一、肝移植供肝活力的测定(论文文献综述)
矫春宝[1](2020)在《L-抗坏血酸在改善大鼠DCD供肝常温机械灌注灌注液中的应用研究》文中认为目的:探讨L-抗坏血酸应用于常温机械灌注的灌注液中的最佳浓度及对大鼠DCD供肝的缺血再灌注损伤的改善作用。方法:将24只雄性wistar大鼠随机分为静态冷保存组(static cold storage,SCS)、常温机械灌注组(normothermic machine perfusion,NMP)和L-抗坏血酸组(药物浓度梯度分组分别为1m M、2m M、5m M、10m M),每组4只大鼠。采用剪开膈肌法建立大鼠心脏死亡模型并记录时间,在心脏死亡30min后,取出大鼠肝脏,连接到大鼠肝脏体外常温携氧机械灌注系统中,灌注4h。同时设置不加L-抗坏血酸的常温机械灌注对照组与用UW液进行冷保存的对照组。在常温机械灌注过程中,分别于10min、20min、30min、40min、50min、60min、90min、2h、3h、4h取灌注液1ml,检测AST、ALT、LDH、-GT水平,根据酶学水平筛选最佳L-抗坏血酸浓度;并在灌注结束后取胆汁称重;在常温机械灌注或静态冷保存4h后,留取肝组织标本行HE染色,观察DCD大鼠肝组织形态;PAS染色观察DCD大鼠肝组织糖原消耗及补充情况;分别检测DCD大鼠肝组织MDA与SOD含量以及各组肝脏TNF-、IL-1、IL-6含量。结果肝脏灌注过程中酶学呈上升趋势,相同时间点各组比较,L-抗坏血酸组浓度为5m M时酶学水平最好(p<0.001);各组肝脏保存4h后的HE染色Suzuki’s病理评分,SCS组评分明显高于NMP组(p<0.01),并高于L-抗坏血酸组(p<0.001);肝脏糖原消耗SCS组最重,L-抗坏血酸组储备最丰富;各组肝脏胆汁生成没有明显统计学差异;L-抗坏血酸组肝脏SOD活力显着高于NMP组(p<0.01)与SCS组(p<0.001),MDA含量则显着低于NMP组(p<0.01)与SCS组(p<0.001);关于肝脏炎性细胞因子TNF-、IL-1β、IL-6含量比较,L-抗坏血酸组含量最少。结论:L-抗坏血酸应用于常温机械灌注的灌注液最适浓度为5m M且对大鼠DCD供肝有显着改善作用。
蓝海斌[2](2020)在《逆灌注法肝移植对移植肝氧化应激损伤的动物实验与临床研究》文中进行了进一步梳理目的本研究分为两个部分:一、通过建立大鼠同种异体原位肝移植模型,观察经下腔静脉逆灌注法对肝移植氧化应激分子和炎症因子影响的变化;二、通过回顾性研究本中心肝移植手术患者术前及术后手术相关指标,观察临床原位肝移植术中采用经下腔静脉逆灌注法对DCD供肝移植肝术后氧化应激损伤的影响。方法第一部分:将130只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为七组:对照组、1小时经门静脉正灌注(IPR)组、2小时IPR组、6小时IPR组、1小时经下腔静脉逆灌注(RETR)组、2小时RETR组、6小时RETR组,对照组参照供肝手术方式,IPR组和RETR组均实行同种异体原位肝移植术,其中IPR组采用经门静脉正灌注法,RETR组采用经下腔静脉逆灌注法。对照组于取肝前留取血清检测,测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1),留取肝脏组织检测SOD和MDA;门静脉组和逆灌注组于灌注后1小时、2小时和6小时留取血清检测TNF-α和HMGB1,留取肝脏组织检测超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。第二部分:收集我中心2018年1月到2019年9月行肝移植术患者48例,根据手术方式的不同,可分为IPR组23例和RETR组25例。观察在不同手术方式下两组病人术前年龄、性别、MELD评分,以及术后1天、2天、3天、5天和7天血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、凝血酶原时间(PT)、谷氨酰转肽酶(GGT)、血清白蛋白(ALB)和总胆红素(TB)的恢复情况,并检测临床供肝灌注前和灌注后供肝组织中SOD和MDA的含量。结果第一部分:IPR组SOD水平显着低于RETR组(F=16.581,P=0.001),术后各个时间点SOD水平也要显着低于RETR组(P<0.05),IPR组术后MDA水平显着高于RETR组(F=13.884,P=0.002),术后各个时间点MDA水平也要显着高于RETR组(P<0.05);IPR组TNF-α水平显着高于RETR组(F=12.88,P=0.002),术后各个时间点TNF-α水平显着高于RETR组(P<0.05);IPR组HMGB1水平显着高于RETR组(F=30.246,P=0.000),两组之间存在交互效应,术后1小时、2小时HMGB1水平显着高于RETR组(P<0.05),术后6小时两组无明显差异(P>0.05),最大值在IPR组术后2小时处,最小值位于RETR组术后6小时处。第二部分:在ALT、TB和AST水平上,IPR组显着高于RETR组(P<0.05),在术后各个时间的对比上,ALT和TB水平IPR组均要显着高于RETR组(P<0.05),AST水平除术后第1天,两组无显着差异(P>0.05),其余时间IPR组均要显着高于RETR组(P<0.05)。在ALB、GGT和PT水平上,两组均无显着差异(P>0.05),在术后各个时间点的对比上,两组均无显着差异(P>0.05)。在SOD和MDA水平上,IPR组和RETR组在手术前SOD和MDA水平的对比上无显着差异(P>0.05),IPR组SOD灌注后水平显着的低于RETR组(P<0.05),IPR组MDA灌注后水平显着的高于RETR组(P<0.05)。结论1、经下腔静脉逆灌注法能使移植术后氧化应激分子和炎症因子的水平相对的减少。2、经下腔静脉逆灌注法能减轻DCD来源移植肝术后早期氧化应激损伤。
刘忠忠[3](2019)在《辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤中的作用及机制研究》文中研究表明第一部分:辛伐他汀预处理在大鼠全肝缺血再灌注损伤中的作用及潜在机制研究目的:全肝缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)包括肝脏和肠道的热缺血损伤,是肝移植过程中一个错综复杂并不可避免的病理过程,可导致肝移植预后不良。然而,目前改善肝脏IRI的手段有限。本研究探讨辛伐他汀预处理大鼠全肝IRI中的作用及机制。方法:建立一个大鼠全肝热缺血30 min的模型模拟全肝IRI;36只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组、IRI对照组(IRI-Con组)和辛伐他汀预处理组(IRI-Sim组)。IRI对照组和辛伐他汀预处理组分别为大鼠建立全肝热缺血30min之前予以0.1%DMSO和1mg/kg辛伐他汀腹腔注射预处理;于再灌注6h和24h收集血液和肝脏标本以待下一步检测,每组两个时间点各6只(n=6)。结果:与IRI对照组相比,辛伐他汀预处理组能显着降低血清ALT和AST水平以及改善肝脏组织病理形态损伤;辛伐他汀预处理组增加了Kruppel样因子2(Kruppel-like factor 2,KLF2)及其下游保护分子磷酸化内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)和血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)的表达(p<0.05);进一步发现辛伐他汀预处理能影响肝组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和脂质过氧化物(malondialdehyde,MDA)活性(p<0.05)减轻氧化应激损伤,降低肝细胞凋亡水平并能减少高迁移率蛋白b1(high-mobility group box-1,HMGB1)、toll样4受体(toll-like receptor 4,TLR4)、CD68、肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor a,TNF-a)、白介素1β(interleukin-1,IL-1β)和IL-6表达(p<0.05)抑制炎症反应。结论:辛伐他汀预处理能通过KLF2介导的保护机制减轻全肝IRI;辛伐他汀可能作为一种潜在预防治疗的药物拮抗临床肝脏IRI。第二部分:辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝中缺血再灌注损伤中的作用及机制研究目的:严重的肝脏IRI是导致肝移植近远期疗效差的主要原因之一。如何有效优化心脏死亡(donors after circulatory death,DCD)供肝的质量减轻肝脏IRI是移植领域研究的热点。本研究探讨供体辛伐他汀预处理优化大鼠DCD供肝的作用及机制研究。方法:建立大鼠心脏停跳30 min模拟DCD供肝的模型;24只雄性SD大鼠随机分为4组:正常肝脏组(NP组)、正常肝脏冷保存组(CSP组)、DCD对照组DCD-Con组)和DCD肝脏辛伐他汀预处理组(DCD-Sim组)。NP组和CSP组均为无热缺血损伤的供肝;DCD-Con组和DCD-Sim组分别为大鼠建立心脏停跳热缺血30 min之前予以0.1%DMSO和1 mg/kg辛伐他汀腹腔注射预处理;除了NP组,其他三组均在UW液中冷保存24 h;之后四组全部通过常温复灌系统评价肝脏质量;在肝脏体外常温复灌1h内收集灌注液和组织标本用于研究检测,每组各6只(n=6)。结果:与DCD对照组相比,辛伐他汀预处理组能显着降低灌注液ALT和AST水平,增加胆汁和ATP生成以及减轻肝脏组织形态学损伤;辛伐他汀预处理组增加了KLF2及其下游保护分子磷酸化e NOS、TM和血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表达(p<0.05);进一步发现辛伐他汀预处理组能改善肝组织SOD和MDA活性(p<0.05)减轻氧化应激损伤,减少HMGB1、TLR4、CD68、TNF-a、IL-1β、IL-6和ICAM-1基因水平表达(p<0.05)抑制炎症反应并且增加抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值减轻肝细胞凋亡水平。结论:供体辛伐他汀预处理能通过KLF2介导的保护机制减轻DCD肝脏的IRI;以上数据表明辛伐他汀可为临床优化DCD肝脏质量提供潜在的保护效应。
