物基因文库 |
| 1.2.1 cDNA文库构建的原理 |
| 1.2.2 cDNA文库的类型 |
| 1.2.3 cDNA文库构建方法的进展 |
| 1.2.4 cDNA文库的作用 |
| 1.2.5 国内植物cDNA文库构建情况 |
| 1.3 植物表达序列标签(EST) |
| 1.3.1 EST的概念 |
| 1.3.2 EST的原理 |
| 1.3.3 EST的特点与应用 |
| 1.3.4 EST数据库发展迅速 |
| 1.3.5 EST应用前景 |
| 1.4 油脂的生物合成 |
| 1.4.1 脂肪酸的特点 |
| 1.4.2 饱和脂肪酸的生物合成与催化酶 |
| 1.4.3 三酰甘油酯的合成 |
| 1.4.4 不饱和脂肪酸的生物合成与催化酶 |
| 1.5 本研究的目的意义和技术路线 |
| 1.5.1 目的、意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 2 油桐近成熟种子cDNA文库构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 油桐种子中总RNA的提取 |
| 2.2.2 cDNA文库构建 |
| 2.2.3 cDNA文库质量测定 |
| 2.2.4 cDNA文库重组克隆插入片段的大小测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 油桐种子总RNA和mRNA提取浓度和纯度检测 |
| 2.3.2 cDNA回收与连接结果 |
| 2.3.3 cDNA文库库容量及重组率测定结果 |
| 2.3.4 油桐种子cDNA文库中插入片段的大小检测 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 油桐近成熟种子EST文库构建及结果分析 |
| 3.1 试验材料及方法 |
| 3.1.1 试剂与培养基 |
| 3.1.2 质粒DNA提取 |
| 3.1.3 质粒cDNA测定及分析方法 |
| 3.1.4 原始EST序列数据预处理 |
| 3.1.5 EST序列聚类和拼接 |
| 3.2 结果及分析 |
| 3.2.1 原始EST数据分析 |
| 3.2.2 油桐有效EST序列数据分析 |
| 3.2.3 油桐近成熟种子EST序列BLAST分析 |
| 3.2.4 油桐近成熟种子主要表达功能基因分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 4 油桐种子FAD2及核糖体重要基因全长cDNA克隆 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 油桐种子△12油酸脱饱和酶基因FAD2全长cDNA克隆 |
| 4.2.2 油桐种子核糖体蛋白L8全长cDNA克隆 |
| 4.2.3 油桐种子核糖体RNA基因全长cDNA克隆 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 5 结论与创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 成功构建了油桐近成熟种子cDNA文库 |
| 5.1.2 成功构建了油桐近成熟种子EST文库 |
| 5.1.3 揭示了油桐近成熟种子基因表达谱的主要信息 |
| 5.1.4 完成了油桐近成熟种子主要表达功能基因的分析 |
| 5.1.5 获得了4种油桐近成熟种子重要基因的全长cDNA序列 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A 缩略词及中英文对照 |
| 附录B 主要试剂配置 |
| 附录C 攻读博士学位期间的主要学术成果 |
| 附录D 攻读博士学位期间的主要参加的课题 |
| 致谢 |
（8）野生茄子（Solanum torvum）叶片cDNA文库构建及耐盐相关基因StBADH遗传转化番茄（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物基因文库及EST序列分析研究进展 |
| 1.1 基因组文库 |
| 1.2 cDNA文库 |
| 1.3 EST技术的原理 |
| 1.4 EST研究的主要步骤 |
| 1.5 EST技术的形成及应用 |
| 1.6 生物信息学在EST研究中的应用 |
| 2 甜菜碱与植物耐盐基因工程 |
| 2.1 甜菜碱的生物功能 |
| 2.2 甜菜碱生物合成途径 |
| 2.3 甜菜碱基因工程与植物耐盐性 |
| 3 番茄遗传转化研究进展 |
| 3.1 番茄遗传转化方法 |
| 3.2 转基因番茄研究进展 |
| 第二章 野生茄子叶片cDNA文库构建及EST序列分析 |
| 第一节 野生茄子叶片cDNA文库构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 文库构建样品的总RNA浓度及质量检测 |
| 2.2 mRNA分离 |
| 2.3 mRNA反转录双链cDNA |
| 2.4 cDNA文库滴度测定及PCR检测 |
| 3 讨论 |
| 第二节 野生茄子叶片cDNA文库的EST序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 测序模板的获得 |
| 1.3 ESTs序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 cDNA序列测定及EST序列获得 |
| 2.2 ESTs序列同源性比对 |
| 2.3 ESTs序列功能注释与分类 |
| 3 讨论 |
| 第三章 野生茄子甜菜碱醛脱氢酶基因(StBADH)的克隆及序列分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总RNA提取质量与反转录效果检测 |
| 2.2 目的片段序列测定 |
| 2.3 StBADH全长序列的获得 |
| 2.4 氨基酸序列同源性比对 |
| 2.5 野生茄子甜菜碱醛脱氢酶氨基酸序列系统进化树构建 |
| 3 讨论 |
| 第四章 野生茄子耐盐相关基因StBADH的抗除草剂植物表达载体构建 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的片段的PCR扩增与回收纯化 |
| 2.2 中间载体pCAMBIA3301-T800的构建 |
| 2.3 抗除草剂植物表达载体pCAMBIA3301-StBADH-T800的构建 |
| 2.4 重组质粒pCAMBIA3301-StBADH-T800导入农杆菌双酶切检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 StBADH基因遗传转化番茄 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同激素配比对番茄愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2 不同激素配比对番茄不定芽分化的影响 |
| 2.3 生根、炼苗与移栽 |
| 2.4 除菌剂(Carbenicillin)及筛选剂(Bialaphos)的最适浓度筛选 |
| 2.5 T_0代转基因番茄植株的分子鉴定及除草剂抗性检测 |
| 2.6 农杆菌介导的番茄遗传转化转化频率 |
| 3 讨论 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 创新之外 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及申请专利 |
| 致谢 |
（9）湖北海棠抗病相关基因的克隆及其功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物抗病机制 |
| 2 植物系统获得抗病性研究进展 |
| 2.1 信号转导途径 |
| 2.1.1 依赖水杨酸(SA)的信号转导 |
| 2.1.2 依赖茉莉酸/乙烯(JA/ET)的信号转导 |
| 2.1.3 SA信号转导途径和JA/ET的信号转导途径的互作 |
| 2.2 植物病程相关蛋白非表达子(NPR1)基因 |
| 2.2.1 植物NPR1基因的克隆 |
| 2.2.2 NPR1基因的结构 |
| 2.2.3 NPR1蛋白的功能 |
| 2.2.4 NPR1基因的作用机理 |
| 2.3 碱性亮氨酸拉链(bZIP)类转录因子 |
| 2.3.1 bZIP转录因子的分布、结构与亚细胞定位 |
| 2.3.2 植物bZIP转录因子的分类 |
| 2.3.3 植物bZIP转录因子的功能 |
| 2.3.4 TGA类转录因子 |
| 2.4 病程相关蛋白基因 |
| 2.4.1 病程相关蛋白基因的分类 |
| 2.4.2 病程相关蛋白的功能 |
| 3 基因克隆技术研究进展 |
| 3.1 图位克隆 |
| 3.2 RACE |
| 3.3 cDNA文库筛选技术 |
| 3.4 转座子标签 |
| 3.5 电子克隆 |
| 4 植物多基因转化的方法 |
| 5 本研究的技术路线图 |
| 第二章 水杨酸处理湖北海棠全长cDNA文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料与处理 |
| 1.2 仪器和药品 |
| 1.2.1 仪器 |
| 1.2.2 试剂 |
| 1.3 全长cDNA文库的构建 |
| 1.3.1 总RNA的提取 |
| 1.3.2 mRNA的纯化 |
| 1.3.3 全长cDNA文库的构建 |