薛帅[4](2019)在《低温机械灌注通过抗氧化应激保护大鼠心脏死亡供肝的机制研究》文中认为肝移植技术经过半个多世纪的发展,随着肝移植新技术的拓展,适应症也逐渐扩大,使该技术成为终末期肝病患者的最佳选择。与之伴随而来的是供肝的相对短缺,成为制约肝移植手术和发展的瓶颈。在过去数十年,如何扩大供肝来源成为移植领域内研究的热点。心脏死亡后器官捐献(donation after cardiac death,DCD)供肝成为扩大供肝池的选择。然而,这类供肝由于存在较长时间的热缺血,移植后容易引起术后并发症。传统的冷保存(cold storage,CS)已经不能满足这类供肝的临床保存需要。低温机械灌注(hypothermic machine perfusion,HMP)因其对ECD供肝,特别是DCD供肝具有良好的保存效果,具有代替CS成为供肝保存方式的潜力。HMP分为主动氧合与被动氧合两种,主动氧合的HMP也称为低温携氧机械灌注(hypothermic oxygenated perfusion,HOPE)。但HMP和HOPE保护DCD供肝的具体机制尚未明确。目的:(1)建立Sprague Dawley(SD)大鼠DCD供肝模型以及后续的CS、HMP和大鼠离体复灌模型探讨HMP对大鼠DCD供肝的保护作用以及具体分子机制;(2)建立大鼠DCD供肝模型,在之前的基础上建立HOPE模型以及大鼠自体血离体复灌模型,进一步探究HOPE对大鼠DCD供肝的保护作用以及具体的分子机制。方法:(1)将18只成年雄性SD大鼠随机分为3组:对照组,HMP组和CS组。CS和HMP组中的大鼠肝脏经历30分钟的热缺血,然后通过CS或HMP保存3小时。随后,在离体灌注1小时后通过检测MDA产生、SOD活性、ATP水平以及用于组织学分析,免疫组织化学和TUNEL染色评估肝脏缺血/再灌注损伤(ischima reperfusion injury,IRI)。然后通过蛋白质印迹(western blot,WB)和RT-PCR与Nrf2-ARE信号传导途径相关的组分的表达水平;(2)将18只成年雄性大鼠随机分成3组:对照组,CS组和HOPE组。CS和HOPE组中的大鼠肝脏经历30分钟的热缺血,然后通过CS保存4小时或在CS后HOPE1小时。然后,通过离体大鼠自体血复灌4小时评估肝功能和肝脏IRI。在再灌注期间,收集胆汁和灌注液以测量酶量和肝功能的其他指标。再灌注后,将肝脏样品用于组织学和透射电子显微镜(TEM)分析。测定抗氧化剂应激水平、炎性细胞因子和细胞凋亡。通过蛋白质印迹,免疫沉淀和免疫组织化学分析Notch1信号传导途径和与Notch1相关的其他信号传导途径的表达水平。结果:(1)研究结果显示,与CS组相比,HMP组的ATP和SOD活性水平较高,组织学结果改善;较低水平的细胞凋亡和MDA。另外,研究还表明Nrf2-ARE信号传导途径可以通过HMP激活;(2)研究结果显示,与CS组相比,HOPE组肝功能明显改善。轻微缺血再灌注损伤反映在酶(AST,ALT和LDH)水平,肝功能(胆汁流量,ATP和O2消耗)??,抗氧化应激(ROS,MPO和SOD)和炎性细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-10)。与CS组相比,HOPE组的组织学、细胞凋亡率和透射电镜(ransmission electron microscope,TEM)分析也显示出更好的结果。Western印迹、免疫沉淀和免疫组化分析还表明Notch1信号传导途径可以通过HOPE处理激活。结论:(1)HMP可通过激活Nrf2-ARE信号传导途径减轻大鼠DCD肝脏的缺血再灌注损伤;(2)HOPE可通过激活Notch1信号传导途径减轻大鼠DCD肝脏的缺血再灌注损伤。
张黎[5](2019)在《CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究》文中研究说明第一部分大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒载体的构建及鉴定[目 的]构建大鼠CaMKⅡγ基因的过表达及干扰慢病毒载体并鉴定,为下一步探讨慢病毒介导CaMKⅡγ基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及其在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤的作用提供基础。[方 法]根据大鼠CaMKⅡγ目的基因的mRNA序列,全基因合成CaMKⅡγ目的基因,构建大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,根据本课题组前期实验中已筛出的干扰效率最高的siRNA序列构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγyshRNA慢病毒空载体,转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞并进行测序验证,随后转染293T细胞进行慢病毒包装并用绝对定量qPCR测定慢病毒滴度。应用Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体的蛋白表达情况,确定大鼠CaMKⅡγ过表达的有效性。根据不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A,将其分为生理盐水空白对照组(CON组),CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体组(CON-mCaMKⅡγ组),CaMKⅡγ过表达慢病毒载体组(mCaMKⅡγ组),CaMKⅡγ干扰慢病毒空载体组(CON-shCaMKⅡγ组),CaMKⅡγ干扰慢病毒载体组(shCaMKⅡγ组),应用Western Blot检测各组CaMKⅡγ蛋白表达情况。[结 果]成功构建了大鼠CaMKIIⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体蛋白的表达。根据已知干扰效率最高的siRNA序列成功构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγshRNA慢病毒空载体。绝对定量qPCR测定大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体、大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体滴度均为2E+9TU/mL。不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A 48h后,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ蛋白表达最高,shCaMKⅡγ的CaMKⅡγ表达最低,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ表达高于CON-mCaMKⅡγ组(P<0.01),shCaMKⅡγ组的 CaMKⅡγ表达低于CON-shCaMKⅡγ组(P<0.01)。[结 论]大鼠CaMKⅡγ基因的过表达慢病毒在293T细胞中构建成功并表达,大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体在293T细胞中构建成功。大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中蛋白表达显着增加,而大鼠CaMKⅡγ干扰慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中的蛋白表达量显着下降,为后续研究CaMKⅡγ作为靶基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及在大鼠DCD肝移植术缺血-再灌注损伤的作用提供基础。第二部分建立SD大鼠DCD原位肝移植模型[目 的]建立稳定的SD大鼠DCD原位肝移植模型并确定在本课题后续实验中SD大鼠DCD原位肝移植模型的最佳热缺血时间。[方 法]本实验通过Kamada“二袖套”法,控制不同热缺血时间(热缺血Omin、热缺血15min及热缺血30min)建立SD大鼠DCD原位肝移植模型,并通过移植术后存活时间及肝脏变化确定本实验最佳动物模型热缺血时间。[结 果]供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型术后7d的生存率分别为90%、80%及60%,随着热缺血时间延长,肝脏损伤加重,肝功能ALT、AST及TBIL逐渐升高,肝脏病理切片结果显示肝细胞从轻度水肿到点状坏死,再从桥接样坏死到大片状坏死。[结 论]在SD大鼠DCD原位肝移植模型中,热缺血时间的长短是直接影响供肝质量的关键因素,随着热缺血时间延长,供肝肝功能损伤逐渐加重,与病理结果一致,术后受体存活率随热缺血时间延长而显着下降。经过对比,热缺血15min是建立SD大鼠DCD原位肝移植模型并为后续进一步试验的理想造模时间,既可保证移植术后受体有一定的存活率,又可观察后续慢病毒干预对肝损伤是否有效。第三部分CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]用第二部分建立的供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型,三组分别于肝移植术后1d、3d及7d处死20只大鼠,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、CytC的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ蛋白表达,探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[结 果]三组移植术后1dCa2+水平达到高峰,术后3d Ca2+下降,到术后7d Ca2+又逐渐升高,同一时点,热缺血15min组及30min组Ca2+浓度水平高于热缺血Omin组(P<0.01)。JC-10标记绿色荧光细胞比例随时间延长逐渐升高,提示线粒体膜势能下降比例逐渐升高,术后1d,三组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组(P<0.05),术后7d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组(P<0.01)。Tunel检测肝细胞凋亡比例随时间延长逐渐升高,术后1d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组(P<0.05),热缺血15min组与热缺血Omin组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组(P<0.05),术后7d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组(P<0.05)且热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血15min组(P<0.05)。Western Blot测CaaM、CaMKⅡγ、AIF及Cyt C蛋白表达随热缺血时间延长而逐渐增加(P<0.05,P<0.01),同一时点,热缺血15min组及30min组的蛋白表达高于热缺血Omin组,QRT-PCR及免疫组化测CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA及 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与 Western Blot 结果趋势大致相同。[结 论]热缺血时间是影响供肝质量的关键因素,SD大鼠DCD原位肝移植术后,供肝热缺血时间越长,供肝功能损伤越重,移植术后Ca2+浓度逐渐升高,从分子、蛋白及组织水平验证了随热缺血时间的延长,CaM及CaMKⅡγ表达增加,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,线粒体膜势能下降细胞比例增加,AIF及CytC从线粒体内释放,线粒体凋亡增加,由线粒体凋亡引起的肝细胞凋亡随之增加。第四部分慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]建立热缺血15min SD大鼠DCD原位肝移植模型,每只大鼠术中通过门静脉按1.0×108TU/mL注射CaMKⅡγ过表达及其对照慢病毒。(mCaMKⅡγ组、CON-mCaMKⅡγ组)、CaMKⅡγ干扰及其对照慢病毒(shCaMKⅡγ组及CON-shCaMKⅡγ组)、生理盐水(CON组)转染移植肝脏,于术后1d、3d、7d分别处死20只大鼠。取血清行肝功能检测,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、Cyt C的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ的蛋白表达,电镜检测肝组织中肝细胞、线粒体的超微结构变化。[结 果]CaMKⅡγ过表达慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为83.3%、78.3%及70.0%,而CaMKⅡγ干扰慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为98.3%、93.3%及88.3%,提示干扰CaMKⅡγ的表达对大鼠DCD肝移植术后肝损伤是保护因素,可提高大鼠DCD肝移植术后生存率。肝功能结果示:血清 ALT、AST 术后各时点 mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于CON-shCaMKⅡγ组(P<0.01),血清TBIL于术后1d各组无显着差异,术后3d及7d结果同血清ALT、AST。移植术后Ca2+浓度于术后1d达到高峰,各组间无显着差异,术后3d逐渐下降,术后7d再次升高,术后3d及7d,mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组(P<0.01)。JC-10标记绿色荧光细胞比例在术后1d及3d,shCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例低于 CON-shCaMKⅡγ组(P<0.05,P<0.01),术后 7d,mCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组(P<0.01)。Tunel法测肝细胞凋亡结果示:术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例低于CON-shCaMKⅡγ组(p<0.01)。Western Blot 测 CaM、CaMKⅡγ、AIF 蛋白表达于术后 1d,mCaMKⅡγ组表达高于 CON-mCaMKⅡγ组(P<0.01,P<0.05),术后 3d 及 7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于CON-shCaMKⅡγ组(P<0.01),CytC蛋白表达于术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于 CON-shCaMKⅡγ组(P<0.05,P<0.01)。QRT-PCR 测 CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA 的表达及免疫组化测 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与Western Blot结果趋势相同。电镜结果可见mCaMKⅡγ组出现超微结构损伤,肝细胞肿胀及坏死、线粒体肿胀、嵴消失,而shCaMKⅡγ组受损形态明显改善,肝细胞大致正常,线粒体或肝细胞轻微肿胀,CON组、CON-mCaMKⅡγ组、CON-shCaMKⅡγ组可见肝组织轻微的超微结构损伤,随时间推移,mCaMKⅡγ组损伤逐渐加重,shCaMKⅡγ组损伤逐渐减轻。[结 论]DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致CaMKⅡγ异常表达,可通过激活Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路诱导线粒体损伤,上调CaMKⅡγ可使Ca2+水平升高,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,使线粒体膜势能下降,线粒体通透性增加进而导致线粒体肿胀、破裂及凋亡,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质可启动线粒体凋亡,进一步促进肝细胞凋亡;而下调CaMKⅡγ则可使Ca2+水平降低,减少线粒体膜势能下降,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质减少,进而减少线粒体凋亡及其诱导的肝细胞凋亡,对SD大鼠DCD原位肝移植术后的肝功能损伤有保护作用。CaMKⅡγ过表达在DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致的线粒体凋亡中起主导作用,特异性干扰CaMKⅡγ表达可特异性调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路,有效改善SD大鼠DCD原位肝移植术后肝损伤及提高术后移植大鼠存活率。
曾宪鹏[6](2019)在《小鼠肝脏低温携氧机械灌注系统的建立及保护机制研究》文中指出目的:由于器官来源不足,心脏死亡(donation after circulatory death,DCD)供肝等质量不佳的肝脏被应用于临床,为弥补冷保存(cold storage,CS)不能修复供肝质量的缺陷,肝脏低温携氧机械灌注(hypothermic oxygenated machine perfusion,HOPE)技术逐渐被使用。然而鉴于缺乏合适的研究模型,HOPE作用的分子机制尚不明晰。为此,我们拟建立小鼠肝脏HOPE模型,在探究合适灌注参数的基础上,应用该模型阐明HOPE对DCD供肝的保护作用机制。方法:对比应用不同流量HOPE灌注正常肝脏及热缺血30分钟肝脏的效果,验证小鼠肝脏HOPE系统的稳定性与有效性,并探寻适合的灌注流量。应用体外常温非载血复灌系统,阐明自噬在HOPE对DCD供肝中的作用。通过体外常温载血复灌系统与基因工具鼠,分析P选择素是否参与HOPE对DCD供肝的保护作用。结果:当HOPE流量不小于0.3 ml/min·g时,该系统能在正常小鼠肝脏中达到完全灌注。在流量为0.1-0.5 ml/min·g条件下,HOPE能发挥明显优于CS的DCD供肝保护作用。与CS相比,经历了HOPE的DCD供肝能够激活自噬体的生成,自噬蛋白表达与自噬体数量明显增加,然而应用自噬抑制剂后,HOPE的保护作用被消除。在炎症反应方面,P选择素敲除能够减轻DCD供肝损伤程度,其与野生型小鼠HOPE的作用机制类似。此外,比较P选择素敲除小鼠HOPE与CS对DCD供肝效果发现,P选择素敲除小鼠HOPE在拥有抗炎作用的基础上还能减轻DNA与氧化应激损伤。结论:我们成功建立了稳定的小鼠肝脏HOPE系统,阐明了HOPE可通过激活自噬及P选择素依赖与非依赖途径发挥对DCD供肝的保护作用。
唐波[7](2018)在《树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究》文中指出第一部分树鼩原位肝移植模型的建立[目的]首次尝试用树鼩建立同种异体原位肝移植动物模型,为肝移植的临床及科学研究提供一种新型的,与人类基因型及免疫系统同源性更高,且更为经济实用的肝移植动物模型。[方法]在Kamada报道的“二袖套”法肝移植模型基础上加以改进,通过对总共60只树鼩进行随机分组为供体组和受体组进行同种异体原位肝移植实验,观察手术成功率,术后树鼩存活率,并行肝脏组织病理学检查,建立稳定的树鼩原位肝移植模型。[结果]定型手术成功率为90.00%(27/30),树鼩24h存活率为76.67%(23/30),3 天存活率为 60.00%(18/30),1 周存活率为 30.00%(9/30),最长存活时间为11天。3例手术失败原因为:肝上下腔静脉吻合口出血,麻醉过深,气胸死亡各1例。24h内死亡4例,其中1例因吻合口出血,1例吻合口血栓形成,2例死亡原因不明。术后存活超24h死亡23例,原因分别为急性排斥反应15例,占65.22%,其它为:胆道梗阻1例,腹腔感染2例,肝叶坏死1例,不明原因4例。[结论]1树鼩原位肝移植模型建立的难度及操作复杂性比大鼠肝移植更大,综合影响因素更多。合理的围手术期处理及娴熟的显微镜操作是影响肝原位移植模型手术成功的关键。2树鼩肝移植模型成功建立为本研究的创新点,目前未见报道,首次成功用树鼩建立了同种异体原位肝移植模型,作为一种新型动物肝移植模型的建立——改良“二袖套”法在树鼩原位肝移植模型的建立,模型稳定可靠,为今后将树鼩原位肝移植模型运用于肝移植的临床及基础研究奠定了基础。第二部分树鼩淋巴细胞CXCL12/CXCR4基因表达和迁移的体外实验研究[目的]研究雷帕霉素对树鼩外周血淋巴细胞趋化因子CXCL12(SDF-1)趋化功能及其受体CXCR4表达的影响,为移植排斥体内研究提供实验依据。[方法]实验分组:Rapacymin药物组、DMSO对照组和空白组。采用MTS细胞增殖实验,观察雷帕霉素对树鼩淋巴细胞存活及状态的影响;用细胞迁移运动实验检测雷帕霉素对人源性重组CXCL12所诱导树鼩淋巴细胞迁移能力的影响:使用Real-time PCR法检测雷帕霉素对树鼩淋巴细胞CXCR4基因的表达情况。[结果]雷帕霉素对树鼩淋巴细胞活力无显着影响,但对树鼩的淋巴细胞的迁移有抑制作用。同时雷帕霉素可下调树鼩淋巴细胞的CXCR4基因表达。[结论]趋化因子CXCL12及其受体CXCR4表达水平可影响淋巴细胞迁移,为树鼩肝移植急性排斥反应体内实验研究提供依据。