| 1.3.4 cDNA文库中片段大小的检测 |
| 1.3.5 湖北海棠MhPGIP基因的克隆 |
| 1.3.6 湖北海棠MhWRKY1基因克隆 |
| 1.3.7 目的片段的回收及克隆 |
| 1.3.8 湖北海棠MhPGIP基因和MhWRKY转录因子的序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 苹果叶片总RNA的浓度与质量分析 |
| 2.2 mRNA的纯化 |
| 2.3 dscDNA的合成 |
| 2.4 dscDNA中片段大小的测定 |
| 2.5 湖北海棠MhPGIP基因的克隆和序列分析 |
| 2.6 湖北海棠MhWRKY1转录因子的克隆与序列分析 |
| 2.6.1 湖北海棠MhWRKY1转录因子全长cDNA序列的电子克隆及其RT-PCR验证 |
| 2.6.2 湖北海棠MhWRKY1转录因子基因全长cDNA序列分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 湖北海棠MhNPR1基因的克隆与功能分析 |
| 第一节 湖北海棠MhNPR1基因及其上游启动子的克隆与序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 湖北海棠MhNPR1基因的克隆 |
| 1.3.1 湖北海棠MhNPR1基因cDNA克隆 |
| 1.3.2 湖北海棠基因组MhNPR1基因ORF的扩增 |
| 1.3.3 目的片段的回收及克隆 |
| 1.4 MhNPR1上游启动子序列的克隆 |
| 1.4.1 MhNPR1基因上游调控区染色体步行的接头序列 |
| 1.4.2 接头引物 |
| 1.4.3 MhNPR1基因特异性引物 |
| 1.4.4 启动子的克隆 |
| 1.4.5 MhNPR1启动子PCR产物回收、克隆及测序 |
| 1.5 序列分析 |
| 1.6 细胞定位分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 湖北海棠NPR1基因的cDNA克隆与基因组DNA克隆 |
| 2.2 MhNPR1氨基酸序列分析 |
| 2.3 MhNPR1基因上游启动子序列的分离 |
| 2.4 MhNPR1基因上游启动子序列顺式作用元件分析 |
| 2.5 MhNPR1的亚细胞定位分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 湖北海棠MhNPR1基因表达特性的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料与处理 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 总RNA的提取 |
| 1.3.2 总RNA中DNA的消化以及cDNA第一链的合成 |
| 1.3.3 荧光定量PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 湖北海棠叶片、茎、根总RNA的提取 |
| 2.2 MhNPR1基因在各组织中的表达特性分析 |
| 2.3 SA、MeJA、ACC诱导MhNPR1基因的在叶片中的表达分析 |
| 2.4 SA、MeJA、ACC诱导MhNPR1基因的在茎中的表达分析 |
| 2.5 SA、MeJA、ACC诱导MhNPR1基因的在根中的表达分析 |
| 2.6 苹果轮纹病病原菌诱导MhNPR1基因的在叶片中的表达分析 |
| 2.7 苹果蚜虫诱导MhNPR1基因的在叶片、茎中的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第三节 湖北海棠MhNPR1基因的功能分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 质粒与菌株 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 植物表达载体的构建 |
| 1.3.1 带有酶切位点的MhNPR1基因的克隆 |
| 1.3.2 载体构建 |
| 1.4 转基因烟草株系的获得 |
| 1.4.1 遗传转化 |
| 1.4.2 转基因烟草株系的检测 |
| 1.5 转基因烟草病程相关蛋白基因的表达分析 |
| 1.6 转基因烟草抗病性分析 |
| 1.6.1 烟草灰霉病病原菌的培养 |
| 1.6.2 转基因烟草抗病性分析 |
| 1.7 转基因烟草抗渗透胁迫分析 |
| 1.7.1 T_0株系叶盘法分析 |
| 1.7.2 T_1代种子发芽试验 |
| 1.7.3 T_1代植株苗期分析 |
| 1.8 转基因烟草抗盐性分析 |
| 1.8.1 T_1代种子发芽试验 |
| 1.8.2 T_1代幼苗组培苗抗盐性分析 |