第三部分树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4表达的作用及机制研究[目的]在肝移植模型建立的基础上加用免疫抑制剂及趋化因子受体阻止剂对趋化因子及其受体的作用进行实验研究。通过表达的差异性,阐明肝移植急性排斥中趋化因子/趋化因子受体(CXCL12/CXCR4)轴调控淋巴细胞迁移发挥的作用和机理等系列问题。为肝移植急性排斥反应发生机制提供重要依据,同时为临床有效的治疗和控制急性排斥反应,促进移植物存活提供实验数据和理论支持。[方法]1树鼩肝移植急性排斥反应模型建立,方法同第一部分。2实验分组;(1)对照组,A组(n=25):正常树鼩作为对照;(2)排斥组,B组(n=25):树鼩同种异基因肝移植组;(3)AMD3100组,C组(n=25):树鼩同种异基因肝移植静脉注射AMD3100,1mg/kg/day;(4)雷帕霉素(Rapacymin,RAPA)抑制组,D组(n=25)。术后1、3、5、7d随机处死5只,收集血液、肝脏、脾脏标本。留下5只观察生存期,绘制生存曲线。3 实验室常规指标测定:收集各组肝移植术后1d,3d,5d,7d的血清,使用血液全自动生化分析仪测定TP,ALT,AST,TB水平。4流式细胞仪检测淋巴细胞CXCR4:分别在肝移植术后1d,3d,5d,7d,收集脾脏淋巴细胞,进行分离、培养,流式细胞检测。5移植物组织形态及病理学检测:免疫组织化学染色(IHC)检测并分析CXCL12的表达情况。肝组织HE染色病理学检查,根据Banff评分系统判断排斥反应程度。6酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中CXCL12(SDF-1)蛋白量。7组织蛋白印迹(Western blot)分析与检测各组移植肝的CXCR4蛋白表达情况。[结果]1 C、D组树鼩移植后中位生存时间明显长于B组,差异有显着意义(P<0.05),各组与 A 组比较,(P<0.05)。2树鼩肝移植术后实验室常规检查指标:对比各组树鼩肝移植术后1d,3d,5d,7d的相关指标。血清TP同时间点各组之间相比较,B、C、D组明显低于A组,差异有显着性(P<0.05)。而1d时,B、C、D,TP开始下降,但三组间比较,无显着性差异(P>0.05)。B组呈持续性下降,而C、D组术后5d、7d随着时间延长,开始恢复,呈上升趋势,C、D组5d,7d时点与B组比较,差异有显着性(P<0.05)。D组3d后,TP上升略高于C组,但两组统计无差异(P>0.05)。B组,C组,D组术后血清TB,ALT,AST,急剧上升,与A组在1d,3d,5d,7d同期比较,明显高于A组,差异有显着性(P<0.05)。B组持续性升高,而C、D组术后5d、7d随着时间延长,肝功能开始恢复,略有上升趋势,但较平缓,C、D组5d,7d时点与B组比较,差异有显着性(P<0.05)。而1d时,B、C、D三组间比较,无显着性差异(P>0.05)。3外周脾淋巴细胞流式细胞检测:术后1d、3d,B、C、D组间脾脏淋巴CXCR4表达无明显差异(p>0.05),与A组有显着性差异(P<0.05)。术后5d、7d各时间点,C、D组明显低于B组,差异有显着性(P<0.05)。4移植肝脏形态学检测:采用Banff分级对移植肝脏AR的程度进行分级,A组术后各时间点,移植肝脏组织结构正常;B、C、D组1d肝小叶结构基本完好,肝细胞基本无变性、坏死,汇管区仅有少许炎性细胞浸润,未发生排斥;B组移植术后Id排斥不明确,在术后第3、5、7 d分别发生了轻度(Ⅰ级)、中度(Ⅱ级)、重度(Ⅲ级)排斥;C、D组术后3天到10天内,有少数发生了轻度AR。B组与C,D组同期比较排斥反应更为严重(P<0.05)。B组,术后3d可有明确的急性排斥反应发生。5免疫组化检测肝脏CXCL12表达:术后第7d B组CXCL12在肝脏细胞表达最高,C组、D组肝细胞CXCL12表达少,C组、D组与B组比较有显着性差异(P<0.05)。A组正常组织也有较少量的CXCL12表达,但与B组、C组、D组比较有显着性差异(P<0.05)。6酶联免疫吸附法检测树鼩外周血浆中CXCL12蛋白的表达:肝移植后`d,B组,C组,D组血清CXCL12表达相互比较均无明显差异(P>0.05),与A组相比有显着差异(P<0.01)。移植术后3d,B组血清中CXCL12快速上升,与术前`d的表达水平相比较,有显着差别(P<0.05),并随时间上调。C组、D组表达水平在术后5d,7d天上升缓慢,与B组同时间点比较表达水平低(P<0.05)。CXCL12蛋白的表达变化与RAI呈正相关,相关系数(r)为0.880。7 Western蛋白印迹分析检测:术后第1d各组树鼩移植肝内CXCR4蛋白表达无明显差异(P>0.05)。而术后第3d、5d、7d各时段A组、C组、D组树鼩淋巴细胞表达CXCR4蛋白明显低于B组(P<0.05)。C组、D组术后CXCR4蛋白表达高于A组(P<0.05),而C组、D组两组之间第3d、5d、7d 比较CXCR4蛋白表达差异不明显(P>0.05)。[结论]1树鼩与人同源性较好,可用人的相关试剂应用在树鼩实验研究上,本实验研究结果的可靠性,进一步证实树鼩肝移植模型可应用于肝移植的系列实验研究中,并具有物种的优越性和价值。2树鼩肝移植模型急性排斥反应研究证实,正常肝组织有CXCL12表达,急性排斥时,可与CXCR4协同发生淋巴细胞、炎性细胞迁移至移植物,引起移植肝功能不全或受损。3趋化因子受体抑制剂AMD3100可阻断CXCL12/CXCR4轴在肝移植排斥中的作用,抑制T淋巴细胞向移植物浸润,减轻急性排斥反应。4雷帕霉素可抑制CXCL12人重组蛋白诱导的树鼩淋巴细胞迁移。其相关可能的机制为:雷帕霉素可下调CXCL12的激活与表达,并影响CXCR4受体的表达,以调控CXCL12/CXCR4信号通路所介导的淋巴细胞的运动能力,发挥其免疫抑制作用。5肝移植后CXCL12/CXCR4的表达水平与急性排斥反应的程度密切相关,表达水平与排斥反应强度有关,可评估免疫排斥反应状态。6 CXCL12血清中持续高表达可较敏感地预示肝移植急性排斥发生。检测血清CXCL12表达可作为一种无创的、敏感的早期诊断肝移植急性排斥反应的方法,为临床监测和诊断提供参考依据。并且可通过CXCL12的表达水平在一定程度上预测排斥反应的严重程度和判断抗排斥反应的治疗效果。
蓝柳根[8](2009)在《联合应用厄贝沙坦和依达拉奉对大鼠边缘性体积供肝移植的供肝保护作用研究》文中提出第一部分大鼠边缘性体积供肝肝移植模型的建立目的本部分实验通过离体减体积肝叶切除供肝―大鼠原位肝移植方式,探讨大鼠边缘性体积供肝肝移植模型建立的方法,为研究小肝综合症的发病机制及防治措施提供一个较为理想的小动物模型。材料和方法选用健康、912周龄、体重190250g的雄性大鼠192只作为实验动物,取周龄相差13周,体重相差2030克的大鼠,以小体重大鼠作为供体,采用离体减体积肝叶切除方式行不同体积供肝的大鼠原位肝移植。本部分实验设立4个实验组:A组,全肝移植组(n=24);B组,50%部分肝移植组(切除肝左叶,双乳突叶,保留肝中叶、右后叶和右前叶作为供肝,使供肝与受体肝比值控制在50%左右,n=24);C组,30%部分肝移植组,除保留大鼠肝中叶外,其余四叶均予以切除,使供肝重量与受体肝比值控制在30%~35%之间,n=24);D组:小于30%部分肝移植组(保留右前叶、右后叶和双乳突叶,切除肝中叶和左叶,使供肝与受体肝比值小于30%,n=24)。供、受体均采用乙醚持续开放式吸入麻醉,大鼠原位肝移植血管重建采用双袖套法,不做肝动脉血管重建。观察各组术后肝功能ALT和AST水平、门静脉压力和存活率,光镜下及电镜下表现,比较分析各组间ALT、门静脉压力及累积存活率之间的关系。结果1.全肝移植组(A组)7天累积存活率为100%(12/12),50%部分肝移植组(B组)7天累积存活率为83.3%(10/12),30%部分肝移植组(C组)7天累积存活率为16.7%(2/12),小于30%部分肝移植组(D组)均于术后48小时内死亡。各组间存活率经生存分析life-table方法比较,A组与B组累积存活率比较,组间差异无统计学意义,p=0.148; C组与A组累积存活率比较,组间差异有统计学意义,p<0.001;C组与B组两组存活率有显着性差异,p<0.001; C组与D组两组存活率有显着性差异,p<0.001;2.受体在移植前基础门静脉压力各组间差异无统计学意义,p>0.05。A组术中开放门静脉后1小时内门静脉压力稳定,B组开放门静脉后门静脉压力虽有小幅上升,但门静脉压力仍保持相对稳定,而C组和D组开放门静脉后门静脉压力显着升高,15分钟达到峰值,两组门静脉压力峰值分别较基础门静脉压力升高65%和82%。两组门静脉压力30分钟开始回落,至45分钟到60分钟逐渐稳定,但仍维持于一高位。将供肝体积的大小与各时间点的门静脉压力进行Pearson相关分析后发现,供肝体积的大小与基础门静脉压力无相关性,相关系数r=0.249,p=0.241;而供肝体积大小与开放门静脉后5、15、30、45、60分钟门静脉压力呈负相关性,(相关系数分别为r=-0.926,r=-0.936, r=-0.904, r=-0.902, r=-0.867, p<0.05)。3.肝移植术后24小时各组ALT和AST水平明显升高,四组中以D组水平最高,C组次之,B组和A组最低,各组间差异有统计学意义,p<0.001。将供肝体积大小与各组移植术后24小时ALT和AST水平进行Pearson相关分析后,结果显示供肝体积大小与移植术后24小时ALT和AST水平呈负相关性,相关系数r分别为-0.704和-0.815, p<0.05。4.光镜下可见各组均出现不同程度的肝窦充血、局部肝窦扩张、血管内皮细胞完整性受损、肝板结构改变及肝细胞空泡变性等形态学异常的表现。与其他组相比较,C,D组在术后24小时形态学异常的表现均较为明显且程度严重。5.电镜观察结果显示,C,D组在肝移植术后24小时出现严重的肝窦内皮细胞线性结构完整性破坏、线粒体肿胀等严重的形态学异常。A,B在相应的时间点肝细胞的超显微结构保持得相对完整结论1.再次证实直视下离体减体积肝叶切除供肝―大鼠原位肝移植模型是作为为小肝综合症基础性研究的较为理想的小动物模型,具有很好的可靠性和可重复性。2.再次证实了大鼠减体积供肝肝移植模型供肝体积大小的安全界限为50%标准体积;体积介于35~30%标准体积之间的供肝应视为边缘性体积移植物,小于30%标准体积的供肝可视为超小体积肝移植。3.大鼠边缘性体积供肝肝移植模型的建立,可选取周龄相差1~3周,体重相差20~30克的大鼠,以小体重的大鼠作为供体,除保留肝中叶外,其余四叶均予以切除,可以使供肝湿重与受体肝比值控制在30%~35%之间。4.大鼠减体积供肝肝移植模型中,供肝体积大小与开放门静脉压力升高幅度及术后24小时ALT和AST水平呈负相关性,小体积供肝肝移植术中开放门静脉后急剧升高的门静脉压力对肝窦造成的应力性的损伤,是导致肝移植术后小体积移植物功能损害、受体存活率降低的主要原因。第二部分联合应用厄贝沙坦和依达拉奉对大鼠边缘性体积肝移植的移植物保护作用的研究目的本部分实验拟对大鼠边缘性体积供肝肝移植术后小体积移植物早期损伤的机制进行初步研究,探讨在大鼠边缘性体积供肝肝移植术中联合使用厄贝沙坦和依达拉奉,降低再灌注期间门静脉压力,减轻缺血再灌注损伤对边缘性体积供肝早期损伤的保护作用机制。材料和方法选用健康、体重相差2030克的雄性SD大鼠300只,以小体重大鼠为供体,按第一部分介绍的方法建立大鼠边缘性体积供肝肝移植模型,将供受体大鼠随机分为:A组,边缘性体积部分肝移植生理盐水对照组;B组,边缘性体积部分肝移植依达拉奉实验组;C组,边缘性体积部分肝移植厄贝沙坦实验组;D组,边缘性体积部分肝移植厄贝沙坦联合依达拉奉实验组;E组,假手术组。观察各组术后一般情况、门静脉压力和存活率,各组分别于术后6小时和24小时各取6只受体在无菌操作条件下采取下腔静脉血标本和肝组织标本。测定血清中ALT、AST水平、肝细胞匀浆内SOD活力和MDA含量、RT-PCR检测肝组织中Egr-1,ET-1,Bax mRNA表达情况,免疫组化检测肝组织中ET-1,Bax,TNF表达情况,TUNEL检测肝组织细胞凋亡情况以及光镜下观察肝组织形态学改变。结果1.光镜下可见各组均出现不同程度的肝窦充血、局部肝窦扩张、血管内皮细胞完整性受损、肝板结构改变及肝细胞空泡变性等形态学异常的表现。以术后6小时最为严重。与其他组相比较,A,B组在术后6小时和24小时形态学异常的表现均较为明显且程度严重。D组最轻。E组无明显变化。2.A组7天累积存活率为8.33%(1/12),B组7天累积存活率为33.3%(4/12),C组7天累积存活率为58. 7%(7/12), D组7天累积存活率为83. 3%(10/12),E组7天累积存活率为100%(12/12),经SPSS生存分析life-table方法比较,各组累积存活率之间的差异有统计学意义。A组与B组累积存活率比较,组间差异有统计学意义,p=0.018; C组与A组累积存活率比较,组间差异有统计学意义,p<0.001;D组与A组两组存活率有显着性差异,p<0.001; E组与A组两组存活率有显着性差异,p<0.001;3.C,D组受体移植前基础门静脉压力低于A,B组,各组间均数比较,差异有统计学意义(8.21,8.15 vs 10.28,10.55,p=0.019)。各组开放门静脉恢复血流灌注后门静脉压力的峰值均出现在开放门静脉后的15分钟处,但C,D组门静脉压力峰值要明显低于A,B组,各组间均数比较差异有显着统计学意义(15.76,15.80 vs 18.11,18.55 ,p<0.001)。开放门静脉30分钟之后两组门静脉逐渐回落,C,D组开放门静脉后门静脉压力维持相对稳定,波动于12.63~13.42cmH2O之间,峰值门静脉压力较基础门静脉压力升高幅度达23.1%。而A,B组恢复门静脉灌注后门静脉压力显着升高,波动于15.47~16.52cmH2O之间,峰值门静脉压力较基础门静脉压力升高幅度高达65.5%。C,D组在恢复门静脉灌注后的5、15、30和60分钟各时间点均明显低于A,B组,各组各时间点门静脉压力均数经单因素方差分析,LSD分析,p<0.001,差异有显着统计学意义。4.实验中各组肝移植术后血清ALT和AST水平显着升高,均在再灌注6小时升至峰值,术后24小时虽有所下降,但仍处于高水平状态。说明移植后移植物的肝实质细胞的损伤以6小时最为严重,24小时内仍处于一个急性期阶段。与其他组相比较A,B组在术后6小时和24小时血清ALT和AST水平显着升高,均较为明显且程度严重。D组最轻。E组无明显变化。各组间ALT和AST均数经比较差异有统计学意义,p<0.05。说明再灌注期间降低门脉压力,抗氧化减轻缺血再灌注损伤可减轻小体积移植物肝实质细胞的损伤的程度。5.本实验中各组肝移植术后MDA水平显着升高,均在再灌注6小时升至峰值,术后24小时虽有所下降,但仍处于高水平状态。说明移植后移植物的缺血再灌注损伤以6小时最为严重,24小时内仍处于一个急性期阶段。与其他组相比较,A,B组在术后6小时和24小时MDA水平显着升高。均较为明显且程度严重。D组最轻。E组无明显变化。各组间MDA均数经比较差异有统计学意义,p<0.05。本实验中各组肝移植术后SOD水平显着下降,说明移植后移植物的缺血再灌注损伤SOD不断耗竭,24小时内仍处于耗竭阶段。与其他组相比较,A,B组在术后6小时和24小时SOD水平显着降低。均较为明显且程度严重。D组最轻。E组无明显变化。各组各亚组间SOD均数经比较差异有统计学意义,p<0.05。说明各组大鼠受体均不同预处理后,缺血再灌注损伤有显着差别。D组缺血再灌注损伤较A,B,C组轻。E组无明显变化。说明联合使用厄贝沙坦和依达拉奉能明显减轻小体积移植物缺血再灌注损伤。6.A组术后6小时和24小时Egr-1 mRNA ,ET-1mRNA ,BaxmRNA表达均高于其他组(p<0.05)。D组术后6小时和24小时Egr-1 mRNA ,ET-1mRNA ,BaxmRNA表达较A,B,C组表达低(p<0.05)。说明在厄贝沙坦和依达拉奉的联合作用下,Egr-1 mRNA ,ET-1mRNA ,BaxmRNA表达较低。而C组术后6小时和24小时Egr-1mRNA, ET-1mRNA , BaxmRNA表达均低于B组(p<0.05)。说明在小体积肝移植中,门静脉一过性增高对这些mRNA影响大于缺血再灌注因素。7、免疫组化显示:A组术后6小时和24小时ET-1,Bax,TNF表达均高于其他组(p<0.05)。D组术后6小时和24小时ET-1 ,Bax,TNF表达较A,B,C组表达低(p<0.05)。说明在厄贝沙坦和依达拉奉的联合作用下,ET-1,Bax,TNF表达较低。而C组术后6小时和24小时ET-1 ,Bax,TNF表达均低于B组(p<0.05)。说明在小体积肝移植中,门静脉一过性增高对这些基因蛋白的影响大于缺血再灌注因素。8、Tunel显示:A组术后6小时和24小时凋亡指数高于其他组(p<0.05)。D组术后6小时和24小时凋亡指数较A,B,C组表达低(p<0.05)。说明在厄贝沙坦和依达拉奉的联合作用下,肝细胞凋亡较少。而C组术后6小时和24小时凋亡指数表达均低于B组(p<0.05)。说明在小体积肝移植中,门静脉一过性增高对细胞凋亡的影响大于缺血再灌注因素。结论1.大鼠边缘性体积部分肝移植术后造成小体积移植物的灌注后损伤的特殊性就在于其面临的是早期门静脉过度灌注和缺血再灌注的双重损伤。2.在大鼠边缘性体积供肝移植中,门静脉压力升高和缺血再灌注损伤两个因素中,门静脉压力升高对肝窦内皮细胞造成的应力性损伤,对供肝的损害最大。3.针对以上两个损伤因素,联合使用厄贝沙坦和依达拉奉可通过降低门静脉压力,抗氧化减轻缺血再灌注损伤的双重保护作用可明显的减轻大鼠边缘性体积肝移植术后早期小体积移植物的损伤程度,较单纯使用一种药物效果好。第三部分联合应用厄贝沙坦和依达拉奉对大鼠边缘性体积肝移植的移植物再生影响的研究目的本部分实验通过在大鼠边缘性体积供肝肝移植术中联合使用厄贝沙坦和依达拉奉,降低再灌注期间门静脉压力,抗氧化减轻缺血再灌注损伤,减轻小体积移植物早期损伤,初步探讨联合使用厄贝沙坦和依达拉奉对大鼠边缘性体积供肝肝移植术后小体积供肝再生的影响。材料和方法选用健康、体重相差20~30克的雄性SD大鼠72只,以小体重大鼠为供体,按第一部分介绍的方法建立大鼠边缘性体积肝脏移植模型。随机分为:A组,边缘性体积部分肝移植依达拉奉实验组和B组,边缘性体积部分肝移植厄贝沙坦实验组,C组,边缘性体积部分肝移植厄贝沙坦联合依达拉奉实验组。各组于术后2、7天各随机抽取6只存活受体在乙醚麻醉下取肝组织标本。分别测定供肝湿重、肝组织免疫组化Ki-67标记指数,了解大鼠边缘性体积供肝肝脏移植术后供肝再生的初步情况。结果1、C组移植术后供肝湿重(D1)、移植术后大鼠供肝湿重与受体原肝脏湿重之比(D1/R)和供肝再生率(D1/R -D0/R)在第2天和第7天明显高于A,B组,p<0.05,差异有统计学意义.B组移植术后供肝湿重(D1)、移植术后大鼠供肝湿重与受体原肝脏湿重之比(D1/R)和供肝再生率(D1/R -D0/R)在第2天和第7天明显高于A组,p<0.05,差异有统计学意义。2、免疫组化Ki-67标记指数结果显示,各组中Ki-67标记指数的高峰均出现在术后第2天。C组术后第2天和第7天的Ki-67标记指数均高于A组,B组,各组间比较差异有统计学意义(p<0.05),B组术后第2天和第7天的Ki-67标记指数均高于A组,各组间比较差异有统计学意义(p<0.05),结论1.联合使用厄贝沙坦和依达拉奉组对肝细胞的再生没有直接的促进作用,供肝再生的影响是通过通过降低门静脉压力,抗氧化减轻缺血再灌注损伤的双重保护作用减轻了边缘性体积供肝的损伤程度,间接的维护供肝细胞再生的顺利进行。比单纯使用一种药物的效果好。2.厄贝沙坦和依达拉奉对肝细胞的再生没有直接的促进作用,厄贝沙坦通过降低门静脉压力减轻了边缘性体积供肝的损伤程度,间接维护供肝细胞再生的作用较依达拉奉抗氧化减轻缺血再灌注损伤,间接的维护供肝细胞再生的作用效果好。
王治康[9](2009)在《应用灯盏花素对大鼠肝移植术后缺血/再灌注损伤的影响》文中指出目的建立一种更高效、稳定的大鼠肝移植动物模型,在围手术期应用灯盏花素,阐明其对大鼠肝脏移植术后缺血/再灌注损伤是否有保护作用及其相关的机制。方法分三个步骤:1.原二袖套法基础上,综合各种改良术式,经腹主动脉灌注,单线连续外翻缝合吻合肝上下腔静脉,袖套法吻合门静脉和肝下下腔静脉,单管内支架端端吻合胆总管,术中改进细节,减少出血,合理地复温、补液,缩短了手术时间和无肝期。术后观察成活率和存活期。2.将40对实验大鼠随机分为移植给药组和移植对照组,每组再分为存活6小时、24小时取材2个亚组,复制肝移植模型,观察术后成活率、6小时和24小时存活率,并于6小时和24小时分别取下腔静脉血测定血清ALT活力,取肝组织行普通光镜观察。用SPSS13.0统计软件两组独立样本资料的t检验进行统计分析。3.(1)分组420只雄性SD大鼠,随机分为正常组、假手术组、生理盐水对照组、低剂量给药组和高剂量给药组,除正常组外每组按术后1小时、3小时、6小时、12小时和24小时取材时间分为5个亚组,其中正常组和假手术组n=5,生理盐水对照组、低剂量给药组和高剂量给药组n=10。(2)给药方式正常组和假手术组不给药;生理盐水对照组只给生理盐水;低剂量给药组给予含5mg/kg灯盏花素的生理盐水;高剂量给药组给予含10mg/kg灯盏花素的生理盐水。(3)手术方法正常组不予手术;假手术组只离断肝周韧带和结扎左膈下静脉、肝动脉;生理盐水对照组、低剂量给药组和高剂量给药组复制肝移植模型。(4)取材和保存于各时间点,下腔静脉穿刺取血3-4ml,离心取上清-80℃保存;取小块活肝组织浸泡于冷生理盐水立即送检,检测细胞凋亡;取小块肝组织-80℃保存;取小块肝组织10%中性甲醛固定。