| 1.8.3 T_1代幼苗大田抗盐性分析 |
| 1.9 转基因烟草抗性相关基因的半定量RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 湖北海棠MhNPR1基因双元表达载体的构建 |
| 2.2 转基因烟草株系获得 |
| 2.2.1 PCR检测 |
| 2.2.2 RT-PCR检测 |
| 2.3 过量表达MhNPR1基因诱导烟草PR基因的表达 |
| 2.4 转基因烟草的抗病性分析 |
| 2.5 转基因烟草的抗旱性分析 |
| 2.6 转基因烟草的抗盐性分析 |
| 2.7 转基因烟草株系抗逆相关基因的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 湖北海棠MhTGA2基因的克隆与功能分析 |
| 第一节 湖北海棠MhTGA2基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 湖北海棠MhTGA2保守片段的克隆 |
| 1.3.2 湖北海棠MhTGA2 3’端的扩增(3’RACE) |
| 1.3.3 MhTGA2 5’电子克隆 |
| 1.3.4 MhTGA2基因ORF的扩增 |
| 1.3.5 湖北海棠MhTGA2基因的序列分析 |
| 1.3.6 细胞定位分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 湖北海棠MhTGA2基因中间片段的获得 |
| 2.2 湖北海棠MhTGA2基因3’序列和5’序列的获得 |
| 2.3 湖北海棠MhTGA2基因的序列全长序列 |
| 2.4 湖北海棠MhTGA2基因同源性比较 |
| 2.5 亚细胞定位分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 湖北海棠MhTGA2基因的表达与功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料与处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 表达特性的分析 |
| 1.2.2 植物表达载体的构建 |
| 1.2.3 转基因烟草株系的获得 |
| 1.2.4 转基因烟草株系中抗逆相关基因的表达分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 湖北海棠MhTGA2在组织中的表达特性 |
| 2.2 湖北海棠MhTGA2受SA、MeJA、ACC诱导表达 |
| 2.3 苹果轮纹病病原菌处理后的湖北海棠MhTGA2基因的表达分析 |
| 2.4 湖北海棠MhTGA2基因植物表达载体的构建 |
| 2.5 转基因烟草株系的获得 |
| 2.5.1 PCR检测 |
| 2.5.2 RT-PCR检测 |
| 2.6 转基因烟草株系中PR基因的表达分析 |
| 2.8 转基因烟草中抗逆相关基因的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 湖北海棠病程相关蛋白基因的克隆与功能分析 |
| 第一节 湖北海棠几丁质酶基因(Mhchit1)的克隆与功能分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 电子克隆 |
| 1.2 植物材料与处理 |
| 1.2.1 植物材料 |
| 1.2.2 材料处理 |
| 1.3 湖北海棠Mhchit1的全编码区的验证 |
| 1.4 湖北海棠Mhchit1基因的基因组DNA扩增 |
| 1.5 序列分析 |
| 1.6 细胞定位 |
| 1.7 植物表达载体的构建及其转化烟草的研究 |
| 1.8 转基因烟草植株的获得 |
| 1.9 基因表达分析 |
| 1.9.1 湖北海棠内源Mhchit1基因的表达分析 |
| 1.9.2 转Mhchit1基因烟草中抗逆相关基因的表达分析 |
| 1.10 转基因烟草的抗病性实验 |
| 1.11 转基因烟草株系抗渗透胁迫分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 湖北海棠MhChit1基因的克隆 |
| 2.2 湖北海棠Mhchit1基因推导的氨基酸序列的分析 |
| 2.3 湖北海棠几丁质酶的表达特性分析 |
| 2.3.1 湖北海棠几丁质酶基因在根茎叶中的表达特性 |
| 2.3.2 湖北海棠几丁质酶可以被植物激素SA、MeJA和ACC诱导表达 |
| 2.3.3 苹果轮纹病病原菌诱导湖北海棠Mhchit1基因的表达 |
| 2.3.4 苹果蚜虫诱导Mhchit1基因的表达 |
| 2.4 湖北海棠M-hchit1蛋白的亚细胞定位分析 |