(5)指标检测方法记录生理盐水对照组、低剂量给药组和高剂量给药组的供肝冷缺血保存时间、无肝期时间、受体手术时间,分别进行比较;全自动生化分析仪检测血清ALT、AST活力和TBil含量;分别用黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法、硫代巴比妥酸法(TBA)测定血清SOD、GSH-Px活力和MDA含量;流式细胞分析仪Annexin V-PE染色法检测肝组织细胞凋亡比率;-80℃保存的肝组织解冻后,制成10%的匀浆液,离心取上清,Brodford法测定样本蛋白含量,分别用黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法、硫代巴比妥酸法(TBA)测定肝组织SOD、GSH-Px活力和MDA含量:10%中性甲醛固定的肝组织石蜡包埋,4μm厚切片,铺片,染色,普通光学显微镜观察。(6)统计学处理数据以均数士标准差(X士S)表示。采用SPSS 13.0版统计软件,组间均数比较用方差分析,组内比较用t检验,以α=0.05作为检验水准。结果1.共制作120例大鼠原位肝移植(不包括预练习),供体手术时间(17+1.5)min,受体手术时间(37+2.5)min,无肝期为(19+1.5)min。手术成功率94.2%,周存活率90.0%。2.移植给药组和移植对照组各20例,分别手术,两组术后成活率相同,相比较无统计学差异(P>0.05);6小时移植给药组存活率高于移植对照组,比较有统计学意义(P<0.05);24小时移植给药组存活率高于移植对照组,比较有统计学意义(P<0.05);6小时移植给药组血清ALT活力低于移植对照组,比较有统计学意义(P<0.05);24小时移植给药组血清ALT活力低于移植对照组,比较有统计学意义(P<0.05);病理学变化,移植对照组的肝细胞变性、坏死、肝窦闭塞、炎性细胞浸润等改变比移植给药组严重。3.(1)移植手术各期时间供肝冷缺血保存时间,C、L、H三组间无统计学差异(P>0.05);无肝期时间C、L、H三组间比较无统计学差异(P>0.05);受体手术时间C、L、H三组间无统计学差异(P>0.05)。(2)肝功能①血清ALT,各时间点N、L、H三组明显升高,与N、S组比较有统计学差异(P<0.01);C组高于L组,两组比较,有统计学差异(P<0.05);L组高于H组,两组比较,有统计学差异(P<0.05);C组明显高于H组,两组比较,有统计学差异(P<0.01);手术各组均以6小时为高峰(P<0.05,P<0.01)。②AST活力,各时间点C、L、H三组明显升高,与N、S组比较有统计学差异(P<0.01);C组高于L组,有统计学差异(P<0.05);L组高于H组,有统计学差异(P<0.05);C组明显高于H组,有统计学差异(P<0.01);手术各组均以6小时为高峰(P<0.05,P<0.01)。③TBil含量,C、L、H三组升高显着,与N、S组比较有统计学差异(P<0.01);C组高于L组,有统计学差异(P<0.05);L组高于H组,有统计学差异(P<0.05);C组明显高于H组,有统计学差异(P<0.01);手术各组均以6小时为高峰(P<0.05,P<0.01)。(3)血清SOD、GSH-Px活力和MDA含量①SOD活力,S组轻微升高,与N组比较有统计学差异(P<0.05);而C组、L组、H组则降低,分别与N组、S组比较有统计学意义(P<0.01);以C组降低最显着,与L组比较有统计学意义(P<0.05),与H组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);H组降低不如L组,两组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);手术各组以6小时降低最明显,与1小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);12小时至24小时逐渐升高,24小时与6小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05),24小时与1小时比较,L组和H组内无统计学意义(P>0.05)。②GSH-Px活力,C组、L组都明显降低,分别与N、S组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);而H组比L组有升高,H组与L组比较有统计学意义(P<0.05);手术各组以6小时降低最显着,与1小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);12小时至24小时逐渐升高,24小时与6小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。③MDA含量,C组升高最为显着,与N组和S组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);L组和H组有所降低,C组与L组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);H组降低更多,L组与H组比较有统计学意义(P<0.05);MDA含量随术后时间逐渐升高,手术各组均以6小时为高峰,之后逐渐降低,6小时与1小时比较有统计学意义(P<0.01);6小时与24小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。(4)肝组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量①SOD活力,S组轻微升高,与N组比较有统计学差异((P<0.05);而C组、L组、H组则降低,与N组、S组比较有统计学意义(P<0.01);以C组降低最显着,与L组比较有统计学意义(P<0.05),与H组比较统计学意义(P<0.01,P<0.05);H组降低不如L组,两组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);手术各组以6小时组降低最明显,与1小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);12小时至24小时逐渐升高,6小时与24小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);24小时与1小时比较,在L组和H组内无统计学意义(P>0.05)。②GSH-Px活力,C组、L组都明显降低,分别与N、S组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);而H组比L组升高,H组与L组比较有统计学意义(P<0.05);手术各组以6小时降低最显着,与1小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);12小时至24小时逐渐升高,24小时与6小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。③MDA含量,C组升高最为显着,与N组和S组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);L组和H组有所降低,C组与L组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);H组降低更多,L组与H组比较有统计学意义(P<0.05);随术后时间逐渐升高,手术各组均以6小时为高峰,之后逐渐降低,6小时与1小时比较有统计学意义(P<0.01);24小时与6小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。(5)肝组织细胞凋亡C组的凋亡比例最高,C组与N组比较有统计学意义(P<0.01);L组用药可抑制凋亡比例,与C组比较有统计学意义(P<0.05);而H组的抑制作用优于L组,两组比较有统计学意义(P<0.05);随术后时间延长凋亡比例升高,手术各组以6小时为高峰,之后逐渐降低,6小时与1小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);6小时与24小时比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。(6)病理学变化以C组的肝细胞变性、坏死、肝窦堵塞和炎性细胞浸润等变化最重,L组次之,然后是H组;病理损伤分级,C组最高,C组与L组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);而H组损伤分级比L组低,二组比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05);手术各组以6小时损伤表现最显着,6小时与其他时间点比较有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论1.改良“两袖套”法大鼠原位肝移植,在娴熟的外科操作的基础上,两人固定的配合,精简手术步骤,改进细节,减少失误和并发症,缩短手术时间,尤其是无肝期,悉心的围手术期管理,提高了受体生存率和存活期,为大鼠肝移植研究提供高效、稳定的模型。2.应用改良的“两袖套”法大鼠原位肝移植模型,手术成功率高,而且手术操作过程较稳定,影响因素控制相近,减少了个体间因手术操作造成的差异和影响。应用灯盏花素后,可以提高肝移植受体的存活时间和存活率,可以降低受体血清ALT水平,减轻肝脏病理学改变。可认为,灯盏花素对大鼠肝移植供肝的缺血再灌注损伤有保护作用;具体的保护机理及与用药剂量关系,需要进一步研究。3.灯盏花素通过抑制氧自由基的生成,降低SOD、GSH-Px消耗,增加合成,提高SOD、GSH-Px活力,抑制脂质过氧化损伤,保护细胞膜,抑制MDA的产生和含量升高,抑制细胞凋亡,减少肝细胞损伤,改善肝脏功能和肝脏病理学变化,从而对大鼠肝移植术后肝脏和机体缺血/再灌注损伤起保护作用。而且有一定的量效关系。
卢景宁[10](2008)在《大鼠边缘性体积供肝肝移植模型的建立和控制门脉压力对供肝保护作用研究》文中认为第一部分大鼠边缘性体积供肝肝移植模型的建立目的本部分实验通过建立不同体积供肝大鼠原位肝移植模型,摸索出边缘性体积供肝大小的范围,探讨大鼠边缘性体积供肝肝移植模型建立的方法,为研究小肝综合征的发病机制及防治措施提供一个较为理想易于复制的小动物模型。材料和方法选用健康、9~12周龄、体重190~250g的雄性SD大鼠192只作为实验动物,取周龄相差1~3周,体重相差20~30克的大鼠,以小体重大鼠作为供体,采用离体减体积方式切除不同肝叶设计出不同体积供肝的大鼠原位肝移植模型。本部分实验设立4个实验组:A组,全肝移植组(n=24);B组,50%部分肝移植组(切除肝左叶、双乳突叶,保留肝中叶、右后叶和右前叶作为供肝,使供肝与受体肝比值控制在50%左右,n=24);C组,30%部分肝移植组(除保留肝中叶外,其余四叶均予以切除,使供肝与受体肝比值控制在30~35%之间,n=24);D组:小于30%部分肝移植组(保留右前叶、右后叶和双乳突叶,切除肝中叶和左叶,使供肝与受体肝比值杏?0%,n=24)。供、受体均使用乙醚持续开放式吸入麻醉,大鼠原位肝脏移植模型建立采用的双袖套法,不进行肝动脉血管重建。观察各组术后肝功能ALT水平、门静脉压力和存活率,比较分析各组间ALT、门静脉压力及累积存活率之间的关系。结果全肝移植组(A组)7天累积存活率为100%,50%部分肝移植组(B组)7天累积存活率为83.3%,30%部分肝移植组(C组)7天累积存活率为16.7%,小于30%部分肝移植组(D组)受体均于术后48小时内死亡。各组组间存活率经log rank(mantel-cox)方法比较,A组与B组累积存活率组间差异无统计学意义,P=0.148;C组与A组累积存活率有显着性差异,P<0.001;C组与B组累积存活率比较,P<0.001,组间差异有显着的统计学意义,C组与D组两组存活率有显着性差异,P<0.001。受体移植前基础门静脉压力各组间差异无统计学意义,P>0.05。A组术中开放门静脉后1小时内门静脉压力稳定,B组开放门静脉后门脉压力虽有小幅上升,但门脉压力仍保持相对稳定,而C组和D组开放门静脉后门脉压力显着升高,15分钟达到峰值,两组门脉压力峰值分别较基础门脉压力升高65%和82%。两组门静脉压力30分钟后开始回落,至45分钟到60分钟逐渐稳定,但仍维持于一高位。将供肝体积大小与各时间点的门静脉压力进行Pearson相关分析后发现,供肝体积的大小与基础门静脉压力无相关性,相关系数r=0.249,P=0.241;而供肝体积的大小与开放门静脉后5、15、30、45和60分钟门静脉压力呈负相关性,(相关系数分别为r=-0.926,r=-0.936,r=-0.904,r=-0.903,r=-0.902,P<0.001)。肝移植术后24小时各组ALT水平明显升高,四组中以D组水平最高,C组次之,B组和A组最低,各组间差异有统计学意义,P<0.001。将供肝体积大小与各组移植术后24小时ALT水平进行Pearson相关分析后,结果显示供肝体积的大小与移植术后24小时ALT水平呈负相关性,相关系数r=-0.704,P<0.001。结论1、大鼠减体积供肝肝移植模型供肝体积大小的安全界限为50%标准体积;体积介于30~35%标准体积的供肝应视为边缘性体积移植物,小于30%标准体积的供肝可视为超小体积移植物。上述标准可作为大鼠减体积供肝肝移植模型小体积移植物选择的参考标准。2、大鼠边缘性体积供肝肝移植模型的建立,可选取周龄相差1~3周,体重相差20~30克的大鼠,以小体重的大鼠作为供体,除保留肝中叶外,其余四叶均予以切除,可以使供肝与受体肝湿重比值控制在30~35%之间。3、大鼠小体积供肝肝移植模型中,供肝体积大小与开放门静脉后的门脉压力升高幅度及术后24小时ALT水平呈负相关性,小体积供肝肝移植术中开放门静脉后急剧升高的门静脉压力对供肝造成的应力性的损伤,是导致肝移植术后小体积移植物功能损害、受体存活率降低的主要原因。第二部分暂时性控制门脉压力对大鼠边缘性体积移植物保护作用的研究目的本部分实验拟对大鼠边缘性体积供肝肝移植术后小体积移植物早期损伤的机制进行初步研究,探讨在大鼠边缘性体积供肝肝移植术中使用三甘氨酸-赖氨酸-加压素,降低再灌注期间门静脉压力对边缘性体积供肝早期损伤的保护作用机制。材料和方法选用健康、体重相差20~30克的雄性SD大鼠120只,以小体重大鼠为供体,按第一部分介绍的方法建立大鼠边缘性体积供肝肝移植模型,设立三甘氨酸-赖氨酸-加压素实验组和生理盐水对照组,实验组的用药方案为:受体于肝脏切除前10分钟和供肝恢复门静脉灌注后立刻经股静脉缓慢推注三甘氨酸—赖氨酸—加压素50ug/kg/份0.5mL,对照组按同样的时间和径路注射生理盐水0.5mL。观察两组术后一般情况、门静脉压力和存活率,两组分别于术后6小时和24小时各取6只受体在无菌条件下采取下腔静脉血标本和肝组织标本。测定血清中ALT、AST水平、血浆中内毒素浓度、肝细胞匀浆内SOD活力和MDA含量、RT-PCR检测肝组织TNF-a mRNA表达情况及光镜下和电镜下观察肝组织形态学改变。结果1、实验组7天累积存活率为66.7%,对照组7天累积存活率为25.0%,经统计学log rank(mantel-cox)方法比较,P=0.044,两组累积存活率之间的差异有统计学意义。2、两组受体移植前基础门脉压力差异无统计学意义(10.20 vs 10.12,P=0.565)。实验组开放门静脉后门静脉压力维持相对稳定,波动于13.52~11.20cmH2O之间,而对照组恢复门静脉灌注后门静脉压力显着升高,波动于16.07~11.85 cmH2O之间。两组开放门静脉后门静脉压力的峰值出现在开放门静脉后15分钟,但实验组门脉压力峰值要明显低于对照组(13.52 vs16.07,P=0.003),峰值较基础门脉压力升高幅度分别为33%和59%。开放门静脉30分钟之后两组门脉压力逐渐回落。实验组在开放门静脉后的5、15、30和45分钟各时间点门脉压力均明显低于对照组,而于60分钟两组门脉压力无统计学差异。3、两组肝移植术后血清ALT和AST水平显着升高。实验组ALT和AST水平在肝移植术后6小时和24小时较对照组明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。说明再灌注期间降低门脉压力可减轻小体积移植物肝实质细胞损伤的程度。4、实验组和对照组肝组织中SOD活性和MDA水平在移植术后6小时和24小时相比较差异无统计学意义,P>0.05。提示实验组和对照组肝移植术后供肝均遭受相同程度的缺血再灌注损伤。5、实验组血浆内毒素水平术后6小时和24小时均低于对照组,各亚组间差异有统计学意义,P<0.05。提示再灌注期间降低门脉压力可降低肝移植术后内毒素水平,减轻内毒素血症所引发的继发性供肝损伤。6、实验组术后6小时和24小时TNF-αmRNA表达水平均低于对照组,P<0.05。提示再灌注期间降低门脉压力可降低供肝炎症反应的程度,减轻小体积移植物肝移植术后早期的损伤。7、光镜下可见实验组和对照组均出现不同程度的肝窦充血、局部肝窦扩张、血管内皮细胞完整性受损、肝板结构改变及肝细胞空泡变性等形态学异常的表现,与实验组相比较对照组在术后6小时和24小时形态学异常的表现均较为明显且程度严重。8、电镜观察结果显示,两组均出现不同程度的肝窦内皮细胞线性结构完整性破坏、线粒体肿胀等的形态学异常。实验组在采取降低再灌注期间门静脉压力的保护措施之后,肝细胞的超显微结构保持得相对完整。结论1、大鼠边缘性体积供肝肝移植术中开放门静脉后瞬间急剧升高的门静脉压力对肝窦内皮细胞造成不可逆的应力性损伤是导致肝移植术后移植物丧失的主要原因。2、大鼠边缘性体积供肝肝移植术中使用三甘氨酸-赖氨酸-加压素降低再灌注期间门静脉压力,可明显的减轻边缘性体积供肝早期损伤的程度。第三部分暂时性控制门脉压力对大鼠边缘性体积移植物再生影响的研究目的本部分实验通过在大鼠边缘性体积供肝肝移植术中使用三甘氨酸-赖氨酸-加压素降低再灌注期间门静脉压力,减轻小体积移植物早期损伤的程度,初步探讨三甘氨酸-赖氨酸-加压素对大鼠边缘性体积供肝肝移植术后小体积供肝再生的影响。材料和方法选用健康、体重相差20~30克的雄性SD大鼠240只,以小体重大鼠为供体,按第一部分介绍的方法建立大鼠边缘性体积肝移植模型。设立三甘氨酸-赖氨酸-加压素实验组和生理盐水对照组,三甘氨酸-赖氨酸-加压素用药方案同第二部分。两组于术后1、2、4和7天各随机抽取6只存活受体在乙醚麻醉下取肝组织标本。分别测定供肝湿重、供肝细胞增殖指数和肝组织免疫组化ki-67标记指数,了解大鼠边缘性体积供肝肝移植术后供肝再生的初步情况。结果1、实验组肝移植术后供肝湿重(D1)、肝移植术后大鼠供肝湿重与受体原肝脏湿重之比(D1/R)和供肝再生率(D1/R—D0/R)在第1天和第2天明显高于对照组,P<0.05,差异有统计学意义,而在第4天和第7天两组各亚组间差异均无统计学意义,P>0.05。2、供肝细胞增殖指数(PI)结果显示,两组供肝细胞增殖指数的高峰均出现在术后的第2天。实验组肝移植术后的第1天和第2天供肝细胞增殖指数较对照组明显增高,差异有统计学意义,P<0.05。而两组肝移植术后第4天和第7天的供肝细胞增殖指数则无统计学差异,P>0.05。3、免疫组化ki-67标记指数结果显示,两组Ki-67标记指数的高峰均出现在术后第2天。实验组术后第1天和第2天的Ki-67标记指数均高于对照组,各亚组间比较差异有统计学意义,P<0.05。而肝移植术后第4天和第7天两组各亚组间Ki-67标记指数的差异无统计学意义,P>0.05。结论三甘氨酸-赖氨酸-加压素对大鼠边缘性体积移植物术后肝细胞的再生没有直接的促进作用,其只是通过降低门静脉压力,减轻边缘性体积供肝的损伤程度,间接的维护供肝细胞再生的顺利进行。
二、肝移植供肝活力的测定(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝移植供肝活力的测定(论文提纲范文)
(1)L-抗坏血酸在改善大鼠DCD供肝常温机械灌注灌注液中的应用研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
英文缩略词对照 |
第1章 引言 |
第2章 综述 |
2.1 常温机械灌注在肝移植供肝保存中的应用 |
前言 |
2.1.1 机械灌注的研究进展及主要方式 |
2.1.2 常温机械灌注 |
2.1.3 灌注平台的研究 |
2.1.4 总结与展望 |
2.2 肝移植供肝缺血再灌注损伤的机制及干预措施 |
前言 |
2.2.1 肝脏IRI的机制 |
2.2.2 肝脏IRI的干预措施 |
2.2.3 总结与展望 |
第3章 材料与方法 |
3.1 实验分组 |
3.2 材料 |
3.2.1 实验动物 |
3.2.2 主要实验器材与试剂 |
3.2.3 大鼠NMP灌注系统示意图 |
3.3 方法 |
3.3.1 灌注液配置 |
3.3.2 大鼠模型建立 |
3.3.3 标本采集 |
3.3.4 检测指标与方法 |
3.4 统计学处理 |
第4章 结果 |
4.1 各组肝脏灌注过程中肝脏酶学比较 |
4.2 各组肝脏病理学检查 |
4.3 各组肝脏糖原消耗比较 |
4.4 各组肝脏胆汁生成比较 |
4.5 各组肝脏SOD与 MDA含量 |
4.6 各组肝脏炎性细胞因子TNF- 、IL-1、IL-6 含量比较 |
第5章 讨论 |
5.1 常温机械灌注的现状 |
5.2 L-抗坏血酸的研究情况 |
5.3 灌注液肝功酶学情况 |
5.4 肝组织形态学变化 |
5.5 胆汁分泌情况 |
5.6 肝组织MDA及 SOD含量 |
5.7 L-抗坏血酸在常温机械灌注灌注液中改善大鼠DCD供肝的炎症细胞因子TNF- 、IL-1和IL-6 的含量 |
第6章 结论 |
参考文献 |
作者简介 |
后记和致谢 |
(2)逆灌注法肝移植对移植肝氧化应激损伤的动物实验与临床研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一部分 建立大鼠肝移植模型并探究逆灌注法对移植术后炎症因子和氧化应激分子影响的观察 |