| 2.5 转Mhchit1基因烟草株系的获得 |
| 2.6 抗逆相关基因的表达分析 |
| 2.7 转基因烟草抗烟草灰霉病病原菌能力分析 |
| 2.8 转基因烟草对渗透胁迫的抗性 |
| 3 讨论 |
| 第二节 湖北海棠B-1,3-葡聚糖酶基因(MhGlu)的克隆与表达分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 电子克隆 |
| 1.2 植物材料与处理 |
| 1.3 总RNA的提取 |
| 1.4 湖北海棠β-1,3-葡聚糖酶基因编码区的RT-PCR扩增 |
| 1.5 湖北海棠β-1,3-葡聚糖酶基因编码区的基因组PCR扩增 |
| 1.6 基因组步移 |
| 1.7 序列分析 |
| 1.8 荧光定量RT-PCR |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MhGLu基因的克隆 |
| 2.2 序列比对 |
| 2.3 MhGLu上游启动子序列的分离和cis-元件分析 |
| 2.4 MhGlu在不同组织中的表达特性 |
| 2.5 MhGLu受SA、MeJA、和ACC诱导表达 |
| 2.6 苹果轮纹病病原菌诱导MhGLu基因的表达 |
| 2.7 苹果蚜虫诱导湖北海棠MhGlu基因的表达 |
| 3 讨论 |
| 第三节 湖北海棠MhPR1、MhPR5基因的克隆与表达分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 MhPR1、MhPR5基因cDNA克隆 |
| 1.2.2 MhPR1、MhPR5基因的基因组DNA克隆 |
| 1.2.3 序列分析 |
| 1.2.4 荧光定量RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 湖北海棠MhPR1基因的克隆及其序列分析 |
| 2.2 湖北海棠MhPR5基因的克隆及其序列分析 |
| 2.4 湖北海棠MhPR1和MhPR5基因在叶、茎和根中的表达特性 |
| 2.5 湖北海棠MhPR1基因受SA、MeJA、ACC诱导表达 |
| 2.6 湖北海棠MhPR5基因受SA、MeJA、ACC诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 第六章 湖北海棠三价融合表达载体(Mh TNC)的构建及其功能分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 1.2.1 试剂 |
| 1.2.2 仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 引物合成 |
| 1.3.2 湖北海棠MhTGA2、MhNPR1和Mhchit1三个目的基因的扩增 |
| 1.3.3 植物融合表达载体的改造 |
| 1.3.4 中间载体的构建 |
| 1.3.5 植物三价双元表达载体的构建 |
| 1.3.6 遗传转化 |
| 1.3.7 将潮霉素抗性烟草株系进行PCR和RT-PCR检测 |
| 1.4 三价融合基因的功能分析 |
| 1.4.1 转三价融合基因烟草的表型观察 |
| 1.4.2 转三价融合基因烟草的抗病性分析 |
| 1.4.3 转三价基因的抗旱性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 三价融合表达载体的构建 |
| 2.1.1 植物表达载体的改造 |
| 2.1.2 三个基因的扩增及其酶切 |
| 2.1.3 中间表达载体的构建 |
| 2.1.4 植物三价融合表达载体的构建 |
| 2.2 转基因烟草株系的获得 |
| 2.2.1 转基因烟草抗性株系的PCR检测 |
| 2.2.2 转基因烟草株系的RT-PCR检测 |
| 2.3 转基因烟草株系的表型观察 |
| 2.3.1 转3价载体烟草提前开花 |
| 2.3.2 转3价载体烟草矮化、节数减少、节间增长 |
| 2.4 转基因烟草株系抗性相关酶基因的定量PCR分析 |
| 2.5 转基因烟草株系的抗灰霉病菌分析 |
| 2.6 转基因烟草株系的抗PEG6000分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 主要创新点 |
| 攻读博士期间发表的学术论文和申请的专利 |
| 致谢 |
（10）嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA文库的构建及亲环蛋白基因的序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 cDNA文库的构建方法与种类 |
| 1.1.1 cDNA文库构建的基本原理和方法 |
| 1.1.2 cDNA文库种类 |