一、大鼠肝移植模型的建立 |
二、经下腔静脉逆灌注法对移植术后炎症因子和氧化应激分子影响的观察 |
三、材料与方法 |
四、结果 |
五、讨论 |
第二部分 经下腔静脉逆灌注法对DCD来源供肝术后早期氧化应激损伤的影响 |
一、资料与方法 |
二、结果 |
三、讨论 |
总结 |
参考文献 |
附录 |
附录A 综述 |
参考文献 |
附录B 中英文对照缩略词表 |
附录C 个人简历及研究生发表文章 |
致谢 |
(3)辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤中的作用及机制研究(论文提纲范文)
英文缩略词简表 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
1 前言 |
1.1 国内外肝移植现状 |
1.2 DCD肝脏存在的问题 |
1.3 KLF2 |
1.4 KLF2 与缺血再灌注损伤 |
1.5 研究假设 |
2 第一部分辛伐他汀预处理在大鼠全肝缺血再灌注损伤中的作用及潜在机制研究 |
2.1 引言 |
2.2 实验材料和方法 |
2.3 统计学分析 |
2.4 实验结果 |
2.5 讨论 |
2.6 结论 |
3 第二部分辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝中缺血再灌注损伤中的作用及机制究 |
3.1 引言 |
3.2 实验材料和方法 |
3.3 统计学分析 |
3.4 实验结果 |
3.5 讨论 |
3.6 结论 |
参考文献 |
综述一 |
参考文献 |
综述二 |
参考文献 |
攻博期间发表的科研成果目录 |
致谢 |
(4)低温机械灌注通过抗氧化应激保护大鼠心脏死亡供肝的机制研究(论文提纲范文)
英文缩略词简表 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
1 前言 |
第一部分:低温机械灌注通过激活Keap1/Nrf2-ARE信号通路减轻心脏死亡后大鼠肝脏的缺血/再灌注损伤 |
前言 |
2 材料和方法 |
2.1 实验材料 |
2.2 实验方法 |
2.3 统计学方法 |
3 实验结果 |
3.1 酶学、肝内阻力和胆汁产生 |
3.2 组织学结果 |
3.3 氧化应激、炎症和凋亡结果 |
3.4 Keap1/Nrf2-ARE抗氧化应激途径的激活 |
4 讨论 |
第二部分:HOPE激活Notch1信号减轻缺血/再灌注损伤保护大鼠DCD肝脏 |
引言 |
5 材料和方法 |
5.1 实验材料 |
5.2 实验方法 |
5.3 统计学方法 |
6 实验结果 |
6.1 HOPE减少了DCD肝损伤并提高了移植物的活力 |
6.2 HOPE可减少肝脏氧化应激,炎症和细胞凋亡 |
6.3 HOPE增加了DCD肝脏抗氧化能力并减轻再灌注损伤 |
6.4 HOPE在再灌注期间激活DCD肝脏中的Notch1信号传导 |
7 讨论 |
8 结论 |
9 本文的创新点、不足与展望 |
9.1 本文的创新点与不足 |
9.2 展望 |
参考文献 |
综述 AMPK对于减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用研究进展 |
参考文献 |
综述 Notch1信号通路在缺血再灌注损伤中的研究进展 |
参考文献 |
攻读学位期间科研成果目录 |
致谢 |
(5)CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
引言 |
参考文献 |
第一部分 大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒的构建及鉴定 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二部分 建立SD大鼠DCD原位肝移植模型 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第三部分 CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第四部分 慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
全文总结 |
综述 |
参考文献 |
攻读学位期间获得的学术成果 |
致谢 |
(6)小鼠肝脏低温携氧机械灌注系统的建立及保护机制研究(论文提纲范文)
论文创新点 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
缩略词表 |
1 前言 |
1.1 我国肝移植发展现状和瓶颈 |
1.2 供肝保存技术 |
1.3 低温机械灌注技术研究进展 |
1.4 HOPE机制的研究现状 |
1.5 自噬可能参与HOPE对 DCD肝脏的保护作用 |
1.6 HOPE可能通过P选择素依赖和非依赖途径发挥对DCD肝脏的保护作用 |
2 小鼠肝脏低温机械灌注系统的建立与参数探究 |
2.1 引言 |
2.2 实验材料和方法 |
2.3 实验结果 |
2.4 讨论 |
2.5 结论 |
3 HOPE通过上调自噬的表达发挥DCD肝脏损伤的保护作用 |
3.1 引言 |
3.2 方法 |
3.3 实验结果 |
3.4 讨论 |
3.5 结论 |
4 HOPE通过P选择素依赖和非依赖途径发挥对DCD肝脏的保护作用 |
4.1 引言 |
4.2 实验方法 |
4.3 结果 |
4.4 讨论 |
4.5 结论 |
参考文献 |
综述一 |
参考文献 |
综述二 |
参考文献 |
综述三 |
参考文献 |
攻读学位期间发表论文目录 |
致谢 |
(7)树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
参考文献 |
第一部分 树鼩原位肝移植模型的建立 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二部分 树鼩淋巴细胞CXCL12/CXCR4基因迁移和表达的体外实验研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第三部分 树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4表达的作用及机制研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述一 |
参考文献 |
综述二 |
参考文献 |
攻读学位期间获得的学术成果 |
致谢 |
(8)联合应用厄贝沙坦和依达拉奉对大鼠边缘性体积供肝移植的供肝保护作用研究(论文提纲范文)
缩略语中英文对照 |
中文摘要 |
英文摘要 |
正文 |
第一部分 大鼠边缘性体积供肝肝移植模型的建立 |
序言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二部分 厄贝沙坦联合依达拉奉对大鼠边缘性体积移植肝保护作用的研究 |
序言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二部分附图 |
第三部分 厄贝沙坦联合依达拉奉对大鼠边缘性体积移植肝再生影响的研究 |
序言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 |
本实验特色和创新点 |
下一步科研方向 |
致谢 |
攻读博士学位期间发表论文情况 |
(9)应用灯盏花素对大鼠肝移植术后缺血/再灌注损伤的影响(论文提纲范文)
中英文缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
引言 |
第一部分 改良“两袖套”法大鼠原位肝移植模型的制作 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
第二部分 应用灯盏花素对大鼠肝移植术后缺血/再灌注损伤保护作用 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
第三部分 应用灯盏花素对大鼠肝移植术后缺血/再 灌注损伤的保护机制 |
1 材料和方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
研究生期间发表论文 |
致谢 |
(10)大鼠边缘性体积供肝肝移植模型的建立和控制门脉压力对供肝保护作用研究(论文提纲范文)
中英文对照表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
正文 |
第一部分 大鼠边缘性体积供肝肝移植模型的建立 |
序言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二部分 暂时性控制门脉压力对大鼠边缘性体积移植物保护作用的研究 |
序言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第三部分 暂时性控制门脉压力对大鼠边缘性体积移植物再生影响的研究 |
序言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 肝移植术后早期肝功能不全和无功能 |
致谢 |
博士期间论文发表情况 |
四、肝移植供肝活力的测定(论文参考文献)
- [1]L-抗坏血酸在改善大鼠DCD供肝常温机械灌注灌注液中的应用研究[D]. 矫春宝. 吉林大学, 2020(08)
- [2]逆灌注法肝移植对移植肝氧化应激损伤的动物实验与临床研究[D]. 蓝海斌. 蚌埠医学院, 2020(01)
- [3]辛伐他汀预处理对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤中的作用及机制研究[D]. 刘忠忠. 武汉大学, 2019(08)
- [4]低温机械灌注通过抗氧化应激保护大鼠心脏死亡供肝的机制研究[D]. 薛帅. 武汉大学, 2019(06)
- [5]CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究[D]. 张黎. 昆明医科大学, 2019(05)
- [6]小鼠肝脏低温携氧机械灌注系统的建立及保护机制研究[D]. 曾宪鹏. 武汉大学, 2019(06)
- [7]树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究[D]. 唐波. 昆明医科大学, 2018(05)
- [8]联合应用厄贝沙坦和依达拉奉对大鼠边缘性体积供肝移植的供肝保护作用研究[D]. 蓝柳根. 广西医科大学, 2009(09)
- [9]应用灯盏花素对大鼠肝移植术后缺血/再灌注损伤的影响[D]. 王治康. 昆明医学院, 2009(10)
- [10]大鼠边缘性体积供肝肝移植模型的建立和控制门脉压力对供肝保护作用研究[D]. 卢景宁. 广西医科大学, 2008(10)