| 1.2 全长cDNA文库的构建策略及评价 |
| 1.2.1 全长cDNA文库的构建策略 |
| 1.2.2 cDNA文库的评价 |
| 1.3 cDNA文库的应用 |
| 1.3.1 筛选与性状相关的重要基因及获得目的基因的全长cDNA |
| 1.3.2 为表达序列标签(EST)的开发提供材料 |
| 1.3.3 构建消减cDNA文库、克隆特异表达基因 |
| 1.3.4 为SSR引物的开发提供平台 |
| 1.3.5 结合DNA芯片技术对生物体的基因的时空表达进行研究 |
| 1.4 本研究的目的意义及主要内容 |
| 第2章 嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞全长cDNA文库的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 嗜水气单胞杆菌的计数 |
| 2.3.2 池蝶蚌总RNA的提取 |
| 2.3.4 双链cDNA的合成 |
| 2.3.5 cDNA的分级分离 |
| 2.3.6 未扩增文库的质量鉴定 |
| 2.3.7 扩增文库及其质量的鉴定 |
| 2.4 文库的保存 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 池蝶蚌血细胞cDNA文库的筛选、测序及初步分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 文库的筛选 |
| 3.2.3 文库单克隆菌液的保存 |
| 3.2.4 测序结果的初步分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 测序结果 |
| 3.3.2 序列信息简要统计 |
| 3.3.2 BLAST同源性分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 池蝶蚌cDNA文库筛选分析 |
| 3.4.2 全长文库筛选的方法 |
| 第4章 池蝶蚌亲环蛋白序列分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要仪器设备 |
| 4.2.1 核酸序列的基本分析 |
| 4.2.2 开放阅读框和信号肽位点分析 |
| 4.2.3 AA8蛋白一级结构序列的基本分析 |
| 4.2.4 蛋白质二级结构预测和同源建模 |
| 4.2.5 AA8蛋白三级结构预测 |
| 4.2.6 同源性分析与系统发育分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 核酸序列的基本分析 |
| 4.3.2 AA8序列的开放阅读框分析 |
| 4.3.3 AA8蛋白一级结构序列的基本分析 |
| 4.3.4 AA8蛋白二级结构预测和功能预测 |
| 4.3.5 AA8蛋白三级结构预测 |
| 4.3.6 AA8同源性分析和系统发育分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5.1 池蝶蚌亲环蛋白 |
| 4.5.2 亲环蛋白的功能 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
四、全长cDNA文库的构建和新基因全长cDNA克隆的策略（论文参考文献）
- [1]长白山药用真菌鸡爪苓菌核cDNA文库构建及EST序列分析[D]. 蒋雨函. 延边大学, 2017(05)
- [2]乌龙茶做青过程香气形成相关基因的分离与表达[D]. 张冬桃. 福建农林大学, 2016
- [3]福建柏叶片cDNA文库的构建及EST分析[D]. 黄佳榕. 福建农林大学, 2016(01)
- [4]草珊瑚叶片cDNA文库构建及EST分析[D]. 谢德金. 福建农林大学, 2016(09)
- [5]葡萄cDNA文库构建及鲜食与酿酒葡萄果实发育相关基因的表达分析[D]. 王西成. 南京农业大学, 2012(11)
- [6]水稻灌浆初期高温胁迫下的籽粒全长cDNA文库构建[D]. 肖小军. 江西农业大学, 2012(06)
- [7]油桐种子EST文库构建及FAD2等重要基因全长cDNA克隆[D]. 谢禄山. 中南林业科技大学, 2011(03)
- [8]野生茄子（Solanum torvum）叶片cDNA文库构建及耐盐相关基因StBADH遗传转化番茄[D]. 陈罡. 南京农业大学, 2011(05)
- [9]湖北海棠抗病相关基因的克隆及其功能分析[D]. 张计育. 南京农业大学, 2011(06)
- [10]嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA文库的构建及亲环蛋白基因的序列分析[D]. 谢凯. 南昌大学, 2010(04)